UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESCUELA DE BIOQUIMICA

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

INFORME

AISLAMIENTO, SELECCIÓN,
PRODUCCION DE BIOMASA Y
PRESERVACIÓN DE CEPAS
ACIDOLÁCTICAS A PARTIR DE
RESIDUOS DEL CAFETO

Diciembre, 2009
 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA
Carrera Alimentos
Microbiología Industrial
 

GRUPO DE TRABAJO

GRUPO DE TRABAJO

PROFECIONALISTA

Nombre Blanca Estela Bravo

Grado Académico Dr. en Microbiología
Institución Universidad Central del Ecuador
Facultad de Ciencias Químicas
Actividades Directora del proyecto

ESTUDIANTES

Nombre Andagana Edgar

Erazo José Luis
Pilco Christian
Mayra Vasconez
Nivel Académico Estudiantes
Programa Académico Microbiología Industrial
Institución Universidad Central del Ecuador
Facultad de Ciencias Químicas
Actividades Especificas Aislamiento, Selección y Conservación de
Bacterias LAB a partir del Mucilago de Café
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Carrera Alimentos
Microbiología Industrial
 
TEMA:

AISLAMIENTO, SELECCIÓN, PRODUCCION DE BIOMASA Y PRESERVACIÓN

DE CEPAS ACIDOLÁCTICAS A PARTIR DE RESIDUOS DEL CAFETO.

PROBLEMÁTICA
En la industria cafetera por cada kilo de cereza de café el 20% es aprovechado y el 80% son
desechos; de estos el 45% es pulpa, 40% es cascara y 15 % es mucilago, siendo este
desechado por medio de lavado a fuentes acuíferas. El impacto ambiental que produce el
mucilago se debe a que la micro flora que se desarrolla en este consume el oxígeno disuelto del
agua causando asfixia a la flora y fauna de los ríos.1

ANTECEDENTES
En estudios realizados en la Universidad Nacional de Colombia, se aprovecha el mucilago como
materia prima en la producción de acido láctico, mediante una hidrólisis enzimática y fermentación
simultánea de mucílago de café, utilizando una cepa liofilizada de Lactobacillus bulgaricus. 2

Se realizó un estudio en el Departamento de Ingeniería Bioquímica, Universidad del Zulia.

Venezuela, sobre el aprovechamiento del mucilago de café. Como alternativa de procesamiento
se siguió la fermentación anaeróbica. Las condiciones óptimas del ensilaje fueron: 80 % de
humedad, pH: 3.6, ácidos grasos (g/100 g de materia seca); acético = 3.31; propiónico = 0.49; iso-
butírico = no detectado; n-butirico = 0.41; isovalérico: no detectado; valérico: no detectado; y ácido
láctico: 2.56.

En la universidad de Costa Rica Facultad de Agronomía aislaron, seleccionaron y caracterizaron

bacterias acido lácticas en ensilaje de soya, este estudio se fundamenta en la fermentación acido
láctica en condiciones anaeróbicas de la soya a la cual se adiciono melaza por el bajo contenido
de carbohidratos, siendo esta técnica útil en el proceso de ensilaje, selección e identificación de
BAL del mucilago del café.

JUSTIFICACIÓN.
La producción de café en el Ecuador actualmente corresponde a 200.000 sacos de 60 kg por día
generando por cada saco de café 36kg de sustancias de desecho de esto el 15% corresponde a
mucilago. Es importante considerar la contaminación que causan la pulpa y el mucílago,
consumiendo grandes cantidades de agua (2m3 por fanega de café) en el proceso, originando un
impacto ambiental siendo la micro flora que se desarrolla en el mucilago y la pulpa consume el
oxígeno disuelto del agua causando asfixia a la flora y la fauna de los ríos.
Por lo expuesto anteriormente, una alternativa para evitar este impacto ambiental es aplicar
procedimiento biotecnológicos aislando bacterias fermentadoras (acido lácticas) productoras de
acido láctico a partir de los residuos del café, dichos microorganismos pueden ser capaces de
aumentar la concentración y el rendimiento del acido láctico por vía biotecnológica abaratando
costos y dando una posible solución a la problemática ambiental que causa los desechos
orgánicos del café. 3

