You are on page 1of 36

BAB I

PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus,
mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan
berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNAmitokondria dan kloroplas
berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.Selain itu DNA mitokondria
dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskansifat-sifat yang berasal dari garis
ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisansifat dari kedua orangtua. Dilihat dari
organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular,
sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponenkomponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuahsel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruhsistem
kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimilikisuatu
organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada
manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah.Komponen darah
yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimanaterdapat DNA
didalamnya.
1.2 TUJUAN

Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR


Untuk mengetahui uji kualitas DNA

Untuk mengetahui komponen dan tahapan PCR

Untuk mengetahui manfaat PCR

1.3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 PENGERTIAN ISOLASI DNA DAN PCR
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung
(Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).
Definisi PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode pemeriksaan yang prinsip
kerjanya memperbanyak (amplification) DNA invitro secara enzimatis.Teknik PCR telah

dikembangan untuk diagnosis berbagai penyakit infeksi,seperti Hepatitis, HIV, Human


Papillomavirus, dan untuk mendeteksi M. Tuberculosis.
2.2 UJI KUALITAS DNA
Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan
DNA yang berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian dilakukan dengan uji kualitatif
DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan untuk mengetahui
keberadaan DNA dalam larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA
dengan metode spekrofotometri.
Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu
senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya.
Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar
dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur
intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi, 2009).
Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain :
1. Spektrofotometri Vis (Visible)
Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak
(visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata
manusia. Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua
cahaya yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun
selama ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak
(visible).
Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten.
Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W
dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 C) dibanding logam
lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.Alat ini bekerja
berdasarkan hukum Lambert-beer.Jumlah radiasi yang diserap proporsional dengan
ketebalan sel (b), konsentrasi analit (c), dan koefisien absorptivitas molekuler (a) dari suatu
spesi (senyawa) pada suatu panjang gelombangLogika prinsip dari alat spektro-vis adalah
intensitas warna dari suatu larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang diserap. Semakin
pekat warna, semakin banyak cahaya yang diserap.Sample yang dapat dianalisa dengan
metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari
metode spektrofotometri visible.
Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna
dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent
yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa.
Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil (Riyadi,
2009).
Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh reagen pembentuk warna (chromogenik
reagent) :

1. Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu


beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh sebab
itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis.
2. Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.
3. Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik.
4. Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan pengukuran.
5. Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga
warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja.
6. Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan yang
dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk
atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehendaki tidak
sempurna.
7. Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang dikehendaki
dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai.
Setelah ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan tersebut harus memiliki
lima sifat di bawah ini :
1. Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi dengan
teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan (fading), disebabkan
oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman, suhu dan jenis
pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi larutan dapat diperoleh kestabilan
yang lebih baik.
2. Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi (warna
harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya () besar. Hal ini dapat dikontrol
dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang memiliki
kepekaan yang cukup tinggi.
3. Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil kecil
dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain.
4. Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai.
5. Sistem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer.(Wanibesak, E. 2011)
Gb 1. Spektrofotometer Visible tipe spectronic-20 lama yang sudah jarang bahkan mungkin
tidak diproduksi lagi
Gb 2. Spektrofotometer Visible tipe Spectronic-20 terbaru.
Untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut :
[DNA] = 260 x 50 x Faktor pengenceran

Keterangan :
260 = nilai absorbansi pada 260 nm
50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml
(dsDNA)
[RNA] = 260 x 40 x Faktor pengenceran
Keterangan :
40= 40 ug/ml untai tunggal RNA (ssRNA) (Fatchiyah, 2011).
2. Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet Visible)
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV
memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata
kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak
memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu
dibuatberwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung
dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat
jernih dengan filtrasi atau centrifugasi.
Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada
partikel koloid apalagi suspensi.Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda,
sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih
sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode
yang dilengkapi dengan monokromator Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling
banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat
digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna (Riyadi, 2011).
DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita
ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau
phenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya
UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm
dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara
1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011). Jika nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung
kontaminan dari protein membran / senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang
didapat belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddH2O yang diambil terlalu banyak
sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit (Larasati, 2011).
Alat yang digunakan dalam uji ini dengan metode spektrofotometri UV-Vis antara lain :
mikropipet, kuvet, nanodrop spektrofotometer dan seperangkat komputer. Bahan yang
digunakan adalah isolat DNA dan aquadest sebagai blanko. Cara kerja pengujian kuantitatif
DNA diawali dengan menghidukan alat nanodrop spektrofotometer. Kemudian melakukan uji
blanko menggunakan aquadest. Setelah itu dilanjutkan dengan menguji isolat DNA dengan
cara meneteskannya pada tempat sampel sebanyak 1 mikroliter. Kemudian mengukur
kemurnian DNA dan baca hasil kemurnian DNA-nya.
Gb. Nanodrop Spektrofotometer

2.3 KOMPONEN DAN TAHAPAN PCR


Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA; sepasang
primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang
komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide
triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA. Proses
PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA
templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer
(extension) dan (5) pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan
tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA. Tahapan
proses PCR dapat dilihat pada gambar 1.
PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada
setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat
(unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga
mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers)
pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang
primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer
yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 40 siklus. Target DNA yang
diinginkan (short target product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus
keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier seperti tampak
pada bagan di atas (Newton and Graham, 1994).
Jumlah kopi fragmen DNA target (amplicon) yang dihasilkan pada akhir siklus PCR dapat
dihitung secara teoritis menurut rumus:
Gambar 1. Bagan Proses Polymerase Chain Reaction
Y = (2n 2n)X
Y : jumlah amplicon
n : jumlah siklus
X : jumlah molekul DNA templat semula
Jika X = 1 dan jumlah siklus yang digunakan adalah 30, maka jumlah amplicon yang
diperoleh pada akhir proses PCR adalah 1.074 x 109. Dari fenomena ini dapat terlihat bahwa
dengan menggunakan teknik PCR dimungkinkan untuk mendapatkan fragmen DNA yang
diinginkan (amplicon) secara eksponensial dalam waktu relatif singkat. Umumnya jumlah
siklus yang digunakan pada proses PCR adalah 30 siklus. Penggunaan jumlah siklus lebih
dari 30 siklus tidak akan meningkatkan jumlah amplicon secara bermakna dan
memungkinkan peningkatan jumlah produk yang non-target. Perlu diingat bahwa di dalam
proses PCR effisiensi amplifikasi tidak terjadi 100 %, hal ini disebabkan oleh target templat
terlampau banyak, jumlah polimerase DNA terbatas dan kemungkinan terjadinya reannealing
untai target.
PELAKSANAAN PCR

Untuk melakukan proses PCR diperlukan komponen-komponen seperti yang telah disebutkan
di atas. Pada bagian ini akan dijelaskan secara rinci kegunaan dari masing-masing komponen
tersebut.
1. Templat DNA
Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan
molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa 2 1 Prinsip Umum dan
Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA kromosom, DNA plasmid ataupun
fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target
yang dituju. Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan
menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau
DNA plasmid dengan menggunakan metode standar yang ada. Pemilihan metode yang
digunakan di dalam penyiapan DNA templat tergantung dari tujuan eksperimen.
Pembuatan DNA templat dengan menggunakan metode lisis dapat digunakan secara umum,
dan metode ini merupakan cara yang cepat dan sederhana untuk pendedahan DNA kromosom
ataupun DNA plasmid. Prinsip metode lisis adalah perusakan dinding sel tanpa harus
merusak DNA yang diinginkan. Oleh karena itu perusakan dinding sel umumnya dilakukan
dengan cara memecahkan dinding sel menggunakan buffer lisis. Komposisi buffer lisis yang
digunakan tergantung dari jenis sampel. Beberapa contoh buffer lisis yang biasa digunakan
mempunyai komposisi sebagai berikut: 5 mM Tris-Cl pH8,5; 0,1 mM EDTA pH 8,5; 0,5 %
Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar). Buffer lisis ini
umumnya digunakan untuk jenis sampel yang berasal dari biakan, sel-sel epitel dan sel akar
rambut.
Contoh lain dari buffer lisis adalah buffer lisis K yang mempunyai komposisi sebagai berikut:
buffer PCR (50mM KCl, 10-20mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl2); 0,5 % Tween-20 dan 100
ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar). Buffer lisis K ini biasanya
digunakan untuk melisis sampel yang berasal dari sel darah dan virus. Selain dengan cara
lisis, penyiapan DNA templat dapat dilakukan dengan cara mengisolasi DNA kromosom
ataupun DNA plasmid menurut metode standar yang tergantung dari jenis sampel asal DNA
tersebut diisolasi.
Metode isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid memerlukan tahapan yang lebih
kompleks dibandingkan dengan penyiapan DNA dengan menggunakan metode lisis. Prinsip
isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid adalah pemecahan dinding sel, yang diikuti
dengan pemisahan DNA kromosom / DNA plamid dari komponen-komponen lain. Dengan
demikian akan diperoleh kualitas DNA yang lebih baik dan murni.
2. Primer
Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan. Di dalam
proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi
dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses
eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah
diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa
didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju
belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari
urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang

