REPBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS
DIVISIN DE ESTUDIOS BSICOS SECTORIALES
DEPARTAMENTO DE QUMICA
















EXTRACCIN, PRECIPITACIN Y
CARACTERIZACIN DE LAS PROTENAS DE LA
LENTEJA ACUTICA (Lemna obscura) TRATADA CON
AMONACO


Trabajo Especial de Grado que se presenta para optar al ttulo de Licenciada en Qumica.



Presentado por:
Br. Josybel M. Rios G.
C.I. V-17.293.458.



Tutor: Ph. D. Alexis Ferrer
Co-Tutora: MSc. Lauris Urribarr



Maracaibo, Mayo de 2009.



















































Rios Guaid, Josybel Moary. EXTRACCIN, PRECIPITACIN Y CARACTERIZACIN
DE LAS PROTENAS DE LA LENTEJA ACUTICA (Lemna obscura) TRATADA CON
AMONACO


Realizado en el:
Laboratorio de Instrumentacin Analtica (L.I.A)
Telfono: (0261)-7598154





Josybel M. Rios G.
C.I. 17.293.458
Telfono: 0414-6734372
Correo electrnico: josybelrios_28@hotmail.com




Ph. D. Alexis Ferrer
Correo electrnico: alexis.ferrer@gmail.com
Tutor




MSc. Lauris Urribarri
Correo electrnico: laurisurribarr@gmail.com
Co-Tutora



























DEDICATORIA



Dedico este esfuerzo a:
Dios.
Mi madre.
Mi hermano.
Mi padre donde quiera que este.
Mi novio, futuro esposo y padre de mis hijos.
La bendicin que nos regalo Dios mi sobrina.
Todos mis amigos (as) y familiares, que siempre han estado a mi lado apoyndome.



AGRADECIMIENTO


A Dios, por ser mi padre, mi amigo, mi hermano, mi todo! porque siempre, ha iluminado
mis pasos para encontrar el camino hacia donde debo andar, me ha consolado, me ha felicitado,
me ha dado aliento y fuerzas para vencer los obstculos. Por ensearme muchas cosas, entre
ellas, que por ms larga que sea la noche siempre llegara un amanecer hermoso y que no hay
imposibles para los que luchan con el corazn para alcanzar sus sueos.


A mi madre, por ser la mejor que Dios me haba podido dar, por su fuerza para sacarnos
adelante a mi hermano y a m, a pesar de las adversidades, por ensearme a ser humilde, cariosa,
agradecida, sincera, a tener fe en mi corazn y a creer en lo que mis ojos no pueden ver y por
recordarme que nunca debo dejar de luchar y perder la esperanza de lograr mis sueos, que no me
debo dejar vencer por los obstculos y sobre todo que tenga perseverancia para alcanzar el xito.


A mi padre por darme el ser y sus genes. S que si Dios no se lo hubiera llevado habra sido
un gran pilar en mi vida. Gracias por haber existido.


A mi hermano Jos Manuel, por su paciencia, apoyo, amor, consejos, confianza y por
siempre estar all dndome la mano cuando me senta sola y por hacerme ver que la felicidad no
est en la meta sino en el camino para llegar a ella.


A quien es ms que mi novio, mi maestro Eliel Josue Viloria que ha llegado a mi vida a
llenarla de dicha y felicidad, gracias por tu amor incondicional, confianza, dedicacin, paciencia
para sobrellevarme, sinceridad al hacerme ver mis errores sin importar que puedan afectar la
relacin, y por hacerme rer y cada da ensearme algo nuevo y que es estar enamorada. Despus
de encontrarme con Dios, conocerte a ti es lo ms especial y hermoso que me ha sucedido.


A Pedro, quien ms que mi compaero de estudios ha sido mi amigo, a quien agradezco su
sinceridad, compaa durante esta larga travesa, sus crticas constructivas, lealtad, aprecio,
apoyo, confianza y cario. S que aunque no lo demuestre mucho detrs de esa coraza hay un
gran corazn.


A mi mejor amigo Adrin, por su cario, amistad, paciencia, apoyo, confianza, dedicacin,
tolerancia y esfuerzo, por acompaarme en todo este largo camino, gracias por estar siempre ah
dndome palabras de aliento cuando ms la necesitaba, por hacerme ver mis cualidades, ms all
de mis debilidades.


A mis queridas amigas Marlin, Yasel, Adriana, Nicole, Jerine, Karol, Johana, Angie, Yolis,
Maigualida y Orlaidy por su amistad, apoyo, compaerismo incondicional, cario, confianza y
sobre todo gracias por existir y estar siempre al alcance de mis brazos. Espero que nuestra
amistad pueda perdurar por siempre.


A mis tutores, los profesores Lauris Urribarr y Alexis Ferrer por su amistad, sus enseanzas,
su estimulo, su asesoramiento en este trabajo, sobre todo por creer y confiar en m y por darme la
oportunidad de crecer a su lado profesionalmente. Gracias y que Dios los bendiga!


A todos los miembros y amigos del Laboratorio de Instrumentacin Analtica, David,
Wilberto, Jean, Adriana, Denny y los Profesores Blanca, Maigualida, Roberto, Minerva y Vctor,
les agradezco su apoyo, tiempo, confianza y cario. De cada uno de ustedes he aprendido cosas,
tanto a nivel acadmico como espiritual.


A Peters por su amistad, colaboracin prestada, solidaridad, por iniciarme en el camino de la
investigacin y desarrollo profesional y con quien compart momentos muy agradables.


Al Consejo de Desarrollo Cientfico y Humanstico (Condes) de la Universidad del Zulia, y
al ICLAM por el financiamiento parcial de este trabajo.


A todos mis familiares y amigos que me dieron su cario y as mismo a todas aquellas
personas que formaron de alguna manera parte de esta meta.


Y a la Universidad del Zulia, por mi preparacin y formacin acadmica. Les agradezco
tambin a todos aquellos profesores de la F.E.C. por su contribucin.


NDICE DE CONTENIDO


Pg.
RESUMEN.. 9
ABSTRACT 10
1.-INTRODUCCION... 11
2.- FUNDAMENTOS TEORICOS...... 14
2.1.- Potencial Nutricional de la Lemna obscura en la alimentacin de
Animales Monogstricos..

14
2.2- Caractersticas de la Lemna obscura. 16
2.3.- Componentes del Material Lignocelulsico.. 16
2.4.- Caracterizacin de Material Foliar 21
2.5.- Protena Foliar y su Cuantificacin... 22
2.6.- Mtodos para Mejorar la Utilizacin de la Fibra... 24
2.6.1.- Pretratamientos Fisicoqumicos: Procesos Amoniacales 25
2.6.1.1.- Tratamiento de Explosin Amoniacal (AFEX).... 25
2.6.1.2.- Proceso de Presurizacin y Despresurizacin Amoniacal (PDA) 25
2.7.- Procesos de Extraccin y Precipitacin de las Protenas en Material Foliar 27
2.8.- Caracterizacin Electrofortica.. 29
3.- PARTE EXPERIMENTAL 31
3.1.- Materiales. 31
3.1.1.- Fuente de Protena.. 31
3.2.- Mtodos 31
3.2.1.- Caracterizacin de la Biomasa. 31
3.3.- Tratamiento de Presurizacin y Despresurizacin Amoniacal (PDA).. 31
3.4.- Extraccin de las Protenas de la Lemna obscura. 31
3.5.- Determinacin del Punto Isoelctrico 32
3.6.- Precipitacin de las Protenas de la Lemna obscura.. 33
3.7.- Purificacin de las Protenas Precipitadas por pI... 33
3.8.- Electroforesis en Gel Discontinuo de Poliacrilamida con Dodecil Sulfato
de Sodio (SDS-PAGE).

33
4.- RESULTADOS Y DISCUSIN.... 34


4.1.- Caracterizacin de la Biomasa... 34
4.2.- Condiciones de Extraccin y Precipitacin de las Protenas de la Lemna
obscura no Tratada (LNT)...

37
4.3.- Condiciones de Extraccin de las Protenas de la Lemna obscura Tratada
con Amonaco (LT).
38
4.3.1.- Seleccin del pH de la Solucin Extractante. 38
4.3.2.-Seleccin del Tiempo de Extraccin.. 39
4.3.3.- Seleccin de la Temperatura y la Relacin Slido-Lquido.. 40
4.4.- Efecto del Tratamiento Amoniacal sobre las Condiciones de Extraccin de
las Protenas de la Lemna obscura Tratada con Amonaco.

43
4.5.- Evaluacin de las Condiciones de Precipitacin de las Protenas de la
Lemna Tratada con Amonaco.

45
4.6.- Efecto del Tratamiento Amoniacal sobre las Condiciones de Precipitacin
de las Protenas de la Lemna obscura..
48
4.7.- Perfil Electrofortico de las Protenas de la Lemna obscura Tratada con
Amonaco en Gel de Poliacrilamida
49
5.- CONCLUSIONES.. 52
6.- RECOMENDACIONES..... 53
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 54
NDICE DE FIGURAS.... 64
NDICE DE TABLAS. 65















Rios Guaid, Josybel Moary. EXTRACCIN, PRECIPITACIN Y CARACTERIZACIN
DE LAS PROTENAS DE LA LENTEJA ACUTICA (LEMNA OBSCURA) TRATADA
CON AMONACO. Trabajo Especial de Grado. Universidad del Zulia. Facultad Experimental
de Ciencias. Departamento de Qumica. Laboratorio de Instrumentacin Analtica. Maracaibo,
Venezuela. 2009. 65 p.



RESUMEN



Existe una gran escasez de alimentos protenicos en Venezuela. La principal fuente para uso
animal es harina de soya importada. Como alternativa ha surgido el uso de la lenteja acutica,
actualmente presente en forma abundante en el Lago de Maracaibo y que puede contener altos
niveles de protenas de excelente calidad. Sin embargo, su alto nivel de fibra impide su consumo
directo con eficiencia en animales monogstricos, requirindose de un tratamiento fisicoqumico,
como el proceso de Presurizacin y Despresurizacin Amoniacal (PDA), que debilita la matriz
lignocelulsica permitiendo el aumento de la remocin de protenas. En este trabajo se
optimizaron las condiciones de extraccin de las protenas citoplsmicas en la lemna tratada con
amonaco (LT), para obtener concentrados proteicos. La lemna se recolect, sec, moli,
caracteriz y se le realizaron extracciones de sus protenas en condiciones ya establecidas,
correspondiendo a lemna no tratada (LNT). Una parte de la lemna se someti al proceso PDA. Se
optimizaron las condiciones de extraccin de la LT con agua y solucin de hidrxido de calcio,
variando el pH, relacin slido/lquido, temperatura y tiempo de extraccin. Luego se
almacenaron en fro, precipitando las protenas cloroplsticas y separndose por centrifugacin.
Para la precipitacin de las protenas citoplsmicas se ajust el pH en su punto isoelctrico y se
calent a varias temperaturas. Se establecieron como condiciones ptimas de extraccin de
protenas de la LT: pH 5,85, 90C, relacin slido-lquido 1:15 y 20 min., condiciones para las
que se obtuvo el mximo rendimiento del 46,44%, mayor (1,82 veces) que el obtenido para la
LNT del 25,54%. Las condiciones de precipitacin optimizadas para la LT fueron pH 3,5 y 50 C,
para las cuales se obtuvo un rendimiento de 96,29%, 1,23 veces mayor al obtenido para la LNT
que fue 78,2%. El contenido de protena cruda en el concentrado fue de 22,89% (b.s). El estudio
electrofortico revel protenas de masa molar aproximada entre 11,28 y 21,68 kDa.



Palabras Clave: Protenas foliar, lenteja acutica, Lemna obscura, tratamiento amoniacal,
extraccin de protenas, precipitacin de protenas.


Correo Electrnico: josybelrios_28@gmail.com








Rios Guaid, Josybel Moary. Extraction, precipitation and characterization of proteins from
ammonia-treated duckweed (Lemna obscura). Trabajo Especial de Grado. Universidad del
Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Departamento de Qumica. Laboratorio de
Instrumentacin Analtica. Maracaibo, Venezuela. 2009. 65 p.



ABSTRACT



There is a great shortage of protein feeds in Venezuela. The main source for animal use is soy
bean flour. As an alternative, the use of duckweed has arisen, which is currently abundant in the
Maracaibo Lake and it may contain high levels of excellent quality protein. However, its high
fiber level prevents its direct and efficient use in simple-gutted animals, requiring a physical-
chemical treatment, such as Pressurization and Depressurization with Ammonia process (PDA)
which weakens the lignocellulosic matrix, and may enhance the protein removal. In this work the
conditions of extraction of cytoplasmic proteins from ammonia-treated lemna (LT) were
optimized to obtain protein concentrates. Duckweed was collected, dried, milled, and
characterized. Extractions were carried out at preestablished conditions, corresponding to non
treated lemna (LNT). The conditions of extraction of proteins from LT were optimized, varying
pH, solid/liquid ratio, temperature and time. Subsequently, the samples were refrigerated, the
chloroplastic proteins precipitated and then separated by centrifugation. In order to precipitate the
cytoplasmic proteins, pH was adjusted at the isoelectric point and the extracts were heated at
several temperatures. Optimal extraction conditions for LT were pH 5.85, 90C, 1:15 solid/liquid
ratio and 20 min., giving a maximum yield of 46.44%. Much bigger (1.82 fold) that the one
obtained for the LNT of 25.54%. Optimal precipitation conditions for LT were pH 3.5 and 50 C,
giving a yield of 96.29%, 1.23 times greater than the one obtained for LNT which was 78.2%.
The crude protein content in the concentrate was 22.89% (dwb). The electrophoretic study
revealed proteins of molar masses between 11.28 and 21.68 kDa.



Key words: Leaf proteins, duckweed, Lemna obscura, ammonia treatment, protein extraction,
protein precipitation.


Correo Electronico: josybelrios_28@gmail.com









1.- INTRODUCCIN


En pases como Venezuela, la produccin creciente y sostenible de aves, cerdos y otros
animales de estmago simple, se ha visto limitada, debido a la produccin vegetal deficiente de
cereales (maz, cebada trigo, avena, sorgo, centeno, entre otros), granos de leguminosas y granos
de oleaginosas (soya, girasol, etc.), ya que no cuentan con los avances tecnolgicos ni las
condiciones climticas que les permita sostener la produccin
1
requerida para satisfacer las
exigencias del mercado interno. Estos hechos han conllevado a adoptar los parmetros impuestos
por los modelos productivos transferidos de pases industrializados, que requieren una alta
inversin de capital
2
, ya que segn Len
3
la industria de alimentos concentrados en
Latinoamrica, destina casi el 90% de su produccin a cerdos y aves. Esto representa una enorme
dificultad desde el punto de vista econmico y social para nuestras condiciones, ya que solo
aumentan la dependencia.


El incremento demogrfico, el aumento de los ingresos y la urbanizacin inducen un notable
crecimiento de la demanda mundial de alimentos, entre ellos los de origen animal, que aportan un
alto contenido de protenas a la dieta humana. Para la produccin intensiva de animales rumiantes
altamente productores (ovejas, cabras y vacas normalmente lecheras) se requiere complementar
las dietas forrajeras con alimentos ricos en nutrientes como cidos grasos, protenas,
carbohidratos, vitaminas, antioxidantes y minerales (que compiten con la alimentacin humana)
4
y stos se utilizan en grandes cantidades en el racionamiento de animales monogstricos (cerdos,
aves y conejos). Por tanto, la produccin de estos animales est concentrada en pases con amplio
desarrollo tecnolgico. Segn datos de la Organizacin de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentacin (F.A.O)
5
, la produccin porcina y la de aves de corral son las que
crecen y se industrializan con mayor rapidez a nivel mundial, duplicando a la poblacin humana,
con una tasa de crecimiento anual del 2,6 y del 3,7%, respectivamente. S se compara el consumo
de cereales por parte del hombre vs. aves y cerdos se tiene que son equivalentes, esto es
alarmante en un mundo donde la tasa de desnutricin es cada da mayor.