                                                       
1
 http://www.enziclean.com/articulos/tratamiento_biologico_de_la_pulpa_de_cafe.html 
2
 http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/dyna/article/viewFile/10254/10772
3
 http://www.sica.gov.ec/cadenas/cafe/docs/historia_cafe.html
http://www.cedeco.or.cr/documentos/Caracterizacion%20del%20cafe.pdf 
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OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Aislar, seleccionar, producir biomasa y preservar cepas acido lácticas para la degradación
del mucilago del café.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Recolectar el mucilago de café proveniente de la Finca Don Benito Quevedo para el

posterior aislamiento
2. Tratar químicamente al mucilago de café mediante hidrólisis ácida para la
despolimerización y eliminación de compuestos tóxicos.
3. Seleccionar el medio de cultivo más adecuado para el crecimiento óptimo de las
microorganismos degradadores de mucilago de café.
4. Aislar cepas acido lácticas utilizando el medio de cultivo adecuado.
5. Evaluar y elegir la mejor cepa productora de acido láctico mediante pruebas cinéticas de
crecimiento.
6. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de género y especie con mayor
velocidad de transformación
7. Preservar las cepas puras mediante técnica de criopreservación

MARCO TEÓRICO
4
Mucilago De Café

Composición química (%) del mucílago del fruto del café

Composición mucílago en peso seco

Sustancias pécticas totales 35.8
Azúcares totales medios 45.8
Azúcares reductores 30
Azúcares no reductores 20
Celulosa= cenizas 17%

                                                       
4
Doyle Michael, P.(2001) .Microbiología de los Alimentos Fundamentos y fronteras. Zaragoza. Acribia. (Págs. 684, 685)Belitz H.
D, Grosch W.(1997).Química de Alimentos. Zaragoza. Acribia (págs. 1011-1023)
http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n_l%C3%A1ctica
http://tegra.lasalle.edu.co/dspace/bitstream/10185/1222/1/13961076.pdf
http://www.eis.uva.es/~biopolimeros/alberto/acido_lactico.htm
http://tegra.lasalle.edu.co/dspace/bitstream/10185/1222/1/13961076.pdf
 
 
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Pectinas.-

Estas son abundantes en el reino vegetal, se las puede obtener de las pieles de cítricos, están formadas de
restos de ácido α-D-galacturónico unidos por enlaces 1-4; la cadena posee restos de L ramnosa y
pequeñas cantidades de D- galactanos, L-arabinanos y arabino galactanos.

Pectina

Bacterias ácido lácticas

Las bacterias lácticas son anaerobias facultativas, Gram positivas, ácido tolerantes, sus rangos de pH son
entre 4.8 y 9.6, no forman esporas, son inmóviles, pueden ser cocos o bacilos, y asociados todos por sus
características metabólicas y fisiológicas comunes, generalmente se encuentran en plantas y productos
lácteos en descomposición produciendo ácido láctico como producto metabólico final de la fermentación de
carbohidratos.

Los medios de cultivo para bacterias lácticas incluyen fuentes de carbohidratos, siendo que la mayoría de
estas especies son incapaces de aprovechar la respiración celular.

Géneros principales de las bacterias del ácido láctico.

 
Genero Morfología celular Tipo de fermentación
Lactococcus Cocos en cadenas homo
Leuconostoc Cocos hetero
Pediococcus Cocos homo
Lactobacillus Bacilos homo/hetero
Streptococcus Cocos en cadenas homo

Bacterias ácido lácticas (pectinolíticas).

Por ser el mucilago de café rico en compuestos pécticos, las bacterias aisladas son capaces de
producir pectinasas que les permite degradar las pectinas a compuestos más simples y utilizarlos
como fuente de carbono. Estas bacterias son anaerobias.

