La

catalasa es una enzima que descompone el

perxido de Hidrgeno en oxgeno y agua(El perxido
de Hidrgeno se forma como uno de los productos
finales del metabolismo oxidativo aerbico de los
hidratos de carbono).
Qumicamente la catalasa es una hemoprotena de
estructura similar a la de la hemoglobina,
Excluyendo los estreptococos, la mayora de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen
actividad catalasa.

 La

prueba de catalasa, llevada a cabo en

portaobjetos o en tubos es comnmente utilizada
para diferenciar estreptococos (negativos) de
estafilococos (positivos)

 Medios

y reactivos
1.- Cultivo de 24 horas del
microorganismo en un medio no
selectivo y que contenga sangre
2.- Perxido de Hidrgeno al 3%
(diluir la solucin de 30% con agua
destilada)

Prueba en portaobjetos
1.- Transferir con asa clulas del centro de una
colonia bien aislada a la superficie de un
portaobjetos en que se coloc una pequea gota de
agua. Emulsionar bien
2.- Aadir 1 o 2 gotas de perxido de Hidrgeno al
3%. Se recomienda no aadir el organismo al
reactivo, especialmente si se utilizan asas que
contengan hierro, ya que se pueden producir falsos
positivos
Prueba en tubos o placas de agar
Aadir unas gotas de perxido de Hidrgeno al 3%
directamente sobre la superficie de una placa o tubo
de agar donde se ha desarrollado un cultivo puro del
organismo en estudio

1.- Prueba cualitativa: la rpida aparicin y

produccin sostenida de burbujas de gas o
efervescencia indica una prueba positiva. Dado que
algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de
la catalasa capaces de descomponer el perxido de
Hidrgeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a
los 20 a 30 segundos no se considera una prueba
positiva
2.-Prueba semicuantitativa: las determinaciones
cuantitativas de catalasa se llevan a cabo ms
comnmente en la identificacin de mico bacterias.
Se mide la altura que alcanza la formacin de
burbujas de gas en el tubo, luego aadir el perxido
de Hidrgeno. Una columna de burbujas de 50mm o
ms, se considera una reaccin fuertemente positiva.

CITOCROMO OXIDASA

Fundamento

Los citocromos son Hemoproteinas y actan como el ultimo eslabn de la

cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (Hidrogeno) al oxigeno,
con formacin de agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos
aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de Oxidasa es
importante para identificar aquellos organismos que carecen de esta enzima

La prueba es muy til para diferencia Enterobacterias (Todas Oxidasa

negativas) de otras especies como Pseudomona o Neisserias oxidasa positiva.

Reactivos

Medios y reactivos

1. Cultivo de 24 horas del microorganismo, en un medio libre de colorantes

que pueda interferir en el ensayo, en un medio no selectivo.

2. Solucin al 1% de diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina (producto de

color rosado), o clorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (producto de color
azul), recin preparada.

Procedimientos

La prueba puede realizarse por 2 mtodos:

1) Tcnica directa en placas, en la cual se aaden directamente 2 a 3 gotas

de reactivo a las colonias aisladas que desarrollan en placas.

2) Tcnica indirecta en tiras os discos de papel, en la que se aaden unas

gotas de reactivo a una tira de papel de filtro (colocada en una placa de Petri
limpia) y se extiende luego un ansa de la colonia sospechosa. Se debe realizar
un control negativo del asa ya que sta puede producir falsos positivos.

Interpretacin

Cuando se utiliza el reactivo tetrametil-p-fenilendiamina:

Se considera el ensayo como positivo cuando aparece un color azul profundo en un tiempo menor a 10 seg.
Se considera positivo lento a confirmar cuando el color aparece entre 10 y 60 seg. Y se considera negativo
cuando no hay desarrollo de color o cuando se produce en un tiempo mayor a 60 seg.

Cuando se utiliza el reactivo dimetil-p-fenilendiamina:

Se considera el ensayo como positivo cuando aparece un rosado a fucsia en un tiempo de

aproximadamente 2 minutos.

Controles

Positivo: Pseudomonas aeruginosa

Negativo: Escherichia coli

Limitaciones

El ensayo en placa es menor sensible que el ensayo en papel de filtro, por lo que un ensayo negativo
utilizando el primer mtodo debe compararse con el segundo. El reactivo tetrametil-p-fenilendiamina es
ms estable durante el almacenamiento y ms sensible a la deteccin de citocromo oxidasa.