terdekat. Dalam melakukan perancangan primer harus dipenuhi kriteria-kriteria sebagai


berikut:
a. Panjang primer
Di dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang akan dipilih. Umumnya
panjang primer berkisar antara 18 30 basa. Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan
menjadikan spesifisitas primer rendah. Untuk ukuran primer yang pendek kemungkinan
terjadinya mispriming (penempelan primer di tempat lain yang tidak diinginkan) tinggi, ini
akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan
berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR. Sedangkan untuk panjang primer lebih
dari 30 basa tidak akan meningkatkan spesifisitas primer secara bermakna dan ini akan
menyebabkan lebih mahal.
b. Komposisi primer.
Dalam merancang suatu primer perlu diperhatikan komposisinya. Rentetan nukleotida yang
sama perlu dihindari, hal ini dapat menurunkan spesifisitas primer yang dapat memungkinkan
terjadinya mispriming di tempat lain. Kandungan (G+C)) (% jumlah G dan C) sebaiknya
sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Sebab primer dengan % (G+C)
rendah diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada
tempat yang dituju dengan demikian akan menurunkan efisiensi proses PCR. Selain itu,
urutan nukleotitda pada ujung 3 sebaiknya G atau C. Nukleotida A atau T lebih toleran
terhadap mismatch dari pada G atau C, dengan demikian akan dapat menurunkan spesifisitas
primer.
c. Melting temperature (Tm)
Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda DNA terpisah.
Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer akan berpengaruh sekali di
dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Tm berkaitan dengan komposisi primer dan
panjang primer. Secara teoritis Tm primer dapat dihitung dengan menggunakan rumus
[2(A+T) + 4(C+G)]. Sebaiknya Tm primer berkisar antara 50 65 oC.
d. Interaksi primer-prime
Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology harus dihindari. Demikian
juga dengan terjadinya mispriming pada daerah lain yang tidak dikehendaki, ini semua dapat
menyebabkan spesifisitas primer menjadi rendah dan di samping itu konsentrasi primer yang
digunakan menjadi berkurang selama proses karena terjadinya mispriming. Keadaan ini akan
berpengaruh pada efisiensi proses PCR.
3. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)
dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP
(deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat).
Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam
proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus OH pada ujung 3 dari primer
membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal
dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan.

4. Buffer PCR dan MgCl2


Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk
melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin
pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari
berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas
DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan
templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara).
Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses.
Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi
disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah
dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan.
5. Enzim Polimerase DNA
Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada
proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang
digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena
itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95 oC. Aktivitas polimerase DNA
bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi . Sebagai contoh adalah
enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas
spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari
bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer
PCR yang dipakai.
Dengan menggunakan teknik PCR, panjang fragmen DNA yang dapat diamplifikasi
mencapai 35 kilo basa. Amplifikasi fragmen DNA pendek (kurang dari tiga kilo basa) relatif
lebih mudah dilakukan. Untuk mengamplifikasi fragmen DNA panjang (lebih besar dari tiga
kilo basa) memerlukan beberapa kondisi khusus, di antaranya adalah diperlukan polimerase
DNA dengan aktivitas yang kuat dan juga buffer PCR dengan pH dan kapasitas tinggi (Highsalt buffer).
OPTIMASI PCR
Untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal perlu dilakukan optimasi proses PCR. Secara
umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang
digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor
seperti jenis polimerase DNA; suhu; konsentrasi, dalam hal ini berkaitan dengan dNTPs,
MgCl2 dan DNA polimerase; buffer PCR dan waktu.
1. Jenis polimerase DNA
Kemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses PCR yang terjadi pada tahap
ekstensi untuk DNA rantai panjang akan berbeda dengan untuk DNA rantai pendek.
Penggunaan jenis DNA polimerase tergantung pada panjang DNA target yang akan
diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari tiga kilobasa akan memerlukan
jenis polimerase dengan aktivitas tinggi.
2. Konsentrasi dNTPs, MgCl2; polimerase DNA

Konsentrasi optimal dNTPs ditentukan oleh panjang target DNA yang diamplifikasi. Untuk
panjang target DNA kurang dari satu kilobasa biasanya digunakan konsentrasi dNTPs
sebanyak 100 uM, sedangkan untuk panjang target DNA lebih besar dari satu kilobasa
diperlukan konsentrasi dNTPs sebanyak 200 uM.
Umumnya konsentrasi optimal MgCl2 berkisar antara 1,0 1,5 mM. Konsentrasi MgCl2
yang terlalu rendah akan menurunkan perolehan PCR. Sedangkan konsentrasi yang terlalu
tinggi akan menyebabkan akumulasi produk non target yang disebabkan oleh terjadinya
mispriming. Jumlah polimerase DNA yang digunakan tergantung pada panjang fragmen DNA
yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua kilobasa diperlukan
1,25 2 unit per 50 uL campuran reaksi, sedangkan untuk panjang fragmen DNA lebih besar
dari dua kilobasa diperlukan 3 unit per 50 uL campuran reaksi.
3. Suhu
Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor
yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Dalam hal ini suhu berkaitan dengan proses
denaturasi DNA templat, annealing dan ekstensi primer. Suhu denaturasi DNA templat
berkisar antara 93 95oC, ini semua tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan
dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan
menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu
juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan
proses denaturasi DNA templat tidak sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang
digunakan adalah 94oC. Secara umum suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37
60oC.
Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk proses PCR.
Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm 5)oC sampai dengan (Tm
+ 5)oC. Dalam menentukan suhu annealing yang digunakan perlu diperhatikan adanya
mispriming pada daerah target dan nontarget, dan keberhasilan suatu proses PCR akan
ditentukan oleh eksperimen. Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada
suhu 72oC karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa
digunakan untuk proses PCR.
4. Buffer PCR
Buffer PCR yang digunakan berkaitan dengan pH dan kapasitas buffer nya. Dalam
perdagangan ada dua jenis buffer PCR yaitu Low-salt buffer (pH 8,75 dan kapasitas buffer
rendah) dan High-salt buffer (pH 9,2 dan kapasitas buffer tinggi). Umumnya buffer PCR
tersedia sesuai dengan jenis polimerase DNA nya. Penggunaan jenis buffer ini tergantung
pada DNA target yang akan diamplifikasi. Untuk panjang DNA target antara 0 5 kilobasa
biasanya diperlukan low-salt buffer sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari
lima kilobasa digunakan high-salt buffer.
5. Waktu
Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat,
annealing dan ekstensi primer. Untuk denaturasi DNA templat umumnya dilakukan selama
30 90 detik, ini semua tergantung pada DNA templat yang digunakan. Waktu denaturasi
yang terlalu lama akan merusak templat DNA dan sekaligus dapat menurunkan aktivitas

polimerase DNA. Sedangkan waktu denaturasi yang terlalu pendek akan menyebabkan
proses denaturasi tidak sempurna.
Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan panjang primer. Untuk panjang
primer 18 22 basa cukup dengan 30 detik, sedangkan untuk panjang primer lebih besar dari
22 basa diperlukan waktu annealing 60 detik.
Pemilihan waktu ekstensi primer tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan
diamplifikasi. Secara umum untuk mengamplifikasi setiap satu kilo basa DNA diperlukan
waktu 30 60 detik. Pada setiap melakukan PCR harus dilakukan juga kontrol positif, ini
diperlukan untuk memudahkan pemecahan masalah apabila terjadi hal yang tidak diinginkan.
Selain itu juga harus dilakukan terhadap kontrol negatif untuk menghindari kesalahan positif
semu.
BAB III
METODOLOGI
1.1 ALAT, BAHAN, DAN FUNGSI
1.1.1 Alat