CARACTERÍSTICAS
Habitad Superficie del fruto de café, suelo
Grupo trófico Quimioheterótrofos
Subdivisión Osmotrófos
Fuente de carbono y energía Pectina , compuestos pecticos, azúcares
Grupos aceptores de electrones NAD+,ácido pirúvico
Aceptor final de electrones Ácido pirúvico
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Fórmula del bio-proceso

Fermentación Láctica
 
Es un proceso anaeróbico, en el que la glucosa es el sustrato y ácido láctico el producto
final; este proceso lo realizan bacterias acido lácticas, hongos y los tejidos animales.
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Tabla de resultados
Aislamiento de microorganismos.

De un total de 3 muestras se aislaron y purificaron 10 cepas de bacterias acido lácticas.

Se seleccionaron bacterias ácido láctico como las más promisorias, por presentar mayor crecimiento
en el medio mínimo con mucilago de café.

Caja 1

Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + - Blancas,
redondas, Cocos
4.5 38 + + brillosas, 2-3 Positivo Negativo Negativo
mm de ( color azul)
6 38 + + diámetro

Caja 2
Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + - Lechosas
transparentes,
4.5 38 + + opacas,
aspecto Positivo Bacilos
baboso, 2-4 ( color azul) Negativo Negativo
6 38 + + mm, redonda

Caja 3
Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + +
Blancas, redondas, Positivo Bacilos Negativo
4.5 38 + + brillosas, 2-3 mm ( color azul) Positivo
6 38 + + de diámetro

Caja 4
Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + - Negativo Cocos

Blancas, redondas, (color rojo) Positivo Negativo
4.5 38 + + brillosa 1-2 mm
6 38 + +

Caja 5
Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + -
Blancas, redondas, Negativo Bacilos Negativo
4.5 38 + - brillosas, 2-3 mm (color rojo) Positivos
6 38 + + de diámetro
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Caja 6
Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + + Lechosas
transparentes, Positivo Bacilos
4.5 38 + + opacas, aspecto (color azul) Negativos Negativo
baboso, 2-4 mm,
6 38 + + redonda

Caja 7
Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + - Blancas, Negativo Bacilos

Negativo
4.5 38 + + redondas, brillosa (color rojo) Positivos
1-2 mm
6 38 + +

Caja 8
Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + - Blancas,
redondas, 2-3 Positivo Bacilos
4.5 38 + + mm de diámetro, (color azul) negativos Negativo
con depresiones
6 38 + + a los lados

BACTERIAS SELECCIONADAS

Caja 3
Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + + Blancas, redondas, Positivo Bacilos Negativo

4.5 38 + + brillosas, 2-3 mm de ( color azul) Positivo
diámetro
6 38 + +

Caja 6
Crecimiento Reducción de
pH T oC Tubos MORFOLOGIA Tinción Gram Catalasa
Cajas nitratos

3.5 38 + + Lechosas
transparentes, Positivo Bacilos
4.5 38 + + opacas, aspecto (color azul) Negativos Negativo
baboso, 2-4 mm,
6 38 + + redonda

Simbología:
- Crecimiento negativo (No hay turbidez)
+ Crecimiento positivo (turbidez)
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Observaciones

1. El medio base resultó muy óptimo para el aislamiento de las bacterias acido lácticas
(Lactobacillus) ya que en éste medio fue uno de los más turbios a lo largo del bioproceso.

2. El crecimiento en medio liquido, tanto base como selectivo fue una especie de nata de
forma espiralada, que es la que caracteriza al crecimiento de levaduras.

3. Las bacterias acido lácticas sembradas en medio agar MRS desprendían su olor
característico algo parecido la leche cortada.

