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ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE

358027 TOXICOLOGA AMBIENTAL


Gua de actividades componente prctico. Ao 2014_2

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA


ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLA, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE
ECAPMA

GUA DE ACTIVIDADES COMPONENTE PRCTICO


PRACTICA AUTONOMA
2014 2

MODULO ELECTIVO TOXICOLOGA AMBIENTAL


CDIGO - 358027

Directora
MSc. ZULMA LORENA DURAN HERNANDEZ

JUNIO 2014

ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE


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I - ACTIVIDADES PARA EL ESTUDIANTE


1. IDENTIFICACIN DE LA PRCTICA
Nombre del curso
Cdigo de curso
Valor de esta actividad prctica
Nombre del director de curso
CEAD al que pertenece
Contacto del director del curso
Espacio donde se debe
desarrollar la prctica
Objetivos de la prctica

Justificacin de la prctica

Competencias a desarrollar
Duracin de la prctica
Mecanismo mediante el cual se
evaluar la prctica:

Modulo electivo Toxicologa Ambiental


358027
150 puntos.
Zulma Lorena Duran Hernndez
Yopal
zulma.duran@unad.edu.co celular nmero 3144315556
Skype zulma.lorena.duran
Libre escogencia
Identificar los tipos de bioensayos utilizados para
pruebas de toxicidad.
Realizar autnomamente un bioensayo de
ecotoxicidad,
siguiendo
el
procedimiento
establecido.
Interpretar los resultados de un bioensayo para
evaluar el nivel de toxicidad de una muestra.
Uno de los aspectos ms importantes dentro del rea de la
toxicologa ambiental son los protocolos de monitoreo y
seguimiento. Dentro de estos, los bioensayos constituyen
una de las herramientas de mayor aplicabilidad y flexibilidad
para ser aplicados en cualquier ambiente y para diferentes
contaminantes.
Por tal motivo es de gran trascendencia que los estudiantes
realicen uno y evalen sus resultados.
El estudiante aumenta su capacidad de interpretacin
cualitativa y cuantitativa de datos de toxicologa ambiental.
8 horas en 2 jornadas.
A travs de la rbrica de evaluacin del componente
prctico, la cual se detalla en el punto D del presente
documento.

El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba esttica
de toxicidad aguda (120 horas de exposicin) en el que se pueden evaluar los efectos
fitotxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinacin de
las semillas y en el desarrollo de las plntulas durante los primeros das de crecimiento. A
continuacin se describe el procedimiento.

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2.1 METODOLOGIA
A. Actividades a desarrollar

Obtencin de la muestra
Si su tema de proyecto es la contaminacin de algn cuerpo de agua con txicos podr
recolectar una muestra de esta agua para utilizarla en el bioensayo. Si el proyecto que estn
trabajando es sobre contaminacin de suelo o lodos, deben tomar una muestra y llevarla a
un laboratorio de aguas o suelos de su ciudad y solicitar que se haga un proceso de
centrifugacin para extraer una solucin liquida a partir de ese suelo o lodo, que pueda
utilizarse en el bioensayo, el tamao de la muestra lquida debe ser de 500mL.
Si el desarrollo de este procedimiento no es posible o su tema de proyecto no es ninguno de
los mencionados anteriormente entonces igual deber tomar una muestra de agua de
cualquier sitio que se presuma est contaminado para efectos del desarrollo la prctica.
Toma de muestra de agua
Los materiales requeridos para el muestreo dependern del lugar donde se planee
recolectar la muestra. Se recomienda seguir el protocolo establecido por el Ideam en la gua
de monitoreo de vertimientos, aguas superficiales y subterrneas, disponible en el link
http://www.corponor.gov.co/control_calidad/2014/Guia_monitoreo_IDEAM.pdf y tambin en los
archivos del curso.
El muestreo que harn es puntual, pero debern seguir las indicaciones para preparacin del
recipiente, llenado de la botella, marcacin, preservacin y transporte de la muestra hasta el
CEAD el da que tengan su prctica. Sin embargo, como materiales generales se
recomienda llevar para el muestreo: balde, soga, un recipiente limpio para recolectar 1Litro
de muestra (pueden ser botellas de agua lavadas y desocupadas), toalla para secar, cinta de
enmascarar para marcar el recipiente donde se pondr la muestra, marcador sharpie, nevera
de icopor con hielo, guantes de caucho, formato de campo para recolectar informacin del
sitio como nombre del lugar, del cuerpo de agua, hora, fecha, etc. (En la gua del Ideam
encontrarn ejemplos de estos formatos), importante tambin tomar fotos del sitio de
muestreo y no ir solos a tomar la muestra.