Mortar & pestle


gelas ukur

: untuk menghaluskan bahan


: untuk mengukur larutan yang akan digunakan

Tabung eppendorf

tissue

: untuk membersihkan

gunting

: untuk menggunting bahan yang akan digunakan

mikropipet

spatula

erlenmeyer

: tabung untuk wadah bahan yang diuji

microwave

: sebagai alat untuk pensterilan

mesin vortex

timbangan analitik : sebagai alat untuk menimbang bahan

stirer

: sebagai alat untuk mencampurkan bahan

pH meter

: untuk mengukur pH

mesin centrifuge : untuk mengetahui perbedaan lapisan antara supernatan dan


lapisan lainnya

autoclave

: untuk pensterilan bahan

freezer

: untuk penginkubasian larutan

: sebagai tempat untuk bahan yg diuji

: untuk mengambil larutan dalam jumlah yang kecil


: sebagai alat untuk mencampur bahan

: sebagai alat untuk menghomogenkan bahan

Bahan

Buffer ekstraksi CTAB dan Merkaptoethanol : untuk melisis membran sel daun
nitrogen cair
: untuk mempermudah penggerusan

PVP (polyvinilpirolidone)

CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol) : untuk mendegradasi protein

buffer pencuci

buffer TE

RNAse

: sebagai enzim dalam isolasi DNA

Isopropanol

: untuk resipitasi

Daun srikaya

: sebagai bahan yang diuji

: untuk melindungi agar DNA tidak rusak

: sebagai larutan penyangga

1.2 CARA KERJA

+ buffer ekstrasi

timbang sample 0,3

CTAB (1 ml)

gr + PVP 1 % + N2 -196 C
+ mercaptoetanol 5 l
+ inkubasi 30 65 C
+ chisam 500 l
Di vortex
sentrifuge 10000 rpm 10
Ambil supernatan
+ chisam 1 x volume supernatan

Sentrifuge 10000 rpm 10


+ isopropanol 0,45 x
volume supernatan
invert
Inkubasi freezer 30

Sentrifuge 10000 rpm 10


Buang isopropanol
DNA pellet
+ buffer pencuci 200 l 2x
+ RNAse 1 l
+ resuspensi dengan elution buffer 20-50 l
Simpan untuk elektroforesis
1.3 ANALISA PERLAKUAN
Pada praktikum isolasi DNA ini bahan yang digunakan adalah daun srikaya. Langkah
pertama yang dilakukan adalah mengisi tabung eppendorf dengan 1 ml buffer ekstraksi
CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M dan Tris -HCl 0,1M) dan 5 l
mercaptoethanol. Daun srikaya ditimbang 0,3 gram dan digerus dalam mortar dengan
bantuan nitrogen cair dan ditambah PVP 1%, kemudian dimasukkan kedalam tabung
eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 l mercaptoethanol. Setelah
itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65 oC
selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10 menit. Kemudian ditambahkan 500 l chisam
(Chloroform : Isoamylalcohol (24:1)). Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen.
Ekstrak daun kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Dan
diambil supernatannya. Supernatan dimasukkan pada mikrovivet baru dan ditambahkan
chisam 1 x volume supernatan. Larutan supernatan dan chisam disentrifuge selama 10 menit
dengan kecepatan 10000 rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol 0,45
x volume supernatan. Larutan tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang
putih dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Setelah diinkubasi,
larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm setelah itu supernatan
dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA pellet tidak ikut terbuang. Endapan DNA pellet
dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 200 l buffer pencuci ke dalam
tube, kemudian cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu endapan DNA
pellet dikering anginkan. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan 20-50 l buffer TE
lalu ditambah 1 l RNAse dan disimpan dalam lemari es untuk elektroforesis.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1.ANALISA GAMBAR HASIL ELEKTROFORESIS
Gambar Hasil Elektroforesis Warna
Gambar Hasil Elektroforesis Hitam Putih
Dari hasil praktikum mengenai isolasi DNA halus, didapatkan gambar seperti diatas dapat
diketahui bahwa penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat adanya potongan pita-pita DNA
yang mempunyai fragmen-fragmen. Pada daun srikaya dapat diketahui bahwa salah satunya

potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna karena pengaruh
konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA bermigrasi, sehingga fragmen-fragmennya
lebih besar.
Dari setiap bahan yang dilakukan untuk praktikum ini tidak semua akan muncul pita DNA
saat dielektroforesis. Hal ini dikarenakan kurang efektifnya perlakuan saat praktikum dan
kesterilan alat dan bahan praktikum. Hal ini menyebabkan tidak munculnya pita DNA saat
dielektroforesis dibawah lampu UV.
Pada elektroforesis tersebut terdapat bermacam-macam kontaminasi, diantaranya smear
(semburan) yang diakibatkan karena adanya kontaminasi protein dan DNA terdegradasi,
berapi-api yang disebabkan karena adanya kontaminasi polisakarida, dan pita tebal dibawah
bagian bawah gel agarose yang disebabkan karena adanya kontaminasi RNA. (Asris, 2010)
Dari gambar hasil elektroforesis ini dapat diketahui bahwa adanya kontaminasi polisakarida
dengan ditunjukkan adanya gambar berapi-api diatas pita DNA yang sangat tebal.

4.2.KESIMPULAN
Dari praktikum isolasi DNA ini dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA bertujuan untuk
memisahkan DNA dari sel dan kotoran. Dari hasil sentrifuge pertama dihasilkan 3 lapisan
yaitu lapisan supernatan, lapisan organik, dan lapisan fenol. Dan pada sentrifuge kedua
dihasilkan 2 lapisan, yaitu lapisan DNA pellet dan lapisan supernatan. DNA pellet ini lah
yang nantinya akan diuji kualitas DNAnya yang sering disebut dengan elektroforesis.
4.3.SARAN
Hasil elektroforesis belum dijelaskan oleh asisten mengenai gambar dan cara analisisnya,
untuk lebih jelasnya mohon dijelaskan lagi.
DAFTAR PUSTAKA
Asris. 2010. Isolasi DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id/ 2010/06/19/isolasi-dna/. Diakses
tanggal 25 November 2012
Fatchiyah, 2011. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman
Dengan Metode RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya, Malang.
Larasati, P. 2011. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas.
http://puspalarasati.wordpress.com. Diakses tanggal 2 Desember 2012.
Riyadi, W. 2009. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis, UV dan IR).
http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 23 September 2011.
Riyadi, W. 2009. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. http://wahyuriyadi.blogspot.com.
Diakses tanggal 23 September 2011.

Wanibesak, E. 2011. Spektrofotometri Sinar tampak (Visible).


http://wanibesak.wordpress.com. Diakses tanggal 22 September 2011.

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang


Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam
makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk
hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan
membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional
dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004).
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus,
mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan
berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas
berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria
dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis
ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari
organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular,
sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Kirsman, 2010).
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsipisolasi DNA yaitu
dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untukmemisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di
bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil
sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian
atas dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012).

I.2 Tujuan Percobaan


Adapun tujuan yang akan dicapai pada percobaan isolasi DNA ini yaitu untuk
mengetahui cara memisahkan (mengisolasi) DNA dari 2 jenis buah yang dijadikan sebagai
sampel, serta untuk mengetahui keaktifan detergen dalam proses isolasi DNA pada sampel
buah.