Prueba de Oxidacin-Fermentacin (O/F)

Medio de cultivo:
-

Medio bsico de Hugh Leifson, medio O/F.

Componentes:
-

Peptona
Cloruro de sodio
Fosfato de potasio
Hidratos de carbono (glucosa, sacarosa, lactosa,
maltosa)
Agar
Agua destilada
Indicador de pH: azul de bromotimol
cido: color amarillo (pH=6)
Alcalino: azul de Prusia intenso (pH=7.6)
Medio no inoculado: verde (pH=7.1)

Se deben tener dos tubos para esta prueba, uno sin sello y
otro con sello de parafina

Fundamento
Determina el metabolismo oxidativo o fermentativo de un
hidrato de carbono
Consistencia del medio
Semislido (tambin permite la observacin de la movilidad)

Inoculacin
Picadura, inoculo poco denso. Picar ambos tubos
aproximadamente hasta 0.6 mm de fondo.
Condiciones de incubacin
Tiempo: 18-24 hrs
Temperatura: 35 37 C

Resultados

Es utilizado para diferenciar

microorganismos especialmente
Salmonella sp, basado en la
descarboxilacin y desanimacin de la
lisina y en la produccin de c.
Sulfhdirco.

La peptona y el extracto de casena aportan los

nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano.
La glucosa es el carbohidrato fermentable
La lisina es utilizada para detectar a enzimas
descarboxilasas y desaminasas.
El citrato de hierro y amonio y el tiosulfato de sodio son
los indicadores de la produccin de c. sulfhdrico.

Indicador: Purpura de bromocresol; a pH de 5.2 o

menos es amarillo y a pH igual o mayor de 6.8 su color
es violeta.
Los microorganismos fermentables de glucosa
acidifican el medio y producen un vire del color violeta
al amarillo

PRUEBA BIOQUMICA MIO

ARELY NATHALIE CABRERA GRANADOS.

MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA: MIO

Composicin:
Consistencia del medio: semislido
en forma vertical.

Inoculacin: por picadura, en forma

vertical.

Condiciones de incubacin:
Tiempo: 24-8 hrs
Temperatura 35- 37 C

FUNDAMENTO.
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de
extracto de levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta
grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la
realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono
fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina
descarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en
medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo.

FUNDAMENTO.
El medio MIO se utiliza para la identificacin de Enterobacterias. Por su
composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo:

Movilidad.
La produccin de ornitina descarboxilasa.
Produccion de indol.

DESCARBOXILACIN DE ORNITINA.

Mide la capacidad enzimtica de un organismo para descarboxilar un aminocido

(ornitina) para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad.

La descarboxilacin es el proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas

descarboxilasas especificas son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo
carboxilo dando una amina o una diamina y anhdrido carbonico.

La descomposicin de los aminocidos se produce anaerbicamente. El proceso de

descarboxilacin es irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima: fosfato de
piridoxal.

 La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio.
Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una
condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol
vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la
actividad de la enzima ornitina descarboxilasa, la cual descarboxila la
ornitina presente.

Por descarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del

indicador hacia el color prpura.

MICROORGANISMOS ORNITINA POSITIVOS:

Especies de enterobacter
Proteus mirabilis.
Proteus morganii
Yersinia enterocolitica

MICROORGANISMOS ORNITINA NEGATIVOS:

Especies de klebsiella
Enterobacter aglomerans
Proteus vulgaris
Proteus rettgeri
Yersinia pestis
Yersinia pseudotuberculosis.

PRUEBA DE PRODUCCIN DE INDOL.

El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que
contienen la enzima triptofanasa.

La prueba se basa en la formacin de un complejo de color rojo cuando el

indol reacciona con el grupo aldehdo de p-dimetilaminobenzaldehido
(sustancia activa del reactivo de Kovacs), el cual indica un resultado positivo.

 La formacin de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces

de fermentar los hidratos de carbono.

El agregado de tritofano estimula la produccin de indol ya que es un

aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias, formando el mismo.

Mientras que la glucosa la inhibe, debido a la elevada acidez producida por

la fermentacin de la glucosa.

MOVILIDAD.

Determina si un organismo es mvil o inmvil. La movilidad se demuestra por un

enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de
inoculacin.

Generalmente se consideran mviles a los bacilos con flagelos e inmviles a los

cocos.

Las bacterias mviles pueden contener un solo flagelo o muchos. A veces las
bacterias con movilidad producen variantes no mviles que parecen ser estables y
raramente se revierten en formas mviles. Los organismos no mviles carecen de
flagelos.

