Diario de Gestin Ambiental 93 (2012) 38e43

Diario de Gestio n Ambiental

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El uso de las huellas dactilares de Escherichia coli BOX-PCR para
identificar las fuentes de contaminacin fecal de los cuerpos de
agua en el Estado de So Paulo, Brasil
Camila Carlos
a
, Fabiana Alexandrino
a
, Nancy C. Stoppe
a
, Maria Ins Z. Sato
b
,
Laura M.M. Ottoboni
a,
*

a Centro de Biologa Molecular e Ingeniera Gentica de la Universidad Estatal de Campias,
UNICAMP, CP 6010, CEP 13083-875, Campias, SP, Brasil
b Departamento de Anlisis Ambiental, Compaa de Tecnologa y Saneamiento Ambiental,
CETESB, So Paulo, SP, Brasil


Abstract
Elemento repetitivo reaccin de polimerasa en cadena con sede en secuencia (rep -PCR) es
uno de los mtodos ms comunes utilizados para identificar las fuentes de contaminacin fecal
de los sistemas de agua. En este trabajo, basado en BOX- A1R repetitivo extragnica
palindrmico -PCR (BOX- PCR) se utiliz para discriminar cepas de Escherichia coli procedentes
de diferentes animales y fuentes de agua, y se evalu la idoneidad de la tcnica para el
seguimiento de la fuente bacteriana (BST). Un total de 214 cepas de los seres humanos, 150
cepas de animales, 55 cepas de aguas residuales y 77 cepas de los cuerpos de agua se
analizaron por la tcnica de la BOX - PCR. Cuando se utiliz la mxima similitud entre las
huellas dactilares, una tasa de clasificacin correcta del 84 % se consigui para las cepas
procedentes de fuentes humanas y animales. Adems, el 95% de las cepas que se encuentran
en las aguas residuales fueron clasificados como de fuentes humanas por lo menos una de las
cuatro herramientas de clasificacin utilizados. La clasificacin de las cepas encontradas en los
cuerpos de agua en el Estado de So Paulo se bas en las huellas dactilares obtenidas por
fuentes humanas y animales. La mayora de los sitios de muestreo pareca estar afectada por
las fuentes mixtas de contaminacin fecal. El uso de BOX- PCR para BST podra ser
especialmente valioso en los pases en desarrollo, donde la simplicidad y costo son
consideraciones importantes.





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1. Introduccin
La deteccin de Escherichia coli en el agua indica la presencia de patgenos y un riesgo
potencial para la salud pblica. Por lo tanto, de identificacin de las fuentes de contaminacin
fecal es importante para la gestin eficaz de los sistemas acuticos (USEPA, 2004). Existen
varios mtodos de seguimiento de fuentes bacterianas (BST), utilizando Cepas de E. coli, se
han desarrollado para este propsito, en la que fuentes se identifican de acuerdo a las
diferencias en las caractersticas de las heces de diferentes animales (Meays et al., 2004). Los
mtodos que utilizan E. coli son normalmente biblioteca dependiente (USEPA, 2004) y el uso
de cualquiera de los dos fenotpicas o genotpicas perfiles. Mtodos genotpicos consideran el
host- especficas diferencias genticas de los organismos indicadores, mientras que mtodos
fenotpicos emplean propiedades bioqumicas especficas de servidor (USEPA, 2004).
Mtodos fenotpicos incluyen perfiles de resistencia a los antibiticos (Jiang et al, 2007; Price
et al, 2007), las pruebas de utilizacin de la fuente de carbono (Harwood et al, 2003; Moussa y
Massengale, 2008) y con la asistencia de matriz de desorcin lser/ionizacin de tiempo de
vuelo / Masa Spectrom - metra (MALDI-TOF/MS) perfilado (Siegrist et al., 2007). Mtodos
genotpicos incluyen ribotipificacin (Parveen et al, 1999; Nelson et al, 2008) (Casarez et al,
2007), la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), desnaturalizacin electroforesis en gel
de gradiente (DGGE) (D' Edlia et al., 2007) y el elemento repetitivo PCR basada en la secuencia
(rep PCR) (Dombek et al, 2000; Mohapatra et al, 2007a). Nuestro grupo ha propuesto
recientemente un enfoque diferente para la identificacin de las fuentes de contaminacin de
las heces, utilizando E. coli grupos filogenticos (Carlos et al, 2010). El mtodo de rep-PCR
utiliza cebadores para amplificar regiones especficas del genoma bacteriano (Versalovic et al.,
1991). Estas huellas genmicas se pueden generar utilizando repetitivo extragnica
palindrmico (REP) secuencias (35e40 pb), enterobacterias consenso intergnica repetitiva
(ERIC) secuencias (124e127 pb) , los elementos de la caja (154 pb) (Vesalovic et al. ,1994) y la
secuencia de polytrinucleotide ( GTG ) 5 (Mohapatra et al . ,2007b ; Mohapatra y Mazumder ,
2008) . Estas secuencias han permitido la identificacin de las fuentes animales de E. coli
fecales, mediante BOX- y (GTG) 5 -PCR (Mohapatra y Mazumder, 2008). Somarelli et al. ( 2007 )
identific la fuente animal de contaminacin fecal en las cuencas Conesus Lago en el oeste de
Nueva York, EE.UU. , el uso de las huellas dactilares BOX- PCR. Edge y Hill (2007) utilizaron
BOX- PCR para mostrar la importancia de la contaminacin fecal de las aves en una playa de
agua dulce en el puerto de Hamilton, Lago Ontario, y Mohapatra y Mazumder (2008) utilizado
(GTG) 5 -PCR para identificar las poblaciones de E. coli presentes en diversos ambientes
acuticos.
La rpida urbanizacin es una amenaza generalizada a la calidad de los recursos hdricos. En
este trabajo, se construy una biblioteca con E. coli aisladas de heces humanas y animales,
aguas residuales y los cinco cuerpos de agua diferentes en el estado de So Paulo, Brasil. Estas
cepas fueron analizadas por BOX-PCR para identificar las principales fuentes de contaminacin
fecal de los cuerpos de agua.