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Ilustracin 1. Toma de muestra de agua con un balde

Fuente: Aquatox (2010)


IMPORTANTE: la muestra no debe tener ms de 24 horas de recogida antes del montaje del
bioensayo.
La muestra a trabajar ser idealmente del entorno contaminado que estn investigando pero
si no es posible, simplemente debern escoger un cuerpo de agua diferente donde
presuman que haya contaminacin. El ensayo se podr elaborar individualmente o en grupo
de 3 personas del mismo CEAD, as si desean trabajar en grupo debern ponerse en
contacto entre ustedes para que alisten materiales, recojan la muestra en grupo y
desarrollen el bioensayo.
La gua del Ideam habla de medir algunos parmetros In situ a las muestras, pero estos
anlisis no se realizarn.
Toma de muestra de suelo
Si su tema de proyecto es contaminacin de suelos, el procedimiento para toma de muestra
es el siguiente:
A- Se debe remover entre 2-3 cm de la superficie del terreno (capa vegetal superficial) en el
punto escogido con el fin de limpiar y eliminar los residuos frescos de materia orgnica,
polvo de la carretera u otros contaminantes. Utilizar guantes de ltex con el objetivo de evitar
contaminacin de la muestra.
B- Las muestras deben ser tomadas a una profundidad de 0-15 cm. Una vez tomada la
muestra debe homogenizarse, destruir terrones y remover material orgnico como: hojas,

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1 y animales. Una vez realizado esto, incorporar la muestra de aproximadamente 250 g


races
en las bolsas ziploc, asegurndose que quede bien sellada.

Las bolsas ziploc deben estar adecuadamente rotuladas con el nombre de quien toma la
muestra, tipo de sistema agrcola o cobertura vegetal que hubiera tenido, hora y fecha de
muestreo.
Una vez tomada la muestra deber dirigirse a un laboratorio de aguas o suelos de su ciudad
donde sea posible hacer una extraccin lquida de la muestra, ya que solo de esta manera
podr ser usada en la prctica.
Nota: Recuerde que si este procedimiento no es posible de realizarlo, deber hacer el
bioensayo entonces con una muestra de agua.
Ejecucin del ensayo
A. Preparacin de las soluciones
Solucin de control positivo:
Las soluciones de control positivo estn diseadas para obtener resultados similares de los
que se obtendran con agua contaminada. Esta solucin le permitir observar cmo
reaccionan las semillas al agua contaminada.
Primero se deber preparar una solucin madre de NaCl (sal de cocina), para esto se debe
aadir 11gramos (2 cucharaditas a ras) de sal (NaCl) al recipiente de 1.5 litros. Luego
aada 1 litro de agua de botella sin gas al recipiente. Utilizando la probeta graduada
(cilindro graduado), aada otros 100 ml de agua de botella sin gas al recipiente de 1.5 litros.
Cierre con la tapa, agite bien, y etiquete como "Solucin madre NaCl 10 g/L". Almacnela al
resguardo de la luz solar directa o del calor extremo.
Despus de preparar la solucin madre de NaCl se procede a preparar el control positivo
para el bioensayo, utilice un recipiente limpio de al menos 500 mL, con tapa no metlica,
luego aada 250mL de la solucin madre de NaCl y dilyala con agua de botella o destilada
hasta completar los 500mL.
Tape, agite bien, y etiquete como "Control (+) 5g/L", marque la fecha de preparacin.
Solucin de control negativo
Sera una muestra de agua sin gas y sin saborizante, alistar mnimo 500mL para el
bioensayo.

