I.

INTRDUCCION

La Cromatografa

lquida

de

alta

eficacia o High

performance

liquid

chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada

frecuentemente en bioqumica y qumica analtica. Tambin se la denomina a
veces Cromatografa lquida de alta presin o Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin (High

pressure

liquid

chromatography)

(HPLC),

aunque

esta

terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica

utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes
tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatogrfica.
En la HPLC, el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con
ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido
(fase mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es
introducida

en

pequeas

cantidades

sus

componentes

se

retrasan

diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase

estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retencin de los
componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la
composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que tarda un
compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencin y se
considera una propiedad identificativa caracterstica de un compuesto en una
determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de
cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la
columna y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de
la cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el
acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido
trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos.

II.

MARCO TEORICO
2.1.

DEFINICION DE HPLC

La cromatografa lquida (HPLC), es una tcnica utilizada para separar los

componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase mvil. La fase estacionaria es slica que se ha tratado
con RMe2SiCl. La fase mvil acta de portador de la muestra.
La muestra en solucin es inyectada en la fase mvil. Los componentes de
la solucin emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los
compuestos con la columna. Estas interacciones qumicas, determinan la
separacin de los contenidos en la muestra. La utilizacin de los diferentes
detectores depender de la naturaleza de los compuestos a determinar.

2.2.

Tipos de HPLC

2.2.1. Cromatografa de fase normal

La cromatografa de fase normal o "Normal phase HPLC" (NP-HPLC) fue el
primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se
caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta
tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se
utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto
polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de
adsorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la
interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en
comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin.

La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del

compuesto de inters, sino tambin en factores estericos de forma que los
ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La
utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo
de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms
hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin.

La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC
de fase reversa o Reversed-phase HPLC debido a la falta de
reproductibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes
prticos cambiaban el estado de hidratacin de la silica o almina de la
cromatografa.

2.2.2. Cromatografa de fase reversa

La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria
apolar y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases
estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa es la silica
tratada con RMe2SiCl, donde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o
C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza
apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms
rpidamente.

El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase

mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La
cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo
denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de
fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que
resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar,
un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La
fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la
disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente.
Este efecto hidrofbico est dominado por el aumento de la entropa, y la
consecuente disminucin de la energa libre, asociada con la minimizacin
de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye
con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el
coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la
columna y eluye.

Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy

importante en la retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil
larga se asocia con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la
hidrofobicidad de la molcula. Aun as, las molculas muy grandes pueden
ver reducida la interaccin entre la superficie del compuesto y la fase
estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de superficie
hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del
compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que
sus ismeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la

fase mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la
adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin
superficial, y como que la entropa de la interfase compuesto-disolvente
est controlada precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales
tiende a aumentar el tiempo de retencin.

Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la

hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos
utilizan un tampn como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH.
Estos tampones controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o
cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado
expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del
compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar,
pero en general mejoran la separacin cromatogrfica.

Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que
las columnas de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase
reversa estn formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se
deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que stas podran
daar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en

cidos en medio acuoso pero no deberan estar expuestas demasiado

tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de
HPLC.

2.2.3. Cromatografa de exclusin molecular

La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como
cromatografa por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en
funcin de su tamao. Generalmente se trata de una cromatografa de baja
resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de
purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de la estructura
terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas purificadas.

La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en

columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso
molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes.

En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros

entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines
prcticos,

las

columnas se

empaquetan

con

pequeas partculas

esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados. En consecuencia,

estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas
molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en
tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente.
Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina
una serie de caminos a ser recorridos por las molculas que acceden al
interior de esta.

2.2.4. Cromatografa de intercambio inico

Artculo principal: Cromatografa de intercambio inico
En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la
atraccin electrosttica entre los iones en solucin y las cargas
inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son
excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna.
Algunos tipos de intercambiadores inicos son: i) Resinas de poliestireno, ii)
intercambiadores inicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa
o vidrio de tamao de poro controlado. En general los intercambiadores
inicos favorecen la unin de iones elevada carga y radio pequeo. Un
incremento en la concentracin del contrain (respecto a los grupos
funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin. Un incremento en el
pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio
catinico mientras que una disminucin del pH reduce el tiempo de
retencin en las cromatografas de intercambio aninico. Este tipo de
cromatografa es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones:
purificacin de agua, concentracin de componentes traza, Ligandexchange chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins,
High-pH

anion-exchange

chromatography

of

carbohydrates

and

oligosaccharides, etc.