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Tabla 1
Cepas a partir de muestras fecales y aguas residuales.

Fuente Nmero de cepas Sitio de muestreo
(Municipio de Sao Paulo
Humano 214 Sao Paulo
Vaca 50 Dracena
Pollo 16 Ribeiro Preto
Cerdo 39 Jaboticabal
Cabra 16 Jaboticabal
Oveja 29 Jaboticabal

Total 364

Jesus Neto STS 24 Sao Paulo
Barueri STS 22 Barueri
Parque Novo Mundo STS 9 Sao Paulo

Total 55


2. Materiales y mtodos
2.1. Cepas de Escherichia coli
364 cepas de E. coli fueron aisladas de muestras de heces recogidas de una variedad de
anfitriones utilizando torundas estriles (Tabla 1). Cada cepa fue aislada de un solo animal.
Estas cepas se utilizaron para construir el conjunto de calibracin (biblioteca) para su
posterior anlisis estadstico 86 cepas fueron aisladas de una variedad de sitios por CETESB
(Compaa de Tecnologa de Saneamiento Ambiental), la organizacin responsable para el
control de la contaminacin ambiental, las aguas residuales y la calidad del agua en el
Estado de So Paulo (Tabla 2). Las cepas de una planta de tratamiento de aguas residuales
se utilizaron como un conjunto de validacin, ya que se esperaba que la fuente principal
de E. coli ser humano. Todas las cepas de E. coli de los cuerpos de agua se encontraban en
las muestras recogidas durante julio de 2009 a los sitios que se muestran en la figura. 1.
Las cepas de aguas residuales estaban en las muestras recogidas durante abril, mayo y
septiembre de 2008.
Las cepas de humanos, aguas residuales y cuerpos de agua fueron mencionados como se
describe por Orsi et al. (2008), utilizando la tcnica de filtro de membrana y (MTEC de
agar) (Difco) termotolerantes membrana de E. coli con agar - glucsido de indoxilo BD
(concentracin final 100 mg L 1), se incubaron durante 2h a 35C y 0,5 para 22 y 24h a 44,5
0,2 C. Las colonias tpicas (de color amarillo) se transfirieron a caldo de E. coli (caldo de CE)
y se incubaron a 44,5C durante 24h. Tubos positivos se sembr en metileno eosina azul
agar (agar EMB) (Merck). Las colonias aisladas se ensayaron para determinar la utilizacin
de citrato, fermentacin de la lactosa, oxidasa, L- lisina descarboxilasa, la motilidad, la
glucosa y la fermentacin de sacarosa, desaminacin triptfano, la produccin de indol,
hidrlisis de la urea y la produccin de sulfuro. Asla mostrando un perfil de E. coli se
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incubaron durante la noche a 37C en Luria -Bertani caldo (caldo LB). Una colonia aislada
de cada muestra positiva caldo de CE fue seleccionado para otros anlisis.
Las cepas de origen animal se aislaron utilizando placas de MacConkey y EMB, y colonias
caractersticas de E. coli se ensayaron como se ha descrito anteriormente.
El estudio fue aprobado por el Comit de tica en Investigacin de la Universidad Estatal
de la Escuela de Medica.
Tabla 2
Cepas ambientales
Sitio de muestreo / municipio
(nombre de la muestra)
Uso del
suelo
Coordenadas Nmero de
cepas
Billings Reservoir/So Paulo (BILL
02801 and BILL 02251)
rea
urbana
S 23 46 37/S 23 44 46
W 46 32 01/W 46 38
25
19
Guarapiranga Reservoir/So Paulo
(GUAR 00601 and GUAR 00502)
rea
urbana
S 23 41 57/S 23 43 39
W 46 44 41/W 46 44
34
17
Tanque Grande Reservoir/Guarulhos
(TGDE0900)
rea
Pristine
S 23 22 28 W 46 27 35 12
Tiet River/Salespolis (TIET02050) rea
rural
S 23 33 54 W 46 00 51 21
Tiet River/Suzano (TIET03120) rea
urbana
S 23 30 11 W 46 20 13 8
77
Total