Los problemas antes sealados obligan a la bsqueda de fuentes alternas de protenas no
convencionales, derivadas de productos vegetales, subproductos de la agricultura, ganadera y de
la industria, con la calidad suficiente para cubrir las necesidades alimenticias de animales

12
monogstricos, y as reducir al mnimo la necesidad de suplementacin, importaciones y la
competitividad con la alimentacin humana
4
, siendo las fuentes proteicas mas estudiadas las
oleaginosas, leguminosas, follajes, plantas acuticas, otras plantas superiores y algas. Entre stas,
las plantas acuticas reciben una atencin especial, ya que constituyen fuentes proteicas de alto
valor nutricional (18 a 46% PC), potenciados por el hecho de poseer buen balance de
aminocidos y bajos valores de cidos nucleicos en comparacin con fuentes de protena
unicelular
6
, entre las que se destacan las integrantes de la familia macrofitas acuticas flotantes,
y de las cules se han estado evaluando como posibles fuentes proteicas las especies
pertenecientes a los gneros lemna (Lemna minor y gibba)
7
, azolla (Azolla spp)
7
, y la espinaca
acutica (Ipomoea aquatica)
8
, por su amplia distribucin geogrfica, sobresaliente produccin de
biomasa, elevada supervivencia en condiciones naturales, elevada reproducibilidad vegetativa
bajo condiciones ambientales propicias, disponibilidad durante todo el ao y fcil incorporacin
en sistemas de alimentacin para cerdos y aves. Particularmente en estas macrofitas no se han
encontrado factores antinutricionales que pudieran limitar su uso en alimentacin animal, lo que
las hace muy atractivas en este sentido
8
.


La lemna es una planta que asimila los nutrientes como el fsforo y nitrgeno, liberados en
el proceso de descomposicin de la materia orgnica presente en las aguas residuales, tiene una
gran velocidad de crecimiento y una concentracin de aproximadamente 45,3% de protena
cruda
9
, lo que la convierte en una alternativa que el trpico presenta para el desarrollo de sistemas
apropiados de produccin rentables desde el punto de vista ambiental, econmico y humano
10
y
en especial, Venezuela, debido a su abundante crecimiento en el Lago de Maracaibo (entre el 4 y
9% de la superficie del lago) el cual puede ser aprovechado para la produccin de protenas de
excelentes caractersticas nutricionales, que permitiran minimizar la escasez de alimentos
concentrados. Tambin la lemna se puede cultivar de manera intensiva en lagunas de oxidacin
ubicadas en las instalaciones de granjas porcinas del pas para su posterior empleo en la
alimentacin de animales, con lo que a su vez se lograra la descontaminacin de los efluentes
producidos en dichas granjas
11
. Es importante destacar que en otras regiones del mundo, la lemna
se cultiva de dicha manera, y esto permite recolectarla cada dos das, obtenindose una biomasa
con un elevado contenido proteico y un nivel mnimo de fibra, que permite utilizar la lemna
directamente en alimentacin de animales monogstricos. En el caso concreto de la lenteja de
agua del Lago de Maracaibo, sta solo se puede recoger de manera prctica cuando alcanza las

13
orillas, pero esta lemna tiene generalmente ms de un mes, la concentracin de protena ha bajado
mucho entre un 6 hasta un 25%, y por el contrario, el nivel de fibra sube a valores entre 15 y
40%
12
. Como consecuencia, su consumo directo por animales de estmago simple se ve limitado,
ya que el elevado contenido de fibra le confiere baja digestibilidad. Adems, las protenas se
encuentran en la compleja matriz fibrosa del material lignocelulsico, quedando inaccesibles para
los animales monogstricos por no contar stos con las enzimas requeridas para hidrolizar los
enlaces de la matriz lignocelulsica, haciendo difcil la absorcin de los nutrientes y la liberacin
de los aminocidos
13
. Sin embargo, existen diversos tratamientos fisicoqumicos a los cuales
puede ser sometido el material vegetal que ayudan a remover las protenas del material fibroso, lo
que permite incrementar su digestibilidad y su concentracin.


El proceso de Presurizacin y Despresurizacin Amoniacal (PDA) es un tratamiento donde
se utiliza amonaco en fase lquida a temperatura y presin relativamente bajas durante un corto
perodo, que finaliza con una rpida descompresin causando cambios fsicos y qumicos en el
material vegetal. Un estudio reciente
12
ha demostrado su efectividad al abrir la estructura del
material lignocelulsico, debido al rompimiento de los enlaces tipo ster que mantienen unidos a
los constituyentes de la matriz, lo cual ha permitido una mayor liberacin de protenas
14
y por
consiguiente ha facilitada su extraccin del sustrato vegetal
15
; dejando en ste una fibra con
mayor digestibilidad tanto para los rumiantes como para los procesos enzimticos para su
conversin en azcares
12
. Para la utilizacin de las protenas presentes en los extractos vegetales,
es necesaria su precipitacin a fin de obtener un producto con elevada calidad, bajos niveles de
fibra, mayor digestibilidad y valor nutritivo, y menor contenido de humedad.


Como existe una gran deficiencia de fuentes proteicas de calidad, y dado el potencial de la
lemna como fuente de la misma y a su repentina disponibilidad en el Lago de Maracaibo, se
propuso como objetivo principal de esta investigacin, establecer un mtodo eficiente de
extraccin y precipitacin de protenas de la lemna tratada con amonaco para la elaboracin de
un concentrado proteico que a la vez pueda ser empleado en la alimentacin de animales
monogstricos y resulte competitivo tanto desde el punto de vista nutricional como econmico
con respecto a otras fuentes de alimentacin convencional. Adicionalmente, con este trabajo se
busca evaluar el efecto del tratamiento amoniacal sobre las fibras y protenas, para determinar el
mejoramiento del potencial biolgico de dicha fuente por accin del PDA.


14
2.- FUNDAMENTOS TERICOS


2.1.- Potencial Nutricional de la Lemna obscura en la Alimentacin de Animales Monogstricos.


Entre los animales de consumo humano, la cra de las especies monogstricas es de mayor
importancia debido a que son mucho ms eficientes en la utilizacin de los alimentos, su tasa
reproductiva es mayor, su crecimiento es mucho ms rpido, se manejan ms fcilmente en
produccin intensiva y tienen buena aceptabilidad para el consumo
15
. Para ellos se busca que la
alimentacin sea la ms ajustada posible para producir la mayor cantidad de carne en el menor
tiempo y al menor costo posible, maximizando la ganancia diaria. Para los aos 90 en Alemania
se produca la misma cantidad de carne de cerdo al ao que en toda Latinoamrica. Este hecho es
explicable, ya que en pases como Venezuela, el costo de alimentacin puede alcanzar hasta el
70-80% del costo de produccin, debido principalmente a que la mayor parte de los alimentos
son compuestos que contienen materias primas concentradas, ingredientes complementarios y
aditivos que son un su mayora importados. Esta situacin es ms crtica en aquellos pases donde
los animales compiten con el hombre por los mismos alimentos, en esta posicin se encuentran
incluidos la mayora de los pases del rea tropical
16
, que adems mantienen un crecimiento
demogrfico elevado
17
.


Los animales monogstricos se alimentan con piensos elaborados de alimentos concentrados
de alta calidad nutritiva. As, para cerdos se utilizan materias primas como cebada, maz, trigo,
mandioca, salvados, harinas de soya, de girasol, de algodn, de carnes (en la actualidad
prohibidas), pescados y diversos tipos de grasas. Todo ello se muele adecuadamente y se le
aaden correctores minerales y vitamnicos, aminocidos sintticos y otros tipos de sustancias
denominadas aditivos alimentarios. El resultado es una mezcla compleja que suele presentarse en
forma de harina o grnulo (pellet). En el caso de las aves, las raciones suelen requerir una
mayor concentracin energtica, lo que obliga a incluir una mayor proporcin de materias nobles
como son el maz y la harina de soya o de pescado
18
.


Todo lo anterior ha conllevado a los nutricionistas, y a los pequeos y medianos productores,
a explorar el uso de materias primas alternativas en la alimentacin animal, que puedan sustituir

15
parcialmente el uso de concentrados proteicos comerciales en la produccin avcola, porcina y
cuncola sostenible
5,4,19
, y de esta manera disminuir la importacin de cereales como fuentes de
almidn y de oleoginosas como fuente proteicas.


En las zonas tropicales existe disponible una amplia variedad de plantas de contenido de
protena variable, que por su velocidad de crecimiento, aportan una cantidad de biomasa
suficiente para suplir gran parte de las necesidades nutricionales, tanto proteicas como
energticas, en la alimentacin de animales monogstricos.


Actualmente, se buscan fuentes de protenas vegetales que resulten econmicas y que sirvan
de solucin a este dficit alimentario. Sin embargo, la obtencin de protena a partir de
subproductos proteicos de la industria harinera o de la industria aceitera como pellets de soya,
canola y algodn, resultan costosos y escasos
20-21
, ya que deben ser procesados antes de ser
incorporados a las dietas de los animales, por ejemplo, el residuo remanente de leguminosas
como la soya, debe ser tratado con calor para destruir los factores antinutricionales (FANs)
lbiles al calor, como inhibidores de tripsina o lectinas, pero desafortunadamente deja los FANs
estables al calor intactos, requiriendo entonces procesamientos especiales que permitan una
disminucin de los mismos
22
. De aqu que las plantas acuticas, como la Lemna obscura, sean
una alternativa que el trpico presenta para el desarrollo de sistemas apropiados de produccin
desde el punto de vista ambiental, econmico y humano
10
, en especial Venezuela, que por su
ubicacin en el trpico presenta las condiciones climatolgicas, que facilitan el desarrollo y
crecimiento de estas macrofitas.


El potencial de la Lemna obscura se debe a su rpido crecimiento, reproduccin,
bioacumulacin de otros compuestos presentes en el agua y a su capacidad de adaptacin a
cualquier medio ordinario. Adems, estas plantas son un cultivo gratuito de gran valor potencial,
que no requieren mano de obra, fertilizacin o siembra
7
. En condiciones adecuadas de
crecimiento puede llegar a contener 35-45,3% de protena, 5-15% de fibra y hasta 5% de grasa
poliinsaturada
21
. Su alto contenido de humedad (85-95%) reduce la absorcin efectiva de los
macronutrientes contenidos en la biomasa, por lo que resulta necesario el secado de las plantas
para reducir su volumen
23
y lograr la concentracin de los nutrimentos, adems de facilitar su
manejo, disminuir la descomposicin por hongos
24
y reducir los costos de transporte.


16
2.2.- Caractersticas de la Lemna obscura.


Las plantas acuticas se clasifican como: emergentes, flotantes y subemergentes. Las
emergentes son las que desarrollan las races por debajo de la superficie del agua, mientras que
parte de su estructura vegetativa sobresale a la superficie, principalmente las fotosintticas salen
del agua, por ejemplo, Aeschynomene sensitiva y Limnocharis flava. Las flotantes son del tipo de
libre flotacin, se mueven a merced de las corrientes de agua y por accin del viento, se
encuentran sobre la superficie del agua y sus races estn suspendidas en el agua, por ejemplo la
Pistia stratiotes, Lemna obscura y Salvinia minima. Las plantas subemergentes son las que
crecen por de bajo de la superficie del agua, formando una barrera desde el fondo hasta la
superficie, por ejemplo Elodia sp. Las variedades de plantas acuticas alrededor del mundo son
muy amplias y todas ellas pueden ser utilizadas para el tratamiento de agua
7
.


La lemna en una planta superior o macrofita acutica libre flotadora, perteneciente a la
familia de las Lemnaceae
25
, que se reproduce fcilmente, cubriendo grandes reas con la ayuda
del viento
26
y crecen rpidamente en aguas estancadas o de corriente lenta. Se adaptan a una
amplia variedad de zonas climatolgicas y geogrficas, mayormente en zonas templadas y
tropicales
27
, pero es originaria de Norte Amrica. Alcanzan niveles de protena hasta del 45,3%
26

y de 3% de fsforo en base seca, sobrevive en zonas altas y la biomasa que produce es baja en
fibra y lignina
27
. Algunas bacterias epfitas pueden tener efectos negativos en el crecimiento de la
planta acutica y causar envejecimiento de las hojas
28
. Son capaces de extraer de las aguas y
acumular gran cantidad de metales pesados y micronutrientes en sus tejidos como Hg, N, Cd, As,
Pb, Cr, Fe, Cu, Mn y Zn
25
.



2.3.- Componentes del Material Lignocelulsico.


Todas las plantan se encapsulan en clulas, cuyo contenido celular se encuentra cubierto por
una pared celular, principalmente compuesta de protenas y polisacridos, incluyendo la celulosa,
hemicelulosa, y pectinas. Estos polmeros determinan la forma y las propiedades mecnicas de la
clula
29
.


17
El material foliar se divide en dos partes conocidas como la pared celular y contenido
celular.


La pared celular de las plantas es la fuente principal de consumo de fibra diettica en la
mayora de los alimentos y contienen aproximadamente del 35 a 80% de la materia orgnica
(MO), la cual proporciona rigidez estructural a la planta
30
. Su estructura es compleja, y se halla
compuesta por fibra y en menor proporcin por protenas. Entre ellos se destacan cinco
componentes mayoritarios: homopolisacridos (celulosa) y heteropolisacridos (hemicelulosa y
pectina), los cuales forman los carbohidratos insolubles llamados polisacridos diferentes al
almidn, las gomas (polisacridos de reserva) como alginatos, xiloglucanos y dextranos y la
lignina, compuesto fenlico que une los grupos anteriores. Tambin se hallan presentes inulina,
glucanos y polisacridos no sintticos, as como pequeas cantidades de protena, polifenoles de
alto peso molecular, cutinas, cido ftico y almidn resistente a la hidrlisis enzimtica
31
.


La celulosa es un homopolmero constituido por 8.000 a 10.000 unidades de -D-
glucopiranosa unidos por enlaces glicosdicos (1-4) (unin ter R-O-R)
32
, para forman cadenas
lineales, donde cada residuo glicosilo presenta una rotacin de 180 con respecto al contiguo
(Figura 1); Cuando la molcula de celulosa est completamente extendida, y toma forma de cinta
aplanada con los grupos -OH dispuestos de manera regular y sobresaliendo lateralmente, se
pueden formar puentes de hidrgeno inter, e intramoleculares de manera que ocurre una
alineacin paralela de las cadenas de celulosa, que se unen hermticamente
29,33
por dichos enlaces
para formar tiras en forma de lminas denominadas microfibrillas
32
. La superficie de la cinta,
compuesta por tomos de hidrgeno unidos directamente al carbono, es hidrofbica y le confiere
una alta cristalinidad (70% aproximadamente), insolubilidad en agua y rigidez, impidiendo la
flexin de las molculas, la que debe ocurrir para facilitar la ruptura por hidrlisis de las uniones
glucosdicas
33
. Estas microfibrillas estn embebidas en una matriz compuesta de un enrejado de
lignina (unidades de fenilpropano) que cementan otra matriz de polisacridos (ms alguna
glicoprotena), tal como hemicelulosas (arabinoxilano y xiloglucano) y es el componente
principal de la pared celular (30-50% peso seco)
34
. A medida que la planta envejece, el enrejado
de lignina de la pared secundaria se agranda hacia la pared primaria, la que desaparece,
incrustando las microfibrillas que conducen a una menor accesibilidad, sin embargo, son
parcialmente hidrolizadas en soluciones fuertes de cido sulfrico (72%)
31
. Se piensa que las


18
microfibrillas de celulosa pueden unirse con la hemicelulosa
29
. La celulosa es considerada como
un polmero semicristalino porque est compuesto por dominios cristalinos muy organizados en
microfibrillas y regiones amorfas menos organizadas.




