Media Kultur

3. Formulasi media

Pada awal penelitian, media yang

digunakan berupa cairan tubuh.
Cairan plasma, limfe, serum dan ekstrak jaringan.

Media basal awal

Garam, asam amino, gula, vitamin
disuplementasi dengan serum

Define media

Formula define media

a.

b.

c.

d.

e.

f.

Ion-ion anorganik
Keseimpangan osmotik dan volume sel

Unsur mikro (trace element)

Cofactor untuk reaksi biokimiawi (Zn, Cu)

Asam amino
Sintesis protein
Glutamin dibutuhkan dalam konsentrasi tinggi

Vitamin
Metabolik coenzim untuk replikasi sel

Sumber energi
glukosa

serum

Formula define media (lanjutan

Serum menyediakan

Nutrisi dasar
Hormon dan growth factor
Faktor untuk penempelan dan penyebaran sel
Protein pengikat (binding protein): albumin,
membawa hormon, vitamin, mineral dan lipid
Protease inhibitor
pH buffer

4. Fase gas
a.

Oksigen, diperlukan untuk

b.

Metabolisme aerob
Kandungan di atmosfer 20%
Kandungan dalam jaringan 1-7%

CO2

Sebagai buffer

5. Monitoring pH
pH fisiologis 7
pH dapat mempengaruhi:

a.
b.

c.

Metabolisme sel
Laju pertumbuhan sel
Sintesis protein
Ketersediaan nutrien

Co2 bertindak sebagai agensia

pembuffer dalam kombinasi dengan
bikarbonat dalam media

6. Temperatur dan
Kelembaban
Temperatur normal tobuh hewan endoterm
37C
Kelembaban harus dipertahankan pada
level jenuh -- evaporasi dapat mengubah

Osmolaritas
Volume media dan bahan aditif

Introduction:
Animal cell culture can be described as in vitro maintenance and
propagation of animal cells using a suitable nutrient media.
Culturing is a process of growing animal cells artificially.
The most important and essential step in animal cell culture is
selecting appropriate growth medium for in vitro cultivation.
The selection of the medium depends on the type of cells to be
cultured and also the purpose of the culture:
growth differentiation, or even production of desired products like
pharmaceutical compounds.
Animal cells are cultured using a completely natural media, or an
artificial media along with some of the natural products.

Natural Media:
In the early years of this in vitro cultivation of animal cell culture
technique natural media are obtained from biological sources were
used. For eample
1. Body fluid such as plasma, serum, lymph, amniotic fluid and
much more are used. These fluids used as animal cell culture
media after testing for toxicity and sterility.
2. Tissue extract such as extract of liver, spleen, bone marrow and
leucocyes also used as animal cell culture media. But most
commonly used tissue extract is from chick embryo.
3. Plasma clots are also used as media for animal cell culture and
now they are commercially produced as culture media.
4. Bovine embryo extract are also prepared using bovine embryos
of up to 10days age, and are used as animal cell culture media.

Artificial Media:
1. The artificial media contains partly or fully defined components.
2. The basic criteria for choosing a artificial media for animal cell culture
are the culture media should provide all the required nutrients to the cell.
3. Media should maintain the physiological pH at around 7 with the help of
buffering system.
4. The animal cell culture media should be sterile, and isotonic to the
culturing cells. The basis for the animal cell culture media is the balanced
salt solution, which are used to create a physiological pH and osmolarity
required to maintain the animal cells in vitro or in laboratory conditions.
5. For promoting cell growth and proliferation, many types of animal cell
culture media are designed by adding or varying different constituents. For
example serum containing media and serum-free media.

Apakah keunggulan dan

kelebihan media alami???

PLASMA
Digunakan terutama pada kultur jaringan tradisional: Koagulum

Ross Harison : Menumbuhkan potongan kecil jaringan

(1907)
dari dekat pipa syaraf dalam jendalan
limpe katak
Carrel (1910) : Jendalan plasma sbgai media kultur
Sekarang bukan sebagai media
kultur melainkan sbg matriks melekat sel
/penyokong

Keunggulan plasma
1.