RESULTADOS.
1-Movilidad:
-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas all de la lnea de siembra.
-Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra.

2-Ornitina decarboxilasa:
-Resultado positivo: color prpura.
-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la superficie
del medio.
3-Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de
ornitina.
-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.
-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

APLICACIONES DE LA PRUEBA BIOQUMICA MIO.

SUGERENCIAS.
Se leen las reacciones de movilidad y de ornitina descarboxilasa antes de
agregar el reactivo de kovacs para la prueba de indol.

Para la prueba de indol adicionar 5 gotas de reactivo de kovacs y agitar

suavemente el tubo. Interpretar inmediatamente. La reaccin positiva despus
de 24 hrs indica una prueba completa, si el cultivo de 24 hrs es negativo
deber incubarse otras 24 hrs y repetirse la prueba.

BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
LICENCIATURA EN FARMACIA
ALUMNA: ANA PAOLA GONZLEZ LPEZ
PROFESORA:REYNA DEL CONSUELO ALMIRAY PINZN
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

COAGULASA

La coagulasa es una protena producida por varios microorganismos

que permiten la conversin del fibringeno en fibrina.
En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de
STAPHYLOCOCCUS.

*FIBRINOGENO(ES UNA PROTEINA SOLUBLE DEL PLASMA SANGUINEO

PRECURSOR DE LA FIBRINA,ES RESPONSABLE DE LA FORMACION DE COAGULOS
DE SANGRE).

Un resultado de la coagulasa positivo indica que la muestra contiene

STAPHYLOCOCCUS AUREUS .Esta protena tambin es producida por
YERSINIA PESTIS.(bacilo Gram negativo anaerobio facultativo y
patgeno primario, del gnero Yersinia, que produce en el ser
humano la peste pneumnica, la peste bubnica y tambin la peste
septicmica, aunque la ltima es muy poco comn.)

FUNDAMENTO
Detecta un factor de agregacin
clumping factor en la
superficie de la bacteria.Esta
prueba se usa para diferenciar
especies dentro del genero
staphylococcus.La prueba de la
coagulasa se usa para identificar
s.aureus y con frecuencia se usa
para indicar virulencia o
patogenicidad.

PROCEDIMIENTO
Se coloca una colonia
sospechosa de
pertenecer una especie
de staphylococcus y se
emulsifica en una gota de
plasma de conejo.

 S. aureus posee dos tipos de coagulasa:

a) Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que est unida a la
pared celular.Esta acta directamen te sobre el fibringeno provocando la
formacin de cogulos o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana
con plasma citratado (test en lmina).
b) Una exocoagulasa o coagulasa libre que acta mediante la activacin de un
factor srico (CRF), formndose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona
con el fibringeno producindose un cogulo de fibrina (test en tubo).Mientras
el test en tubo es definitivo, el test en lmina nos sirve como una rpida y
econmica tcnica de tamizaje (screening). Entre un 10 a 15% de las cepas de
S. aureus se mostrarn negativas en el test en lmina, por lo cual en esos casos
se hace necesario realizarun test en tubo.

La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo

resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa
convierta el fibringeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre. La
coagulasa est estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria
S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto
con la sangre. Se cree que esta cubierta de fibrina del estafilococo es
capaz de resistir la fagocitosis haciendo esta bacteria tenga un factor de
virulencia mayor. La coagulasa Bound es parte de una familia ms grande
de MSCRAMM.

PRUEBA DE LA COAGULASA
La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus
aureus del coagulase-negative staphylococci. S.aureus produce 2
formas de coagualasa (por ejemplo, coagulasa ligada y coagulasa
libre). La coagulasa ligada tambin conocida como "factor de
Clumping " se puede detectar mediante la realizacin de una
prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una prueba de
coagulasa de tubo.

PRUEBA EN PORTAOBJETOS
Prueba del portaobjetos se hace conjuntamente con un control
negativo para descartar auto aglutinacin. Se ponen 2 gotas de
solucin salina en el portaobjetos microescpico rotulado con un
nmero de muestra, Test (T) y control (C). Las 2 gotas son
emulsionadas con la prueba de organismo mediante el uso de un
cable de lazo, cable recto, o un palo de madera. Se pone una gota de
plasma (plasma de conejo con anticoagulante (EDTA)acido
etilendiaminotetraacetico) en la gota de solucin salina inoculada
correspondiente a la prueba y se mezcla bien con un una varilla de
madera. Agitar el portaobjeto con cuidado unos 10 segundos.