Poli(1,4-o--D glucopiransido)
Figura 1. Estructura molecular de la celulosa, mostrando los enlaces glicosdicos
36
.


La pectina constituye un grupo muy complejo y heterogneo de polisacridos
29
, se encuentra
especialmente en la pared celular primaria de las plantas dicotiledneas y sirven en el tejido de
las plantas como goma cementante que une a las clulas entre s. Est constituida por un
esqueleto lineal de cido poligalacturnico siempre ramificado con azcares neutros
(principalmente arabinosa y galactosa). Este esqueleto lineal se interrumpe de vez en cuando, por
unidades de L-ramnosa
34
. Se encuentra enlazada a la celulosa en la membrana celular primaria de
algunas plantas superiores
35
.


La hemicelulosa, es el segundo polisacrido mas abundante en las paredes celulares de las
plantas, constituyendo entre un 10-40% de la fraccin total de los carbohidratos, aunque su
composicin vara dependiendo de la especie de la planta. Es un heteropolisacrido cuya cadena
central suele estar constituida por xilosas unidas por enlaces glicosdicos (1-4) con un alto grado
de polimerizacin y ramificacin. Los sustituyentes ms comunes presentes en los residuos de la
cadena de D- xilopiranosilo son los grupos acetil que esterifican los carbonos dos y tres (C
2
y C
3
)
de la xilosa, la L- arabinosa que se une mediante el enlace glicosdico (1-3) a la cadena central
de xilosa, el acido glucurnico que se une a travs del enlace glicosdico (1-2) a los residuos de
xilosa, y otros como el cido p-cumrico y el cido ferlico que esterifican a la L- arabinosa
36
.
Pueden formar una gran cantidad de enlaces de hidrgeno con la celulosa
34
y al combinarse con
la lignina proporcionan una envoltura protectora alrededor de la celulosa, que debe ser

19
modificada o eliminada para obtener una hidrlisis eficiente. Su naturaleza ramificada hace que
la hemicelulosa sea amorfa, y relativamente fcil de hidrolizar a sus azcares constitutivos
35
.



Figura 2. Estructura esquemtica de la hemicelulosa y sus unidades estructurales
36
.


La lignina es la tercera fraccin mayoritaria de la biomasa lignocelulsica. Se trata de un
polmero tridimensional amorfo que acompaa la celulosa, formado por la polimerizacin
deshidrogenante de unidades de fenilpropano
33
y derivadas de los cidos p-cumrico, ferlico y
sinpico, unidas por diferentes tipos de enlaces carbono-carbono (C-C) o ter (C-O-C)
37
, que se
alternan de manera desordenada. Los monmeros que forman la lignina son los denominados
alcoholes cinamlicos (diferenciados por su grado de metoxilacin)
33
. Este biopolmero se
deposita en las paredes celulares de las plantas como parte del proceso de maduracin de las
clulas. La proporcin de tejidos y rganos lignificados tpicamente aumenta conforme la planta
madura, por lo que a menudo hay una relacin negativa entre la digestibilidad y madurez. Sin
embargo, si se utiliza una planta muy joven, la productividad de materia vegetal es muy baja, de
tal manera que es necesario optimizar el tiempo de cosecha. En los forrajes, la lignina se
considera como un componente que disminuye la calidad por su impacto negativo en la
disponibilidad nutricional de la celulosa y de la hemicelulosa de la planta
38
. Adems, la lignina
no es utilizada por ninguna especie animal superior, ya que no se conocen enzimas mamferas ni
de microbios anaerbicos capaces de degradarla
39
.


La polimerizacin de los precursores alcohlicos durante la formacin de la pared celular se
produce mediante la sucesin de una etapa enzimtica, y una etapa qumica. En la primera, los
precursores son oxidados por peroxidasas de la pared dando radicales fenoxilo que, a
continuacin y durante la etapa qumica, reaccionan al azar entre ellos. En este proceso se


20
originan una gran variedad de formas resonantes que pueden reaccionar unas con otras, razn por
la que la lignina no presenta una nica estructura. Las uniones pueden ser de tipo condensado
(enlaces C-C), o de tipo no condensado (enlace aril-alquil ter), en las que intervienen tanto los
anillos aromticos como las cadenas proplicas. Los enlaces que van a condicionar una alta
condensacin de la lignina son los enlaces C-C que slo pueden establecerse entre unidades H o
G, ya que las unidades S al tener dos grupos metoxilo en posiciones 3 y 5, no pueden establecer
este tipo de enlaces
33
.



Figura 3. Representacin grafica de la estructura de la lignina
38
.


Los taninos qumicamente se presentan como agrupaciones de grupos glicsidos y
polifenlicos de estructura qumica variada, que se encuentran ampliamente distribuidos en el
cuerpo del vegetal y se localizan en vacuolas combinados con alcaloides y protenas o
impregnados en las paredes celulares. En la naturaleza pueden encontrarse dos tipos de taninos:
condensados e hidrolizables, estos ltimos son rpidamente degradados en grupos fenlicos ms
pequeos, incapaces de reaccionar con las protenas del medio, mientras que los taninos
condensados poseen suficientes hidroxilos fenlicos para formar complejos con protenas y otras
macromolculas que contengan grupos carbonilo y amino, y pueden formar puentes de hidrgeno
con macromolculas susceptibles de autooxidacin. Por ello, la presencia de taninos ha sido

21
asociada con bajo valor nutritivo y baja disponibilidad biolgica de macromolculas como las
protenas, carbohidratos, aminocidos, vitaminas, y minerales
40,41
.


Alcohol coniferlico
Unidad guayacilo
Alcohol sinaplico
Unidad siringilo
Alcohol p-cumarlico
Unidad p-hidroxifenilo

Figura 4. Alcoholes precursores de la lignina
33
.


El contenido celular es fcilmente digerible y corresponde a la porcin que se encuentra
envuelta por la pared celular. Incluye la protena cruda (cidos nucleicos, aminocidos, protenas
y otros compuestos nitrogenados), azcares, almidn y lpidos, que conforma el componente
denominado solubles en la tcnica de Goering y Van Soest junto con la pectina
42
.



2.4.- Caracterizacin del Material Foliar.


Entre los sistemas tradicionales para determinar el contenido de fibra en alimentos animales
se encuentra el anlisis proximal (mtodo Weende) y el mtodo de los detergentes de Van
Soest
43
. El anlisis de Weende, es proximal porque no determina sustancias qumicamente
definibles, sino que asocia combinaciones orgnicas que responden a determinadas reacciones
analticas. Por ello se habla de grupos nutritivos que son: agua o materia seca (MS), extracto
etreo (EE), protena cruda (PC), cenizas, fibra cruda (FC) y extracto no nitrogenado (ENN)
44
.
Este anlisis presenta serias limitaciones en la determinacin del extracto no nitrogenado (ENN)
y fibra cruda por no diferenciar los componentes de la pared celular lo suficiente como para
generar estimaciones acuciosas para un amplio rango de especies vegetales y estados de madurez.
Por esta razn se dise otro mtodo para la determinacin de estas fracciones de la materia seca
como lo es el mtodo de Van Soest
31
, el cual es ms ventajoso, porque separa a los carbohidratos
de acuerdo a su disponibilidad nutricional y hasta puede servir como un predictor de


22
digestibilidad
32
. Se basa en el uso de detergentes para separar el material en dos fracciones
nutricionales. La primera (soluble en detergente neutro) corresponde al contenido celular,
compuesto como se mencion anteriormente por carbohidratos no estructurales, lpidos, la mayor
parte de las protenas y fibra soluble, esta ltima corresponde a las pectinas y los -glucanos que
son muy resistentes a las enzimas de mamferos, pero que pueden ser utilizados por los
rumiantes, a travs de la fermentacin en el rumen. Las pectinas y los -glucanos son
componentes de la pared celular que no tienen enlaces covalentes con la lignina. La segunda
fraccin (insoluble en detergente neutro) corresponde a la pared celular
45
, cuya disponibilidad
est controlada por las caractersticas estructurales que ligan a la celulosa, hemicelulosa, lignina,
cenizas y protenas de membranas. Posteriormente, las hemicelulosas son disueltas en detergente
cido, y la fraccin insoluble remanente (fibra detergente cido), representada por lignina y
celulosa principalmente, se puede someter a una digestin con cido sulfrico concentrado
(72%), para eliminar la celulosa, y as determinar el contenido de lignina, mediante la
determinacin de cenizas
31
.



2.5.- Protena Foliar y su Cuantificacin.


Las plantas contienen protenas, que son componentes fundamentales de sus clulas y son el
resultado de las combinaciones de 20 aminocidos distintos enlazados unos a otros por medio de
enlaces peptdicos, formados por la condensacin de grupos amino (NH
2
) y carboxilo (COOH)
46

y que dan origen a largas cadenas que pueden estar formadas por varios cientos de aminocidos.
La forma en particular en la que los aminocidos estn combinados en cada protena determina
sus caractersticas bioqumicas. Los animales, incluyendo al hombre, son incapaces de sintetizar
10 de los 20 aminocidos requeridos para la sntesis de protenas, por lo que estos aminocidos
esenciales deben ser obtenidos de su dieta diaria, que debe incluir una porcin importante de
protena, para as cubrir las necesidades de cada organismo en particular
47
. El catabolismo de las
protenas es posible por la presencia de las enzimas especficas que pueden acelerar su
trasformacin para obtener los aminocidos. Las protenas sintetizadas no son importantes como
fuente de energa, su principal valor radica en su funcin en los procesos metablicos, de
crecimiento y reparacin de tejidos
44
. Estas protenas se obtienen principalmente de semillas de
leguminosas (soya), cereales (trigo, maz), oleaginosas (man, torta de algodn) y de hojas

23
verdes
48
, cubriendo prcticamente las necesidades de rumiantes y no rumiantes. En el caso de la
alimentacin de camarones, es necesario utilizar harina de pescado.


La protena foliar consiste de enzimas y algunas protenas estructurales, constituyendo entre
70 y 80% del nitrgeno total
49-50
. Se conocen dos tipos de protenas: la protena citoplsmica
(fraccin blanca), libre de clorofila, soluble en agua, de mayor digestibilidad, de alto valor
biolgico
51
, y la protena cloroplsmatica (fraccin verde), insoluble en agua, que corresponde a
lipoprotenas en estado coloidal asociadas con los cloroplastos, en donde se encuentra la clorofila
y los carotenos
52
, de menor digestibilidad y valor nutritivo
44
. Entre las protenas cloroplsmaticas
la ms abundante es la ribulosa 1,5-difosfato carboxilasa (rubisco), que es la enzima
53
que
cataliza la primera etapa de la fijacin fotosinttica de anhdrido carbnico atmosfrico
40
. Esta
enzima es la protena ms abundante en diversos materiales vegetales, llegando a constituir entre
un 20-50% de la protena foliar
53
, su peso molecular es 560 kDa, y bajo una variedad de
condiciones desnaturalizantes, puede disociarse en ocho subunidades grandes (aproximadamente
55 kDa cada una) y ocho subunidades pequeas (aproximadamente 14 kDa cada una) con pI de
6.0 y 5.3, respectivamente
54
. La protena de 55 kDa slo es soluble en presencia de una alta
concentracin de sal (NaCl) y generalmente no se extrae de los extractos acuosos tpicos. Esta
protena cristaliza en forma de un polvo blanco inspido que tiene el valor nutritivo comparable a
las protenas de la leche humana y bovina y es superior al de las protenas de la soya. La
extraccin acuosa de la fraccin de protenas de 14 kDa, est constituida por una mezcla de
protenas solubles de bajo peso molecular, extrable de los cloroplastos y citoplasma
55
. La pared
celular de las hojas contiene alrededor de un 10% de protenas
56
.


La determinacin de protena cruda (PC), se realiza a travs del mtodo de Kjeldahl, el cual
evala el contenido de nitrgeno total en la muestra, usa reactivos corrosivos y necesita una
cantidad relativamente grande de protena para ser exacto. Este mtodo se fundamenta en la
suposicin de que la protena contiene como promedio un 16% de nitrgeno. Pero esta suposicin
no es completamente cierta, ya que el nitrgeno total de una muestra adems de estar presente
como protena verdadera (PV), tambin se encuentra como nitrgeno no proteico (NNP) en forma
de aminocidos libres, amidas, cidos nucleicos, glucsidos, alcaloides, urea, purinas y sales de
amonio. En general, cerca del 80 % del nitrgeno total presente en las plantas es PV y stas son
de alto valor biolgico, pero muchas veces se les estima un valor menor debido a la tradicin de


24
expresar la protena PC como el contenido de nitrgeno total x 6,25, olvidando las diferentes
formas de nitrgeno que existen en las plantas
57-58
. Para determinar la concentracin de protenas
en base a la concentracin de aminocidos, se prefiere utilizar la hidrlisis cida. Sin embargo,
puede haber prdida de algunos aminocidos. Como alternativa, las protenas como compuestos
polipeptdicos, pueden determinarse mediante el mtodo de Lowry. Este mtodo es sensiblemente
constante de protena a protena, lo cual ha hecho que sea ampliamente empleado en las
determinaciones de protena verdadera, como una alternativa completamente aceptable con un
rigor absoluto en todas las determinaciones en donde se involucren mezclas de protenas o
extractos crudos. Adems este mtodo es simple, sensible, preciso y rpido
59
. Tiene como
principio el desarrollo del color debido a la reaccin de los enlaces peptdicos de los aminocidos
aromticos de las protenas y del cobre alcalino de uno de los reactivos, y la reduccin del
fosfomolibdatofosfotungsteno del reactivo Folin Ciocalteau (3H
2
OP
2
O
5
13WO
3
5MoO
2
10H
2
O y
3H
2
OP
2
O
5
14WO
3
MoO
2
10H
2
O)
58, 60-61
. La prdida de 1, 2 o 3 tomos de oxgeno del tungsteno
y/o molibdato bajo las condiciones alcalinas y en la presencia de protenas tiene como resultado
la formacin de uno o varios complejos que tienen un color azul caracterstico con una max de
745750 nm y min de 405 nm
58
. La tirosina, el triptfano y en menor grado la histidina, cistina
y cistena pueden reducir el reactivo de Folin-Ciocalteu
62
. Para la determinacin se realiza una
curva estndar con seroalbmina de bovino (BSA) y se lee la absorbancia a 750 nm.