Menyediakan substrat dan struktur penyokong

yang mengandung nutrisi pada berbgai tipe kultur

Penyediaan matriks bagi sel baru selama

proses penyembuhan luka pada tubuh

2.

Memfasilitasi perlekatan sel pada permukaan

gelas

3.

Menyediakan sarana proteksi terhadap trauma

terhadap sel akibat proses sub-kultur dan
pergantian media

4.

Menyediakan kantung medium di sekitar sel

Plasma ayam dewasa lebih baik dari

plasma mamalia
Karena :
1. plasma lebih jernih
2. Kadar Ca darah lebih konstan
3. koagulum lebih kental
4. Hewan sumber mudah didapat
5. Prosedur pembuatan sederhana
dan mudah

Ayam Jantan muda

Prosedur pembuatan plasma

Pengambilan darah
Ayam: sayap, jantung , arteri carotid
Mamalia: carotid arteri, jantung
Perlu penambahan antikoagulan:
heparin dan EDTA

Centrifugasi darah

Pengambilan plasma

Prosedur pembuatan plasma

Cara pengambilan darah pada ayam

Gambar 1. Pengambilan darah dari vena

Gambar 3. Pengambilan darah

intrakardial cara 2.

Gambar 2. Pengambilan darah

intrakardial cara 1.

Gambar 4. Arteri carotis pada ayam

Pengambian darah ayam dari

vena branchial

Teknik pengambilan darah

ikan

Caudal Peduncle cut

Caudal vain puncture

Cardiac puncture

Serum
Serum: plasma tanpa fibrinogen
Dapat digunakan sebagai medium utuh
atau sebagai suplemen
des Ligneris (1928): kultur sel mamalia
Parker (1933, 1936): kultur jaringan
ayam
Simms (1936), Simms dan Sanders
(1942): ultrafiltrat serum sebagai
madium dasar untuk berbagai tujuan
ternasuk menumbuhkan virus
Risher et al. (1948): growth factor
bermolekul rendah penting untuk kultur

SERUM MEDIA
1. Serum media is an example for natural media. Natural media are very useful and
convinient for a wide range of animal cell culture. But they also have got some
disadvantages such as poor reproductability due to lack of knowledge of exact
composition of these natural media.
2. Major reasons for using synthetic media are for immediate survival of cells, for
prolonged survival, for indefinite growth and also for specialized functions.
a. Balanced diet solution with specific osmotic pressure and pH are used for the
immediate survival
b. Serum or balanced salt solution along with amino acids, oxygen, vitamins and
serum proteins are used for long survival.
c. Minimum Essential Medium also known as Eagles media are used for mammalian
cell culture
d. Role of serum in animal cell culture is very complex and also it contains mixture of
many biomolrcules such as growth factors and also growth inhibitory factors.

The function of Serum

1. Serum is bound to proteins and basic nutrient in solution.
2. Serum also contains hormones and growth factors, which play a major role
in stimulating cell growth and function
3. Serum also helps in attachment of the cells
4. Serum also acts as spreading factor.
5. Serum also function as binding protein such as albumin carrying factor
6. Serum also helps in carrying hormones, vitamins, minerals, lipids and much
more biological substances.
7. Serum also minimizes mechanical damage and also damage caused by
viscosity
8. Serum also acts as natural buffering agent and helps in maintaining the pH
of the culture media.

Disadvantage of Serum in Media:

1. Serum may contain inadequate amount of cell specific growth factors and may need to
suppliment the media or it may also contain in abundance of cytotoxic compounds.
2. Serum media has got high risk of contamination with virus, fumgi and mycoplasma.
3. There is no uniformity in the composition of serum, as still we do not know the exact
composition of the serum
4. Special tests are done to maintain the quality of the each batch of serum before it is
used in cell culture media.
5. Serum may also contain some of the growth inhibiting factors, these in turn will inhibit
the cultured cell growth and proliferation.
6. Serum availability is restricted as they are extracted from cattle
7. Presence of serum in the culture media may interfere with the purification and isolation
of cell culture products, such as pharmaceutical compounds. Due to this additional steps
are added for the isolation of cell culture products.

