ANTIANDROGEN ASSAY

Kajian literatur
ANTI-ANDROGEN VINCLOZOLIN IMPAIRS SPERM
QUALITY AND STEROIDOGENESIS IN GOLDIS!
"A#a$e% !ate&' Sa((e$ M)%a**a$ Ala+i !a$i' S(l+ain Milla' ,iri
Kri-t.an' Ma%$i G)l-%an' Pa-/al )ntaine' Ot)*ar Lin%art0 12314
Di5uat untu6 *e*enu%i -ala% -atu tu7a-
Mata6ulia% 8i)a--a(
D)-en Pen7a-u% 9
Dr0 Prati:i Pu$jia-tuti' M0Si0
Di-u-un Ole% 9
S(l+ia Aulia Ra%*a% "2;3<1=1><2234
UNIVERSITAS AIRLANGGA
AKULTAS SAINS DAN TEKNOLOLOGI
PROGRAM MAGISTER KIMIA
123=
ANTI-ANDROGEN VINCLOZOLIN IMPAIRS SPERM QUALITY AND
STEROIDOGENESIS IN GOLDIS!

"A#a$e% !ate&' Sa((e$ M)%a**a$ Ala+i !a$i' S(l+ain Milla' ,iri Kri-t.an'
Ma%$i G)l-%an' Pa-/al )ntaine' Ot)*ar Lin%art0 12314

A8STRAK
Pada mamalia, vinclozolin (VZ) dikenal sebagai anti-androgen, yang
menyebabkan infertilitas pada laki-laki melalui reseptor antagonis androgen (AR)
Pada !e"an air, tela! banyak diketa!ui efek dari VZ dalam fungsi reproduksi dan
!asilnya sedikit kontradiktif #ntuk mema!ami efek samping VZ pada reproduksi
!e"an $antan, ikan mas de"asa (Carassius auratus) diberikan tiga konsentrasi VZ
(%&&, '&&, dan (&& )g*+) dan dalam gonadosomatik (,-.) serta indeks
!epatosomatik (/-.), %0 1-estradiol (2
3
), %%-ketotestosterone (%%-45) dan
kualitas sperma diamati kemudian dibandingkan dengan kontrol pelarut -atu
kelompok yang terpapar 2
3
(konsentrasi nominal dari 6 )g*+), suatu senya"a
estrogenik, digunakan sebagai kontrol negatif -etela! terpapar selama satu bulan,
,-. dan /-. tidak beruba! pada semua kelompok perlakuan VZ dan kemudian
dibandingkan dengan pelarut kontrol
Volume sperma, motilitas dan kecepatan berkurang pada ikan yang
diberikan konsentrasi VZ (&& )g*+ /al ini terkait dengan penurunan tingkat %%-
45 yang menun$ukkan efek VZ langsung pada androgenesis testis dan fungsi
sperma Pada ikan mas yang diberikan konsentrasi VZ %&& )g*+, %%-45
meningkat tetapi 2
3
tetap tidak mengalami peruba!an /al ini mungkin ter$adi
karena alasan utamanya adala! kualitas sperma yang tidak beruba! pada
konsentrasi VZ %&& )g*+ 7alam ikan mas yang terkena 2
3
, ,-. dan %%-45
mengalami penurunan, 2
3
meningkat se!ingga tidak ada sperma yang diproduksi
Penelitian terbaru menun$ukkan ba!"a efek dari VZ $uga tergantung ole!