2.6.- Mtodos para Mejorar la Utilizacin de la Fibra


A pesar del amplio potencial de la protena presente en las macrofitas, sta no puede ser
aprovechada por animales de estmago simple puesto que stos no cuentan con las enzimas
requeridas para la hidrlisis de los enlaces de la compleja matriz lignocelulsica en la que se
encuentra la protena, adems la fibra crea una alta viscosidad en el intestino delgado de estos
animales impidiendo la absorcin de los nutrientes
12
. Por tanto, la utilizacin de las protenas se
ve limitada por el contenido de algunos polisacridos y de compuestos polifenlicos ya que stos
se asocian a las protenas a travs de interacciones electrostticas, hidrofbicas, puentes de
hidrgeno y enlaces covalentes, principalmente tipo ster y ter. El grado de interaccin depende
tanto de la cantidad y tipo de grupos funcionales como de la carga neta de la protena
20,63
. Entre
los mtodos empleados para romper dichas interacciones, as como tambin para reducir el estado
cristalino de la celulosa, aumentar el rea superficial del material y disminuir la presencia de

25
aquellas sustancias que dificulten la solubilizacin de las protenas, se destacan los mtodos
mecnicos, fsicos (calor, presin y explosin con vapor), qumicos (tratamiento con cidos como
clorhdrico y sulfrico y lcalis como NaOH, urea, sales de sulfito, agua, solventes orgnicos y
amonaco) y biolgicos
33
. La mayora de estos pretratamientos han demostrado efectividad, sin
embargo, se ven limitados en cuanto al costro de procesamiento o reactivos, el tratamiento de
efluente y degradacin de la biomasa, lo cual limita la posibilidad de aplicacin de estos a gran
escala.


2.6.1.- Pretratamientos Fisicoqumico: Procesos Amoniacales.


2.6.1.1- Tratamiento de Explosin Amoniacal (AFEX).


Entre los tratamientos fisicoqumicos se encuentran AFEX es un proceso donde el material
vegetal es impregnado con amonaco lquido anhidro (1 a 2 kg amoniaco/kg biomasa seca) a una
temperatura en torno a los 90C, por un tiempo aproximado de 30 minutos y a bajas presiones.
Transcurrido este tiempo, el material es sometido a una rpida descompresin
33
, lo cual expande
la estructura del material. Dicho proceso tiene un efecto descristalizante y de hinchamiento sobre
la celulosa incrementando su reactividad qumica y biolgica
64
. Ms del 99% del amonaco
utilizado se volatiliza y se recupera fcilmente.


Este tipo de pretratamiento ha sido empleado con diferentes tipos de sustratos como alfalfa,
paja de trigo, astillas de lamo, bagazo, residuos slidos urbanos, papel residual, pajas de cebada
y arroz
33
y pasto bermuda de la costa, para este ltimo sustrato el tratamiento AFEX ayud a
solubilizar y a extraer hasta un 80% de la protena, mientras que para el pasto sin tratar se extrajo
menos del 30%
65
.


2.6.2.- Proceso de Presurizacin y Despresurizacin Amoniacal (PDA).


Para mejorar los rendimientos de extraccin,

Ferrer
66
cre una modificacin del tratamiento
AFEX. El PDA es ms rpido que el anterior (2-5 min.), y la reaccin ocurre en fase lquida a
temperaturas y presiones relativamente bajas. El PDA garantiza que la reaccin ocurra
principalmente en fase lquida y aprovecha el efecto exotrmico de la dilucin del amonaco


26
anhidro en agua, conllevando esto a la reduccin del tiempo del proceso
67
. Este proceso tiene la
ventaja de no producir efluentes que tratar y el amonaco es recuperado y reusable.


El tratamiento de presurizacin y despresurizacin amoniacal (PDA), consiste en tratar el
sustrato con amonaco anhidro bajo ciertas condiciones de temperatura, presin, tiempo,
humedad del material y carga de amonaco, los cuales parecen ser especficas para cada material
con el fin de aumentar la susceptibilidad de las fibras a la hidrlisis. Este pretratamiento permite
separar los componentes del material vegetal a travs del debilitamiento de la mtriz originado
por la ruptura de enlaces steres principalmente entre la hemicelulosa y lignina por accin del
amonaco, que a su vez causa un hinchamiento de las fibras del material lignocelulsico debido a
la desacetilacin de la hemicelulosa y luego ocurre un aumento del rea interfacial, ya que las
microfibrillas de celulosa se abren al pasar el amonaco de estado lquido a gaseoso durante una
despresurizacin sbita. Como resultado, se libera una fraccin mayor de protenas, facilitando
remocin para producir concentrados proteicos para alimentacin de animales monogstricos
66-68
.



Tratamiento
Regin Cristalina

Regin Amorfa
Lignina
Celulosa
Hemicelulosa


Figura 5. Representacin esquemtica del efecto de los pretratamientos
33
.


Las tecnologas que utilizan el amonaco para mejorar el valor nutritivo de los subproductos
permiten alcanzar varios objetivos: a) son menos contaminantes y ms econmicos que los
tratamientos con hidrxido de sodio; b) incorporan nitrgeno, elemento nutricional deficitario en

27
la mayora de estos materiales y digerible por animales rumiantes como amonaco; c) inducen
una accin fungicida capaz de evitar el deterioro causado por los hongos, lo cual, a su vez, da la
posibilidad de almacenar importantes volmenes de alimento para el ganado por largos perodos
de tiempo
68
.



2.7.- Procesos de Extraccin y Precipitacin de las Protenas en Material Foliar.


Las fuentes de protenas de origen vegetal una vez recolectadas, son secadas, molidas y
sometidas al proceso fisicoqumico para separar la mayor porcin de elementos nutritivos de las
fibras no digestibles. Posteriormente, los compuestos nutricionales, que son principalmente
protenas cloroplsticas y citoplsmicas, pigmentos y vitaminas, se solubilizan en medio neutro
hasta alcalino, dependiendo de la fuente vegetal y se recogen en un extracto marrn verdoso.


La extraccin de las protenas de las hojas vegetales ha logrado tener buenos resultados a
nivel de laboratorio
69
, pero ha fracasado a nivel industrial por presentar rendimientos muy bajos
como en el caso de la alfalfa en donde el rendimiento de extraccin de protenas estuvo entre 30 y
50%
70
. Otro factor que influye negativamente y no permite que sea una alternativa viable, es su
contenido fibroso de baja digestibilidad. Con el uso del tratamiento de PDA, se obtuvo un
rendimiento de extraccin superior y un residuo fibroso de alta digestibilidad
66
.


El tratamiento PDA permiti elevar el rendimiento de extraccin de las protenas del pasto
elefante enano 4,5 veces mostrando su gran efectividad
67
. Se presume que su accin est basada
en la simplificacin de la compleja matriz vegetal. Por su parte Gonzlez, obtuvo un incremento
de 1,5 veces en el rendimiento de extraccin de las protenas del follaje de yuca tratadas con
tratamiento PDA, con respecto a las no tratadas
71
.


Es importante sealar que la extraccin de protenas de tejidos vegetales como material de
partida es mucho ms complejo que la extraccin de las mismas de microorganismos o tejidos
animales, debido a la extraccin simultnea de otros compuestos que disminuyen la
concentracin de protena en el producto y le pueden restar calidad al concentrado, como sales,
cidos orgnicos, fenoles, proteasas, lignina, pigmentos, taninos, entre otros
72
.


28
Es necesario concentrar las protenas aisladas de fuentes vegetales que se encuentran en
medio acuoso, para ello normalmente se emplea como mtodo de concentracin, la precipitacin
isoelctrica
73
. Pero este procedimiento desafortunadamente no recupera totalmente las protenas y
generalmente se obtienen concentrados con escasez en aminocidos azufrados esenciales, que por
lo general son deficientes en muchas fuentes de protena vegetales. Por otra parte, es importante,
que el mtodo de obtencin del concentrado proteico no genere prdida de solubilidad; ya que
esto puede impactar negativamente sobre otras propiedades importantes como las funcionales
74
.


Algunos estudios han mostrado que las mejores condiciones para recuperar las protenas de
un extracto proteico de hojas son temperaturas entre 65 y 85C y medio cido
75
. En 1986,
Mastrodi y Correa
8
realizaron estudios con concentrados de follaje de yuca aplicando tcnicas de
filtracin y centrifugacin obteniendo tambin valores bajos alrededor de 34%. Castellano y
col.
76
, obtuvieron concentrados por ultrafiltracin y termocoagulacin cida sin detectar
diferencias en el perfil de aminocidos, de tal manera que es posible concentrar por calentamiento
controlado sin degradar las protenas, lo que representa un proceso relativamente rentable.
Koschuh y col.
77
, utilizaron las mismas tcnicas, pero en follaje de centeno y alfalfa teniendo
resultados similares y con una extraccin alrededor de 51% de protena cruda. El uso del
tratamiento PDA permiti aumentar el rendimiento de precipitacin de las protenas del pasto
elefante enano y el follaje de yuca de 1,3 y 2,8 veces, respectivamente
67,71
.


Para obtener un concentrado proteico de calidad a partir de un extracto vegetal, que permita
una alimentacin cuidadosamente equilibrada, ste debe poseer un mnimo contenido de fibra,
alto contenido de componentes nutritivos y un perfil de aminocidos adecuado. Para determinar
entonces su calidad nutricional es necesario estimar la disponibilidad de los aminocidos y
valorar su digestibilidad. Tambin se requiere la comprensin de varios factores interrelacionados
que influyen en su valor nutritivo
78
. Uno de los factores ms importantes y que debe ser tenido en
cuenta, es la degradabilidad qumica y enzimtica de las protenas, la cual se ve influenciada por
las condiciones existentes durante el almacenamiento y procesamiento. Entre los parmetros mas
importantes que afectan la degradabilidad de las protenas se tiene su potencial para sufrir
interacciones con los carbohidratos o nutrientes menores y el efecto combinado del tratamiento
alcalino y el calor, ya que este ltimo, puede producir la formacin de compuestos como la
deshidroalanina, metildeshidroalanina, -aminoalanina, lisinoalanina (LAL), histidinoalanina

29
(HAL), feniletilaminoalanina, lantionina (LAN). La presencia de residuos de LAL a lo largo de
una cadena de la protena disminuye la digestibilidad y la calidad nutritiva para alimentacin de
animales monogstricos. Los efectos positivos pueden incluir inactivacin de compuestos
antinutricionales como taninos, fitatos, inhibidores de tripsina. Los efectos negativos incluyen
destruccin de sitios activos (substratos potenciales) como arginina y lisina, e isomerizacin de
L-aminocidos y D-aminocidos hacindolos menos digeribles. Por otro lado, el uso de lcali
puede tambin puede promover las reacciones de empardeamiento enzimticas y no-enzimticas
(reacciones de Maillard), entre los aminocidos y las protenas con los carbohidratos, durante el
almacenamiento y procesamiento. Por consiguiente, la estabilidad fisicoqumica y la
disponibilidad de protenas, representan a menudo los elementos ms importantes para evaluar su
utilizacin
79
.



2.8.- Caracterizacin Electrofortica


La electroforesis es una tcnica para separar y caracterizar biomolculas incluyendo cadenas
polipeptdicas y consiste en la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo
elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (movilidad electrofortica) como
resultado de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional
46
. En el
estudio de protenas, uno puede usarla para mostrar de una manera semi-cuantitativa cuntas
protenas hay en una muestra, si dos muestras difieren cualitativamente o cuantitativamente en su
composicin en cuanto una protena, si una protena especfica est presente en una muestra y se
puede estimar la masa molar de las subunidades de protenas presentes en una muestra
49
. La
determinacin de la masa molar (Mr) de protenas empleando la electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE) en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), se hace en
base a la medida de la movilidad en el gel
80
. Esta es una herramienta analtica simple, rpida,
econmica y muy sensible. Se emplea el SDS para desnaturalizar las protenas
81
, generando que
las protenas pierdan sus estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria
54
. Las protenas se unen
especficamente al detergente y de manera uniforme a lo largo de su longitud a una proporcin de
1.4 g de la protena por 1 g de SDS
81, 82, 54
. Esto crea proporciones de carga/masa y formas
idnticas en las protenas, que es la razn por la cul
80,83,54
la separacin en un gel del
poliacrilamida en la presencia de SDS ocurre exclusivamente por la masa
54
.



30
Como soporte qumicamente inerte se emplea un gel de poliacrilamida, que es capaz de ser
preparado de forma rpida y reproducible y que tiene la ventaja de que variando la concentracin
de polmeros, se puede modificar de manera controlada el tamao del poro
46
. El gel de
apilamiento (con un tamao del poro grande) permite el paso de todas las protenas (las protenas
grandes pueden alcanzar a las pequeas) concentrando las protenas en una zona muy estrecha y
se enfocan en bandas delgadas antes de entrar en el gel de separacin, y sto mejora la resolucin.
Despus de entrar en el gel de separacin (que tiene un tamao del poro ms pequeo) las
protenas son separadas segn su tamao molecular relativo. Un gel poroso puede actuar como un
tamiz retardando o en algunos casos obstruyendo completamente, el movimiento de
macromolculas grandes, mientras que permite que molculas ms pequeas puedan migrar
libremente. Su proporcin de migracin depende de la fuerza del campo, de la carga neta, tamao
y forma de las molculas y tambin en la fuerza inica, viscosidad y temperatura del medio en
que las molculas se estn moviendo
81
.


Dependiendo del tamao y el espesor del gel, la cantidad de protena cargada debe estar
entre 0.54.0 g para las muestras purificadas y 4060 g para las muestras crudas, si se usa para
el teido de las bandas en el gel azul de Coomassie, mientras que para la tincin con plata se
requiere menor cantidad de muestra, ya que sta es aproximadamente 100 veces ms sensible
84
.
El glicerol se agrega para aumentar la densidad de la muestra, facilitando su apilamiento en el gel
y previniendo la migracin fuera de los pozos de la muestra. Una cantidad pequea de azul del
bromofenol se agrega como una ayuda visual durante la carga de la muestra y como marcador de
corrida
85
. Es normalmente necesario reducir los puentes disulfuro en las protenas antes de que
ellos adopten la configuracin de hlice al azar, y sto es necesario para la separacin por tamao
de las protenas, para ello se usa -mercaptoetanol.


Jideani y col.
86
, utilizaron la electroforesis (SDS-PAGE) para estimar las masas molares de
las fracciones proteicas del acha (Digitaria exilis Stapf), un cereal de frica occidental, donde el
componente mayoritario fue de 25,2 kDa. Peters
14
, determin que la masa molar de las fracciones
proteicas del pasto elefante enano oscilaban entre 12 y 45 kDa. Por su parte, Tern
87
, utiliz la
misma tcnica, pero en follaje de yuca no tratado y tratado con amoniaco, mostrando bandas de
36,3; 17,8 y 14,5 kDa y 70,8; 48,9 y 19,1 kDA respectivamente.


31
3.- PARTE EXPERIMENTAL


3.1.-.Materiales.


3.1.1.- Fuente de Protena


La Lemna obscura fue recolectada en la cuenca del Lago de Maracaibo, municipio
Machiques de Perj, Estado Zulia. La biomasa se sec en un horno de conveccin forzada a 55C
por 72 h. Se tritur manualmente hasta un tamao de partcula aproximado de 2 mm.


3.2. Mtodos.


Para la caracterizacin de la biomasa se determin el contenido de humedad, segn la norma
Covenin
88
, protena cruda por el mtodo de Kjeldahl
91
y celulosa, hemicelulosa y lignina por el
mtodo de Goering y Van Soest
89
. El contenido de protena soluble de los extractos proteicos se
determin por el mtodo de Lowry
90
.


3.3.- Tratamiento de Presurizacin y Despresurizacin Amoniacal (PDA).