I.3 Waktu dan Tempat Percobaan


Percobaan ini dilaksanakan pada hari Kamis, 13 Maret 2014, pukul 14.00 17.30
WITA. Percobaan ini bertempat di Laboratorium Biologi Dasar, Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hsanuddin, Makassar.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis)
biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis
untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).
Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada
nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari
90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan
kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel

sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA
(Elrod, 2007).
Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan
mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein
berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam
nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).
Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik
pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman
dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel
eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA
tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA
merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah
yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert, 1994).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara
sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran
inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang
digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau
penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan
dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk
melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel,
pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat
dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat
memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan
polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi
DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda,
dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut
di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit
(Kirsman, 2010).
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel,
melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada
membrane membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat
terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga
dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).
Prinsip prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :
1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. pemecahan dinding sel.

3. pemecahan membran sel.


4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.
Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan
atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan
jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan
menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender.
Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur
utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen
dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi
inti sel (DNA) bisa keluar (Tohib, 2012).
Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan
menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak
melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan
melayang-layang di permukaan (Tohib, 2012).
CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat
mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel
dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar
termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman,
penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi
senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi
fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari
senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan
pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang
kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012).
Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan
komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA.
Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi
presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini
bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir
dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk
melarutkan DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE
mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa
pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas
berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA
yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan
karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA,
dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di
bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).
Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan
kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila
dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan
metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada
ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah
adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama
waktu penyimpanan (Asris, 2010).

BAB III
METODE PERCOBAAN

III.1 Alat dan Bahan


III.1.1 Alat
Alat alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah alat tulis menulis, tabung
reaksi, timbangan, gelas aqua, pisau, batang pengaduk, spatula, blender, pipet tetes, dan
mesin vortex.
III.1.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah buah tomat Solanum lycopercium
dan pepaya Carica papaya, detergen (Rinso cair, Surf bubuk, dan sabun bukrim), Aquades,
garam dapur, Ethanol 96 % , dan kertas saring.

III.2 Prosedur Kerja


Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam percobaan ini adalah sebagai
berikut:

1. Buah dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil.


2. Buah yang telah dipotong kemudian ditimbang sampai beratnya 100 gr.
3. Diambil 100 gr buah dan 100 ml aquades, kemudian diblender hingga halus, kira-kira
diblender selama 40 detik.
4. Masing-masing buah yang telah diblender dimasukkan kedalam 3 tabung reaksi yang
berbeda sebanyak 4 ml.
5. Dilarutkan detergen (Rinso, Surf, dan Bukrim) kedalam 60 ml aquades, kemudian
diaduk hingga larut.
6. Tiga jenis larutan detergen kemudian dimasukkan kedalam masing-masing tabung
reaksi yang berisi jus buah sebanyak 4 ml.
7. Tambahkan 1 spatula garam dapur kedalam masing-masing tabung reaksi, kemudian
diaduk hingga larut.
8. Campuran kemudian disaring sebanyak 2 kali dengan kertas saring.
9. Lalu ditambahkan ethanol 96 % sebanyak 5 ml kedalam masing-masing campuran.
10. Larutan kemudian dihomogenkan dengan menggunakan mesin vortex.
11. Amati dan catat hasil yang tampak dari keseluruhan proses, meliputi warna, serta
sedikit banyaknya DNA yang terbentuk.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama.
JJJJJJJakarta.

Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id.
Diakses pada tanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.
Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.
Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada tttttttttanggal
17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada ssssssstanggal


17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.


Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada
tttttttangga17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.

PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN


SPEKTROFOTOMETER

Oleh :
Nama
: Wina Pratiwi Nugrahani
NIM
: B1J011019
Rombongan
: VI
Kelompok
: 3
Asisten
: Puspa Dwi Pratiwy

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN


UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2013
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Penghitungan asam nukleat sangat penting sebagai prosedur dalam banyak penelitian
biologi molekuler. Namun, penentuan konsentrasi DNA atau RNA yang akurat bisa menjadi
sulit, terutama ketika kemurnian sampel tidak pasti. Di banyak kasus, pendekatan yang paling
cepat dan akurat untuk menentukan konsentrasi asam nukleat yang relatif murni dan protein
adalah dengan membaca absorbansi pada spektrofotometri. Jumlah cahaya yang diserap oleh
sampel berbanding lurus dengan konsentrasi protein atau asam nukleat dalam sampel.
Konversi absorbansi dalam pembacaan konsentrasi didasarkan pada hukum Lambert-Beer.
Analisis kuantitatif merupakan salah satu teknik analisis yang bertujuan untuk
menentukan jumlah atau seberapa banyak suatu zat atau komponen zat. Aplikasi yang dapat
dimanfaatkan dari teknik analisis kuantitatif adalah menghitung jumlah DNA atau RNA
dalam suatu larutan, yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam
larutan contoh dengan uji kualitatif. Analisis kuantifikasi DNA dapat dilakukan dengan
bantuan alat, yaitu spektrofotometer. Spektrofotometer adalah alat yang dilengkapi dengan
sumber cahaya (gelombang elektromagnetik), baik cahaya UV (ultra-violet) atau pun cahaya
nampak (visible). Komponen utama dari alat ini adalah sumber cahaya, pengatur intensitas,
monokromator, kuvet, detektor, penguat arus dan indikator atau layar (Harjadi 1986).
Sinar UV digunakan untuk mengukur bahan larutan yang terbaca dengan panjang
gelombang di bawah 400 nm. Sinar visible light bisa digunakan untuk mengukur bahan
dengan panjang gelombang 400-700 nm. Sumber cahaya dari alat tersebut memancarkan
seberkas cahaya melalui dua buah lensa dan celah masuk ke suatu sisi difraksi yang akan
menyebarkan cahaya menjadi berkas horizontal dengan semua warna spektrum. Cahaya yang
mengenai suatu benda dalam larutan contoh akan dihamburkan, sedangkan cahaya yang lolos
atau diteruskan akan melewati sampel akan mengaktivasi fototabung dan akan menampilkan
persen trasmitan. Biasanya Absorban merupakan daya cahaya masuk dan daya cahaya yang
diteruskan melewati larutan contoh (Underwood & Day, 2002).

B. Tujuan
Tujuan praktikum kali ini adalah untuk melakukan pengukuran kualitas dan kuantitas
DNA hasil isolasi dan mengetahui pengaruh perbedaan perlakuan isolasi DNA terhadap
kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh.

II. MATERI DAN METODE


A. Materi
Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu spektrofotometer UV-VIS, tissue,
kuvet, mikropipet beserta tip, tabung reaksi dan rak tabung reaksi.
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah DNA hasil isolasi dari buah dan E.
coli serta akuades steril.
B. Metode
Metode yang digunakan dalam praktikum adalah sebagai berikut:
1.

Sebanyak 3 L DNA hasil isolasi di masukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan
akuades steril hingga volume 3000 L.

2.

Mesin spektrofometer dinyalakan.

3.

Nilai absorbansi dihitung dengan panjang gelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm dan 320 nm.

4.

Konsentrasi DNA dihitung dengan ketentuan untuk mengetahui konsentrasi DNA adalah
nilai absorbansi 260 nm, untuk protein dengan nilai absorbansi 260 nm dibagi nilai
absorbansi 280 nm dan untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi karbohidrat dan
kemikalia dengan nilai absorbansi 260 nm dibagi nilai absorbansi 230 nm.

5.

Kemudian tingkat kemurnian dan konsentrasi DNA buah dan E. coli dibandingkan.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Tabel 1. Perhitungan Konsentrasi DNA
No.

Sampel

A230
A260
A[S]-A[B] A[S]-A[B]

A280
A320
A[S]-A[B] A[S]A[B]

1.

Mangga

0,003

0,005

0,002

0,005

2.

Alpukat
Buah
Naga
E.coli

0,950

0,056

0,018

0,014

0,206

0,008

0,003

0,003

0,194

0,002

0,006

3.
4.

