Laborator 8

Enzime. Efectul catalitic al enzimelor. Specificitatea de substrat. Factorii care

influeneaz viteza reaciilor enzimatice. Studiul cinetic al unor enzime
Enzimele sunt biocatalizatori care mresc viteza reaciilor chimice pe care le catalizeaz,
permind ca acestea s aib loc n condiii compatibile cu viaa. Enzimele catalizeaz numai
reacii care termodinamic sunt posibile, ele nu deplaseaz echilibrul unei reacii, ci fac ca
acesta s fie mai repede atins.
Substanele asupra crora acioneaz enzima poart numele de substrat, iar compusul sau
compuii care rezult n urma aciunii enzimei poart numele de produs de reacie.
Enzimele sunt compui cu structur complex. Unele sunt proteine formate numai din
resturi de aminoacizi, altele sunt constituite dintro component proteic !apoenzima" i una
neproteic care, dac este puternic le#at n structura enzimei este denumit grupare
prostetic, iar dac este uor disociabil poart numele de coenzim. Enzimele au toate
caracteristicile catalizatorilor, dar eficiena lor catalitic este superioar celei nre#istrate n
cazul catalizatorilor chimici.
$ea mai important deosebire ntre activitatea catalitic a enzimelor i cea a
catalizatorilor chimici const n nalta specificitate de aciune a enzimelor.
Specificitatea enzimelor
%poenzima determin specificitatea de substrat. $oenzimele !n #eneral, derivai ai
vitaminelor hidrosolubile i ioni metalici" sunt cele care determin specificitatea de reacie. &n
funcie de modul n care apoenzima lea# substratul se pot deosebi mai multe tipuri de
specificitate de substrat:
specificitate absolut de substrat'
specificitate relativ de substrat'
stereospecificitate de substrat.
Specificitatea absolut
Principiu: Enzimele care acioneaz asupra unui sin#ur substrat sunt considerate c au
specificitate absolut. %stfel, ureaza catalizeaz numai reacia de hidroliz a ureei, dar nu i a
compuilor cu structur asemntoare, ca tiouree sau acetamid.
(rin hidroliza ureei rezult $)
*
i +,
-
, ultimul putnd fi identificat prin reacia cu
reactivul +essler.

+,
*
+,
*
).$
/
*
+,
-
/ ,
*
)
$)
*
ureaz0
Reactivi:
1. Uree *2'
*. 3iouree *2'
-. %cetamid *2'
4. Ureaz 12'
5. 6eactiv +essler.
Mod de lucru:
&n trei eprubete se introduc urmtorii reactivi7
Reactivi ! "
Uree *2 -
3iouree *2 -
%cetamid *2 -
Ureaz 12 1 1 1
15 min la -8
9
$
6eactiv +essler 9,5 9,5 9,5
1
+umai n eprubeta 1 se va obine cu reactivul +essler o coloraie portocalie, care arat
prezena amoniacului deci, sub influena ureazei, sa produs numai reacia de hidroliz a
ureei. $elelalte substane, dei prezint structuri asemntoare cu ureea, nu au fost hidrolizate
n aceleai condiii de reacie, ceea ce demonstreaz c ureaza acioneaz selectiv asupra
ureei.
Specificitatea relativ
Principiu: ) enzim care acioneaz asupra unui #rup de substane care au structur apropiat
prezint specificitate relativ de substrat.
%stfel, tirozinaza din cartof catalizeaz oxidarea fenolilor !tirozin, adrenalin, fenol,
crezol" la compui chinonici de culoare brun.
Reactivi:
1. Extract de cartof crud. Se cur cartoful de coa: i apoi se taie felii subiri, care se
mrunesc n mo:ar cu 19 ml ap distilat. Extractul se filtreaz i conine tirozinaz'
*. 3irozin 9,5 2 n hidroxid de sodiu 9,91 +'
-. ;enol 12'
4. 6ezorcin 12.