dosisnya, !al ini menyebabkan penurunan kualitas sperma melalui gangguan
dalam steroidogenesis-nya -elain efek VZ melalui kompetitif mengikat AR, data
ini $uga menun$ukkan dampak potensial dari VZ karena in!ibisi langsung dari
biosintesis %%-45 pada ikan serta kelainan pada morfologi sperma
PENDA!ULUAN
8ayoritas penelitian tentang disfungsi reproduksi pada spesies air
!anya berfokus pada gangguan kimia endokrin (279s) yang menun$ukkan aksi
estrogenik (+eet et al, 3&%%) :elas ba!"a androgen (testosteron, 5 dan %%-
ketotestosterone, %%-45) sangat penting untuk mengontrol diferensiasi
(penurunan) seksual dan spermatogenesis pada laki-laki dengan mengikat AR
untuk mengaktifkan atau menekan ekspresi gen tertentu (;org, %<<'= 7elvin dan
>aga!ama, 3&&3= +eet et al, 3&%%) 7alam konteks ini ikan dan mamalia berbeda
4unci androgennya adala! %%-45 yang lebi! efektif daripada 5, dimana stimulasi
proliferasi spermatogonium dan ta!ap spermatogenesis berikutnya merupakan
karakterisasi se?ual pada ikan (;org, %<<'= 8uda et al, 3&&6) >amun dalam
mamalia, 5 mengontrol spermatogenesis dan karakteristik seksualnya
(8c+ac!lan et al, 3&&3= -ofikitis et al, 3&&()
@ungsi Androgen bisa terpengaru! ole! anti-androgen yang meniru atau
memblokir respon androgenik melalui model tindakan AR antagonis (4elce et al,
%<<0) ;eberapa kelas pestisida menun$ukkan peran sebagai anti-androgen yang
mengganggu fungsi testis dan menyebabkan gangguan para! pada kesuburan laki-
laki melalui peng!ambatan biosintesis androgen (8ac+atc!y et al, %<<0= -!arpe
et al, 3&&'= /atef et al, 3&%3)
Vinclozolin adala! fungisida dicarbo?imide banyak digunakan di 2ropa
dan Amerika -erikat untuk mengontrol penyakit yang disebabkan ole! ;otrytis
cineera, -clerotinia sclerotiorum dan spesies 8onilinia dalam anggur, bua!-
bua!an, sayuran, tanaman !ias, dan turfgrass (Pot!uluri et al, 3&&&) /al .ni
belum dianggap berba!aya untuk vertebrata (#- 2PA, %<<() >amun penelitian
lebi! lan$ut pada mamalia menun$ukkan ba!"a VZ mungkin menimbulkan
aktivitas anti-androgenik, dan efeknya dapat berta!an !ingga beberapa generasi
berikutnya 2fek yang timbul seperti gangguan dalam perkembangan testis dan
steroidogenesis serta penurunan kualitas sperma (4ubota et al, 3&&A= 4ang et al,
3&&'= An"ay et al, 3&&6= 2lzeinova et al, 3&&(= 2ustac!e et al, 3&&<)
Penelitian ini menun$ukkan ba!"a efek samping dari VZ dimediasi ole!
pergantian dalam regulasi reproduksi neuroendokrin yang meningkatkan
biosintesis 5, tapi menyebabkan infertilitas laki-laki melalui meng!ambat
pengikatan 5 untuk AR (4elce et al, %<<0= +outc!an"oot et al, 3&&()
7ibandingkan dengan mamalia, penelitian tentang efek VZ sangat $arang
pada ikan dan tela! difokuskan pada penuruan gonadal, perkembangan testis dan
kontrol reproduksi endokrin (5abel %) Penelitian ini menun$ukkan berbagai efek
dari VZ pada reproduksi laki-laki termasuk ter$adinya interseks (4oger et al,
%<<<), gangguan pengembangan gonadal (4iparissis et al, 3&&A), penurunan
karakteristik seksual, $umla! sperma, dan kiner$a perilaku seksual (;aatrup dan
:unge, 3&&%= ;ayley et al, 3&&3, 3&&A) dan gangguan pada testis steroidogenesis
(8artinovic et al, 3&&(= Villeneuve et al, 3&&0) -ebaliknya, 8akynen et al
(3&&&) melaporkan peruba!an ada di penurunan gonadal dan biosintesis 5, %%-45
atau %0 1-estradiol (2
3
) serta tidak ada afinitas VZ ke AR -ecara bersama-sama,
literatur tentang efek anti-androgenik dari VZ pada ikan sedikit kontradiktif dan
terdapat informasi yang kurang tentang efek potensial ter!adap kualitas sperma
sebagai titik penting bagi kesuburan pria
Ble! karena itu, peneliti mengevaluasi efek dari VZ pada organ reproduksi