Keterangan:
A[S] = Absorbansi sampel DNA
A[B] = Absorbansi Blanko
Tabel 2. Perhitungan Konsentrasi DNA terhadap Kontaminasi Protein dan
Karbohidrat/ Kemikalia
Kon
sentrasi
No.
1
2
3
4

260 nm

260 / 280 nm

260 / 230 nm

250 ng/ L
2800 ng/ L
400 ng/ L
100 ng/ L

2,5 ng/ L
3,11 ng/ L
2,67 ng/ L
0 ng/ L

1,67 ng/ L
0,058 ng/ L
0,039 ng/ L
0,01 ng/ L

DNA murni
= < 2 = Kemikalia (karbohidrat)
= >2,2 = Blanko tidak sesuai
260 / 280 nm = 1,8 = DNA murni
= <1,8 = Protein
= >1,8 = RNA
Buah Naga
Konsentrasi DNA
= 260 x 50 x faktor pengenceran
= 0,008 x 50 x 1000
= 400 ng/ L.
Konsentrasi kemikalia
= 260 / 230 nm
= 0,008/ 0,206
= 0,039 ng/ L
Kontaminasi Protein
= 260 / 280 nm
= 0,008/ 0,003
= 2,67
Bakteri E. coli
Konsentrasi DNA
= 260 x 50 x faktor pengenceran
= 0,002 x 50 x 1000
= 100 ng/ L.
Konsentrasi kemikalia
= 260 / 230 nm
= 0,002/ 0,194
= 0,01 ng/ L
Kontaminasi Protein
= 260 / 280 nm
= 0,002/ 0
= 0 ng/ L

Interpretasi :
260 / 230
nm = 2 - 2,2 =

B. Pembahasan
Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran
serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombamg
spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor
fototube. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan
spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Riyadi
2009).
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan
studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur
pada berbagai panjang gelombang dan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan
spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda. Pada spektrofotometri visible
yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible
termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang
gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat
oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka
sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible) (Riyadi 2009).
Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan
interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm.
Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Karena sinar UV tidak dapat
dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan
senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak
berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample
dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap
harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri
adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi
(Riyadi 2009).
Spektrofotometer UV-VIS banyak dimanfaatkan seperti dalam analisis logam
berbahaya dalam sampel pangan atau bahan yang sering digunakan dalam kehidupan. Air
merupakan salah satu kebutuhan yang luas oleh masyarakat. Beragam sumber air yang
digunakan dalam keseharian. Salah satu sumbernya ialah air sumur. Kandungan dalam air
sangat mempengaruhi kesehatan masyarakat yang menggunakannya. Spektrofotometer UV-

Vis merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan sinar
tampak. Alat ini digunakan guna mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh
suatu materi dalam bentuk larutan. Konsentrasi larutan yang dianalisis sebanding dengan
jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut (Khopkar, 2002).
DNA mengandung basa-basa purin dan pirimidin yang dapat menyerap cahaya UV.
Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein
atau phenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Adanya perbedaan penyerapan cahaya UV
maka dapat digunakan untuk mengetahui kemurnian DNA yang dapat diukur dengan
menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280)
(Sahasrabudhe and Deodhar, 2010). Kelebihan dari menggunakan spektrofotometri pada
analisis kualitas dan kuantitas DNA adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih
terseleksi, caranya sederhana, dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat
kecil. Kekurangan dari menggunakan spektrofotometer pada analisis kualitas dan kuantitas
DNA adalah absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat
pengganggu dan kebersihan dari kuvet, hanya dapat dipakai pada daerah ultraviolet yang
panjang gelombang >185 nm, pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung
elektron valensi dengan energi eksitasi rendah, sinar yang dipakai harus monokromati.
Berdasarkan praktikum, diperoleh hasil bahwa konsentrasi DNA buah mangga adalah
250 ng/L, DNA buah alpukat 2800 ng/L, DNA buah naga 400 ng/L dan DNA E.coli 500
ng/L. Berdasarkan perhitungan konsentrasi DNA terhadap kontaminasi protein dengan
rumus 260/280, diperoleh hasil untuk DNA buah mangga 2.5, DNA buah alpukat 3.11, DNA
buah naga 2.67 dan DNA E.coli 0,91. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kemurnian DNA
kurang memadai karena mempunyai nilai kemurnian kebanyakan di atas 1,8 kemungkinan
terjadi karena pada praktikum isolasi tidak menggunakan RNAse. Jika nilai kemurnian DNA
dibawah nilai 1,8 artinya masih terkontaminasi protein atau phenol di dalam larutan dan harus
dibersihkan dengan proteinase K (Sartika et al., 2010). Menurut Sulandari dan Zein (2003),
apabila nilai kemurnian DNA di atas 1,8 maka sebaiknya dilakukan pemurnian ulang dengan
menambahkan RNAse.
Berdasarkan perhitungan konsentrasi DNA terhadap kontaminasi karbohidrat dan
kemikalia dengan rumus 260/230, diperoleh hasil untuk DNA buah mangga 1.67, DNA buah
alpukat 0.059, DNA buah naga 0.039 dan DNA E.coli 0.56. Hasil tersebut menunjukkan
bahwa kemurnian DNA dari karbohidrat dan kemikali kurang memadai, karena mempunyai
nilai di bawah 2. Menurut Fatchiyah (2011), DNA yang murni akan memiliki nilai 260/230
berkisar 2-2,2. DNA dikatakan terkontaminasi oleh karbohidrat atau kemikalia lain apabila

nilainya lebih rendah dari. Apabila nilainya lebih tinggi dari 2.2, hal ini menandakan bahwa
blanko yang digunakan tidak sesuai dengan pelarut DNA yang digunakan.
Banyak faktor yang menyebabkan kemurnian DNA pada praktikum ini masih sedikit
rendah. Selain terkontaminasi bahan kimia, sampel juga masih terdapat RNA dan protein,
sehingga hasilnya bukan DNA murni. Peningkatkan kemurnian DNA dilakukan dengan cara
pencucian dengan beberapa kali dan penambahan PCI dua kali (Khosravinia et al., 2007).
Selain itu, ketelitian dalam bekerja merupakan salah satu hal yang harus diperhatikan karena
dapat mempengaruhi kemurnian DNA yang dihasilkan juga.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN


A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan:
1. Hasil dari praktikum penentuan kualitas dan kuantitas asam nukleat dengan spektrofotometri
adalah untuk DNA buah DNA terkontaminasi karbohidrat dan kemikalia karena nilai
260/230 kurang dari 2 dan blanko tidak sesuai. Hasil dari DNA e. coli adalah terkontaminasi
oleh karbohidrat dan kemikalia karena nilai 260/230 kurang dari 2.
B. Saran
Pengenceran DNA sebaiknya dilakukan oleh praktikan saja agar praktikan mengerti
cara pengenceran.

DAFTAR REFERENSI
Hardjadi. 1990. Ilmu Kima Analitik Dasar. PT Gramedia: Jakarta.
Khopkar. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia: Jakarta.
Khosravinia, H., N. N. Murthy., D. T Parasad and N. Pirany. 2007. Optimazing Factors Influencing
DNA Extraction from Fresh Whole Avian Blood. African Journal of Biotechnology, Vol. 6(4),
pp. 481-486.
Underwood, A. L dan R.A. Day. J. R. 1996. Analisis Kimia Kuantitatif edisi Kelima. Penerbit
Erlangga: Jakarta
Sahasrabudhe, A. and M. Deodhar. 2010. Standardization of DNA Extraction and Optimization of
RAPD-PCR Conditions in Gracinia indica. International Journal of Botany. Vol 6 (3): 293298. ISSN: 1811-9700.
Riyadi, W Riyadi. 2009. Macam Spektrofotometri dan Pebedaannya, Milis Kimia Indonesia.
Sartika, T., S. Iskandar dan S. Sopiyana. Identifikasi Gen Penciri Resistensi Genetik terhadap Flu
Burung pada Ayam Sentul. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Balai
Penelitian Ternak, Bogor.
Sulandari, S. dan M. S. A. Zein. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA. Buku. Edisi pertama.
Bidang Zoologi, Puslit Biologi, LIPI. 125 hal.