Mod de lucru:
&n trei eprubete se msoar * ml soluie tirozin, * ml soluie de fenol n cea dea doua i
* ml soluie rezorcin n a treia eprubet. Se adau# n eprubete 1 ml extract de cartof i se
menine o or la -8
9
$, pe baie de ap sau la termostat. Se a#it din timp n timp pentru a mri
contactul cu oxi#enul atmosferic. $oninutul eprubetelor se coloreaz n roubrun, iar dup 1
h se coloreaz n brunne#ru.
Factorii care influeneaz activitatea enzimelor
$antitatea de enzim care se #sete ntro prob i acioneaz n condiii optime asupra
substratului adecvat este exprimat prin activitatea enzimatic. %ctivitatea enzimatic este
influenat de o serie de factori fizici sau chimici7 temperatura, p,ul, concentraia enzimei,
efectori enzimatici7 activatori sau inhibitori.
#nfluena temperaturii asupra activitii amilazei salivare
<nfluena temperaturii asupra reaciilor enzimatice se manifest prin7
- modificarea vitezei reaciei enzimatice'
- denaturarea prii proteice a enzimei.
3emperatura optim este cuprins ntrun interval lar#, pentru ma:oritatea enzimelor
variind ntre -959
o
$. Se prefer ca temperatura de lucru s fie -8
9
$, deoarece distru#erea
enzimei este practic nul, iar viteza reaciei este suficient de mare.
Principiu: %milaza salivar este activ la -8
9
$, dar prin fierbere se inactiveaz i nu mai are
aciune hidrolitic asupra amidonului.
Reactivi:
1. Saliv diluat'
*. %midon 1 2 n clorur de sodiu 9,- 2'
-. 6eactiv ;ehlin#.
Mod de lucru:
&n dou eprubete se msoar cte 4 ml soluie amidon. &ntruna din eprubete se adau# 1
ml saliv proaspt nefiart, iar n cealalt 1 ml saliv fiart. Se a#it i se introduc n
termostat la -8
9
$, timp de 15 minute. Se adau# n fiecare eprubet cte 1 ml reactiv ;ehlin#
i se fierb pe baie de ap 5 minute. Se analizeaz prezena oxidului cupros roucrmiziu n
cele dou eprubete.
*
#nfluena p$%ului asupra activitii amilazei salivare
Enzimele, n calitate de proteine, conin un numr mare de #rupri amino, carboxil i alte
#rupri disociabile, comportnduse ca amfioni. =in aceast cauz variaiile de p, produc
modificri n ncrctura ionic a enzimei, cu repercursiuni asupra conformaiei, ceea ce
afecteaz i centrul catalitic. <nfluenele survenite se reflect n activitatea catalitic, respectiv
n viteza de reacie, a crei reprezentare #rafic corespunde unei curbe sub form de clopot.
p,ul corespunztor maximului curbei se consider p,ul optim de aciune a enzimei.
>iteza unei reacii enzimatice este maxim la un p, optim specific fiecrei enzime. =e
exemplu, pepsina din sucul #astric acioneaz la p, . *, tripsina din sucul pancreatic la p, de
aproximativ 8,??, fosfatazele alcaline la p, ntre ?,519 etc.
Reactivi:
1. $lorur de sodiu 9,- 2'
*. %midon 1 2 n clorur de sodiu 9,- 2'
-. %cid clorhidric 9,* 2'
4. ,idroxid de sodiu 1 2'
5. Soluie <
*
@A<'
B. Camilaz 1 m#@ml.
Mod de lucru:
&n dou seturi a cte ? eprubete se pipeteaz cte 1 ml ap distilat. &n prima eprubet a
primului set se introduce 1 ml soluie ,$l 9,* 2. Se omo#enizeaz prin a#itare. Se recolteaz
1 ml soluie i se introduce n a doua eprubet, a#itnd pentru omo#enizare. )peraia se
continu pn la ultima eprubet, din care se nltur 1 ml soluie.
