CONTEO DE CLULAS EN EL HEMOCITMETRO

William Andrs Olalla Chicaiza

Laboratorio de Microbiologa de los Alimentos I, Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos,
Universidad Tcnica de Ambato
Resumen
El objetivo de esta prctica fue conocer el uso adecuado del hemocitmetro, con el cual se pudo
realizar el conteo de clulas de levadura Saccharomyces cerevisiae, un hemocitmetro est
constituido un portaobjetos que posee una retcula, su construccin permite conocer el volumen de
cualquier lquido colocado sobre l y por debajo de su cubreobjetos. La retcula se encuentra
compuesta por nueve cuadros de 1 mm cada uno. Los cuatro cuadros de 1 mm localizados en cada
esquina poseen a su vez 16 cuadros internos, cada uno con 0.0625 mm de superficie. El cuadro
central, se encuentra compuesto por 25 cuadros de 0.04 mm 2.
Al finalizar el conteo de las clulas, se obtuvo la concentracin de las diferentes soluciones
utilizadas, una concentracin de 4,69 x 10 cel/ml para la primera muestra, 3,94 x 10 6 cel/ml en la
segunda y 4.55 x 10

cel/ml en la tercera muestra, el anlisis de los resultados indican que las

soluciones se encontraban en diferentes factores de dilucin de la muestra Saccharomyces

cerevisiae.
Introduccin
El conteo celular es un paso necesario cuando se efectan siembras o subcultivos celulares o cuando
se preparan experimentos para ensayos basados en clulas. Los conteos celulares pueden ser usados
principalmente en: monitoreo de la salud de los cultivos, monitoreo de los niveles de proliferacin,
es importante que los conteos celulares sean precisos, consistentes y rpidos, en particular cuando
se monitorean las respuestas celulares cuantitativas, (Doyle, 1997).
Los hemocitmetros estn hechos de un vidrio ptico especial en los que se cargan suspensiones
celulares en volmenes especificados y se efectan los conteos bajo un microscopio ptico.
Phillips, 1973, se refiere que la cmara Neubauer para el recuento de levadura consiste en la
observacin al microscopio de volmenes muy pequeos de suspensiones de clulas. Se usan unos
portaobjetos especiales, la cual est diseada de manera de contener una cantidad fija de suspensin
celular lquida. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada

uno de ellos est, a su vez, dividido en 16 cuadrados. Se coloca un cubreobjetos sobre la zona
cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales de manera que cuando hay un buen contacto
entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cmara. Esto determina que el
lquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3
Aun cuando la hemocitometra es de bajo costo, los mltiples pasos que hay que seguir para
completar un conteo celular son tediosos y adems pueden dar como resultado conteos imprecisos.
Segn Daz, R., 1999., la levadura es una fuente de distintos nutrientes que adems de tener un gran
valor nutritivo tambin tienen una importante funcin biolgica. La levadura es el producto natural
con el contenido ms alto en cidos ribonucleicos y nucletidos. La levadura de cerveza en un
ingrediente ampliamente reconocido por sus caractersticas organolpticas, mejorando la
palatabilidad de los piensos. Saccharomyces cerevisiae es una levadura, un hongo unicelular, del
grupo de los ascomicetos. Este grupo incluye a ms de 60.000 especies, entre ellas las trufas o el
Penicillium, el hongo que produce la penicilina.
El objetivo de la prctica estn en establecer que el conteo celular es muy necesario en el
Laboratorio de Microbiologa, es utilizado para la caracterizacin de lneas celulares, con lo que se
puede establecer condiciones reproducibles del cultivo, la consistencia de cultivos primarios. Dicho
conteo se lo realiza en un instrumento denominado hemocitmetro,

Material y mtodos
El conocimiento previo sobre el uso del hemocitmetro nos ayudar a comprender mejor como se
realiza el conteo de las clulas. En el hemocitmetro se coloca una gota de la solucin muestra de
clulas de la levadura Saccharomyces cerevisiae en el portaobjetos y se coloca el cubreobjetos
evitando la formacin de burbujas, el proceso antes mencionado fue realizado dentro de la cmara
de flujo laminar (Streamline, Singapur). El hemocitmetro con la muestra problema se llev al
microscopio (Olimpus, Japon), en donde se proceder al conteo del nmero de clulas, para una
mejor apreciacin se debe enfocar con el lente de 40X. Se realiza el conteo de las clulas que se
encuentran en la diagonal principal del hemocitmetro de izquierda a derecha y de arriba hacia

abajo. Los datos del primer cuadrante de la esquina superior e inferior se estiman en promedios, as
tambin los datos del cuadro intermedio.