Serum Free Media:

As using serum in animal cell culture media has got some
disadvantages, to overcome this serum free media are designed and
developed.
Advantages of Serum Free Media:
1. Main and important advantage of serum free media is scientists or
researchers can control the growth of cultured cells as required by
changing the composition of the media.
2. Serum free media can be designed using specific factors, which will
help in differentiation of cultured cells with specific desired functions.

Disadvantages of Serum Free

Media:
1. cell proliferation is very slow in serum free
media.
2. Cultured cells may need more than one type of
media to obtain desired cell culture products.
3. Purity of reagents used in the serum free media
4. Availability

serum
Serum Autolog

Serum
Serum Heterolog
Manusia Dewasa

Sumber
Serum

Kuda
Tali Pusar
Fetus sapi

Paling
Baik

Pembuatan
Pembuatan Serum
Serum
Penjendalan

Penyaringan

Uji
Steri
litas

Pembekuan
(Jangka Panjang)

Penyimpanan
Temperatur Lemari
Pendingin
(Beberapa Minggu)

Prosedur pembuatan
serum
Pengambilan darah
(tanpa anti
koagulan)
Pembekuan darah
Centrifugasi
( 3000rpm)
Pengumpulan
serum

Komponen
Komponen
Serum
Serum

Healy dan Parker

Terdiri dari

Orosomukoid
(1= acid glikoprotein)

2 makroglobulin

Hilang dari medium selama kultivasi mencit

Dalam keadaan terpisah (1= acid

glikoprotein dan 2 makroglobulin) memiliki
efek kecil dalam merangsang pertumbuhan.
Tetapi, secara bersama-sama efek
pertumbuhannya mencolok dan dapat
menggantikan serum.
Makroglobulin

Molekul-molekul non-protein Ex:

Dextran/ficol

Acid glikoprotein

Tidak dapat digantikan

Serum sering bersifat toksik dan toksisitas dapat dikurangi

dengan pemanasan 60OC selams 30 menit

Serum
Serum Darah
Darah Tangkai
Tangkai Ari-Ari
Ari-Ari
Dr.Gey dan Dr. Margaret Murray

Cara mendapatkan darah dari tali pusar yaitu

dengan membiarkan darah menetes sendiri
dan ditampung dalam suatu wadah darah
dibiarkan menjendal serum yang
terbentuk dipisahkan dengan hati-hati dengan
jalan memipetnya disentrifugasi
disimpan dalam suhu kamar selama 2 atau 3
minggu
Pengurutan
Tuk mengel

Hemolisis

Pengumpulan darah dari tali

pusat

Cairan
Cairan Amnion
Amnion
Cara:

Bagian luar uterus sapi dicuci, digantung, area

dekat pangkal uterus diolesi yodium/ betadin.

Setelah kering dimasukan dalam tocar,

disiapkan tabung canula dan tabung
penampung untuk menyadap cairan amnion.

Cairan amnion disterilisasi, siap digunakan.

Amnion yang paling baik adalah amnion sapi

Cairan
Cairan Asites
Asites dan
dan Cairan
Cairan Pleura
Pleura

Cairan ini diperoleh dari cairan asites pasien

dengan carsinomatis peritonial.

Bahan ini diperoleh dari rumah sakit dan dapat

digunakan secepat mungkin setelah disterilkan.

Dianjurkan untuk menguji toksisitasnya karena

beberapa pasien yang menjadi sumber cairan
ini sedang mendapat terapi medik dan
beberapa obat dalam cairan tersebut dapat
bersifat toksik.

Humor
Humor Akuosa
Akuosa
Humor akuosa dari mata telah diusulkan sebagai
suatu nutrien yang baik untuk kultur karena in
vivo cairan ini sebagai satu-satunya sumber
nutrisi untuk epitel retina

Sumber
Terbaik

Mata lembu jantan

Serum
Serum Ultrafiltrasi
Ultrafiltrasi
Komponen penting dalam serum adalah molekul
molekul yang lebih besar: protein dan material
yang terikat pada protein.

Serum yang diultrafiltrasi merupakan nutrien

pensuplemen yang sangat berguna.
Pembuatannya memerlukan alat khusus.
Serum ultrafiltrasi telah tersedia secara
komersial dan dapat dipakai sebagai suplemen
berdaya guna dalam menumbuhkan jaringan
yang sangat dibutuhkan.

