SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
JUAN GUILLERMO CUBILLOS HINOJOSA
Microbiologo Agroindustrial (c)MSc.

DETERMINACION DEL GRUPO COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES

FECALES (E.coli) EN ALIMENTOS MEDIANTE LA TECNICA DE
FERMENTACION EN TUBOS MULTIPLES
NUMERO MS PROBABLE (NMP)
1. INTRODUCCION
El grupo coliformes est formado por todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas,
gram negativas, no formadoras de esporas y con forma de baston que fermentan lactosa,
produciendo gas y acido en 48 horas a 35C+/-2. Este grupo lo comprenden varios gneros
de la familia Enterobacteriacea; se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza,
agua y suelo. Es habitual encontrarlos en el tracto intestinal del hombre y animales de
sangre caliente.
La determinacin de coliformes fecales (E.coli) en los alimentos se utiliza para
diferenciarlos de otros grupos coliformes de otros orgenes. Los fecales son indicadores del
contacto de la materia prima o el procesamiento del alimento con materia fecal.
La presencia de coniformes en el alimento es signo de mala calidad higinica en el proceso,
mala manipulacin del alimento, recontaminacin despus del proceso y aun de
contaminacin fecal.
La tcnica de fermentacin en tubos mltiples, los resultados del estudio de los tubos y
diluciones replicados se comunican en trminos de Numero Mas Probable (NMP) de
microorganismos existentes. Est numero, basado en determinadas formulas de
probabilidad, es un calculo de la densidad media de coliformes en la muestra.
2. OBJETIVO

Determinar el grupo coliformes totales en muestras de alimentos.

Adquirir destreza en la determinacin de coliformes fecales (E.coli) en los
alimentos.
Adquirir destreza en el montaje de la tcnica de fermentacin de tubos mltiples.

3. MATERIALES

Caldo Bilis Verde Brillante

Agua peptonada
Tubos de ensayo tapa rosca
Campanas Durham
Micropipeta
Pipetas de 1mL
Maceradotes
Probetas
Incubadora
Gradillas

4. METODOLOGA
Procesar la muestra y realizar las diluciones seriadas en agua peptonada.
Prueba para coliformes totales

Pipetear 1mL de cada una de las diluciones del homogenizado del alimento en tubos
con caldo bilis verde brillante, utilizando tres tubos por cada dilucion.
Agitar suavemente los tubos e incubarlos a 35C +/-2 durante 24-48 horas.

Prueba para coliformes fecales (E.coli)

Tomar a partir de los tubos positivos en C. totales una azada y transferirlas a los
tubos con caldo bilis verde brillante.
Agitar los tubos e incubarlos a 44.5C+/-2 durante 24-48h.

Prueba confirmatoria de (E.coli)

Tome los tubos positivos de la prueba anterior y simbrelos en una caja Petri que
contenga EMB.

Tcnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas lquidas o slidas)

10
Gram
os

10
ml

1ml

1ml

90
ml
Agua
pept
ona
10-1
1
m
l

9 ml
A.Pe
p
10-2

9 ml
APep
10-3

1
m
l

1
m
l

Incubar 35C +/-2 durante

24-48 horas

Incubar 44.5C +/-2 durante

24-48 horas

Confirmar tubos positivos

sembrndolos en EMB e
incubando a 35C+/-2

5. LECTURA DE RESULTADOS

Coliformes totales

Pasado en tiempo de incubacin, obsrvese los tubos que muestren fermentacin

(turbidez) y produccin de gas, que se observa por el desplazamiento del medio en
la campana de Durham; reprtelos como positivos.

Coliformes fecales (E.coli)

Pasado en tiempo de incubacin, obsrvese los tubos que muestren fermentacin
(turbidez) y produccin de gas, que se observa por el desplazamiento del medio en
la campana de Durham; reprtelos como positivos, teniendo en cuenta la prueba
confirmatoria de E.coli en agar EMB.

Confirmacin de E.coli
Obsrvese las colonias tpicas de E.coli siguiendo las caractersticas establecidas
por el medio cultivo EMB y reporte los tubos confirmados como positivos.

6. EXPRESION DE LOS RESULTADOS

De acuerdo a la serie obtenida en cada una de las pruebas, obsrvese la tabla anexa
de NMP para tres tubos.

Los resultados se expresan como NMP/ g mL de alimento; hay veces dependiendo

del alimentos se expresa como NMP / 100mL. Los resultados de un anlisis de
NMP, estn directamente relacionados con la frecuencia con que se presentan una
serie de resultados positivos, que son los ms probables que ocurran cuando un
nmero dado de organismos estn presentes en una muestra de alimentos.

Nota: En caso de realizar ms diluciones que las que posea la tabla empleada, se puede
usar la siguiente frmula para hallar el NMP por g mL:
(NMP de la tabla x Factor de dilucin intermedio de la lectura)/ 100 = NMP/g mL
7. BIBILOGRAFIA

INVIMA. 1998. Manual de tcnicas de anlisis para control de calidad

microbiolgico de alimentos para consumo humano.
BAM. 2002. Enumeracin de coliformes y E. coli NMP. Cap 4 Metdo II

ANEXO
TABLA NO. 1
TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS
NMERO DE TUBOS POSITIVOS NMP/g mL
LIMITES DE CONFIANZA
10-1
10-2
10-3
99%
95%
000
<3
<1
23
<1
17
010
3
<1
28
1
21
100
4
1
35
2
27
101
7
1
36
2
28
110
7
2
44
4
35
120
11
1
50
2
38
200
9
3
62
5
48
201
14
3
65
5
50
210
15
5
77
8
61
211
20
5
80
8
63
220
21
4
177
7
129
300
23
10
230
10
180
301
40
10
290
20
210
310
40
20
370
20
280
311
70
20
520
30
390
320
90
30
660
50
510
321
150
50
820
80
640
322
210
100
1900
100
1400
330
200
100
3200
200
2400
331
500
200
6400
300
4800
332
1100
333
>2400