2.2.5. Cromatografa basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias
biolgicamente activas de formar complejos estables, especficos y
reversibles. La formacin de estos complejos implica la participacin de
fuerzas

moleculares

como

las

interacciones

de

Van

der Waals,

interacciones electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones

hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la
fase estacionaria.

2.2.6. Cromatografa lquida de alta eficacia en condiciones

desnaturalizantes (DHPLC)
Se trata de un mtodo que se emplea para el rastreo de mutaciones (ya
casi totalmente en desuso debido al auge de la secuenciacin), que permite
detectar la presencia de variaciones en el ADN aunque no se determinan
especficamente cules. En este caso, se utiliza la tcnica cromatogrfica
para la deteccin de heterodplex de ADN, en lugar de utilizar un gel para
correr las molculas de cidos nucleicos.

El procedimiento consiste en desnaturalizar (aumentando la temperatura

normalmente) una muestra que contenga tanto el ADN problema como un
ADN control, que no es ms que el mismo ADN problema pero en su
versin silvestre o normal (sin mutaciones). Luego se procede a
renaturalizar (disminuyendo la temperatura), de manera que aquellas
cadenas

de

ADN

que

vuelvan

unirse

con

sus

respectivas

complementarias (cadena "a" silvestre con cadena "b" silvestre; o bien

cadena "a" mutante con cadena "b" mutante) no presentarn diferencia con
el estado original; sin embargo, si por ejemplo una cadena "a" silvestre
hbrida con una cadena "b" mutante, aquella regin (ms o menos amplia)
en la que exista mutacin no complementar, formndose un bucle u
horquilla, es decir, una regin en la que las bases nitrogenadas no son
complementarias y no establecen las uniones caractersticas por puentes
de hidrgeno en la doble hlice de ADN. Dichas estructuras son los
denominados heterodplex (dplex de ADN hbridos). Estos heterodplex
migran de forma diferente a los homodplex en la columna de
cromatografa de fase reversa(al igual que lo hacen en un gel de agarosa o
acrilamida). La separacin se realiza en condiciones desnaturalizantes
variables, detectndose las molculas de ADN midiendo la absorbancia a
260 nm. Esto origina un pico de elucin a un tiempo caracterstico. A
medida que se incrementan las condiciones desnaturalizantes los
heterodplex migran por delante de los homodplex, apareciendo los picos

correspondientes a heterodplex antes en el grfico resultante, el

cromatograma. De esta manera, como los heterodplex se desnaturalizan a
temperaturas distintas a los homodplex, ambas molculas dan lugar a
picos de elucin distintos.

Previo al proceso inicial de desnaturalizacin se suele llevar a cabo una

PCR para la amplificacin del ADN molde en fragmentos de unas 150-450
pb.

Con este sistema pueden detectarse fcilmente sustituciones de una base,

inserciones o deleciones, con un coste reducido y de manera rpida
(aproximadamente 16 minutos).

2.3.

PARAMETROS
2.3.1. Dimetro interno

El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que

determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y
tambin influye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms
grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificacin de compuestos
para su utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno
menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se
caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo
de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar
columnas de rango analtico y normalmente estn asociadas a un detector
UV-VIS. Aparte, existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar,
con un dimetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en
espectrometra de masas.

2.3.2. Medida de las partculas

La mayora de HPLC tradicionales se realiza con una fase estacionaria
unida al exterior de partculas esfricas de silica. Estas partculas pueden
tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de dimetro las ms
utilizadas. Partculas ms pequeas ofrecen una mayor superficie y una
mejor separacin, pero la presin que se requiere por obtener una
velocidad lineal ptima aumenta de forma inversamente proporcional al
cubo del dimetro de la partcula. Esto significa que disminuir la medida de
las partculas a la mitad, aumentara la resolucin de la columna, pero a la
vez, aumentara la presin necesaria en un factor de ocho.

2.3.3. Tamao de poro

Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor
superficie. Los poros pequeos proporcionan una mayor superficie mientras
que los poros de mayor medida proporcionan una cintica mejor,
especialmente para los compuestos de tamao ms grande; por ejemplo,
una protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao de los poros
puede entrar, pero difcilmente saldr con facilidad.

2.3.4. Presin del sistema

La presin de las bombas es variable segn el modelo y fabricante, pero su
rendimiento se mide en su habilidad para generar un flujo constante y
reproducible. La presin puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400
atmsferas). Los aparatos ms modernos de HPLC incorporan mejoras
para poder trabajar a presiones ms altas y, por lo tanto, poder utilizar
partculas de tamao ms pequeo en las columnas (< 2 micrmetros).
Estos

nuevos

aparatos,

denominados

Ultra

Performance

Liquid

Chromatography (UPLC) pueden trabajar con valores de hasta 100 MPa de

presin (unas 1000 atmsferas). (Hay que tener en cuenta que las siglas
UPLC son una marca registrada de Waters Corporation aunque a veces se
utilizan de forma general para designar este tipo de aparatos).

