Sedimentarea si centrifugarea

I . Noiuni teoretice
1. Sedimentarea
Sedimentarea - Este o tehnic de separare ce se bazeaz pe diferena de densitate dintre
componentele amestecului. n practica medical se utilizeaz nu numai ca tehnic de separare dar i ca o
metoda de analiz (VSH - viteza de sedimentare a sngelui).
Pentru o nelegere mai bun a procesului se poate modela comportarea unei hematii n cmp
gravitaional.
S consideram o suspensie de particule sferice de raz R i densitate aflate ntr-un lichid de
densitate
0
(
0
). Asupra particulelor acioneaz urmtoarele forte:
- fora de greutate: g R
3
4
g m G
3

- fora Arhimedic: g R
3
4
g m F
0
3
0 A

- fora de frecare cu moleculele lichidului - fora de vscozitate; pentru particule sferice i viteze
mici de deplasare, fora de vscozitate este dat de legea lui Stokes: v R 6 F
V

unde: v este viteza, coeficientul de vscozitate iar R raza particulei.
La echilibru dinamic rezultanta acestor fore este nul i particula coboar cu vitez constant
(figura 5.1).


Figura 5.1. Forele ce acioneaz asupra unei particule
de raz R i densitate aflat ntr-un lichid de densitate
0
(
0
).

v R 6 g R
3
4
g R
3
4
0
3 3

1
0
2
g R
9
2
v (1)
Considernd
t
L
v unde L este spaiul parcurs n micare rectilinie i uniform iar t timpul de
sedimentare, obinem:
1
0
1 2
g R L
2
9
t
Dup cum se constat din relaia (1) viteza de sedimentare depinde att de mrimea particulelor
(R) ct i de interaciunea acestora cu lichidul n care se afl, prin coeficientul de vscozitate .
Sedimentarea poate fi deci folosit nu numai ca tehnic de separare a unor particule de interes dar
i ca metod de cercetare n vederea obinerii unor informaii legate de aceste particule.
De mare importan clinic este determinarea vitezei de sedimentare a eritrocitelor. n tabelul
urmtor sunt prezentate valorile normale obinute prin metoda Westergreen.

Subiect 1 ora 2 ore
barbat 2 - 8 mm 5 - 18 mm
femeie 4 - 10 mm 6 - 20 mm
nou - nascut 1 - 2 mm -
sugar 5 - 10 mm -
copil mic 7 - 12 mm -

2. Centrifugarea
Centrifugarea - reprezint o tehnic de separare a componentelor unui amestec cu densiti
diferite sub influena unui cmp centrifugal.
Deoarece viteza de sedimentare pentru particule de mrimea hematiilor, sau mai mici, este
deosebit de sczut, este necesar o metod care s creasc fora activ (greutatea n cazul sedimentarii).
Astfel, n cazul centrifugrii, rolul forei de greutate l joac fora centrifug.

Figura 5.2. Forele ce acioneaz asupra unei particule
de raza R i densitate aflat ntr-un lichid de densitate
0
(
0
).

x R
3
16
a m F
2 3 3
c cf

Neglijnd fora de greutate i considernd c migrarea duce la creterea razei traiectoriei
circulare, avem urmtoarele relaii:
cf v a
F F F
dt
dx
R 6 F
v

x R
3
16
F
0
2 3 3
a

x
dx
R
8
9
dt
1
0
2 2 2

Prin integrare obinem timpul necesar separrii:
i
f
1
0
2
c
x
x
ln ) R (
8
9
t .
Ultracentrifugarea - Pentru particule foarte mici cum ar fi proteinele plasmatice sedimentarea
prin centrifugarea obinuit este practic nerealizabil din cauza fenomenelor de difuzie. Sunt necesare n
acest caz turaii deosebit de mari 15000rot/min.
Ultracentrifugele ce realizeaz aceste turaii trebuie s fie bine stabilizate mecanic (pentru a evita
fenomenul de bti care ar duce la ruperea axului) i bine termostatate (pentru a mpiedica degradarea
termic).
Cnd sistemul este monodispers apare o limit net de separaie ntre solvent i particulele
dispuse la fundul eprubetei.
Cnd sistemul este polidispers apar mai multe cmpuri i este necesar o ultracentrifugare
fracionat. Se centrifugheaz pe rnd la fiecare turaie de interes i se recolteaz sau sedimentul sau
super-natantul.