ikan mas (Carassius auratus) ketika broodfis! diberikan VZ dengan konsentrasi
%&&, '&& dan (&& )g*+ selama satu bulan -ekelompok ikan yang terkena 2
3

digunakan sebagai kontrol negatif 5u$uan utamanya adala! untuk mempela$ari
kualitas sperma (volume, motilitas dan kecepatan) sebagai titik ak!ir untuk
kesuburan $antannya -elain itu, $uga diamati kemampuan VZ untuk memodulasi
produksi steroid seks (%%-45 dan 2
3
) Penelitian ini dapat menun$ukkan toksisitas
VZ dalam ikan mas $antan, menun$ukkan penurunan kualitas sperma yang terkait
dengan gangguan dalam steroidogenesis pada ikan yang terkena VZ Penelitian
sebelumnya pada ikan menun$ukkan kesamaan dengan mamalia, VZ bereaksi
dengan AR dan %%-45 mengalami peningkatan (5abel %) >amun pada penelitian
ini menun$ukkan potensi efek VZ melalui peng!ambatan biosintesis %%-45

8A!AN DAN METODE
A0 In Vi+) ?a$a I6an Ma- De:a-a
.kan mas $antan de"asa (3-A ta!un) yang digunakan diperiksa da!ulu
kese!atannya .kan pertama-tama diaklimatisasi selama dua minggu dan
kemudian dimasukkan ke dalam akuarium (masing-masing (&+) dan disimpan
dalam su!u yang sama (%(-33C9, masing-masing pada a"al pengamatan !ingga
ak!ir pengamatan) dan %3 $am pada suasana terang-%3 $am pada suasana gelap
Bksigen terlarut dan p/ air diperiksa setiap tiga kali seminggu sebelum feeding,
masing-masing D,&E&,6 mg*+ dan 0,6E&,A .kan diberi makan sekali se!ari (AF
berat badan) dengan makanan komersial (ZZ> Vodnany, Republik 9eko) -emua
!e"an ditangani sesuai %0 odst % zakona >o 3'D*%%< -b, 8inistry of
Agriculture t!e 9zec! Republik, disetu$ui ole! 9entral 2t!ics 9ommite of 5!e
8inistry of /ealt! of 5!e 9zec! Republic
4elompok eksperimen yang terdiri dari ikan yang diberikan tiga
konsentrasi VZ (%&&, '&&, dan (&& )g*+), satu pelarut kontrol (aseton), dan satu
kontrol negatif (2
3
, 6 )g*+) -epulu! akuarium yang digunakan dalam penelitian
ini, dua akuarium untuk masing-masing kelompok -tock VZ dilarutkan dalam
aseton dan kemudian ditamba!kan ke masing-masing akuarium dengan
konsentrasi ak!ir aseton sebesar &,&&%F -etiap akuarium mengandung aseton
dengan konsentrasi yang sama 5iga sampel ikan $antan dimasukkan dalam
akuarium (n G D per setiap kelompok eksperimental) -etiap '( $am, total volume
air diperba!arui -ebelum sampling, setiap ikan dibius dengan larutan 3-
p!eno?yet!anol (&,A ml*+) -perma pertama kali dikumpulkan dengan memi$at
perut dengan pelan-pelan mulai dari bagian anterior testis menu$u papilla genital
dan dikumpulkan dengan $arum suntik plastik Hang perlu diper!atian pada saat
mengambil sperma adala! kontaminasi sperma ole! urin, lendir, dara! atau air
4emudian, dara! dikumpulkan dengan menggunakan sebua! $arum suntik
!eparinized % ml dari vena caudal dan disimpan dalam tabung 2ppendorf dalam
es -etiap ikan ditimbang (E &,% g) dan diukur pan$ang totalnya (E % mm)
4emudian ikan tersebut dibunu! untuk diambil gonadal dan !atinya lalu
ditimbang (E &,&% g), data ini digunakan untuk penentuan ,-. (G %&& I gonad
berat*total berat ikan) dan /-. (G %&& I berat !ati*berat total ikan) 7ara!
disentrifugasi pada 6&&& rpm selama %& menit pada 'C9 dan plasma disimpan
dalam tabung 2ppendorf %,6 m+ pada (&C9 !ingga steroidnya dianalisis
80 Kualita- S?er*a
Volume -perma diukur untuk masing-masing ikan dan dinyatakan
sebagai )+ #ntuk mengevaluasi motilitas sperma, sperma masing-masing ikan
langsung diaktifkan dalam larutan aktivasi (>a9l 6& m8, 3& m8 5ris, p/ (,6,
%%& mBsmol*kg) pada rasio %J%&&&-3&&& (spermJactivation solution) #ntuk
meng!indari menempel sperma ke dalam slide, bovine serum albumin (;-A)
ditamba!kan ke dalam media aktivasi sebelum sperma ditamba!kan pada
konsentrasi ak!ir &,%F ("*v) 8otilitas sperma tercatat untuk frame captured ole!