Resultados
Tabla 1. Datos del conteo de clulas Saccharomyces cerevisiae, en Hemocitmetro.
MUESTRA 1
Cuadrantes 4x4
307
295
299
289
284
285
280
287
Promedio
290,75

MUESTRA 2

Cuadrante 5x5 Cuadrantes 4x4

190
29
188
39
192
27
188
35
191
18
16
15
10
Promedio
Promedio
189,8
23,625

CLULAS/ml
46520000

MUESTRA 3

Cuadrante 5x5 Cuadrantes 4x4

Cuadrante 5x5
32
4
4
13
3
2
15
2
0
5
3
0
17
1
3
4
2
4
Promedio
Promedio
Promedio
16,4
2,875
1,8
CLULAS/ml

CLULAS/ml
47450000

3780000

4100000 460000

CONCENTRACIN
4,699x10

Clulas/ml
3,940x10

FINAL
4,550x10

Elaborado por: Olalla, A., (2015)

Fuente: Laboratorio de Microbiologa, FCIAL, UTA

En la Tabla 1. , se puede observar los datos acerca del conteo de clulas, estos corresponden a los
cuadros pequeos de las diagonales principales que forman el cuadrante del hemocitmetro, con
estos datos se calcul las concentraciones finales de clulas de la levadura Saccharomyces
cerevisiae en las diferentes disoluciones, teniendo que estas fueron elaboradas a distintos factores
de dilucin.
Discusin

450000

Durante el desarrollo de la prctica se realiz el conteo de clulas utilizando el hemocitmetro, con

los datos se puede determinar la concentracin de las distintas disoluciones, en este caso se
determin de todas tenan un factor de dilucin diferente, esto se debe a que las concentraciones en
nmero de clulas por mililitro (cel/ml) disminua. Tabla 1.
Una de las facilidades que tiene este mtodo de conteo utilizando el hemocitmetro es que la
preparacin de la placa es relativamente fcil, se coloca la gota de muestra en la retcula y luego el
cubreobjetos evitando que se formen burbujas para posteriormente ser observada al microscopio.
La forma de conteo es desde el centro de cada cuadrante que conforma la diagonal principal, tanto
los cuadrantes de 4 mm x 4 mm como del cuadrante central de 5 mm x 5 mm y si existen clulas
que rodean a los bordes de los cuadros se debe realizar el conteo en dos de los cuatro lados del
cuadrante. Como las dimensiones de todos los cuadrantes son conocidas se calcula el volumen que
posee cada uno de los cuadrantes, estos datos nos ayudarn a encontrar la concentracin final de
cada disolucin.
Se debe tener en cuenta que es necesario el correcto conteo de cada seccin del hemocitmetro, el
nmero de clulas presentes est directamente relacionado con la concentracin de la disolucin, en
el campo laboral conocer los valores de concentracin en diferentes muestras como en la industria
cervecera, harinera, etc., nos ayuda a evaluar a calidad de distintos productos, ya que algunos
productos alimenticios dependen directamente de la cantidad de microorganismos presentes como
en este caso utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae, su alta o mnima concentracin
puede repercutir en la calidad de una cerveza.
Para una mejor visualizacin de las clulas de la levadura Saccharomyces cerevisiae, y por lo tanto
obtener un conteo adecuado, se recomendara la utilizacin de algn mtodo de tincin, pero el
hemocitmetro al tener contacto con algn colorante afectara su uso.

Conclusiones
Finalizado el conteo celular utilizando el hemocitmetro, se obtuvo que las muestras analizadas se
encontraban elaboradas con diferentes factores de dilucin, el nmero de clulas por recuadro era
mayor en la primera muestra que en las otras placas, finalmente en el clculo de las concentraciones
se apreci de mejor manera los diferentes factores de dilucin que tenan y cada una de sus

concentraciones, en este caso la muestra 1, tena la concentracin ms elevada con 4,699x10

clulas/ml. Tabla 1.
Se aprendi que el conteo correcto de clulas en un hemocitmetro debe realizarse en los cuadros
que conforman las diagonales principales de los cuadrantes de 4 mm x 4 mm y 5 mm x 5 mm,
logrando as obtener 3 valores diferentes, estos sern promediados e indicaran la concentracin
estimada de cada solucin, se debe tener en cuenta que al encontrarse clulas entre los bordes de los
lados del cuadrante se deben contar las clulas encontradas en los bordes en dos de los cuatro lados
que forman dicho cuadrante.

Bibliografa
Phillips, H.J.,(1973) "Dye exclusion tests for cell viability." Chapter 3, Tissue Culture: Methods and
Applications ed. by Kruse, P.F., Jr.and Patterson, M.J., Jr., pp. 406-408.
Tortora, F. (2007). Introduccin a la Microbiologa.

4 Ed. Argentina, Editorial Mdica

Panamericana. pp. 35.

Ingraham, I (1998). Microbiologa. 7 Ed. Espaa: Editorial Revert, pp. 53 58
Prescott, L. (2000), Microbiologa. Argentina. 4 edicin. McGraw-Hill Interamericana, pp. 325
Doyle, M. (1997). Microbiologa de los alimentos. Fundamentos y experimentacin. 6 Ed. ASM,
Washington, p 101.
Mossel, D. (2003). Microbiologa de los Alimentos. 2 ed. Acribia, Zaragoza, p 506, 636.
Daz, R. (1999). Manual prctico de los Microbiologa. 2 edicin. Barcelona. Masson, S.A., pp.
124
Walker, T. (2000) Microbiologa. 4 Ed. Argentina: McGraw-Hill Interamericana, pp. 45
Bernis M. (1997). Atlas temtico de Microbiologa. Idea Books, S.A., Barcelona, Espaa, pp.34
Marquez, D. (2003). Microbiologa de los Alimentos. 2 ed. Acribia, Zaragoza, pp. 506, 636.
Madigan, T., (2009), Brock, Biologa de los Microorganismos, Morfologa y tamao de procariotas,
Pearson Education, pp. 64-70