Se procesaron 300 g de materia seca en la planta piloto de presurizacin y despresurizacin
amoniacal (PDA). Se aplicaron cuatro tratamientos a las siguientes condiciones: cargas de
amonaco 0,25; 0,50 y 0,75 g NH
3
/g de materia seca con 60% de humedad y 0,50 g NH
3
/g de
materia seca con 30% de humedad a 75C por 2 min. Se utiliz material no tratado como control.


3.4.- Extraccin de las Protenas de la Lemna obscura.


La extraccin de protenas de la lemna no tratada se realiz utilizando como agente
extractante agua destilada, relacin slido-lquido 1:15, temperatura 45C por 45 min,
condiciones que fueron establecidas por Ferrer y col.
12
empleando el mismo mtodo de
extraccin usado para la muestra tratada.


32
La extraccin de protenas del material tratado se realiz segn el mtodo desarrollado por
Urribarr y col.
91
. Las extracciones se realizaron por triplicado a partir de 2 g de materia seca en
erlenmeyers de 250 mL en un bao termostatizado con agitacin constante de 100 rpm. Se utiliz
como agente extractante una solucin de hidrxido de calcio a diferentes pH (10, 11, 12 y 13) y
agua destilada, adems se vari el tiempo de extraccin (5, 10, 20, 30, 45 y 60 min), la relacin
slido-lquido (1:10 y 1:15) y la temperatura (30, 45, 60, 75 y 90 C). Una vez realizada la
extraccin el contenido de los erlenmeyers se filtr al vaco empleando una tela sinttica, y los
slidos se lavaron con 15 mL de agua destilada. Se midi el volumen y pH de los extractos, y se
almacenaron a 4C por 12 h. Posteriormente, los extractos se centrifugaron a 11.000 rpm por 15
min para separar las protenas citoplasmticas de las cloroplsticas y parte del contenido fibroso
de la biomasa. Luego se determin el contenido de protena soluble (por duplicado) a los
extractos por el mtodo de Lowry
90
. Las medidas de absorbancia de los extractos se realizaron en
un espectrofotmetro UV-Visible, marca PERKIN ELMER, modelo Lambda 25 (Waltham,
Massachussets, USA). La curva de calibracin se construy con un patrn certificado de
albmina de bovino (2000 g/mL) en un rango de concentracin entre 0 y 1500 g/mL. Todas las
medidas se realizaron a una de 750 nm. Posteriormente se calcul el rendimiento de extraccin
como el cociente de los gramos de protena soluble en el extracto y la protena cruda expresado
como porcentaje.



3.5-.Determinacin del Punto Isoelctrico.


Para determinar el pH del punto isoelctrico de las protenas de la lemna tratada se tomaron
alcuotas de 5 mL del extracto proteico y se ajust el pH entre 1,0 y 5,0 con HCl 0,1 N en
intervalos de 0,5 a temperatura ambiente. Para separar el sobrenadante del precipitado, las
muestras se centrifugaron en una centrifugadora marca CLAY ADAMS C.A modelo
CENTRIFUGE DYNAC (New Jersey, USA), por 30 min a 10.000 rpm. Se determin el
contenido de protena soluble en los sobrenadantes por el mtodo de Lowry
90
. El rendimiento de
precipitacin se obtuvo del cociente entre la cantidad en gramos de protena en el precipitado y la
cantidad de protena soluble en el extracto proteico, expresado en porcentaje. El contenido de
protena precipitada a cada uno de los pH utilizados se verific por el mtodo de Kjeldahl.



33
3.6.- Precipitacin de las Protenas de la Lemna obscura.


Se tomaron alcuotas de 5 mL del extracto proteico y se ajust el pH al pI determinado. Estas
alcuotas se atemperaron a 50, 65 y 80C durante 30 min. Luego las alcuotas se centrifugaron a
10.000 rpm por 60 min. Todos estos ensayos se realizaron por triplicado.



3.7- Purificacin de las Protenas Precipitadas por pI.


Las protenas precipitadas se dializaron en una membrana semi-permeable de tamao de
poro de 3500 Da por 24 h en una solucin amortiguadora de cido actico/acetato de sodio a pH
4,5. Las protenas aisladas se liofilizaron en un liofilizador LABCONCO modelo LYPH-6 LOCK
(Kansas City, Missouri, USA) y una vez secas se destinaron algunas fracciones al estudio
molecular de las protenas.



3.8.- Electroforesis en Gel Discontinuo de Poliacrilamida con Dodecil Sulfato de Sodio (SDS-
PAGE).


Para determinar la masa molar aparente se sigui el mtodo propuesto por Laemmli
(1970)
92
, el cul consisti en preparar un gel de apiamiento de poliacrilamida de concentracin 4
% y pH 6,8 y un segundo gel de separacin al 12 % y pH 8,8. Para la corrida se utiliz una mini-
cmara EC 120 Mini Vertical Gel System (Holbrook, USA). Se tom 10 mg de muestra
liofilizada y se diluy en 300 L de solucin amortiguadora, la cual contena dodecil sulfato de
sodio (SDS) al 10 %, 2-mercaptoetanol al 1 %, buffer Tris-HCl 0,5 M a pH 6,8; glicerol y como
marcador de corrida se utiliz azul de bromofenol
92
. Al finalizar la corrida los geles fueron
coloreados con azul de Coomassie para luego ser revelados con una solucin de tiosulfato de
sodio y formaldehdo, en un tiempo aproximado de 2 horas
93
. Se emplearon patrones de protenas
con masas molares en un rango de 14-70 kDa.








34

4. RESULTADOS Y DISCUSIN


4.1.- Caracterizacin de la Biomasa.


El contenido de celulosa, hemicelulosa, lignina, protena cruda y humedad de las muestras
de lemna tratada (LT) y no tratada (LNT) con amonaco en base seca se presenta en la Tabla 1.


Tabla 1. Composicin qumica de la Lemna obscura no tratada y tratada a diferentes condiciones con
amonaco.

Muestra Solubles
(%)
H
a
(%)
C
a

(%)
L
a
(%)
Ceniza
(%)
PC
a
(%)
Humedad
(%)
FND
(%)
LNT 44,39a 22,98b 17,25a 2,46a 12,97 13,23 9,79 55,61a
LT1 45,54ab 22,07ab 18,32a 3,63a 10,44 12,99 11,97 54,46ab
LT2 47,55ab 21,86a 17,15a 3,37a 10,07 13,68 12,04 52,45ab
LT3 48,22b 21,67a 17,52a 3,24a 9,35 13,84 12,72 51,78b
LT4 45,26ab 22,96b 17,70a 4,74a 9,35 13,92 15,71 54,74ab
H = Hemicelulosa, C = Celulosa, L = Lignina, PC = Protena cruda, FND = Fibra neutro detergente.
a
Materia seca.
Letras diferentes indican diferencias significativas entre los resultados (p<0,05).
LNT: Lemna obscura no tratada.
LT1: Lemna obscura tratada: r 0.5, 30%H, 2 min y 75C.
LT2: Lemna obscura tratada: r 0.25, 60%H, 2 min y 75C.
LT3: Lemna obscura tratada: r 0.5, 60%H, 2 min y 75C.
LT4: Lemna obscura tratada: r 0.75, 60%H, 2 min y 75C.


El contenido de protena en plantas es variable. Segn la madurez, las leguminosas
pueden contener de 15% a 23% de protena cruda, gramneas contienen de 8% a 18% de
protena cruda (segn el nivel de fertilizacin con nitrgeno) y los residuos de cosechas pueden
tener slo de 3% a 4% de protena cruda (paja). Desde el punto de vista nutricional, los forrajes
pueden variar entre alimentos muy buenos (pasto joven y suculento, leguminosas en su etapa
vegetativa) a muy pobre (pajas)
94
. En el caso de las plantas acuticas, su composicin qumica
se encuentra directamente afectada tambin por el estrato acuoso en el que se desarrolla
11
.
Normalmente las plantas acuticas, constituyen fuentes proteicas de alto valor nutricional, con
un contenido de protena cruda que se encuentra reportado y vara entre 6,8 a 45,3%,
encontrndose los valores obtenidos para la muestra no tratada y las tratadas dentro de dicho

35
rango. Es importante mencionar que la calidad nutritiva de esta microalga disminuye con la
edad, ya que sta envejece y muere con el paso de los das. Lo ideal es realizar un muestreo en
la zona donde apenas ste naciendo (ms verde) y un rpido secado de la biomasa (que
permitira conservar sus nutrientes), para obtener extractos proteicos de mayor calidad
nutricional. El contenido proteico encontrado en la lemna no tratada fue de 13,23%, valor que
seala que se trataba de lemna en proceso de envejecimiento. El tratamiento amoniacal PDA
no debe dejar amonaco o nitrgeno amoniacal en las muestras. Los valores de las muestras
tratadas son muy cercanos al contenido proteico de la lemna no tratada, por lo tanto, el proceso
PDA y la desamonificacin posterior fueron adecuados.


El estudio estadstico se realiz a travs de anlisis de varianza (AV) y contraste (AC). En el
AV se compararon todas las muestras sin distincin entre el control y los tratamientos
amoniacales, en cuanto al contenido de solubles segn este anlisis se observo diferencia
significativa entre la muestra tratada con carga amoniacal de 0,5 r y la no tratada (p = 0,0156),
por su parte el contenido de hemicelulosa presento diferencia significativa (p = 0,04583),
principalmente entre LT2 y LT3 vs LNT y LT4, mientras LT1 no mostr diferencia significativa
(p>0,05) con respecto al resto de las muestras y en el contenido de celulosa y lignina no se
evidenci diferencias significativas (p = 0,248575 y p = 0,1014 respectivamente). En el AC se
comparan todos los tratamientos con el control, con respecto al contenido de solubles segn este
anlisis se observaron diferencias significativas (p0,02), que indican que los tratamientos
amoniacales aumentaron el contenido de compuestos solubles de manera significativa;
igualmente se evidenciaron diferencias significativas (p0,001) en el contenido de hemicelulosa
entre los tratamientos y en control, y esto sugiere que los tratamientos amoniacales solubilizaron
parcialmente la hemicelulosa, liberando algunos compuestos que probablemente pasaron a formar
parte de la composicin de solubles en las muestras tratadas, aumentando dicho contenido a
mayor solubilizacin de hemicelulosa; de manera similar se observaron diferencias significativas
en el contenido de lignina (p0.05) y esto demuestra que los tratamientos amoniacales estn
generando un incremento en el contenido de lignina, debido a la condensacin de molculas que
aparecen ahora como parte de la lignina cuando se usa el mtodo de Van Soest
95
. Azcares libres,
molculas de almidn presentes en las muestras pudieran haber reaccionado en las condiciones
del proceso amoniacal con la celulosa y hemicelulosa, para formar compuestos que no son
atacados por el cido sulfrico al 72% (Mtodo de Van Soest), por lo que aparecieron como


36
lignina. Por otro lado, el contenido de celulosa segn el AC no presento diferencias significativas
(p0,3254) entre los tratamientos amoniacales y el control.


El contenido de fibra aumenta con el envejecimiento de las plantas, lo que hace ms
compleja la pared celular y limitando la calidad nutricional de las protenas para animales no
rumiantes, que no pueden digerir la celulosa y la hemicelulosa. El tratamiento amoniacal
disminuye la hemicelulosa determinada por el mtodo de Van Soest (significa que la solubiliza
parcialmente) y puede disminuir el contenido de lignina de la misma forma. Esto se ha
reportado en gramneas y en leguminosas
95-96
, y se ha correlacionado positivamente con un
aumento de la susceptibilidad de la celulosa y hemicelulosa a la hidrlisis enzimtica. En la
lemna ocurri solubilizacin parcial de la hemicelulosa, mientras que el contenido de lignina
se increment desde 2,46% en LNT hasta 4,74% en LT4. El contenido de lignina no debe
aumentar con el tratamiento PDA, sin embargo en este trabajo aument y este hecho
corresponde a compuestos liberados por la accin del PDA que se condensan con las fibras,
generando compuestos que son detectados como lignina. En la LNT y LT los niveles de fibra
son tan elevados que influyen negativamente en la biodisponibilidad de minerales como el
manganeso y en la digestibilidad de las protenas
11
e impiden su uso directo en alimentacin de
animales monogstricos, ya que son diez veces ms altos que los recomendados para dietas de
aves (<4%) y tres veces mayor, que lo recomendado para la alimentacin de cerdos (10-15%),
lo que hace necesario que las protenas presentes en la biomasa sean aisladas y concentradas y
as se convertira en un alimento o un valioso suplemento para la alimentacin de estas
especies
97
. Por otro lado, a medida que aumenta la madurez de la planta, disminuye su
proporcin de compuestos solubles y su valor nutritivo
98
. Dependiendo del tipo de tejido y a
medida que la clula de la planta madura, la pared celular se ensancha y comnmente produce
una pared secundaria de composicin distinta con una notable deposicin de constituyentes
aromticos, por lo que ocurren cambios qumicos y anatmicos, que afectan su digestibilidad
99
.
Como resultado el contenido de hemicelulosa y de lignina aumenta, al igual que los enlaces
entre ambas molculas. Este hecho nos permite asociar el alto contenido de fibra en la LNT
con su madurez.


Las condiciones del tratamiento PDA seleccionadas fueron 75C, 60% de humedad, 0,5 Kg
amonaco/ Kg materia seca y 2 min de reaccin, para las cuales se obtuvieron un mayor

37
incremento en el contenido de solubles (S = 48,22%), y una gran disminucin en el contenido de
fibra neutro detergente (FND = 51,78%), aunque desde el punto de vista prctico, no se
observaron diferencias apreciables entre los tratamientos. Estas condiciones fueron menos
drsticas que las utilizadas por Urribarr y col.
67
en el pasto elefante enano (ca. 90C, 70 %H, 5
min y r: 0,75) y las empleadas por Gonzalez
71
en follaje de Yuca (ca. 78C, 30 %H, 5 min y r:
0,5). Con este tratamiento fsico-qumico, se busc mejorar la degradabilidad qumica y/o
enzimtica de la lemna, siendo posible una mejor extraccin y precipitacin de las protenas.
Como la lemna posee mayor contenido proteico que el pasto elefante enano y el follaje de yuca,
se prefiri usar temperaturas menos elevadas.



4.2.- Condiciones de Extraccin y Precipitacin de las Protenas de la Lemna obscura no Tratada
(LNT).


En la Tabla 2, se observan los resultados obtenidos en la extraccin de las protenas de la
lenteja acutica no tratada, empleando las condiciones establecidas por Ferrer y col
12
.


Tabla 2. Extraccin de las protenas del LNT con agua destilada, 45C, relacin slido-lquido
1:15 y 45 min.

pH de la solucin
extractante
pH final del
extracto
Protena soluble
(g/mL)
R. de extraccin de
protenas (%)
5,86 9,02 1160,00 25,540,34
LNT: Lenteja acutica no tratada con PDA.
R: Rendimiento.


El rendimiento de extraccin de protenas para la Lemna obscura no tratada fue de 25,54%,
utilizando como agente extractante agua destilada, tiempo de extraccin 45 min, temperatura de
45C y relacin slido-lquido 1:15. Las protenas extradas en la lemna no tratado corresponden
a aquellas protenas perifricas, glucoprotenas o enzimas que estn dbilmente ligadas a la
matriz o pared celular. El rendimiento de precipitacin fue del 78,2% a pH 3,5 y 50 C.