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Perkembangan ilmu biologi molekuler di dunia begitu pesat,hal ini dipengaruhi oleh
perubahan pola fikir dan keadaan wilayah sehingga banyaknya ilmu-ilmu yang mempelajari
bagaimana memaksimalkan DNA dan mempelajari perubahan DNA (genetik) karena
perubahan lingkungan maupun karena hal lainnya. Sehingga berbagai pihak harus bisa
mengerti dan paham akan fenomena ini,salah satunya profesi dokter hewan di Indonesia.
DNA merupakan pembawa informasi genetik yang akan diturunkan kepada generasi
penerusnya (Anonim,2010) ,sehingga dengan memodifikasi informasi ini akan menghasilkan
generasi baru yang bisa bersaing dan mendapatkan keuntungan berlimpah,baik dari segi
budaya maupun ekonomi serta sosial. Sehingga ilmu ini sangatlah bermanfaat bagi umat
manusia.
Ilmu dasar yang harus dimiliki untuk bisa mengolah data genetik yaitu harus
mengetahui dan memahami teknik Isolasi DNA,Amplifikasi DNA dengan PCR,Uji
Polimerisme dengan teknik RFLP dan Elektroforesis Gel Poliakrilamid. Dimana praktikum
tersebut saling berhubungan antara satu dengan yang lainnya (Suryanto Dwi,2010)
Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA murni yang bebas dari RNA
maupun protein lainnya hal ini didasarkan pada proses sentrifugasi (berat molekul),kemudian
dilanjutkan dengan amplifikasi DNA dengan PCR. Hal tersebut bermanfaat dalam
memperbanyak jumlah DNA agar bisa dimanfaatkan lebih maksimal karena jumlahnya lebih
banyak. Kemudian diidentifikasi dengan proses RFLP agar tahu variasi-variasi dari bahan
genetic tersebut. Dan hasilnya dilihat menggunakan Elektroforesis Gel Poliakrilamid untuk
mengetahui visualisasi dari semua praktikum diatas. Agar bisa ditentukan berat molekul dan
menentukan keberhasilan teknik tersebut.
Berdasarkan latarbelakang di atas, praktikum Isolasi DNA,AmplifikasiDNA dengan
PCR,Uji Polimersime dengan teknik RFLP dan Elektroforesis Gel Poliakrilamid dirasa
sangat dibutuhkan oleh Dokter Hewan. Selain itu,praktikum ini merupakan salah satu cara
memenuhi kewajiban dari pihak akademik fakultas agar menghasilkan lulusan yang bisa
bersaing secara nasional maupun internasional.
1.2 Tujuan
Untuk memperoleh Isolat DNA pada berbagai makluk hidup ( Isolasi DNA )

Untuk memperbanyak jumlah DNA agar bisa digunakan untuk analisis maupun
penelitian. (Amplifikasi DNA dengan PCR)

Untuk mengetahui keanekaragaman genetic maupun variasivariasinya ( Uji


polimersime dengan teknik RFLP )

Untuk memurnikan maupun memisahkan suatu molekul baik protein maupun asam
nukleat berdasarkan perbedaan ukurannya ( Elektroforesis Gel Poliakrilamid )

1.3 Manfaat
Memberikan pengetahuan seputar karakteristik dari DNA pada suatu makluk hidup
khususnya pada praktikum ini DNA sapi (darah sapi). (Isolasi DNA)
Memberikan pengetahuan akan keragaman genetic maupun cara seleksi maupun uji
kemurnian pada bahan tersebut (Amplifikasi DNA dengan PCR)

Memberikan pengetahuan akan variasi-variasi genetic beserta pemetaan


genetic,penentuan mutasi,kekerabatan dan hal-hal yang berhubungan jenis genetic.
( Uji polimersime dengan teknik RFLP )

Memberikan pengetahuan tentang perbedaan ukuran dari DNA hasil PCR dsb serta
berperan dalam mempurifikasikan DNA tersebut dan proses-prosesnya.
( Elektroforesis Gel Poliakrilamid ).

BAB II
METODOLOGI
2.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Isolasi DNA ,Amplifikasi DNA dengan PCR,Uji Polimerisme dengan
Teknik RFLP dan Elektroforesisi Gel Poliakrilamid dilakukan pada tanggal 05 November
2012 jam 13.00 18.00 WIB di Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA) Universitas Brawijaya,Malang.
2.2 Alat dan Bahan
2.2.1 Isolasi DNA
Peralatan yang digunakan pada praktikum Isolasi DNA antara lain microtube atau
eppendorf steril,kemudian mortar,microcentrifugastor,micropipette,vortex dan inkubator.
Kemudian bahan yang dibutuhkan antara lain ; darah sapi,larutan buffer ekstrak atau buffer
lysis,PCI (Phenol Chloroform Isoamil Alkohol), Ethanol atau Alkohol 70% dan dd H2O
steril.
2.2.2 Amplifikasi DNA dengan PCR
Adapun perlatan yang digunakan antara lain ; Thin Wall, Laminar Air Flow (LAF)
,Mikropipet,Mikrotube (tabung 1,5 ml),Yellow Tip , Mesin PCR/Thermal cycler,Spin
down/mesin sentrifugasi,Masker dan Gloves. Serta juga dibutuhkan beberapa bahan seperti
ddH2O,PCR mix,DNA Template / Whole genom (diambil dari darah sapi),Primer forward
(satelit IV) dan Primer reverse (satellite IV).
2.2.3 Uji Polimerisme dengan Teknik RFLP

Bahan yang digunakan antara lain ; ddH2O 5l,Buffer enzim 2x sebanyak 1 l,DNA
hasil PCR sebanyak 3 l,dan enzim Hind III 1 l serta ditambahkan Loading Dye. Adapun
Alat-alat yang digunakan Thin Wall,Eppendorf,Lemari pendingin (refrigerator),mikropipet
dan stopwatch.
2.2.4 Elektroforesis Gel Poliakrilamid
Alat-alat yang digunakan antara lain ; Gloves,Mikropipet,Blue Tip,Yellow
Tip,Sisiran,Alat running,Shaker Machine ,Pemanas,Chamber,Plate cetakan 30 ml,sisiran
17,timbangan digital,tabung Erlenmeyer,plastic penutup,mikropipet dan oven. Sedangkan
bahan yang dibutuhkan antara lain ; Bubuk agarosa 0,45 gr,TBE 30 ml dan ETBR 0,25 ml.
2.3 Cara Kerja
2.3.1 Isolasi DNA
Untuk Isolasi DNA,pertama siapkan terlebih dahulu sampel darah yang ingin
diisolasi. Pada praktikum ini,kami menggunakan darah sapi sebagai sampel tersebut.
Kemudian sebanyak 200 mikroL ditempatkan pada microtube ataupun tabung eppendorf.
Setelah itu tambahkan larutan buffer lysis sebanyak 300 mikrolit menggunakan micropipet.
Selanjutnya campuran tersebut divortex selama lebih kurang 10-20 detik dan dilanjutkan
dengan menginkubasinya selama 10 menit.
Setelah 10 menit,kemudian pisahkan dan ambil supernatant dari mikrotube dan
letakkan di microtube yang baru dan steril. Setelah itu ditambahkan PCI sebanyak 300
mikrolit dan lakukan vortex lagi selama lebih kurang 10 detik sampai homogen. Setelah
homogeny disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm suhu 25 C selama 10 menit.
Kemudian lakukan lagi langkah seperti sebelumnya,yakni ambil supernatannya
kemudian pindahkan ke mikrotube yang baru dan steril. Selanjutnya tambahkan CI sebanyak
300 mikrolit dan lakukan vortex lagi selama lebih kurang 10 detik dan dilanjutkan dengan
mensentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm suhu 25 C selama 10 menit.
Setelah itu ambil upperfase dari sampel tersebut. Kemudian pindahkan ke mikrotube
baru dan steril. Dan ditambahkan Ethanol absolut sebanyak 200 mikrolit dan amunium asetat
7,5 M sebanyak 50 mikrolit,dan homogenkan dengan cara mengocok.
Selanjutnya diinkubasi selama lebih kurag 30 menit dilanjutkan dengan
mensentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm suhu 4 C selama 10 menit. Dan akan
menghasilkan supernatant lagi. Dan supernatant itu dibuang kemudian dicuci pellet DNA
dengan menggunakan Ethanol atau alcohol 70% sebanyak 500 mikrolit. Setelah itu
disentrifugasi kembali pada kecepatan 12.000 rpm suhu 4 C selama 10 menit.
Bagian supernatant hasil dari sentrifugasi dibuang dan tambahkan pada mikortube
larutan buffer ddH2O steril (sebagai pengganti TE). Dan setelah itu masukkan ke dalam oven
pada suhu 55 C selama 3 menit dan dilanjutkan dengan tahap elektroforesis.
2.3.2 Amplifikasi DNA dengan PCR
Langkah awal PCR antara lain membuat PCR mix solution. PCR mix solution
merupakan bahan ataupun campuran dari beberapa jenis bahan kedalam thin wall. Adapun
cara membuatnya dengan menambahkan ddH2o sebanyak 2 mikrolit,dan tambahkan PCR
mix sebanyak 5 mikrolit serta ditambahkan DNA template atau whole genom sebanyak 1
mikrolit. Kemudian primer reverse dan primer forward dimasukkan juga masing-masingnya
sebanyak 1 mikrolit. Setelah semuanya tercampur,whole genom diencerkan menggunakan
ddH2O sebanyak 20 mikrolit. Kemudian disentrifugasu dengan kecepatan lebih kurang
10.000 rpm.
Setelah dilakukan sentrifugasi bahan tersebut dimasukkan kedalam mesin
PCR/thermasl cycle dengan program 1D, dengan rincian sebagai berikut ;