Fig. 1. Mapa del rea de estudio en el Estado de So Paulo, Brasil. Los puntos negros son las
ubicaciones de los sitios descritos en la Tabla 2.
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2.2. La genotipificacin BOX-PCR
cido desoxirribonucleico genmico (ADN) fue aislado de las cepas utilizando un kit de
purificacin de ADN genmico Wizard (Promega), siguiendo las instrucciones del
fabricante. Las reacciones BOX- PCR se llevaron a cabo utilizando una modificacin del
procedimiento descrito por Vesalovic et al. (1994) y Orsi et al. (2007). Las mezclas de
reaccin (20 ml) consistan de 10 ng de ADN, 50 moles de cebador BOX- A1R50 -
CTACGGCAA GGCGACGCTGAGG - 30 (Vesalovic et al . , 1994) , 1 Taq tampn de la
polimerasa , 0,1 mM de cada dNTP ( trifosfatos desoxirribonucleico) 2 mM de MgCl2 y 0,5
unidades de Taq polimerasa (Fermentas) . Las reacciones de PCR se realizaron por
duplicado utilizando un TE100 termociclador (MJ Research Inc.). Las condiciones de
amplificacin consistieron en una desnaturalizacin inicial a 95C durante 7 min, 30 ciclos
de amplificacin (94 C durante 1 min, 53C durante 1 min, 56C durante 4 min) y una
extensin final a 65C durante 16 min. Los productos de amplificacin se separaron por
electroforesis en geles que contienen 2,0 % de agarosa, 0,5 mg ml bromuro de etidio 1 y 1
TBE (Tris borato de correo electrnico EDTA) (Sambrook et al., 1989). Los geles se
corrieron a 5,0 V cm 1, y los resultados se visualizaron y se registran utilizando un gel de
documentacin sistema (Kodak).