38
En la Figura 6 se muestra una de las curva de calibracin caractersticas del mtodo de
Lowry, utilizada para la determinacin del contenido de protena soluble de los extractos.

y =0,0002x +0,0102
R
2
=0,9914
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
Concentraci n (ug/mL)
A
b
s

Figura 6. Curva de calibracin de Lowry obtenida a una = 750 nm.



4.3.- Condiciones de Extraccin de las Protenas de la Lemna obscura Tratada con Amonaco
(LT).



4.3.1.- Seleccin del pH de la Solucin Extractante.


En la Tabla 3, se muestran los resultados obtenidos en las extracciones de la lenteja acutica
tratada con PDA, utilizando como solucin extractante agua destilada e hidrxido de calcio a
diferentes valores de pH a 30C, con una relacin slido-liquido 1:15 y tiempo de 45 min.


La concentracin de las protenas solubles para los diferentes pH son similares,
mantenindose prcticamente constante el rendimiento de extraccin entre 26 y 27%, con
excepcin de pH 13, donde el rendimiento de extraccin es comparativamente mas bajo y esto
probablemente se debi a desnaturalizacin de algunas protenas ocasionando perdida de
solubilidad por exposicin de algunos grupos hidrfobos, tambin puede haber ocurrido
degradacin y/o hidrlisis de las protenas y esto es totalmente desfavorable para la solubilizacin
de las protenas. El pH de extraccin de 5,79 se encuentra por encima del pI 3,5 de las protenas
de la lemna y es suficiente para provocar que los grupos carboxilatos creen repulsin de cargas
negativas entre las protenas, facilitando as, su movilidad y extraccin. Por tanto, y como no

39
existen diferencias significativas (p0,05) entre los pH 5,79 y 10, se estableci como pH ptimo
5,79 correspondiente al uso de agua destilada como solucin extractante, para el que se obtuvo un
mximo rendimiento de 27,45%. El uso de agua destilada como agente extractante es
beneficioso, ya que representa en el proceso menores costos.


Tabla 3. Extraccin de las protenas de la LT con agua destilada y solucin de hidrxido de calcio
a diferentes valores de pH, 30C, relacin slido-lquido 1:15 y tiempo de 45 min.

pH de la solucin de
hidrxido de calcio
pH final del
extracto
Protena soluble
(g/mL)
R. de extraccin
deprotenas (%)
5,79 8,87 0,0763 27,450,65b
10,00 8,75 0,0714 26,991,28b
11,00 8,91 0,0714 26,970,72b
12,00 9,11 0,0728 27,510,49b
13,00 10,85 0,0591 22,330,49a
LT: Lenteja acutica tratada con PDA. R: Rendimiento. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los
resultados (p<0,05)


4.3.2.- Seleccin del Tiempo de Extraccin.


En la Tabla 4, se muestran los resultados obtenidos en la seleccin del tiempo de extraccin,
utilizando agua destilada como solucin extractante y relacin slido-lquido 1:15.


Tabla 4. Extraccin de las protenas de la LT con agua destilada, 30C, relacin slido-
lquido 1:15 y diferentes tiempos de extraccin.

Tiempo de
extraccin (min)
pH final del
extracto
Protena soluble
(g/mL)
R. de extraccin de
protenas (%)
10 8,73 0,0767 28,980, 44
20 8,67 0,0828 31,291,01
30 8,69 0,0751 28,390,16
45 8,87 0,0714 27,450,07
60 8.69 0,0650 24,590,77
LT: Lenteja acutica tratada con PDA. R: Rendimiento.


40
La tabla anterior muestra que el rendimiento de extraccin obtenido en un tiempo de 20
min, fue superior al obtenido para un tiempo de 10 min. Sin embargo, tiempos largos ocasionan
prdida de la solubilidad, probablemente debido al efecto acumulado de la agitacin, la cual
puede desnaturalizar parte de las protenas, o pudieron formar complejos insolubles entre las
protenas y otras sustancias del medio, como compuestos fenlicos. Por lo tanto, son suficientes
20 min para extraer las protenas que se encuentran dbilmente ligadas y las que han sido
liberadas de la matriz lignocelulsica, obtenindose un rendimiento mximo de 31,29%.



4.3.3.- Seleccin de la Temperatura y la Relacin Slido-Lquido.


En la Figura 7, se observa que a medida que aumenta la temperatura de extraccin se
incrementa gradualmente el rendimiento. Tambin se evidencia que para todas las condiciones de
temperatura de extraccin, los rendimientos fueron superiores para la relacin slido-lquido
1:15. Por tanto, un aumento de la temperatura y una disminucin de la relacin slido-lquido
producen una mayor solubilizacin de las protenas. Por lo que ambos factores son determinantes
en la movilidad de las protenas y en consecuencia facilitan su remocin.


0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 20 40 60 80 1
Temperatura,C
%

R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
00
1:15 1:10


Figura 7. Efecto de la temperatura y la relacin slido-liquido sobre el rendimiento de extraccin
de las protenas del LT a pH 5,83 (agua destilada) y 20 min.


41
El mximo rendimiento para la relacin 1:10 fue de 38,89%, mientras que para 1:15 fue de
46,41% a 90C, siendo este ltimo ms elevado que los rendimientos obtenidos para otros
materiales foliares tratados, como pasto elefante enano
67
y follaje de yuca
71
y mucho mayor que
el obtenido para la lemna no tratada de 25,54%.


En las Tablas 5 y 6, se muestran los resultados del anlisis estadstico del efecto de la
temperatura y la relacin slido-lquido sobre el rendimiento de extraccin de las protenas de
LT.


Tabla 5. Efecto de la temperatura sobre el rendimiento de extraccin de las protenas de LT.

Temperatura (C) % Rendimiento
30 27,09e
45 29,93d
60 34,26c
75 40,98b
90 42,65a
Promedio de los rendimientos obtenidos para las dos relaciones slido-lquido.
Letras diferentes indican diferencias significativas entre los resultados (p<0,05)
LT: Lenteja acutica tratada con PDA.


Se encontraron diferencias significativas (p<0,05) entre todas las diferentes temperaturas del
proceso, resultando como mejor condicin 90 C.


Tabla 6. Efecto de la relacin slido-lquido sobre el rendimiento de extraccin de las
protenas de la LT.

Relacin slido-lquido % Rendimiento
1:10 38,890,68b
1:15 46,410,47a
Letras diferentes indican diferencias significativas entre los resultados (p<0,05)
LT: Lenteja acutica tratada con PDA.




42
El anlisis estadstico revel diferencias significativas (p<0,05) entre las relaciones slido-
lquido 1:10 y 1:15, posiblemente existe interaccin entre la temperatura y la relacin slido-
lquido.


Se estableci entonces como temperatura ptima 90C y una relacin slido-lquido 1:15,
condiciones para las que se obtuvo un mximo rendimiento de 46,41%. No es conveniente elevar
la temperatura por encima de 90C, ya que las protenas podran sufrir deterioro

en aminocidos
principalmente lisina, disminuyendo as su calidad nutricional
36
. En cuanto a la relacin slido-
lquido no se emplearon mayores a 1:10, porque el uso de menor cantidad de solucin extractante
aumenta considerablemente la viscosidad del medio de reaccin y dificulta la agitacin durante la
extraccin, ni menores a 1:15, ya que el uso de mayor cantidad de solucin extractante generara
mayores costos de tratamiento de efluentes y a nivel industrial los equipos necesarios tendran
que tener mayor capacidad.



4.4.- Efecto del Tratamiento Amoniacal sobre las Condiciones de Extraccin de las Protenas de
la Lemna obscura.


En la Figura 8, se muestran el rendimiento de extraccin obtenido a las mejores condiciones
de extraccin de las protenas de la lenteja acutica tratada (46,41%) y no tratada (25,54%).

0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o
,

%
LNT LT


Figura 8. Efecto del tratamiento sobre el rendimiento de extraccin de las protenas de la
lenteja acutica a las mejores condiciones de extraccin para la LNT y LT.

43
Las protenas extradas de la lenteja acutica no tratada son aquellas que se encuentran
dbilmente ligadas a la pared celular y que son solubles en la solucin extractante empleada, que
fue agua destilada, estas generalmente comprenden protenas perifricas como las asociadas a
arabino galactanas, glucoprotenas o enzimas
98
.


Al someter la lemna al tratamiento PDA se obtuvo un incremento del rendimiento de
extraccin de 1,82 veces con respecto a la biomasa no tratada, y esto evidencia que el tratamiento
desfribril parcialmente la lemna, quedando las protenas mas expuestas y por ende, fueron mas
fcilmente liberadas de la matriz lignocelulsica. Este valor es inferior al obtenido en el pasto
elefante enano donde se increment 4,5 veces el rendimiento de extraccin
67
, aunque mayor que
el obtenido para follaje de yuca, donde el incremento fue de 1,5 veces
71
. Se debe tener en cuenta,
que las tres son fuentes vegetales distintas y por consiguiente, su composicin qumica,
comportamiento y cultivo difieren. En cuanto a su aprovechamiento, este depende de su
resistencia al procesamiento y a la presencia de compuestos antinutricionales
48
, ejemplo de esto,
es la cantidad de lignina, la cual en la lenteja acutica fue de 2,46%, mientras que en el follaje de
yuca fue de 16,78%
71
, valor mucho mayor y que hace ms difcil la extraccin de las protenas,
ya que la matriz lignocelulsica es mas compleja. El contenido de lignina del pasto elefante
enano estuvo alrededor del 4%
67
, mayor al presente en la lemna, al igual que el contenido de
celulosa y hemicelulosa, y a pesar de que la matriz fibrosa en la lemna es menos compleja y el
contenido de protena cruda es mayor, la remocin de protenas fue menor, de hecho los
rendimientos de extraccin para lemna y el pasto elefante enano fueron 46,41% y 52,65%,
respectivamente. Sin embargo, el aumento en el rendimiento del material tratado con respecto al
no tratado fue menor en la lemna porque la extraccin de protenas en la biomasa no tratada fue
relativamente muy alto (25,54%) con respecto al pasto elefante no tratado (ca.11,68%)
67
. Para
elevar el rendimiento de extraccin sera conveniente elevar la temperatura del tratamiento PDA
y la carga de amonaco, pero se corre el riesgo de afectar negativamente a las protenas.


En la Tabla 7, se resumen los rendimientos mximos de la extraccin de protenas para la
lemna no tratada y tratada, y las condiciones de extraccin (pH, relacin slido/lquido, tiempo y
temperatura) que produjeron dichos rendimientos. El aumento del rendimiento de extraccin para
LT, demuestra la efectividad del tratamiento PDA para facilitar la liberacin de las protenas, y el
valor de rendimiento mximo obtenido, es considerablemente alto, tomando en cuenta que estas


44
protenas son principalmente citoplsmicas y suelen estar presentes de un 40 a un 50% en las
fuentes vegetales
44
.


Tabla 7. Efecto del tratamiento amoniacal sobre las condiciones ptimas de extraccin de pH,
relacin slido-lquido, tiempo, temperatura y rendimiento de extraccin de las
protenas de la LNT y LT.

LNT LT
Tiempo (min.) 45 20
pH inicial 5,86 5,79
Relacin S/L 1:15 1:15
Temperatura (C) 45 90
Rendimiento (%) 25,54 46,41
LNT: Lenteja acutica no tratada; LT: Lenteja acutica tratada con amonaco.


Tambin se observ, que el pH de la solucin extractante y la relacin slido-lquido fueron
los mismos en ambos casos, esto evidencia que las protenas tanto para la muestra tratada como la
no tratada alcanzan la mxima solubilidad a pH cercanos a la neutralidad y para ambas
condiciones de extraccin, slo se not el aumento en el rendimiento de extraccin en la lenteja
acutica tratada, el cul es consecuencia de la mayor disponibilidad de las protenas debido al
tratamiento y a que el pH final (8,53) del extracto est lo suficientemente alejado del pI de las
protenas, para provocar repulsin entre las cargas negativas, y en consecuencia, se incrementa la
extractabilidad de las protenas.


En el trabajo publicado por Ferrer y col.
12
, se observ que para la lemna no tratada un
aumento de la temperatura provoc una disminucin de la protena extrada probablemente
debido a desnaturalizacin, un comportamiento diferente mostr la lemna tratada en este trabajo,
ya que requiri de una temperatura de 90C, para obtener el mximo rendimiento. Si ocurri
desnaturalizacin, su efecto no se puede verificar, ya que se libera una mayor cantidad de
protenas en la lemna tratada. Sin embargo, no es conveniente elevar la temperatura por encima
de 90C, ya que la protena pueden degradarse afectando la calidad nutritiva del producto, debido
a que algunos aminocidos pueden condensarse con azcares (reacciones de Maillard) formando
compuestos como melanoidinas (de color marrn), que contienen 11% de nitrgeno y que tienen

45
muchas de las propiedades fsicas de la lignina
100
o se pueden formar complejos protenas-
taninos
36
. En ambos casos, disminuye la solubilidad de gran parte de las protenas, hacindose
resistentes a la accin de las proteasas
100
y por tanto, decrece la susceptibilidad de las protenas
de liberar aminocidos y su digestibilidad
48
.


En cuanto al tiempo requerido para la remocin de las protenas en la lemna tratada fue
menor que el necesario para la biomasa no tratada, debido a que la protena en este caso est ms
accesible y por lo tanto, ms fcilmente extrable que en la lemna no tratada, ya que el
pretratamiento ayuda a la ruptura de los enlaces steres presentes en el material lignocelulsico
(entre la celulosa, hemicelulosa y lignina) quedando ms expuestas las protenas facilitando as su
remocin.


Necesariamente para poder utilizar los extractos proteicos aislados de fuentes vegetales por
solubilizacin en medio alcalino, en la alimentacin balanceada de animales monogstricos, se
requiere concentrarlos mediante precipitacin isoelctrica
73
, que es la manera ms usual y
econmicamente factible de obtener los concentrados proteicos en la industria alimentaria
101
, ya
que esta permite la separacin de las protenas de los componentes no proteicos y/o txicos como
los azcares, fibra y compuestos qumicos antinutricionales que disminuyen su valor proteico
73
.
Por tanto, para que las protenas aisladas de la lenteja acutica se puedan utilizar de manera
prctica en la alimentacin animal, se deben separar de los compuestos insolubles mediante
centrifugacin y precipitar las protenas en su punto del isoelctrico, el cul sera el mtodo ms
adecuado
101
.



4.5.- Evaluacin de las Condiciones de Precipitacin de las Protenas de la Lemna obscura
Tratada con Amonaco.


La precipitacin de las protenas en solucin acuosa, es el proceso siguiente a la
solubilizacin constituye uno de los mtodos ms importantes disponible para la recuperacin y
purificacin industrial de protenas. La concentracin del producto es frecuentemente la mayor
meta a realizar durante la precipitacin. La purificacin se obtiene por lo menos a niveles
moderados, aunque en algunos casos se obtienen productos de alta pureza (por ejemplo, mediante


46
precipitacin fraccionada, precipitacin por afinidad y cristalizacin)
102
. En la mayora de los
casos se realiza por medio de la precipitacin isoelctrica
103
.


70
75
80
85
90
95
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o

d
e

P
r
e
c
i
p
i
t
a
c
i

n

(
%
)
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
pH

Figura 9. Determinacin del punto isoelctrico de las protenas de la LT a 25C.