 Si es positivo: Se podr observar aglutinacin macroescopica en el

plasma en los 10 segundos mientras que no se observara
aglutinamiento en la gota de solucin salina.
Si es negativo: No se observara aglutinamiento.
NOTA: Si la prueba de la coagulasa de portaobjetos fuera negativa,
debera hacerse una prueba de tubo como confirmacin. El
aglutinamiento en las dos gotas es un indicativo de auto
aglutinacin y por lo tanto debemos descartar la prueba de tubo.

PRUEBA DE TUBO DE ENSAYO

La prueba se utiliza plasma que ha sido inoculado con una colonia
de staphylococcal (por ejemplo, con un coco Gram positivo catalasa
positivo). Luego el tubo se incuba a 37 grados Celsius en 1 horas.
Si es negativo entonces continuamos la incubacin por unas 18
horas.

 Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el

suero coagular,dando como resultado un cogulo (a veces el
cogulo esta tan desarrollado que el lquido se solidifica
completamente).
Si sale negativo, el plasma permanece lquido. Un resultado
negativo podra indicar que se podra tratar de S. epidermidis pero
solo con unas pruebas ms precisas se puede confirmar este hecho,
como por ejemplo el API o mtodos de BBL CRYSTAL.

CONCLUSION
Permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies
de Staphylococcus (coagulasas negativos). La tcnica en tubo detecta coagulasa libre
y ligada.
Mecanismo de accin de la coagulasa libre: procoagulasa (enzima extracelular
bacteriana) reacciona con un factor activador presente en el plasma sanguneo
similar a la protrombina, dando lugar a un complejo anlogo a la trombina
(coagulasa propiamente dicha) que reacciona con fibringeno formando un cogulo
de fibrina en ausencia de Ca2+.
La coagulasa ligada o factor de agregacin acta directamente sobre el fibringeno y
lo convierte en fibrina. No requiere la presencia de activadores plasmticos.

UREA
INTRODUCCIN:

La urea es una diamida del cido carbnico con la formula

CO(NH2)2.
Todas las amidas son fcilmente hidrolizadas con liberacin de amoniaco
y dixido de carbono.
La urea constituye la fraccin de nitrgeno no proteico ms importante en
la mayora de los lquidos biolgicos. En el hombre es el principal
producto final del metabolismo proteico. Se produce en el hgado y es
excretada por la orina a travs de los riones.
La ureasa descompone especficamente la urea produciendo dixido de
carbono y amonaco. Este reacciona en medio alcalino con salicilato e
hipoclorito para dar indofenol color verde.

 Principio:
La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de
microorganismos que pueden hidrolizar urea de acuerdo con la
siguiente reaccin qumica:

NH2 ----- C----- NH2 + 2H2O

CO2 + H2O + 2NH3 (NH4)2CO3

Ureasa

El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio ,

producindose una alcalinizacin y un aumento del pH del medio .

 Medios y reactivos:
El caldo urea de Stuart y el agar urea de Christensen son los dos
medios ms comnmente utilizados en los laboratorios clnicos para la
deteccin de actividad de ureasa.

Tcnica:
Inocular el caldo con un asa cargada con el organismo previamente
aislado en cultivo puro; estria la superficie del agar con el organismo en
estudio .Incubar ambos medios a 35 C durante 18 a 24 horas.

Interpretacin:
Los microorganismos que hidrolizan urea rpidamente pueden producir
reacciones positivas en 1 o 2 horas ; las especies menos activas
pueden requerir 3 o ms das .

 Las reacciones son:

Caldo Stuart: un color rojo en todo el medio indica

alcalinizacin e hidrlisis de urea.
Agar de Christensen:
1.-Degradadores rpidos de urea (Proteus spp.): color
rojo en todo el medio
2.-Degradadores lentos de urea (Klebsiella spp.): color
rojo inicial solo en el pico y gradualmente abarca todo el
tubo.
3.-No hay hidrlisis de urea: el medio conserva el color
amarillo original.

CITRATO:

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de
carbono y compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno
Agar Citrato de Simmons
Medio utilizado para la identificacin de enterobacterias.

Fundamento
La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un
medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el
crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza
con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7.6

Tcnica
Se inocula el agar inclinado en una sola estra
en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un
medio slido y cuidando no arrastrar medio de
cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos
por crecimiento a partir del medio de cultivo del
inoculo. Incubar a 35o C durante 4 horas.