1. Pemanasan awal atau Hot Start (denaturasi awal) dengan memasukkan thin wall ke
mesin PCR selama 30 menit dengan suhu 95 C
2. Kemudian perlakuan tersebut diulang selama 33 kali yang disebut dengan siklus
amplifikasi. Adapun prosesnya antara lain ; denaturasi selama 30 detik dengan suhu
95 C,Annealing selama 30 detik dengan suhu 60 C dan ekstensi selama 30 detik pada
suhu 72 C
3. Diakhiri dengan periode ekstensi selama 10 menit pada suhu 72 C.
Proses ekstensi berakhir,otomatis mesin akan otomatis tersetting 4 C hal ini terjadi demi
keamanan praktikum saat mengambil thin wall di dalam mesin.
2.3.3 Uji Polimerisme dengan Teknik RFLP
Langkah pertama yang dilakukan yaitu memasukkan bahan-bahan yang telah
disebutkan di atas kedalam Thin Wall antara lain ; Pertama masukkan ddH2O sebanyak 5
l,kemudian masukkan juga buffer enzim 2x sebanyak 1 l tidak lupa masukkan juga DNA
hasil PCR sebanyak 3 l serta tambahkan enzim Hind III sebanyak 1 l. Setelah itu
homogenkan dengan cara menjentik thin wall tersebut maupun memutarnya searah jarum jam
atu boleh juga dengan bantuan mikropipet dengan teknik sedot semprot.
Setelah homogen,larutan tersebut diinkubasi dalam eppendorf dengan suhu 37 C
selama 1 jam ( 60 menit). Kemudian bekukan menggunakan lemari pendingin. Setelah reaksi
dirasa cukup sempurna,kemudian ditambahkan Loading Dye dan elektroforesis pada suhu
100 V selama 30 menit.
2.3.4. Elektroforesis Gel Poliakrilamid
Pertama bubuk gel agarosa disiapkan sebanyak 0,45 g (ditimbang menggunakan
timbangan digitas). Kemudian tambahkan larutan TEB kedalam tabung Erlenmeyer selama
lebih kurang 1 2 menit. Tabung tersebut ditutup dengan plastik. Akan tetapi pada plastic itu
diberi lubang sebagai fentilasi sewaktu di dalam oven. Kemudian masukkan ke dalam oven
dan ditunggu sampai mendidih. Kemudian ditunggu 2 menit sampai jernih. Setelah itu
ditambahkan ETBR 0,5 1 mikrolit,lalu dihomogenkan dan setelah dihomogenkan dicetak
pada plate 30 ml sisiran 17 dan ditunggu selama 25 menit. Selanjutnya plate dimasukkan ke
dalam chamber dan plate tersebut direndam dengan TBE.
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil
3.1.1 Isolasi DNA
Gagal,tidak ada visualisasi saat elektroforesis,dapat dilihat pada gambar diatas (kolom
berwarna kuning,sedangkan sampel asisten berhasil, ada visualisasi pada kota berwarna
hijau)
3.1.2 Amplifikasi DNA dengan PCR
Gagal,tidak ada visualisasi saat elektroforesis dapat dilihat gambar di atas ( kolom berwarna
biru muda terlihat kosong/tidak terjadi apa-apa sedangkan milik asisten berhasil,lihat kolom
berwarna hitam).
3.1.3 Uji Polimerisasi dengan Teknik RFLP

1 gagal,3 berhasil. Lihat gambar diatas,di kolom berwarna biru tua. Kelompok I gagal
sedangkan kelompok 2,3 dan 4 berhasil. Cara menghitungnya dengan melihat hasil dari
kolom hijau dihitung dari bawah ke atas. Dimana ditemukan 1000 bp (dimana garis pertama
300bp dan kedua 700bp)
3.1.4 Elektroforesis Gel Poliakrilamid
Berhasil,gel bisa digunakan untuk elektroforesis,terlihat di gambar,hasil elektroforesis
lumayan jelas dan merata.
3.2 Pembahasan
3.2.1 Isolasi DNA
Percobaan Isolasi DNA yang kami lakukan pada saat praktikum tidak membuahkan
hasil yang kami harapkan. Dimana tidak ditemukan pita (sebagai visualisasi keberhasilan)
pada saat elektroforesis. Hal ini bisa disebabkan oleh beberapa factor antara lain ; Faktor
interna,yaitu praktikan belum terbiasa melakukan praktikum yang membutuhkan ketelitian
serta keakuratan pengisian bahan serta perlunya jam terbang yang lebih lama agar bisa
menghasilkan isolat yang terbaik serta maksimal.
Kesalahan selanjutnya bisa terjadi karena faktor eksternal,seperti kesalahan saat
melakukan langkah kerja,misalnya saja langkahnya tidak tepat,ataupun adanya kontaminasi
sehingga DNA yang seharusnya diambil supernatannya,tapi malahan ikut terbuang bersama
hasil sentrifugasi yang tidak diinginkan ( dibuang). Selanjutnya juga bisa dikarenakan
kesalahan dalam memasukkan bahan serta komposisinya tidak tepat serta butuhnya
pengalaman dalam penggunaan alat yang masih non familier bagi mahasiswa kedokteran
hewan.
Adapun isolasi DNA itu sendiri pada dasarnya mengambil DNA murni dari sediaan
yang tersedia ( Darah sapi) kemudian membuang RNA maupun protein-protein lainnya.
Sehingga perbedaan berat molekul akan membuat DNA akan naik ke atas dan yang lainnya di
bawah (dalam proses sentrifugasi). Pada saat penambahan buffer lysis itu dimaksudkan untuk
melisiskan dinding selnya agar materi di dalamnya bisa keluar. Selanjutnya vortex bertujuan
untuk mempercepat percampuran hal tersebut. Setelah tercampur secara maksimal,maka
kombinasi tersebut akan disentrifugasi agar yang berat molekulnya lebih tinggi akan
tersingkir ke bawah dan DNA (supernatant) akan naik ke atas,sehingga DNA murni bisa
didapatkan walaupun hal tersebut diulang sampai beberapa kali.
Adapun tahapannya yang benar sebagai berikut,pertama bahan darah sapi sebanyak
200 mikrolit dilisiskan dinding dan membrane sel dengan larutan pelisis. Pada saat praktikum
kami menggunakan buffer ekstrasi (buffer lisis) sekitar 300 mikrolit. Kemudian bahan
tersebut di vortex menggunakan mesin vortex selama 10 20 detik,hal ini bertujuan untuk
mempercepat proses homogeny atau pencampuran dan perusakan sel dari darah. Sampel yang
sudah tercampur tadi maka akan dilakukan inkubasi pada suhu 55 C selama 10 menit.
Selanjutnya supernatant diambil dan dipindahkan ke dalam mikrotube menggunakan alat
mikropipet. Bahan tersebut kemudian ditambahkan Phonel Chloroform Isoamil Alkohol
(PCI) bertujuan untuk memurnikan DNA dari ekstrak sel tadi.
Setelah itu langkah sebelumnya diulangi lagi,yaitu divortex dan disentrifugasi dengan
kecepatan dan suhu yang sama seperti sebelumnya. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan
DNA yang murni (terbaik) dan sentrifugasi 12.000 rpm berfungsi untuk memisahkan bahan
berdasarkan berat molekulnya.
Selanjutnya akan ditemukan fase supernatant dan pellet,sehingga harus ditambahkan
Chloroform Isoamil Alkohol (CI) sebanyak 300 mikrolit,digunakan untuk purifikasi dengan
cara menghilangkan kontaminan (yang ditambahkan supernatannya saja). Selanjutnya
divortex dan disentrifugasi lagi dengan tujuan yang sama dengan diatas. Supernatan
selanjutnya ditambahkan dengan Ethanol absolut 200 mikrolit dan amunium asestat 7,5 M