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1
Soluciones
de muestras contaminadas

Se utilizar la muestra recolectada, si se presume de una alta contaminacin ser mejor


realizar una dilucin de la muestra para el bioensayo, la dilucin puede ser del 50%, es decir
completar un volumen de 100mL con 50mL de muestra y 50mL de agua destilada o
embotellada sin gas.
B. Montaje del bioensayo:
Colocar en cada caja Petri un disco de papel filtro o un recorte de papel absorbente con la
forma de la circunferencia de la caja de Petri.
Marcar correctamente cada caja de Petri con la dilucin correspondiente y la solucin que se
aplicar, as como la fecha y hora de inicio y trmino del bioensayo. Cada estudiante o grupo
de 3 personas deber tener 5 cajas de Petri y marcarlas de la siguiente manera:
Ilustracin 2. Caja de Petri con su tapa
Caja 1: Control negativo
Caja 2: control positivo
Caja 3: M-R1 (muestra repeticin 1)
Caja 4: M-R2 (muestra repeticin 2)
Caja 5: M-R3 (muestra repeticin 3)

Colocar 4mL de cada solucin en la caja de petri correspondiente, saturar el papel filtro
dispersando homogneamente la solucin sobre ste evitando que se formen bolsas de aire.
Utilizar pipetas (o goteros o jeringas) distintos para la muestra y los controles positivos y
negativos.
Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente 20 semillas (cinco hileras de cuatro
semillas, o cuatro hileras de cinco semillas), dejando espacio suficiente entre las semillas
para permitir la elongacin de las races. Seleccione semillas de tamao, forma y color
similar.

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1
Ilustracin
3. Caja de Petri con semillas de lechuga

Tapar las cpsulas, dado que algunas variedades de semillas de lechuga requieren
oscuridad para que se produzca la germinacin (semillas fotoblsticas negativas), las cajas
de Petri deben cubrirse de la luz inmediatamente despus de colocar las semillas en su
interior; para esto debe envolverse cada caja de Petri con papel aluminio.
Repetir el procedimiento pero utilizando el agua embotellada (control negativo) y la solucin
de NaCl como control positivo.
Marcar con cinta de enmascarar cada caja de Petri envuelta con papel aluminio. El control
negativo se marcar como C (-), el control positivo con una C(+), la muestra como M y la
repeticin correspondiente.
Asegrese de no voltear (no dar vuelta) las placas boca abajo, etiquetando "Parte de arriba"
en cada placa envuelta.
Colocar las placas de Petri envueltas en papel aluminio dentro de una bolsa plstica (ziploc)
para prevenir que se escape la humedad.
Colocar las placas en un lugar seguro, a temperatura ambiente por cinco das, a resguardo
de la luz solar directa.
C. Ejecucin de las observaciones y mediciones
Despus de cinco das, o aproximadamente 120 horas:
Cada punto final se evala comparando el efecto generado en los organismos expuestos a
la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control negativo, sujetos a las
mismas condiciones de ensayo, excepto por la ausencia de la muestra contaminada.
Desenvolver cuidadosamente cada placa Petri, luego se deber contar y apuntar el
nmero de semillas germinadas en cada placa.

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1
Ilustracin
4. Semillas de lechuga germinadas

Se evala el efecto en la germinacin, para esto se registra el nmero de semillas que


germinaron normalmente, considerando como criterio de germinacin la aparicin
visible de la radcula.
Segundo se observa el efecto en la elongacin de la radcula e hipocotilo (figura 1),
utilizando una regla o papel milimetrado se deber medir cuidadosamente la longitud
de la radcula y del hipocotilo de cada una de las plntulas, correspondientes a cada
concentracin del compuesto txico o dilucin de muestra y a los controles. La
medida de elongacin de la radcula se considera desde el nudo (regin ms
engrosada de transicin entre la radcula y el hipocotilo) hasta el pice radicular. La
medida de elongacin del hipocotilo se considera desde el nudo hasta el sitio de
interseccin de los cotiledones.

Ilustracin 5. Partes de la semilla

Fuente: Ramirez, P. y Mendoza (2008).