2.4.

APLICACIN EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

2.4.1. Campos de Aplicacin de HPLC

Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos

Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos

Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes,

aflatoxinas, aditivos

Productos de la industria qumica: Aromticos condensados,

tensoactivos, propulsores, colorantes

Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB

Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos

Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de

orina, estrgenos.

Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

Separacin y purificacin de metabolitos

Separacin y purificacin de los metabolitos de las drogas

procedentes de muestras de orina

Purificacin y separacin de enantimeros

Purificacin de compuestos naturales

Purificacin y caracterizacin de enzimas y protenas

2.4.2. ANALISIS DE VITAMINAS EN AIMENTOS (VITAMINA A)

El anlisis de las vitaminas en los alimentos es un gran desafo para los

analistas dado que se asocia con problemas significativos. Muchos de estos
problemas han sido eliminados gracias a los recientes avances en la
tecnologa y el desarrollo de nuevos enfoques analticos
Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografa (fase normal
y fase reversa) para la cuantificacin de la vitamina A. El Cuadro 2 muestra

dos procedimientos de trabajo a partir de las mltiples posibilidades que

existen para lograr buenas separaciones.
En algunos de los sistemas cromatogrficos, se logra una separacin entre
el retinol "slo trans" y el 13-cis retinol. En estos casos, los resultados
deberan informarse como equivalentes de retinol "slo trans" lo cual es la
suma del retinol "slo-trans" y el 13-cis retinol despus de corregir
considerando la menor biopotencia (75% del retinol "slo-trans"). Es
importante indicar claramente las unidades utilizadas para informar los
resultados.
CUADRO1. Condiciones de los sistemas de cromatografa para vitamina A
Sistema de Fase Normal
(FN)

Sistema de Fase Reversa

(FR)

Columna

Acero inoxidable; 125x4,0

nm

Acero inoxidable; 250x4,0 nm

Fase
estacionaria

Lichrosorb Si 60 (Merck);
5 m

Hypersil ODS (Shandon);

5m

Fase mvil

n-hexano: 2-propanol (98:2)

Metanol: H2O (93:7)

Flujo

l,0ml/min

0,8 ml/min

Presin

35 bar

60 bar

Volumen de
inyeccin

20-50 l

20 l

Deteccin

Fluorescencia; Em: 470 nm

Ex: 325 nm

UV: 325 nm

Tiempo de
retencin

aprox. 6 min

aprox. 5 min

Estndar

aprox. 2 g/ml (6,6 Ul/ml)

aprox. 2 g/ml (6,6 Ul/ml)

Clculo

Mtodo de estndar externo;

Recuento de rea o altura

Mtodo de estndar externo;

Recuento de rea o altura

2.5.

EQUIPOS

2.5.1. HPLC analtico 1200 Series de Agilent Technologies

Bomba cuaternaria G1311

Detector de longitud de onda variable G1314B

Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D

Detector de ndice de refraccin G1362A

Detector de fluorescencia G1321A

2.5.2. HPLC preparativo 1200 Series de Agilent Technologies

Dos Bombas preparativas G1361A

Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D

Muestreador automtico G1329A

Colector de fracciones G1364B

III.

CONCLUSION

Una de las principales ventaja de esta tcnica frente aotras metodologas

analticas

clsicas

es

su

especificidad,permitiendo

la

separacin,

identificacin y cuantificacinde los componentes orgnicos ms complejos.

La HPLC analtica ha adquirido una especial importancia enel campo de la

investigacin y desarrollo cientfico,encargndose del control de calidad
farmacutico y elanlisis medioambiental.

Concluimos que unas de las caractersticas msresaltantes del HPLC es su

alta

resolucin,

sureproducibilidad,

alta velocidad,

y la

capacidad

deautomatizacin que presentan; lo cual la hace ser una delas tcnicas

ms empleadas en el anlisis de diversasformulaciones cosmticas y
alimentarias

IV.

BIBLIOGRAFIA

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE CIENCIA, TECNOLOGIA E INGENIERA
DE ALIMENTOS
FACULTAD DE INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

Monografa: CCROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC)

CURSO

TECNICAS DE ANALISIS DE ALIMENTOS

PROFESOR

ING. CACERES ALAMENARA, Eduardo

ALUMNOS

MANOSALVA MARIN, Jose Luis

CICLO

2014-I

Tingo Mara Per