2.3. El anlisis estadstico
Las huellas dactilares BOX- PCR se analizaron utilizando el software GelCompar II
(Matemticas Aplicadas). Se construy un dendrograma usando (Hassan et al., 2005) y el
UPGMA (mtodo de grupos de pares no ponderados con media aritmtica) algoritmo el
coeficiente de similitud de Jaccard. Un anlisis de funcin discriminante, utilizando el
algoritmo de la navaja de bolsillo y similitudes media y mxima, se aplic a los resultados
del anlisis de clster con el fin de determinar el porcentaje de cepas de cada animal
clasificado en cada categora de fuente. La tasa media de clasificacin correcta (ARCC) se
obtuvo a partir del porcentaje de cepas clasificadas correctamente para todos los animales
analizados.
Una biblioteca se construy usando las cepas aisladas de seres humanos (214 cepas) y
animales (150 cepas). Esta biblioteca se utiliza para crear modelos de clasificacin
utilizando cuatro herramientas estadsticas: similitud media, mxima similitud, K vecinos
ms prximos y de la red neuronal. Las dos primeras herramientas involucradas clculo de
las similitudes entre un aislado de una fuente desconocida y los aislados de la biblioteca. El
aislamiento desconocido podra entonces ser clasificado en el grupo (ya sea humano o
animal) que presenta ya sea el ms alto promedio de similitud o la similitud mxima. El K
vecinos ms prximos y los mtodos de redes neuronales implican aprendizaje
supervisado, en el que una funcin se obtiene utilizando una conocida formacin de datos
de origen, y se utiliza para clasificar los datos de origen desconocido.
Las cepas aisladas de la planta de tratamiento de aguas residuales se utilizaron como un
conjunto de validacin externa, ya que se espera que tenga orgenes humanos. Las cepas
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aisladas de las masas de agua se clasifican utilizando la biblioteca como el conjunto de
calibracin.

3. Resultados y discusin
3.1. Anlisis de biblioteca
Las cepas de E. coli a partir de los seres humanos y los animales fueron analizados por
BOX- PCR con el fin de evaluar su variabilidad gentica y para discriminar de acuerdo a su
husped. Las cepas que no producen las huellas dactilares y los clones fueron excluidas del
anlisis. Como resultado de ello, los anlisis se realizaron utilizando 213 cepas de humano
y 140 cepas de muestras de heces de animales.
La Tabla 3 enumera las tasas de clasificacin correcta obtenidos usando las similitudes
media y mxima. Un ARCC ms alta se alcanz cuando se utiliz la mxima similitud en
lugar de promedio de similitud. Cuando se utiliza la mxima similitud, un aislado se
clasifica dentro del grupo de origen que contiene la mejor coincidencia de aislar en la
biblioteca de la identificacin. Cuando se utiliza la similitud promedio, un aislado se
clasifica dentro del grupo de origen con el que comparte el ms alto promedio de similitud.
Por lo tanto, el uso de mxima similitud puede ser ventajoso cuando la variabilidad dentro
del grupo es alta (Hassan et al. ,2005).
Cuando se utiliz similitud promedio, la tasa de correcta clasificacin de las cepas de los
humanos era ms pequea que la de las fuentes animales, lo que indica que las huellas
dactilares cepa humana eran ms divergentes. Una biblioteca cepa no humana se
construy utilizando cepas de animales, incluyendo vacas, cerdos, ovejas, gallinas y cabras.
Dentro de este grupo, las cepas mostraron una mayor similitud, en comparacin con las
derivadas de seres humanos.
Informacin de inters se puede derivar de los valores ARCC obtenidos utilizando ya sea
similitudes mximo o promedio. Harwood et al. (2000) propusieron que los mtodos de
BST que dan valores de alrededor de ARCC 60e70 % son adecuados para uso en las
estrategias de control de la contaminacin.
Tabla 3
El anlisis discriminante utilizando el algoritmo de navaja. Los valores se dan como
porcentajes.
Grupo pronosticado Anlisis Jackknife (similitudes
promedio)
Anlisis Jackknife (similitudes
mximo)
Humano No humano Humano No humano
Humano 52.11 7.14 85.92 17.14
No humano 47.89 92.86 14.08 82.86
ARCC: 72.48 ARCC: 84.39
Negrita representa los valores de clasificacin correcta.




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3.2. Validacin del mtodo utilizando muestras distintas de biblioteca
55 cepas de E. coli procedentes de tres plantas de tratamiento de aguas residuales
diferentes fueron analizados por BOX- PCR. 43 cepas producen huellas dactilares
distintivos y se utilizaron en el anlisis. La fiabilidad del uso de las huellas dactilares BOX-
PCR para la identificacin de la fuente de contaminacin fecal se evalu por comparacin
de las huellas dactilares de las cepas aisladas de aguas residuales, que deben tener
orgenes principalmente humanos, con los de las cepas de la biblioteca. Las cuatro
herramientas estadsticos diferentes, descritos anteriormente, se utilizaron para este
anlisis. Los posibles resultados que se pueden obtener utilizando la red neuronal, la
similitud media y herramientas mximos de similitud van de 0 a 100, mientras que las
puntuaciones que se pueden obtener usando la gama de herramientas K vecinos ms
prximos de 0 a 10.
Tabla 4
Identificacin de las cepas de E. coli en las aguas residuales por medio de cuatro herramientas
estadsticas. Los posibles puntajes utilizando la red neuronal, la similitud media y herramientas
mximos de similitud comprendidos entre 0 y100. Los posibles puntajes utilizando el programa
de herramientas de K vecinos ms prximos de 0 a 10.