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1 Antes de retirar las plntulas de las cajas petri para evaluar el efecto en los puntos

finales anteriormente mencionados, es importante realizar una observacin detallada


del estado general de las mismas y del crecimiento de la radcula sobre el papel de
filtro. Informar cualquier indicador de fitotoxicidad o de crecimiento anormal en las
plntulas tratadas y en los controles (pices radiculares con necrosis, pelos
absorbentes poco desarrollados, radculas con crecimiento ensortijado, necrosis en
los cotiledones, etc.). La necrosis (presencia de tejido muerto) se evidencia como
manchas localizadas de coloracin parda, blanca o marrn. Al evaluar el efecto en la
germinacin, consignar adems aquellas semillas con germinacin anormal
(emergencia de cotiledones o cotiledones e hipocotilo solamente, pero sin emergencia
de la radcula) o con desarrollo de hongos.
Posteriormente se saca cada semilla germinada, se mide y se apunta el largo de cada
raz en la libreta de notas. Para medir el largo de la raz, puede ser ms sencillo
colocando las races contra un fondo oscuro. Pegue la regla con cinta adhesiva a ese
fondo oscuro y luego, cuidadosamente, "estire" las races a su longitud mxima,
apunte la medida obtenida para cada semilla de cada tratamiento.
La siguiente ilustracin muestra los estadios por los que atraviesa la semilla durante el
ensayo de germinacin y elongacin:
Ilustracin 6. Estadios de la semilla durante el ensayo

Fuente: Ramirez, P. y Mendoza (2008).

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1 Expresin de resultados
D.

Se realizan los siguientes clculos:


Promedio (P) y desviacin estndar (S) de la elongacin de la radcula y del hipocotilo
de las plntulas de cada repeticin para cada tratamiento.
Debe llenar la siguiente tabla:
Variable

Muestra contaminada

M - R1

M - R2

Control
negativo

Control
positivo

C (-)

C (+)

M - R3

Elongacin
radcula Er
(cm)
Promedio Er
(cm)
Desviacin
estndar Er
Elongacin
hipocotilo Eh
(cm)
Promedio Eh
Desviacin
estndar Eh

R1: Repeticin 1

R2: Repeticin 2

R3: Repeticin 3

Calcular el porcentaje de inhibicin del crecimiento de la radcula y del hipocotilo con


el promedio de elongacin para cada dilucin respecto del promedio de elongacin
del control negativo.
%Inhibicin radcula = Promedio Er (muestra)/Promedio Er (control negativo)*100
%Inhibicin hipocotilo = Promedio Eh (muestra)/Promedio Eh (control negativo)*100
Esto se calcula para cada dilucin utilizada.
Calcular el porcentaje de inhibicin en la germinacin
Contar el nmero de semillas germinadas, para facilitar la toma de datos, llene la siguiente
tabla:

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Variable

Muestra contaminada

M- R1

M-R2

Control
negativo

Control
positivo

C(-)

C(+)

M- R3

Numero
de
semillas
germinadas (Sg)
Promedio Sg

R1: Repeticin 1

R2: Repeticin 2

R3: Repeticin 3

Con los datos anteriores se procede a calcular el porcentaje de inhibicin de la germinacin


utilizando la siguiente frmula:
% Inhibicin germinacin = semillas germinadas muestra/semillas germinadas control
negativo*100
Como punto final se debern hacer 1 grafica de un plano cartesiano con los resultados,
colocando en la ordenada el valor de semillas germinadas, y en el eje x se colocan los
tratamientos.
Si se tuviera la concentracin inicial del contaminante de inters en la muestra sera posible
elaborar la grfica dosis-respuesta, colocando en la ordenada el porcentaje de inhibicin y
en la abscisa la concentracin. Posteriormente con un mtodo grfico o el uso de programas
estadsticos, se calculara la concentracin que produce el 50% de inhibicin (CI50/CE50)
para cada punto final evaluado. Para el caso de muestras en donde la inhibicin es inferior al
50%, o para determinar el valor correspondiente al NOEC o LOEC, se realizara el anlisis
de comparacin de medias (t Student, Dunnett) para verificar la significancia estadstica en
el porcentaje de efecto.
Sin embargo, los alcances de esta prctica llegan solo hasta el clculo del % de inhibicin de
germinacin, no los siguientes ndices debido al desconocimiento de la concentracin del
contaminante de inters en la muestra.
B. Elementos necesarios para la prctica
-

1 sobre de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) (Que no sean tan antiguas, ver
fecha de lote).
5 cajas de Petri (de vidrio o plstico, de 100 mm de dimetro).