sebanyak 50 mikrolit. Hal tersebut dilakukan untuk presipitasi dengan cara salting out dan
ammonium asestat agar DNA menempel di mikrotube.
3.2.2 Amplifikasi DNA dengan PCR
Amplifikasi DNA dengan PCR berfungsi untuk memperbanyak DNA setelah hasil
dari Isolasi DNA (DNA murni). Hal ini dimaksudkan agar bisa dimanfaatkan dalam
penelitian karena jumlahnya lebih banyak dibanding dengan hasil isolasi. Akan tetapi pada
saat praktikum,kami lagi-lagi mengalami kegagalan. Hal ini bisa dkarenakan praktikan
sendiri yang baru pertama kali melakukan praktikum ini. Sehingga beberapa kesalahanpun
bisa terjadi. Pertama karena kurang atau kelebihan dalam menambahkan bahan maupun salah
dalam menggunakan alat sehingga hasil yang diharapkan tidak bisa terjadi. Hal itu bisa juga
terjadi karena mahasiswa bercanda saat melakukan praktikum,sehingga kontaminasi misalnya
dari mulut masuk secara bebas,sehingga hasil yang diharapkan tidak bisa ditemukan.
Adapun metode yang seharusnya dilakukan antara lain : Pertama, whole genom
diencerkan dengan ddH2O agar mendapatkan whole genom yang encer. Selanjutnya
dilakukan pembuatn PCR mix Solution yang mengandung Taq enzim. Dimana taq enzim
berfungsi untuk mengikat dNTP (yaitu basa nukleotida yang belum membentuk untai DNA
atau bergerak bebas). Adapun PCR mix itu dikemas didalam LAF agar menghindari
kontaminasi udara maupun bahan asing dari lingkungan luar.
Setelah PCR mix selesai maka dimasukkan dalam thin wall dan di spin down dengan
kecepatan 10.000 rpm agar cairan yang menempel di sisi tabung bisa lepas. Sehingga
dosisnya akan sesuai dengan yang diinginkan.
Kemudian masukkan PCR mix solution ke dalam mesin PCR hal inipun berfungsi
sebagai meningkatkan urutan DNA. Adapun kelompok kami melakukan program 1D dimana
prosesnya meliputi hot start (awal) dimana pada proses ini terjadi pemisahan rantai DNA
kemudian amplifikasi yang diulang berkali-kali (33 kali) dan ketiga adalah ekstensi. Hal ini
tujuan utamanya adalah mendapatkan sequence DNA yang banyak.
3.2.3 Uji Polimerisme dengan Teknik RFLP
Uji polimersime dengan teknik RFLP berfungsi untuk mengidentifikasi variasi variasi
genetic yang ada pada DNA tersebut. Sehingga bisa memberikan hasil yang agak spesifik dari
yang lainnya. Pada saat praktikum kelompok kami berhasil,diamana ditemukan pita-pita
DNA yang lumayan jelas. Ditemukan 1000 dp dengan rincian garis pertama 300dp dan kedua
700dp. Akan tetapi keolompok pertama kurang berhasil karena mereka mengalami kesalahan
dalam penggunaan mikropipet sehingga bahan yang dimasukkan tidak sesuai dengan takaran
yang sudah ditentukan,ataupun dilakukan dengan tidak serius sehingga kontaminasi begitu
besar.
Pada metodologi dari RFLP ditambahkan ddH2O hal ini dimaksudkan untuk menjadi
pelarut bahan,kemudian ditambahkan buffer lysis sebagai penyangga dan ditambahkan lagi
dengan enzim hind III,hal tersebut berfungsi untuk pemotongan sequence pada DNA,dan
diinkubasi. Inkubasi bertujuan untuk memaksimalkan reaksi enzimtis pada suhu kamar 37 C.
Kemudian akan diinkubasi lagi dengan suhu 70 C hal itu bertujuan untuk memberhentikan
reaksi (stop reaksi). Karena enzim tidak akan aktif jika suhu tinggi. Terakhir ditambahkan
loading dye berfungsi untuk penanda jalan saat dilakukan elektroforesis.
3.2.4 Elektroforesis Gel Poliakrilamid
Elektroforesis Gel Poliakrilamid membuahkan hasil yang bagus. Dimana gel yang
dihasilkan bisa digunakan saat pembacaan elektroforesis. Hal itu disebabkan agar lumayan
bening dan ketebalannya masuk dalam kategori standart (bagus). Hal ini didukung dengan
kehandalan mahasiswa dalam menggunakan alat serta teliti dalam memasukkan bahan-bahan
yang dibutuhkan. Serta dengan bantuan asisten dosen yang professional.
Elektroforesis Gel Poliakrilamid ini sendiri berfungsi dalam melihat molekul DNA
berdasarkan berat mereka serta sebagai visualisasi dari praktikum-praktikum sebelumnya.

Hal itu disebabkan pada bahan tersebut terdapat zat fluorence (dicampur gel agarosa)
sehingga kalau disinari dengan ultra violet (UV) dapat menunjukkan ukuran DNA dari bahanbahan yang diujikan di atasnya.
BAB IV
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
Praktikum yang kami lakukan pada tanggal 05 November 2012 mengalami kegagalan
antara lain di Isolasi DNA dan PCR,hal itu dikarenakan praktikan masih belum terbiasa
dengan praktikum yang membutuhkan ketelitian dan kejelian tingkat tinggi serta penggunaan
alat yang masih tingkat pemula sehingga beberapa hal bisa menyebabkan kegagalan. Akan
tetapi pada praktikum RFLP sebagian besar mengalami keberhasilan dengan terlihatnya pita
pada elektroforesis walaupun 1 kelompok gagal dikarenakan pada saat pencampuran bahan
kurang benar komposisinya. Dan terakhir elektroforesis Gel Poliakrilamid sangat sukses
karena bahan gel bisa digunakan untuk elektroforesis dan terlihat lumayan jelas dan ketebalan
yang pas.
4.2 Saran
Adapun saran yang harus diterapkan antara lain ;
Praktikum harus dilakukan dengan langkah-langkah yang tepat sesuai dengan yang
diajarkan. Agar mendapatkan hasil yang maksimal
Jumlah komposisi dan takaran bahan harus tepat untuk mendapatkan hasil yang
maksimal dan sesuai dengan yang diharapkan.

Pengunaan alat dan cara pemakaiannya harus benar dan sesuai dengan instruksi agar
mengurangi persentase kegagalan praktikum

Mulai praktikum dengan berdoa

DAFTAR PUSTAKA
Anonim.2010.Isolasi DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id/2010/06/19/isolasi-dna/ (diakses
pada tanggal 6 November 2012 jam 18.00 WIB)
Avise,JC & R.A Lansman.1983.Polymorphis of mitochondrial DNA in populations of higher
animals. Bab Evolution of genes and proteins.Sunderland : Sinaeur Associates Inc
Fatchiyah.
2005
.Dasar
Teknik
Amplifikasi
dan
Aplikasi.
http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/general/bbbb/ (diaksek pada tanggal 6 November 2012 jam
18.00 WIB)
Prafitdhin,Achmad.2009.Isolasi DNA,Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Deteksi DNA
Melalui Elektroforesis.Fakultas Peternakan Perikanan.Universitas Muhammadiyah Malang
Suryanto,Dwi.2010.Melihat Keanekaragaman Organisme Melalui Teknik Genetika
Molekuler. Program Studi Biologi.Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam.Universitas Sumatera Utara