Identificador de
muestra
K-vecinos ms
prximos
Puntuacin Red
neuronal
Puntuacin Promedio
similitud
Puntuacin Mxima
similitud
Puntuacin
AMB001 Humano 6 Human 90.7 Non-human 45 Human 85.7
AMB003 No-humano 5 Non-
human
92.9 Non-human 27.3 Non-
human
62.5
AMB004 Non-human 6 Non-
human
92.9 Non-human 43.9 Human 77.8
AMB005 Human 10 Non-
human
92.9 Non-human 43.8 Human 81.8
AMB006 Human 8 Human 53.9 Human 35 Human 83.3
AMB007 Non-human 5 Non-
human
53.4 Non-human 46.7 Human 77.8
AMB009 Human 9 Non-
human
53.3 Non-human 40 Human 75
AMB010 Human 7 Non-
human
92.9 Non-human 45.7 Human 77.8
AMB011 Human 7 Human 70.1 Non-human 49.1 Human 87.5
AMB012 Human 8 Non-
human
52.9 Non-human 39.4 Human 80
AMB013 Non-human 5 Non-
human
53.4 Non-human 43.9 Non-
human
80
AMB014 Human 9 Non-
human
92.9 Non-human 41.4 Human 75
AMB015 Human 6 Non-
human
53.4 Non-human 51.7 Non-
human
100
AMB016 Human 6 Human 51.6 Non-human 46.8 Non-
human
83.3
AMB017 Human 10 Non-
human
53.4 Human 40.7 Human 80
AMB019 Human 7 Human 91 Non-human 17 Human 50
AMB020 Human 7 Human 91 Non-human 29.7 Human 71.4
AMB021 Human 6 Non-
human
53.4 Non-human 48.4 Non-
human
100
AMB022 Non-human 8 Human 91 Non-human 52.9 Non-
human
100
AMB024 Non-human 9 Human 91 Non-human 53.6 Non-
human
83.3
AMB025 Human 10 Human 91 Non-human 37.9 Human 70
AMB026 Human 7 Human 91 Non-human 36.3 Non-
human
100
AMB027 Human 7 Human 91 Human 30.7 Non-
human
100
AMB028 Human 7 Non-
human
51 Non-human 41.4 Non-
human
80
AMB029 Human 8 Human 91 Non-human 38.6 Human 71.4
AMB030 Human 9 Human 84.3 Human 46.3 Human 85.7
AMB031 Human 8 Non-
human
52.9 Non-human 48.5 Human 100
AMB032 Non-human 7 Human 91 Non-human 48 Non-
human
85.7
AMB033 Human 7 Human 91 Non-human 45 Human 77.8
AMB059 Human 9 Human 91 Non-human 35.6 Human 80
AMB060 Non-human 8 Human 91 Non-human 52.8 Non-
human
100
AMB061 Non-human 5 Non-
human
63.6 Non-human 49 Human 77.8
AMB062 Non-human 6 Human 91 Non-human 39.8 Non-
human
100
AMB063 Human 8 Human 91 Human 36.6 Non-
human
100
AMB064 Non-human 5 Non-
human
92.9 Non-human 48.7 Human 77.8
AMB065 Human 9 Human 91 Non-human 43.4 Human 100
AMB066 Human 8 Human 90.7 Human 45.1 Human 85.7
AMB067 Human 9 Non-
human
92.9 Non-human 52.7 Human 87.5
AMB069 Human 8 Non-
human
52.9 Non-human 43.6 Human 81.8
AMB084 Human 6 Non-
human
92.9 Non-human 48.1 Human 88.9
AMB085 Human 7 Non-
human
92.9 Non-human 46.8 Human 88.9
AMB088 Human 7 Non-
human
55.2 Non-human 49.7 Non-
human
87.5
AMB089 Human 10 Human 91 Human 41.6 Human 77.8
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Tabla 5
Identificacin de las cepas de E. coli a partir de los cuerpos de agua utilizando el vecino
algoritmo estadstico K-ms cercano. Las posibles puntuaciones varan de 0 a 10.