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1-

3 Goteros o jeringas de 5mL que permitan medir 4mL.


1 Probeta de 250mL o un recipiente que este graduado cada 100mL o 50mL.
Papel de filtro Whatman No. 3 (o 5 pedazos de papel absorbente de cocina
cortado) de 90mm de dimetro, deben ajustar bien en las cajas de petri.
Pinzas o algo similar para coger las semillas.
Sal de cocina
3 Lt de agua destilada o agua en bolsa sin gas.
1 recipiente o botella de 1,5Lt limpia.
Papel aluminio (el suficiente para envolver sus 5 cajas de Petri).
Cinta de enmascarar
Libreta de apuntes
Regla
Guantes de ltex.
1 Litro de muestra de agua a evaluar, mnimo 500mL.

BIBLIOGRAFIA
-

Ramrez, P. y Mendoza, A. (Compiladoras). (2008). Ensayo de toxicidad aguda con semillas de


lechuga Lactuca sativa L. Ensayos toxicolgicos para la evaluacin de sustancias qumicas en agua y
suelo La experiencia en Mxico. 17 55. Instituto Nacional de Ecologa. Mxico.

IDRC-CDRI.
Aquatox
2000.
(2000).
bnc.idrc.ca/dspace/bitstream/10625/31600/1/118283.pdf

Disponible

en

http://idl-

C. Productos a entregar
Informe de mximo 10 hojas, letra Arial 12, espacio 1.15, con fotografas del experimento
(mximo 6).
Las partes del informe sern:
- Portada
- Introduccin
- Un mapa conceptual sobre los tipos de bioensayos y bioindicadores utilizados en
toxicologa ambiental.
- Diagrama de flujo del laboratorio elaborado
- Descripcin de la muestra llevada al bioensayo.
- Resultados
- Anlisis de resultados
- Conclusiones
- Bibliografa
Los estudiantes deben subir individualmente el informe en el entorno de Evaluacin y
seguimiento. Previo a subir el documento debern participar en el foro practica
toxicologa ambiental donde intercambiaran sus ideas e inquietudes sobre los resultados
obtenidos en la prctica y as podrn colaborarse mutuamente en el desarrollo del
informe, aunque este es de carcter individual y cada uno deber subirlo solo en el
entorno de evaluacin y seguimiento, no en el foro.

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D. FORMATO DE RBRICA DE EVALUACIN: La siguiente tabla denominada rbrica


de evaluacin, es la forma como se les calificar la actividad prctica y la actividad del
campus virtual, por favor tenerla en cuenta para la entrega del producto final y
posteriores reclamaciones:
tem
evaluado
Participacin
individual del
estudiante en
el foro de Aprendizaje
Prctico, discutiendo
sus resultados los de
sus compaeros
El estudiante subi el
informe de prctica a
la plataforma del curso

Valoracin
Valoracin
Valoracin
baja
Media
Alta
Evaluacin director de curso o tutor virtual
El estudiante
El estudiante
participo en el foro
El estudiante
nunca particip
pero no realizo
particip de manera
del trabajo dentro
discusiones sobre
pertinente con la
del foro asignado
ninguna de las
actividad
inquietudes
(Puntos = 0)
planteadas en el foro.
(Puntos = 50)
(Puntos = 25)
El estudiante no
subi el informe
de prctica a la
plataforma segn
lo solicitado

No Aplica

El estudiante
subi el informe
de prctica a la
plataforma del
curso segn lo
solicitado

Mximo
Puntaje

50

10

(Puntos = 0)

Desarrollo del
bioensayo.

El estudiante no
desarrollo la
prctica completa.
(Puntos = 0)

Desarrollo de
competencias

Presentacin del
informe

El estudiante no
logr desarrollar
las competencias
planteadas en la
actividad
(Puntos = 0)
El estudiante no
entreg el informe
de la actividad
planteada

(Puntos = 0)
Total Puntos calificados

El estudiante
desarrolla la prctica
completa pero no
obtiene los
resultados
esperados.

(Puntos =10)
El estudiante
desarrolla la
prctica y obtiene
los datos completos
y los resultados
esperados.
(Puntos = 30)

(Puntos =15)
El estudiante logr
desarrollar
parcialmente las
competencias
planteadas en la
actividad
(Puntos = 15)
El informe no aborda
totalmente los puntos
solicitados

El estudiante logr
desarrollar
satisfactoriamente
las competencias
planteadas para la
actividad
(Puntos = 30)
El informe cumple
con lo solicitado
por el curso

(Puntos = 15)

(Puntos = 30)

30

30

30

150