4. Los residuos del café recolectados, con el paso del tiempo producían gran cantidad de CO2
y alcohol debido a la fermentación, evidencia de que existe bacterias acido lácticas para
aislar y posteriormente seleccionar.
5. Para la conservación de las cepas seleccionadas en el medio elegido (MRS), en bisel
crecieron muy bien a las 24h a una temperatura de 30ºC y se observó gran cantidad de
biomasa

6. Los aislamientos provenientes de los tratamientos seleccionados con las mejores

características sensoriales (olor putrefacto, textura pegajosa) y los valores más bajos de pH y
que además, en sus pruebas microbiológicas correspondieron a bacilos Gram positivos,
catalasa negativa y reducción de nitratos, fueron analizados con más detalle. Estos
tratamientos presentaron una flora microbiana homogénea, con pocos morfotipos de
colonias que presentaban características típicas de BAL.

Conclusiones

1. La selección de cepas se las realizo a partir de tres tipos de ensilado de café de diferentes
sitios de la finca de los cuales se obtuvo 9 cepas, por lo que si se hubiera aumentado el
número de muestras hubiera existido la probabilidad de encontrar cepas con mayor poder
degradatorio de mucilago de café.

2. La turbidez (en el medio selectivo) fue variable a las diferentes concentraciones y no reflejo
su crecimiento en el momento de sembrar en cajas de Petri por el método de estriado.

3. Las cepas seleccionadas para preservar fueron aquellas que crecieron en un pH de 3.5 ya
que fue la condición más extrema que aplicamos a las bacterias acido lácticas aisladas del
mucilago de café.

4. La caracterización de las cepas fue un tanto difícil ya que se necesita pruebas genéticas
para saber la especie de las bacterias acido lácticas.
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Discusiones

1. Los resultados obtenidos en este estudio, podrían ser mejorados optimizando otros
parámetros de operación como la agitación y temperatura del proceso, así como
empleando estrategias de purificación selección, conservación de BAL.

2. La caracterización de las cepas es aproximada, ya que se necesita pruebas

genéticas para saber la especie de las bacterias acido lácticas aisladas del
mucílago de café.

3. No se pudo determinar la cinética de producción de biomasa, ni metabolitos debido

a que no se contó con el tiempo necesario.

4. Debido a que la flora activa en el mucílago de café es muy variada se debe regular
el pH a ácido para evitar el crecimiento de otros microorganismos.

5. Debido a que las pectinas son de difícil metabolismo, obteniendo mayor producción
de ácido láctico

6. Para optimizar la producción de ácido láctico con las cepas seleccionadas del
mucílago de café, en un bioreactor, se requiere una hidrólisis enzimática, para
disminuir el tiempo de fermentación y aumentar la producción del metabolito.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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BIBLIOGRAFIA:

1. http://www.enziclean.com/articulos/tratamiento_biologico_de_la_pulpa_de_cafe.

2. http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/dyna/article/viewFile/10254/10772

3. http://www.sica.gov.ec/cadenas/cafe/docs/historia_cafe.html

4. http://www.cedeco.or.cr/documentos/Caracterizacion%20del%20cafe.pdf

5. http://www.mideplan.go.cr/sinades/PUBLICACIONES/cambioactitud/Articulo%20Ca
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6. http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/724/72450109.pdf

7. http://www.invdes.com.mx/anteriores/Febrero2002/htm/cafe.html

8. http://www.eis.uva.es/~biopolimeros/alberto/acido_lactico.htm

9. http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S079872692009000200
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10. http://www.ugr.es/~ri/anteriores/dial03/d28-3.htm

11. http://www.radiolaprimerisima.com/noticias/resumen/39032

12. http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-pdf/BACTERIAS-LACTICAS.pdf

13. Agrinter, Agris. Utilización de Subproductos del Café en la alimentación animal y

otras aplicaciones agrícolas e Industriales. Biblioteca Orton IICA/CATIE. Turrialba
Costa Rica 1974, paginas 16 – 17

14. http://www.olade.org.ec/biocombustibles/Documents/ponencias/ponencias%2pdf/S
esion%204%2 0%20Nelson_Rodriguez%20%20Colombia.pdf