Tabla 4 muestra la clasificacin de las cepas obtenidas utilizando cada herramienta.
Aproximadamente el 65 % de las cepas de aguas residuales fueron clasificados por dos o ms
herramientas estadsticas como procedentes de una fuente humana, y 95 % de las cepas de
aguas residuales fueron clasificados como de una fuente humana por al menos una
herramienta estadstica . El mejor resultado se obtuvo utilizando K -vecinos ms cercanos,
donde el 75 % de las cepas de aguas residuales se clasificaron como de una fuente humana. El
uso de la similitud media fue la menos satisfactoria, ya que slo el 16 % de las cepas fueron
clasificados como procedentes de seres humanos.
La condicin de que las cepas con las puntuaciones ms pequeas o iguales a cinco fueron de
fuentes no identificables se impuso de forma arbitraria, con el fin de determinar si el uso de un
umbral de puntuacin de clasificacin podra aumentar la fiabilidad de los anlisis utilizando el
algoritmo de K vecinos ms prximos. Cuando se utiliz este umbral, cuatro cepas eran no
identificables, y 82 % de las cepas identificables fueron clasificados como humana. El uso de un
Identificador de
muestra
K vecinos ms
prximos
Puntuacin Sitio de muestreo
Rio013 Non-human 5 Billings
Rio017 Non-human 5 Billings
Rio019 Human 7 Billings
Rio020 Human 6 Guarapiranga
Rio021 Non-human 5 Guarapiranga
Rio022 Human 10 Guarapiranga
Rio023 Human 6 Guarapiranga
Rio024 Human 9 Guarapiranga
Rio025 Non-human 8 Guarapiranga
Rio026 Non-human 8 Guarapiranga
Rio029 Non-human 6 Guarapiranga
Rio030 Non-human 9 Guarapiranga
Rio031 Human 7 Guarapiranga
Rio032 Non-human 6 Guarapiranga
Rio033 Non-human 6 Guarapiranga
Rio036 Non-human 6 Guarapiranga
Rio042 Non-human 6 TIET02050
Rio044 Non-human 10 TIET03120
Rio045 Non-human 5 TIET03120
Rio048 Non-human 6 TIET03120
Rio049 Human 10 TIET03120
Rio053 Non-human 7 TGDE0900
Rio054 Non-human 5 TGDE0900
Rio057 Human 9 TGDE0900
Rio058 Non-human 9 TGDE0900
Rio059 Non-human 9 TGDE0900
Rio061 Human 7 TGDE0900
Rio062 Non-human 5 TGDE0900
Tie01 Non-human 7 TIET02050
Tie010 Human 9 TIET02050
Tie011 Human 7 TIET02050
Tie012 Human 7 TIET02050
Tie013 Non-human 7 TIET02050
Tie014 Human 7 TIET02050
Tie015 Non-human 10 TIET02050
Tie02 Non-human 8 TIET02050
Tie03 Non-human 5 TIET02050
Tie04 Human 7 TIET02050
Tie05 Human 7 TIET02050
Tie06 Human 8 TIET02050
Tie07 Human 7 TIET02050
Tie08 Non-human 5 TIET02050
Tie09 Human 8 TIET02050
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umbral, por tanto, mejor la asignacin correcta de las cepas, a pesar de que algunas cepas se
mantuvieron sin clasificar. Hassan et al. (2007) tambin lleg a la conclusin de que la
utilizacin de umbrales redujo el nmero de asignaciones incorrectas.