Se procedeaz asemntor i cu al doilea set de eprubete, numai c, n locul ,$l, se
folosete soluie +a), 1 2. Se msoar p,ul soluiilor. Se adau# n fiecare eprubet cte *
ml amidon 1 2 i 1 ml Camilaz. Se omo#enizeaz i se incubeaz 15 minute la -8
9
$.
6cire.
&cid sau
baz'm(
! " ) * + , 8
,$l 1 9,5 9,*5 9,1*5 9, 9B* 9,9-1* 9,915B 9,998?
p,
+a), 5 *,5 1,*5 9,B*5 9,-1* 9,15B 9,98? 9,9-?
p,
&n fiecare prob se adau# cte * picturi reactiv <
*
@A<. =up a#itare se noteaz prima
prob n care nu se mai observ o coloraie roiebrun, indiciu pentru hidroliza complet a
amidonului. $u a:utorul datelor din tabel se #sete p,ul optim de aciune a enzimei.
#nfluena efectorilor
Efectorii care stimuleaz activitatea enzimelor se numesc activatori, iar cei care o
ncetinesc sau o inhib se numesc inhibitori.
Exemple7 ionii de clor activeaz amilaza, ionii de man#an activeaz ar#inaza, ionii de
ma#neziu activeaz fosfatazele.
<nhibitorii pot s acioneze fie asupra enzimei, fie asupra complexului enzimsubstrat.
<nhibiia poate fi7 competitiv, necompetitiv, incompetitiv, allosteric.
#nfluena efectorilor asupra -%amilazei
Principiu: Se experimenteaz aciunea Camilazei asupra soluiei de amidon, n prezena unui
activator !+a$l", a unui inhibitor !(b!+)
-
"
*
" i n absena acestora. (rin reacia cu iodul a
probelor colectate la mai multe intervale de timp se determin timpul n care se produce
hidroliza inte#ral a amidonului.
-
Reactivi:
1. %midon 12'
*. %milaz'
-. Soluie tampon fosfat 9,9BB D, p, B,?7 se prepar din soluie de fosfat monopotasic
9,9BB m i soluie fosfat disodic 9,9BB D'
4. $lorur de sodiu 1 2'
5. %zotat de plumb 9,991 D'
B. Soluie <
*
@A< 12.
Mod de lucru:
Reactivi Martor !
%midon 1 2 5 5 5
3ampon fosfat * * *
+a$l 12 *
%zotat de plumb 9,991 D *
%p distilat *
Se termostateaz la -8
9
$
%milaz 9,5 9,5 9,5
Se recolteaz la intervale de 4 minute eantioane de cte 1 ml pe care se ncearc reacia
cu iodul prin tratare cu * picturi soluie iodiodur. Se noteaz pentru fiecare prob intervalul
de timp la sfritul cruia reacia cu iodul nu mai este pozitiv.
#n.ibiia ureazei de ctre ionii de /u
!0
Principiu: <onii de cupru inhib activitatea ureazei, enzim care hidrolizeaz ureea cu
formare de amoniac i dioxid de carbon.
Reactivi:
1. Ureaz * 2'
*. Uree 9,5 2'
-. Sulfat de cupru * 2'
4. 6eactiv +essler.
Mod de lucru:
&n dou eprubete se msoar cte 1 ml soluie de ureaz * 2. &ntruna din eprubete se
adau# 9,-9,4 ml soluie sulfat de cupru * 2. &n ambele eprubete se adau# 9,5 ml soluie de
uree 9,5 2 i se menin ntrun termostat la -8
9
$, timp de -9 minute. =up rcire se adau# n
fiecare eprubet -4 picturi reactiv +essler. &n eprubeta n care sa adu#at soluia de sulfat
de cupru reacia trebuie s fie ne#ativ, iar n eprubeta fr sulfat de cupru trebuie s se
formeze complexul crmiziu rezultat n urma reaciei dintre amoniac i reactivul +essler.
4