997 kamera video (-B>H 7K9-<0&87, :epang) dipasang pada bidang gelap
mikroskop (Blympus ;K6&, :epang) dengan menggunakan 7V7-recorder
(-B>H 7VB-%&&& 87, :epang) -ebua! gambar analisa mikro (Blympus 8icro
.mage '&% for Lindo"s) digunakan untuk menganalisis motilitas sperma (F
total sperma) dan kecepatan spermatozoa () m*s) berdasarkan posisi urutan kepala
sperma (untuk rincian li!at /atef et al, 3&%&) 7ua catatan terpisa! untuk setiap
individu dan rata-rata dari nilai-nilai ini digunakan dalam analisis statistik
C0 Pen7u6uran -ter)i$ -e6-
2
3
diu$i pada 6& )+ plasma yang diencerkan dari %*A sampai %*%& dalam
buffer tertentu, menggunakan kit 7iasource 2.A (7iasource, >ivelles, ;elgia) 6&
)+ untuk masing-masing 2
3
standar, kontrol dan sampel plasma yang dibagikan di
setiap sumur dari plate <D-"ell 6& )+ 2
3
-!orseradis! pero?idase kon$ugasi
ditamba!kan ke dalam masing-masing sumur serta serta 6& )+ antibodi diara!kan
ter!adap 2
3
-etela! inkubasi selama %3& menit pada su!u kamar, dan ' kali
dicuci dengan 3&& )+ substrat, plate diinkubasi selama A& menit pada su!u kamar
dan reaksi di!entikan dengan menamba!kan %&& )+ /
3
-B
'
(%,( >) 4ekeru!an
diamati dibaca pada '6& nm dengan mikrotiter plate reader -ensitivitas 6 pg*m+,
intra-assay dan koefisien inter-assay variasi masing-masing, 'F dan DF untuk
konsentrasi plasma di kisaran %&&-36& pg * m+ 8engenai %%-45, kit 9ayman
2.A digunakan (9ayman, 8ic!igan, #-A) dengan plasma diencerkan %& kali
8irip dengan 2
3
assay, 6& )+ plasma*standar, pelacak dan antibodi ditamba!kan
ke masing-masing dengan !ati-!ati -etela! %3& menit inkubasi dan 6 kali dicuci,
3&& )+ larutan substrat ditamba!kan -elan$utnya diinkubasi selama <& menit
lalu diukur absorbansinya pada '6& nm -ensitivitas*4epekaannya %,A pg*m+,
intra-assay dan inter-assay koefisien variasi masing-masing (F dan <F untuk
konsentrasi plasma dari D pg*m+ +angka! ini dilakukan dua kali untuk setiap se?
steroid sampel dan rata-rata nilai-nilai ini digunakan dalam analisis statistik
D0 Anali-i- -tati-ti/
Variasi !omogenitas diu$i untuk semua data menggunakan +eveneMs
test 7ata untuk %%-45 dan 2
3
di$adikan log untuk memenu!i asumsi normalitas
dan !omoscedasticity #$i 5ukey-4ramer digunakan dalam !ubungannya dengan
A>BVA untuk menemukan cara lebi! signifikan yang berbeda satu dengan
lainnya 7alam konteks data tentang VZ ini, diperlakukan perbandingan
kelompok kontrol pelarut dan alp!a yang ditetapkan pada &,&6 Analisis statistik
serupa $uga dilakukan untuk membandingkan kontrol negatif (2
3
) dengan
kelompok-kelompok perlakuan VZ dan kontrol pelarut -emua data disa$ikan
sebagai rata-rata seperti E standard error of mean (-28)