Serum
Serum Dialisis
Dialisis

Strain sel yang tumbuh dalam medium buatan

seluruhnya sangat sedikit
Strain sel kebanyakan tumbuh dalam medium buatan
yang diberi suplemen dialisis. Dalam media ini
sangat tepat menetapkan komponen molekul kecil
Cara:
Tetapkan volume
didialisis dengan air suling
selama 48 jam
tambahkan 1/5 volume x stok
BSS
Volume dijadikan 2x volume asli dengan
ditambahkan air suling
filtrasi menggunakan
filter Millipolar material yang tersususn 50% serum
dialis

Hemolimph
Hemolimph Insekta
Insekta

Digunakan sebagai basis untuk beberapa media

kultur jaringan insekta.
Hemolimph dapat diperoleh dengan memotong dua
atau tiga segmen pupa yang besar dan
mengeluarkan cairan

Kolagen
Substrat fibrin cenderung menjadi cair
Dibuat dari tendo ekor tikus/cakar ayam
Sebelum digunakan didialisis/diencerkan dalam
aquades
Baik untuk kultur dalam tabung dan gelas
penutup
Untuk pengkajian morfologik

EKSTRAK
JARINGAN
Hampir seluruh media kultivasi jar.
mengandung salah satu ekstrak jaringan. ex:
Ekstrak embrio
Sel dapat tumbuh tanpa ekstrak embrio dan beberapa
jaringan telah berhasil dikultivasi dengan sukses dalam serum
dan larutan balans.
Komponen paling penting dalam ekstraks embrio terletak pada
fraksi-fraksi molekul kecil dan bisa diganti secara efektif
oleh suplemen sintetik yang biasanya sebagai campuran
asam amino

Pembuatan
Pembuatan Ekstrak
Ekstrak Embrio
Embrio
Ada dua macam:
1. Ekstrak embrio yang dibuat dengan kerusakan
jaringan yang minim.
2. Ekstrak embrio yang melibatkan penghancuran
secara total jaringan embrio sampai terbentuk
homogenat.

Pembuatan
Pembuatan Ekstrak
Ekstrak Embrio
Embrio Ayam
Ayam
Cara:

Embrio dari telur yang diinkubasi lebih dari 10 hari

dihancurkan

2 atau 3 embrio diletakkan dalam tabung injeksi 20

ml steril, tekan dengan kuat ke dalam penampung
steril

Tambahkan larutan garam balans sampai 50 %,

kemudian disentrifugasi

supernatan yang dihasilkan mengandung ekstrak

embrio (ekstrak embrio 50:50)

Gambar 5. Pembuatan Ekstrak Embrio ayam.

Pembuatan
Pembuatan Ekstrak
Ekstrak Embrio
Embrio Sapi
Sapi

Uterus sapi yang mengandung embrio sapi dicuci

setelah kering, dilumuri iodin.
cairan amnion amnion dikeluarkan.
Uterus diletakkan pada nampan steril, diiris
memanjang.
Dinding yang diiris dilipat keluar, embrio diambil,
dipotong-potong dan dimasukkan dalam blender
ditambah dengan BSS dan dihomogenkan.
Ekstrak dipindahkan ke tabung sentrifugasi,
supernatan yang keruh merupakan EE-50 embrio
sapi.

Ekstrak
Ekstrak embrio
embrio ultrafiltrasi
ultrafiltrasi

Kelompok Earle memperlihatkan

bahwa ekstrak embrio yang telah
diultrafiltrasi memili potensi untuk
menyokong pertumbuhan yang
sama seperti ekstrak embrio sendiri

Suplemen Medium
Suplemen yang paling berguna adalah:
1. Laktabumin hidrosilat (Nutritional Biochemical)
yang dipakai pada konsentrasi 0,1-0,5%
2. Difco bactopecton 0,5% yang dipakai untuk
menggantikan komponen asam amino buatan
3. Ekstrak dehidrasi yeast 0,1% sebagai sumber
vitamin dan Co-enzim

Medium yang digunakan untuk menjaga stok sel

dalam laboratorium virologi mengandung 0,5%
laktabumin hidrosilat, 0,5% ekstrak yeast dan 5-10%
serum anak sapi atau manusia.