En la Figura 9, se muestra el nivel de precipitacin con respecto al pH, para la estimacin del
punto isoelctrico de las protenas de la lenteja acutica tratada. Como las cargas de las protenas
en solucin dependen del pH es importante determinar su punto isoelctrico, ya que en este pH la
carga neta de las protenas es cero y por ende, la solubilidad es mnima, ya que es posible que
ocurran interacciones protena-protena que conducen a que precipiten con mayor facilidad
104
.
Con el cambio de pH, el extracto proteico se tornaba opaco y las protenas parecan coagular y
precipitar, sobre todo a los pH ms bajos, observndose la formacin de partculas suspendidas o
coloides, que se pueden separar ms facilmente
98
. En la misma figura se observa que el
rendimiento de precipitacin va aumentando a medida que disminuye el pH (<5) para
estabilizarse a pH 33,5 y est vuelve aumentar a pH ms cidos. Sin embargo, como otras
sustancias como hemicelulosa y lignina pueden precipitar a esos valores de pH, es necesario
determinar la protena presente en los precipitados. En la Figura 10, se muestra el contenido de
protena cruda en los precipitados y se observa que realmente la precipitacin proteica fue mayor
para los pH 3 y 3,5. Esto significa que la elevada precipitacin por debajo de pH 2,5 se debe
principalmente a la precipitacin no selectiva de compuestos, probablemente hemicelulosa y
lignina, que se encontraban inicialmente en forma de iones carboxilatos y fenxidos
respectivamente, como consecuencia de su solubilizacin en las condiciones alcalinas de
extraccin y que durante la precipitacin pudieron perder la carga y se insolubilizaron a pH
cidos y es posible que estn precipitando con la protena. Esta falta de selectividad no es

47
conveniente, ya que el concentrado proteico obtenido, aunque con mayor rendimiento, tendra un
contenido de fibra no deseado, que disminuye el valor nutricional del mismo.


0
5
10
15
20
25
P
r
o
t
e

n
a

C
r
u
d
a

(
%
)
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
pH

Figura 10. Contenido de protena cruda determinado por el mtodo de micro-Kjeldahl de los
precipitados obtenidos de la LT.


Se puede observar que los porcentajes de precipitacin permanecieron cercanos,
obtenindose la mxima precipitacin a pH 3 de 23,03%; Sin embargo, como la precipitacin a
pH 3,5 fue muy similar con un valor de 22,89%, y como se requiere menor cantidad de cido
clorhdrico para ajustar el pH, se eligi pH 3,5 como ptimo para precipitacin de las protenas.
Es importante mencionar, que es muy ventajoso, usar menor cantidad de cido para ajustar el pH
de precipitacin, ya que a nivel industrial se producira menor cantidad de efluentes
97
, sumado al
hecho, de que si la precipitacin va acompaada de calor, como se hace industrialmente para
aumentar el rendimiento, puede ocurrir desnaturalizacin irreversible que pueden afectar sus
propiedades funcionales y limitar su rango de aplicaciones. La desnaturalizacin suele estar
asociada al desplegamiento de las molculas de las protenas exponiendo un gran nmero de
residuos de aminocidos hidrfobos, que disminuyen adems su solubilidad. Por lo tanto, para
aumentar el rendimiento, se precipitaron las protenas en el pI a diferentes temperaturas. Estos
resultados se muestran en la Figura 11. Observandose que el rendimiento aumento desde 82,54%
hasta 96,29% cuando la temperatura se incremento de 25C hasta 50C. Sin embargo, un aumento
de la temperatura por encima de los 50 C, no caus un efecto sobre el rendimiento de
precipitacin de las protenas de la LT, ya que ste permaneci casi invariable entre 50 y 80C.
Es una ventaja importante desde el punto de vista de costos de energa que slo haya que calentar


48
hasta 50C. En el caso de gramneas, la temperatura de mxima precipitacin en el pI fue 80C
67
.
Sin embargo, hay follajes como el de yuca donde la temperatura ptima es 25C
71
, pero los
rendimientos son menores que en el caso de la lemna. De acuerdo a los resultados obtenidos, las
protenas de la lenteja acutica son precipitables a pH 3,5 y temperatura 50C alcanzndose un
valor mximo de rendimiento de precipitacin de 96,29%, con un 22,85% de protena cruda.


0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
50 65 80
Temperatura, C
R
e
n
d
i
m
i
e
n
t
o

d
e

P
r
e
c
i
p
i
t
a
c
i

n

(
%
)

Figura 11. Efecto de la temperatura sobre el rendimiento de precipitacin de las protenas de la
LT.


4.6.- Efecto del Tratamiento Amoniacal sobre las Condiciones de Precipitacin de las Protenas
de la Lemna obscura.


En la Tabla 8, se observa el efecto del tratamiento amoniacal sobre las condiciones de
temperatura, pI y rendimiento de precitacin para la lenteja acutica.


Tabla 8. Efecto del tratamiento amoniacal sobre la temperatura, pI y rendimiento de
precipitacin.
LNT LT
pI 3,5 3,5
Temperatura (C) 50 50
Precipitacin (%) 71,2 96,29
LNT : Lenteja acutica no tratada; LT: Lenteja acutica tratada

49
Condiciones de precipitacin: pI 3,5 y temperatura 50C.
El rendimiento increment 1,35 veces en la LT con respecto a la LNT, un incremento
superior al obtenido para el pasto elefante enano tratado, el cual fue de 1,3 veces
67
, pero inferior
al obtenido para follaje de yuca, que fue de 2,08 veces
71
. El tratamiento no provoc cambios en el
pI y en la temperatura ptima de precipitacin de protenas.


En la Tabla 9, se muestra que el tratamiento PDA permiti producir concentrados proteicos
con un rendimiento global de 44,69%, que es 2,41 veces mayor que el obtenido para la lemna no
tratada. La concentracin de protenas en el concentrado proteico aument de 16,68% hasta
22,89%.


Tabla 9. Comparacin de los rendimientos de extraccin, precipitacin global y la concentracin
de protenas en LNT y LT.
LNT LT
Extraccin (%) 25,54 46,41
Precipitacin (%) 71,2 96,25
Rendimiento global (%) 18,18 44,65
[P] 16,68 22,89
LNT: Lenteja acutica no tratada; LT: Lenteja acutica tratada
Condiciones de precipitacin: pI 3,5 y temperatura 50C.



4.7.-Perfil Electrofortico de las Protenas de la Lemna obscura Tratada con Amonaco en Gel de
Poliacrilamida.

En la Figura 12, se muestra el perfil electrofortico de las protenas de la lenteja acutica
tratada con amonaco, precipitadas a diferentes pH y luego liofilizadas.


Para la preparacin del gel se probaron dos concentraciones de 10 y 12%, obtenindose
mejores resultados para esta ltima concentracin, ya que mejor notablemente la resolucin de
las bandas proteicas. El tiempo de revelado fue de 8 h, ya que a menores tiempos no se observ
buena resolucin de las bandas. Para todos los pH de precipitacin, los concentrados proteicos
obtenidos a partir de la lenteja acutica presentaron una banda muy pronunciada a una masa
molar aproximada a 21,68 kDa. Seguida de una gran mancha hasta 11,28 kDa.


50
66,2
23,4
19,02
14,5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
P 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 pH
Masa molar (kDa)


Figura 12. Anlisis SDS-PAGE empleando teido con azul de Coomassie para las protenas
concentradas de la LT. (1) Banda para las protenas estndar. (2-10 Bandas para las protenas de
los concentrados proteicos obtenidos a diferentes pH).


No se encontr evidencia de la presencia de la enzima ribulosa-1,5 difosfato carboxilasa
oxigenada mejor conocida como Rubisco de masa molar aproximada a 56 kDa, protena que se
encuentra en gran proporcin en las plantas verdes
105
, y que a su vez est formada por cuatro
unidades dimricas. Por otra parte, en extractos proteicos de lemna no tratada con amonaco
12
, si
se observaron bandas en correspondientes a protenas de elevada masa molar entre 66 y 70 kDa.
La ausencia de bandas de protenas de alta masa molar en la lemna tratada puede deberse a su
falta de deteccin por encontrarse en baja concentracin (el mtodo utiliza volmenes pequeos
de muestra), o por el bajo lmite de deteccin del mtodo de teido con azul de Coomassie
empleado con respecto al mtodo del nitrato de plata. Sin embargo, como el mtodo aplicado
para las muestras de lemna no tratada
12
y tratada fue similar, es posible que el tratamiento est
desdoblando la enzima rubisco en sus monmeros, adems de causar hidrlisis parcial de las
protenas fraccionndolas en protenas de menor masa molar
106
. Esto explicara tambin la alta
solubilidad y digestibilidad de las protenas de la lenteja acutica. Las protenas, al ser
parcialmente hidrolizadas bajo la accin alcalina del amonaco, se da un tipo de hidrlisis que no
es especfica produciendo diferentes fragmentos llamados polipptidos de masa molar
relativamente baja. En el PDA es posible que ocurra un ataque nucleoflico del OH

del hidrxido
de amonio formado al carbonilo parcialmente positivo del enlace peptdico. Preferiblemente su
ataque es sobre los segmentos que poseen residuos que no donen alta densidad electrnica sobre
los carbonilos, como los aminocidos con grupos carboxilo en sus grupos R como asprtico y

51
glutmico, y con grupos hidroxilados como la serina y treonina, entre otros
14
. Sin embargo, en
este tipo de muestras con elevado contenido proteico como la lemna se utilizan temperaturas
relativamente bajas en el tratamiento para evitar la degradacin de las protenas, por lo que si
ocurre es en pequea escala. Adems, el tiempo de tratamiento es corto (2 min) y la temperatura
baja rpidamente despus de la despresurizacin.











































52
5.- CONCLUSIONES


Las condiciones de extraccin de las protenas de la lenteja acutica tratada para las que se
obtuvo el mayor rendimiento, 46,41%, fueron: pH 5,79 (solucin extractante: agua destilada), 20
min., 90C y relacin slido-lquido 1:15, mientras que la lenteja acutica no tratada alcanz un
mximo rendimiento de 25,54% a pH 5,79 (agua destilada), 45 min., 45C y relacin slido-
lquido 1:15. Esto indica que el tratamiento PDA, permiti incrementar 1,82 veces el rendimiento
de extraccin de protenas de la lenteja acutica tratada con respecto a la biomasa no tratada.


El mximo rendimiento de precipitacin de las protenas de la lenteja acutica tratada fue de
96,29%, con un 22,89% de protena cruda y se obtuvo a pH 3,5 y 50C, mientras que para la
lenteja acutica no tratada a las mismas condiciones de precipitacin, se obtuvo un menor
rendimiento de 71,2%, con un 16,68%. El tratamiento PDA permiti incrementar 1,35 veces el
rendimiento de precipitacin de protenas de la lenteja acutica.


El tratamiento PDA permiti producir concentrados proteicos con un rendimiento global de
44,69%, que es 2,41 veces mayor que el obtenido para la lemna no tratada. La concentracin de
protenas en el concentrado proteico aument de 16,68% hasta 22,85%, el incremento fue de 1,37
veces con respecto a la lemna no tratada.


La SDS-PAGE mostr una gran mancha en un rango desde 11,28 hasta 21,68 kDa
aproximadamente, y la banda se acentu a una masa molar de 21,68 kDa aproximadamente, lo
que indica que existe un nmero variado de protenas de masa molar de baja a intermedia, entre
los monmeros de la Rubisco, protena ms abundante de las plantas.












6.- RECOMENDACIONES


Optimizar las condiciones de tratamiento PDA a la lenteja acutica, para evaluar y establecer
comparaciones en cuanto al rendimiento de extraccin y precipitacin de las protenas de la
misma, as como su efecto en el perfil de aminocidos y digestibilidad.


Determinar la digestibilidad in vitro y en ratas de los concentrados proteicos obtenidos a los
diferentes pH de precipitacin y del residuo de las macroextraccin. El conocimiento de la
digestibilidad de los alimentos es bsico para establecer su valor nutritivo y, por tanto, para la
formulacin de raciones para los animales rumiantes
7
.


Determinar la composicin de aminocidos de las protenas del concentrado obtenido de la
lemna, para determinar si se encuentra equilibrada en todos los aminocidos esenciales, inclusive
en lisina y metionina y poder compararla con la calidad nutritiva de las fuentes de protenas
convencionales como la soya
73
.


Desarrollo y evaluacin de mtodos de extraccin alternativos, a la extraccin alcalina, que
podra ser con el uso de surfactantes, alcoholes, entre otros.


Desarrollar un mtodo que permita separar las protenas de otras macromolculas
interferentes como la hemicelulosa y la lignina que son parcialmente solubilizadas durante la
extraccin de protenas, mediante una precipitacin selectiva.


Evaluar mtodos de purificacin de los concentrados proteicos, como la ultrafiltracin (UF)
y diafiltracin, para el posterior estudio de sus propiedades funcionales.










8.- REFERENCIAS BIBLIGRAFICAS


1.- Figueroa, V., 1996, Produccin porcina con cultivos tropicales y reciclaje de nutrientes,
Fundacin CIPAV, Cali, Colombia, p.p. 153-160.


2.- Sarria, B., Gmez, M., Rodrguez, L., Molina, J., Molina, C., Murgueitio, R., 1994, Pruebas
de campo en los trpicos con el uso de biomasa para sistemas integrados y sostenibles de
produccin animal, Documento presentado a la Organizacin de las Naciones para la
Agricultura y la Alimentacin FAO por Fundacin CIPAV, Cali, Colombia, p.p. 5-15.


3.- Len, A., Angulo, I., 1989, Materias primas alternativas para la produccin de alimentos
concentrados para animales en Venezuela, FONAIAP Divulga, N 31.
http://www.fonaiap.gov.ve. 06-08-2007.


4.- Lon Wo, E, 1995, Alimentacin no convencional para las aves en el trpico, Memorias del
XIV Congreso Latinoamericano de Avicultura, Santiago, Chile.


5.- Datos de la FAO, 2007, La transformacin de la industria crnica crea un mayor riesgo de
enfermedades. Sala de prensa. ltimas noticias.
http://www.fao.org/newsroom/es/news/2007/1000660/index.html. 09-09-2007.


6.- Morris, H., Quinatana, M., Almarales, A., Herndez, L., 1999, Composicin bioqumica y
evaluacin de la calidad proteica de la biomasa autotrfica de Chlorella vulgaris, Rev. Cubana
Aliment. Nutr., 13(2): 123-127.


7.- Garcs, K., Gutirrez, R., Kohlmann, B., Yeomans, J., Botero, R., 2006, Caracterizacin del
sistema de descontaminacin productivo de aguas servidas en la finca pecuaria, Tierra Trop,
129-140.


8.- Mastrodi, J., Correa, A. 1987, Estudio do concentrado proteico de folha de mandioca
Obtenvao, analices qumicas e suplementavao con aminocidos, Arch. Latin. Nutr., 36: 483-494.


9.- Gijzen, H, 2000, Lenteja de agua: Planta para las aguas residuales, Universidad del Valle,
Agencia AUPEC, Colombia. http://aupec.univalle.edu.co/Agencia/ agenciabor.html. 12-07-2007.


10.- Preston, T., Rodrguez, L., 1996, Use of effluent from low cost plastic biodigester as
fertilizer from duck weed pond, Livestock Res. Rural Dev., 8(2): 6069.



11.-Febrero, I.; Romero, O., Ruiz, L., Gonzlez, R., 2005, Jacinto de agua (Eichhornia
crassipes) una alternativa para la alimentacin de cerdos en ceba, Revista Electrnica de
Veterinaria REDVET, 6(5):1-5 p. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n050505/050513.pdf
15-07-2007.