3.3. Clasificacin de las muestras ambientales
77 cepas de E. coli aisladas de cinco cuerpos de agua diferentes en el estado de So Paulo
se analizaron mediante BOX- PCR. 43 de ellos producen huellas dactilares distintivos y se
utilizaron en el anlisis. La herramienta de K vecinos ms prximos se utiliz para
comparar los perfiles BOX- PCR con los perfiles para las cepas de la biblioteca, ya que esta
herramienta proporcionada las mejores asignaciones correctas para las muestras de aguas
residuales. La Tabla 5 muestra las clasificaciones y las puntuaciones obtenidas, y la Tabla 6
presenta los porcentajes de cepas de cada sitio de muestreo clasificado como sea humano
o no humano utilizando la herramienta de K vecinos ms prximos, con y sin el uso de un
umbral. En la ausencia de un umbral, todas las cepas no identificadas habran sido
clasificadas como no humano. Utilizando el enfoque de umbral, que se considera ms
fiable, una mayor frecuencia de cepas de humanos se obtuvo para dos sitios de muestreo
(TIET02050 y el Billings Reservoir). Todava no es posible establecer conclusiones firmes a
partir de este resultado, debido al pequeo nmero de cepas del embalse Billings que
produjeron las huellas distintivas.
El sitio de muestreo TIET02050 se encuentra cerca de la fuente de la Ro Tiet, uno de los
ros ms contaminados de Brasil (Rocha et al. ,2009). Sin embargo, se anticiparon fuentes
no humanas de la contaminacin fecal ya que el sitio estaba en una zona de proteccin del
medio ambiente (en el municipio de Salespolis), donde hubo poco urbanizacin. Dado
que hubo una prevalencia de cepas clasificadas como humana en TIET02050, es posible
que una fuente no puntual evento de contaminacin fecal humana pudiera haber ocurrido
en este lugar en julio de 2009.
Las cepas clasificadas como con orgenes no humanos predominaron (54 %) en el embalse
de Guarapiranga. Este resultado est de acuerdo con Orsi et al. (2007), quien sugiri que
los animales podran ser la fuente ms importante de contaminacin fecal en este
yacimiento.
Tabla 6
Clasificacin de las cepas de E. coli ambientales utilizando el K vecinos ms prximos
algoritmo, sin y con un umbral (puntuacin> 5). Los valores se presentan como porcentajes
Sin limite Con limite
Humano No humano Humano No
humano
Sin
clasificar
TIET02050 56.25 43.75 56.25 31.25 12.50
Billings 33.33 66.67 33.33 0.00 66.67
Guarapiranga 38.46 61.54 38.46 53.85 7.69
TIET03120 25.00 75.00 25.00 50.00 25.00
TGDE0900 28.57 71.43 28.57 42.86 28.57
Negrita representa los valores ms altos.
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4. Conclusiones
La tcnica BOX- PCR es una herramienta til para la caracterizacin de fuen-tes de
contaminacin fecal, especialmente en los pases en desarrollo donde los costos de operacin
bajos son un requisito fundamental. Una ventaja adicional es que el procedimiento se puede
realizar en muchos laboratorios de la agencia medioambiental. Aunque todava hay
controversia sobre la fiabilidad de los mtodos de BST bibliotecas dependientes (Field y
Samadpour, 2007), estas tcnicas son tiles, sin embargo, ya que pueden ser utilizados para
evaluar la variabilidad gentica de microorganismos indicadores en los animales y los medios
ambientales. Tambin son capaces de caracterizar las fuentes de materia fecal, que es esencial
para el desarrollo de estrategias de gestin ambiental.
La mayora de los sitios de muestreo estudiadas en el presente trabajo fueron afectados por la
contaminacin fecal de una variedad de fuentes, y 95 % de las cepas de E. coli presentes en las
aguas residuales eran de los seres humanos. Aunque el mes de julio es normalmente la
temporada de mitad de seco en el sureste de Brasil, las precipitaciones fueron inusualmente
alto en julio de 2009 (segn los datos facilitados por el Instituto Nacional de Meteorologa e
brasilea INMET), que podra haber dado lugar a una fuente no puntual de contaminacin
fecal, as como un gran nmero de cepas de E. coli no humanos, incluso en lugares urbanos.
Parece que las fuentes no puntuales de contaminacin fecal son importantes en la Regin
Metropolitana de So Paulo.

Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundacin de Amparo a Pesquisa do Estado de
So Paulo (FAPESP, proceso que no. 2007/55312-6). CC recibi una beca de la FAPESP
(procesar no. 2007/57025-4). LMMO recibi una beca de investigacin del Conselho Nacional
de Desenvolvimento Cientfico y Tecnolgico (CNPq). Los autores agradecen al Dr. Wanderley
Dias da Silveira para proporcionar la cepas de E. coli de las heces de pollo, el Dr. Tnia AT
Gomes para proporcionar las cepas de los seres humanos y el Dr. Luiz A. Amaral para
proporcionar cepas de E. coli de las especies bovina, caprina, porcina y ovina heces .

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