Suplemen lain yang

bermanfaat:
1. Ekstrak Yeast
2. Aryptic meat both
3. Susu krim
4. Medium filde

2. MEDIA BUATAN

Media kultur jaringan yang komponen

penyusunnya sudah diketahui dengan pasti

DMEM

Media Formulation

Inorganic ions

Osmotic balance cell volume

Trace Elements

Co-factors for biochemical pathways (Zn, Cu)

Amino Acids

Protein synthesis
Glutamine required at high concentrations

Vitamins

Metabolic co-enzymes for cell replication

Energy sources
glucose

Serum provides the following

Basic nutrients
Hormones and growth factors
Attachment and spreading factors
Binding proteins (albumin, transferring)
carrying hormones, vitamins, minerals,
lipids
Protease inhibitors
pH buffer

Freshney.(1992) Animal Cell Culture.

Media untuk Jaringan Vertebrata

Endoterm
Media diklasifikasikan menjadi 4 kelompok :
1. Esensial untuk pertumbuhan sesaat
2. Esensial untuk memperpanjang
keberhasilan tumbuh
3. Esensial untuk pertumbuhan yang tidak terbatas
4. Esensial untuk fungsi fungsi spesial

Pertimbangan dalam pemilihan bahan media

1. Kelarutan bahan :
Beberapa bahan kimia yang dipakai di dalam media
sintetik harus sebagai sumber yang sangat mudah
larut & sangat penting untuk menyiapkan menjadi
bahan yang mudah larut.
2. Kesesuaian komponen :
Di dalam mengkombinasikan bahan-bahan tertentu,
harus diingat bahwa material yang digunakan
kemungkinan saling bereaksi sehingga
menghasilkan substansi yang sangat berbeda

3. Kemurnian bahan :

Beberapa komponen yang langka dari beberapa media hanya

mungkin dijumpai dalam keadaan murni sekitar 85 %
4. Ketidakstabilan kimiawi :
Berbagai komponen yang ditambahakan ke dalam media
sintetik kadang tidak stabil sehingga pemyimpanan perlu
mendapat perhatian
5. Larutan stok :
Kemungkinan penyimpanan media dalam jumlah besar &
dalam waktu yang lama dapat diatasi dengan membuat media
menjadi serangkaian stok, yang nantinya dapat
dikombinasikan untuk membuat medium yang komplit pada
saat diperlukan

Larutan Garam Balans (Balance Salt Solution = BSS)

Seluruh media yang digunakan di dalam kultur jaringan berbasis
pada suatu campuran sintetik garam garam anorganik
yang disebut larutan garam fisiologik
atau larutan garam balans (BSS)
Fungsi :
a. Menjaga pH
b. Menjaga tekanan osmotik di dalam medium
c. Menyediakan konsentrasi yang mencukupi ion ion anorganik esensial
Larutan garam fisiologik dibagi menjadi 2 tipe :
1. Larutan garam yang diperuntukkan berekuilibrasi dengan
udara
2. Larutan garam yang diperuntukkan berekuilibrasi dengan
fase gas yg mengandung tekanan karbon dioksida (C02)
tinggi (sekitar 5 %)

Penyiapan Larutan Garam Balans

Kesulitan utama :
pencegahan timbulnya
endapan kalsium
magnesium karbonat dan
posfat

Media Kultur untuk sel mamalia

Basal cell culture media:

BME, DMEM, MEM, E199 and Fischer's media

Improved Cell Culture Media:

199 (HB), DMEM (HED) and MEM (HBS)

The Balance Salt Solution:

199 Earle's , Hanks and Dulbeco's

Substituted Natural Media:

SUB-1, SUB-2 and SUB-H

Serum Free Media:

199 SAF CHO and SAF NSO

Low serum Culture Media:

SXQ-1, 199 SLM, 199 SLM-BR and MEM SLM (HB), DMEM (HED)
and MEM (HBS)