I I . Parte experimental
A. Determinarea vitezei de sedimentare a eritrocitelor
(metoda Westergreen)
Materiale necesare:
-snge venos, 1.6 ml, recoltat pe anticoagulantul citrat trisodic 3.8%, n cantitate de 0.4 ml;
-materiale pentru puncie venoas;
-eprubete de hemoliz;
-hemosedimentrul Westergren, alctuit dintr-un stativ metalic prevzut cu pipete Westergren, de
aproximativ 300mm lungime i 2.53mm diametru.
Mod de lucru:
-se aspir cu seringa, n condiii sterile, o cantitate de 0.4ml citrat trisodic 3.8%;
-se puncioneaz vena pacientului i se aspir snge pn la diviziunea de 2ml;
-dup omogenizare sngele se pune ntr-o eprubet de hemoliz;
-se aspir sngele n pipetele Westergren pn la diviziunea zero;
-se fixeaz pipetele n stativ (ntr-o poziie perfect vertical), apoi se noteaz timpul (momentul se
start) i numele pacientului.
Citirea rezultatului se face la o or i/sau la dou ore, valoarea fiind dat de nlimea coloanei de
plasm aprut n partea superioar a tubului exprimat n mm, pe unitate de timp.


B. Centrifugarea sngelui
Materiale necesare:
- sering i ac pentru puncie venoas
- eprubete de hemoliz
- stativ
- pipete gradate
- citrat trisodic 3,8%
- balan de echilibrare
- ser fiziologic
- eprubete de centrifugare
Mod de lucru:
-se recolteaz o cantitate de 5-6 ml snge dup metoda descris anterior;
-se introduce n eprubeta de centrifugare 1ml citrat trisodic 3,8%, 4ml ser fiziologic i 5ml snge
dup care se aseaz eprubeta pe balana de echilibrare;
-pe platanul opus se aseaz o eprubet identic n care se introduce ap distilat pn la
echilibrarea balanei;
-se aeaz cele dou eprubete n centrifug n poziii diametral opuse una fa de alta, se nchide
capacul centrifugii i se regleaz la 2000rotatii/min, dup care se centrifugheaz 2minute;
-se scoate eprubeta i se masoar deplasarea frontului eritrocitar, apoi se continu centrifugarea.

Probleme:
1._Cunoscnd valorile fiziologice ale coeficientului de vscozitate la brbat
B
=0,047Kg/ms i la
femeie
F
=0,043Kg/ms, densitatea eritrocitului =1095Kg/m
3
i a plasmei
o
=1027Kg/m
3
calculai din
formula vitezei de sedimentare ct ar trebui s fie raza eritrocitului presupus sferic.
2._Determinai viteza de sedimentare a unor particule de cret suspendate ntr-un lichid i raza
acestor particule presupuse sferice cunoscnd
apa
=1 g/cm
3
,
apa
=1.05 10
-3
Kg/ms,
creta
=1,545 g/cm
3
.
3._Cunoscnd raza particulei de cret determinat anterior, evaluai folosind modelul matematic al
centrifugrii, timpul de centrifugare pentru aceste particule suspendate ntr-un mediu vscos (glicerin). Se
cunosc:
- =1000rot/min, (500rot/min)
-
glicerina
=13,93 10
-3
Kg/ms
-
glicerina
=1,26 g/cm
3

- ln(x
2
/x
1
)=0,143