12.- Ferrer, A., Urribarr, L., Peters, J., Gonzlez, O., Tern, M., Chacn, D., Bravo, A., 2006,
Extraccin y precipitacin de las protenas de la Lemna obscura, Ciencia. 14(2): 331-340.


13.- Cansen, W., Carr, B., 1985, Influence of fiber on digestibility of poultry feeds, In W.
Haresing and D. J Cole, Eds. Recent Adv. Animal Nutr. London., p.p. 71-86.


14.- Peters, J. 2003, Caracterizacin de las fracciones proteicas del pasto elefante enano tratado
con amonaco (Pennisetum purpureum Schum. cv. Mott), Trabajo especial de grado.
Departamento de Qumica. Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia.
Maracaibo, Venezuela, p.p. 13-31.


15.- Sarria, P. 1994, Efecto del nacedero (Trichanthera gigantea) como reemplazo parcial de la
soya en cerdas en gestacin y lactancia recibiendo una dieta bsica de jugo de caa, Livestock
Res. Rural Dev., 6(1): 60-69.


16.- Garca, A., Ly, J., 1994, Uso de diferentes niveles de foliares del pltano en la alimentacin
de cerdo: digestibilidad del cerdo en preceba, Rev. Comp. de Prod Porcina, 2(1): 68-75.


17.- Goodland, R., Daly, H., El Serafy, S., Droste, B., 1994, Desarrollo econmico sostenible,
Bogot, Colombia, p.p. 185-189.


18.- Caravaca, F., 2003, Introduccin a la alimentacin y racionamiento, Universidad de
Sevilla, Sevilla, Espaa. p.p. 17.
http://alojamientos.us.es/gprodanim/Racionamiento/Introd%20Racionamiento%2006-07.pdf.02-
08-2007.


19.- Bochi-Brum, O., Carro, M., Valds, C., Gonzlez, J., Lpez, S., 1999, Digestibilidad in
vitro de forrajes y concentrados: Efecto de la racin de los animales donantes de lquido
ruminal, Arch. Zootecnia, 48(181): 51-61.


20.- Otero, M., Cobos, V., Cisneros, M., 1998, Conservacin de subproductos proteicos y su
utilizacin en la alimentacin animal, En mesa redonda II Taller Internacional sobre Produccin
Animal Sostenible, Universidad de Granma, Bayazo, Cuba, p.p. 144-150.




21.- Prez, F., Gill, Romo., Sangines, C, 2000, Potencial de la planta acutica Lemna gibba en la
alimentacin de cerdos, Tesis de Maestra de Ciencias Pecuarias, Universidad de Colima.
Tocoman, COLLM, p.p. 5 -23.


22.- Bruggink, J., Croklaan, L, 1993, Utilizacin de concentrados de protena de soya en dietas
de animales jvenes, IX Curso de especializacin FEDNA, Wormerveer, Holland, p.p. 1.
http://www.etsia.upm.es/fedna/capitulos/93CAP_10.pdf. 14-12-2008.


23.- Faneite, A., Pirela, J., Cardozo, R.; Ferrer, A, 2006, Ingeniera bsica para el diseo de un
secador rotatorio continuo para deshidratar la Lemna obscura presente en el Lago de Maracaibo,
Ciencia, 14(2): 131-146.


24.- Crespo, R., Castao, J., Capurro, J, 2007, Secado de forraje con el horno de microondas:
Efecto sobre el anlisis de calidad, Agric. Tc., 67(2): 210-218.


25.- Del Pilar, M., 2004, La lenteja de agua (Lemna minor): Una planta acutica promisoria,
Rev. EIA., 1:33-38.


26.- Lemna Corporation, 1992, Lemna: the natural alternative for wastewater treatment,
Mimeo, 2:1-4.


27.- Pedraza, G., 1994, Reciclaje del efluente de origen animal con tres especies de plantas
acuticas, CIPAV, Livestock Res. Rural Dev., 6(1). http://www.cipav.org.co/lrrd/lrrd6/1.04-08-
2007.


28.- Burke, D., Weis, J., Weis, P., 2000, Release of metals by the leaves of the salt marsh
grasses Spartina alterniflora and Pharagmitis austalis. Estuarine, Coastal Shelf Sci., 51: 153-
159.


29.- Zykwinska , A., Gaillard, C., Bulon, A., Pontoire, B., Garnier, C., Thibault, J., Ralet, M.,
2007, Assessment of in vitro binding of isolated pectic domains to cellulose by adsorption
isotherms, electron microscopy, and x-ray diffraction methods, Biomacromolecules, 8(1): 223
232.


30.- Savn, L., 2001, Alimentacin no convencional de especies monogstricas: utilizacin de
alimentos altos en fibra, Instituto de Ciencia Animal, La Habana, Cuba, p.p. 30-34.


31.- Ramrez, R., Roque Gonzalo Ramrez., Lpez, F., 2000, Factores estructurales de la pared
celular del forraje que afectan su digestibilidad, Ciencia UANL, 5(002): 180-189.


32.- Van Soest, P., 1994, Nutritional ecology of the ruminant, 2
nd
Edition, Comstock, Cornell
Univ. Press Ithaca. N. Y., 30 p.


33.- Patrouilleau, R., Lacoste, C., Yapura, P., Casanovas, M., 2006,Perpectivas de los
biocombustibles en Argentina, con nfasis en el etanol de base celulsica, Instituto Nacional de
Tecnologa Agropecuaria, p.p 7-13.


34.- Bieto, J., Talon, M., 1993, Fisiologa y bioqumica vegetal, 1
ra
Edicin, Interamericana
McGraw-Hill, Espaa, p.p. 1-24.


35.- Lyons, R., Machen, R., Forbes, T., 1999, Por qu cambia la calidad del forraje de los
pastizales?, Extensin Cooperativa de Texas. El Sistema Universitario, Universidad de Texas
A&M, Texas, USA, p.p. 1-6.


36.- Fennema, O., 1997, Amino Acids, Peptides, and Proteins, In: O.R. Fennema (Ed.), Food
Chemistry, Marcel Dekker, Inc. New York, p.p. 321-424.


37.- Morn, M., 2003, Produccin de azcares mediante de hidrlisis enzimtica de materiales
lignocelulsicos tratados con amonaco, Tesis de Maestra. Departamento de Qumica. Facultad
Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela, p.p. 12-22.


38.- Moore, K.; Jung, H., 2001, Lignin and fiber digestion, J. Range Manage, 54: 420-430.


39.- Cofr, R., 2003, Uso de marcadores internos como mtodo para determinar perdidas de
masa en ensilajes, Tesis de Ingeniera Agronmica, Departamento de Zootecnia, Facultad de
Agronoma e Ingeniera Forestal,. Pontificia Universidad Catlica de Chile, Chile. p.p 15-30.


40.- Kumar, R., DMello, J., 1995, Antinutritional factors in forage legumes, Edited by J. P. F.
DMello y C. Devendra. CAB International, Trop. Legumes Anim. Nutr., p.p. 95-133.


41- Harinder, P., Makkar, S., 1989, Protein precipitation methods for quantitation of tannins: A
Review, Agric. Food Chem, 37:1197-1202.


42.- Goering, H., Van Soest, J., 1970, Forage fiber analysis (apparatus, reagents, procedures and
some applications), Agricultural Handbook, N 379. Ars Usda, Washington DC. p.p. 8, 20.

43.- Van Soest, P., Robertson, J., Lewis, B., 1991, Methods for dietary fiber, neutral detergent
fiber and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition, J. Dairy Sci., 74, 3574-3583.



44.- Hernndez, T., Centeno, C., Martnez, C., Hernndez, A., 1995, Effect of solvent extraction
on the nitrogen compounds in alfalfa protein concentrates, J. Agric. Food Chem., 43: 3065-
3069.


45.- Caas, R., 1998, Alimentacin y nutricin animal, 2
da
. Edicin, Pontificia Universidad
Catlica, Facultad de Agronoma, Santiago, Chile, p.p. 550.


46.- Creighton, T., 1994, Chemical properties of polypeptides, En: T. E. Creigton (ed.) Proteins
structures and molecular properties, Second Edition, W. H. Freeman and Company, New York,
p.p. 1-43.


47.- Daz, M.; Semprn, A., Gualtieri, M., 2003, Produccin de protena unicelular a partir de
desechos de vinaza, Revista de la Facultad de Farmacia, 45(2): 23-26.


48.- Badui, S., 2006, Pigmentos, Qumica de los alimentos, Pearson Educacin, 4
ta
Edicin,
Cap. 7, p.p. 401-439.


49.- Miquilena, E., 2004, Contenido de carbohidratos estructurales, no estructurales y fracciones
nitrogenadas en dos ecotipos de Leucaena leucocephala bajo diferentes niveles de fertilizacin
con nitrgeno y fsforo y diferentes periodos de evaluacin, Trabajo de Ascenso, Facultad de
Agronoma, LUZ, p.p. 15-16.


50.- Sentheshanmuganathan, S, Durand, S., 1969, Isolation and composition of protein from
leaves of plants grown in Ceylon, J. Sci. Food. Agric., 20:603-608.


51.- Buitrago J., 1990, La yuca en la alimentacin animal, Centro Internacional de Agricultura
Tropical, Cap. 2, p.p. 35-43.


52.- Hanczakowski, P., Szymczyk, B., Skraba, B., 1991, Composition and nutritive value of
native and modified green fraction of leaf protein from Lucerne, J. Sci. Food Agric., 56: 495-
501.


53.- Valencia, A., Riao, N., Soto, J., 1997, Actividad de la ribulosa 1,5-difosfato carboxilasa y
contenidos de clorofilas y protena foliar en 6 genotipos de Coffea sp, Cenicaf, 48(1): 5-11.


54.- http://www.bio.davidson.edu/COURSES/GENOMICS/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html.
25-11-2008



55.- Menkhaus, T., Chenming, Y., Nikolov, Z., Glatz, C., 2004, Considerations for the recovery
of recombinant proteins from plants, Biotechnol. Prog., 20:1001-1014.


56.- Bach-Tuyet, T., Iiyama, K., Stone, B., 1990, Primary and secondary walls of grasses and
other forage plants: Taxonomic and structural considerations, Session 2. Plant aspects of
lignocellulose utilization. En: Microbial and plant opportunities to improve lignocellulose
utilization by ruminants, Alan D.; Ljungdahl L.; Wilson J.; Harris P.(Eds), Georgia, USA, p.p.
50-54.


57.- Gross, K., Wedeking, K., Cowell, C., Schoenheer, W., Jewell, D., Zicker, D., Debraekeleer,
J., Frey, R., 2000, Nutrientes. In: Nutricin clnica en pequeos animales (Small animal clinical
nutrition), Hand, M., Thatcher, C., Remillard, R. y Roudebush, P., 4
ta
edicin, Buenos Aires,
Argentina, Inter. Medical S.A.I.C.I., p.p: 23-126.


58.- Olvera, M., Martnez, C., Real, E., 1993, Manual de tcnicas para laboratorios de nutricin
de peces y crustaceos, Organizacin de las naciones unidas para la agricultura y la alimentacin
(FAO), D.F., Mxico. http://www.fao.org/docrep/field/003/AB489S/AB489S00.HTM 30-01-09.
20-01-2009.


59.- Lowry, O., Rosebrough, N., Farr, A.; Randall, R., 1951, Protein measurement with the
Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193: 263275.


60.- Folin, O., Ciocalteu, V., 1927, On tyrosine and tryptophane determinations in proteins, J.
Biol. Chem., 73: 627649.


61.- Singleton, V., Rossi, J., 1965, Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic
phosphotungstic acid reagents, Am. J. Enol. Vit., 16: 144158.


62.- Peterson, G., 1979, Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry,
Rosebrough, Farr and Randall, Anal. Biochem., 100: 201220.


63.- Jansen, W., Carr, B., 1985, Influence of fiber on digestibility of poultry feeds, In: W.
Haresign and D. J. Cole (Eds). Recent Advances in Animal Nutrition. Butterworths, London, p.p.
71-86.


64.- Holtzapple, M., Ripley, P., Nikolaus, M., 1994, Saccharification, fermentation, and protein
recovery from low-temperature AFEX- treated coastal bermudagrass, Biotechnol. Bioeng., 44:
1122-1131.




65.- De la Rosa, L., Reshamwala, S., Latimer, V., Shawky, B., Dale, B., Stuart, E., 1994,
Integrated production of ethanol fuel and protein from coastal bermudagrass, Appl. Biochem.
Biotechnol., 45/46: 483-497.


66.- Ferrer, A., 1997, Development of high energy feeds from forages with ammonia reactor
pressurization/depresurization processes, Ph.D. Dissertation. Texas A & M University Texas,
USA, p.p. 233.


67.- Urribarr, L., Ferrer, A., Colina, A., 2005, Leaf protein from ammonia-treated dwarf
elephant grass (Pennisetum purpureum Schum cv. Mott), Appl. Biochem. Biotechnol., 122: 721-
730.


68.- Ojeda, F., Montejo, L., Morales, Y., 1999, Determinacin de la dosis ptima de amonaco
en el tratamiento de la cascarilla de ctrico deshidratada, Estacin Experimental de Pastos y
Forrajes Indio Hatuey, Matanzas, Cuba, p.p. 1-7.


69.- Escoda, A., 1982, Obtencin de concentrados proteicos a partir de diferentes especies
vegetales, Rev. Fac. Agron. L.U.Z., 7: 90-95.


70.- Fiorentini, R., Galoppini, C., 1981, Pilot plant production of an edible alfalfa protein
concentrate, J. Food Sci., 46:1514-1520.


71.- Gonzlez O., 2007, Extraccin y precipitacin de las protenas del follaje de yuca (Manihot
esculenta Crantz) tratado con amonaco, Trabajo especial de grado, Departamento de Qumica,
Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela, p.p. 22-25.


72.- Casada, J., 2004, Aproximacin protemica al estudio de podredumbre apical.. En:
Aproximacin cintico, molecular y protemica al estudio de podredumbre apical en frutos de
tomate (Lycopersion esculentum M). Implicacin de polifenol oxidasa (ppo) y enzimas
antioxidantes, Tesis doctoral, Alicante Biblioteca Virtual Miguel de Cervantes, Universidad de
Alicante, Facultad de Ciencias, Cap. 4, p.p. 38-41.


73.- Pedroche, J., Yust, M., Lqari, H., Giron, J., Alaiz, M., Vioque, J., Millan, F., 2004, Brassica
carinata protein isolates: chemical composition, protein characterization and improvement of
functional properties by protein hydrolysis, J. Food Chem., 88: 337346.


74.- Berot, S., Gueguen, J., Berthaud, C., 1987, Ultrafiltration of fababean (Vicia faba l.) protein
extracts: process parameters and functional properties of the isolates, Lebensmittel Wissenschaft
und Technologie (Food Sci.Techno.), 20(3): 143150.



75.- Satterlee, L., 1980, The view of a food scientist on promises and problems of leaf protein
incorporated into our food, Trans. ASAE. 23: 237-241.


76.- Castellano, R., Altamirano, S., Moretti, R., 1994, Nutritional characteristics of cassava
(Manihot esculenta Crantz) leaf protein concentrate obtained by ultrafiltration and acidic
thermocoagulation, Plant Foods Human Nutr., 45: 357-363.


77.- Koschuh, W., Povoden, G., Thang, V., Kromus, S., Kulber, K., Novalin, S., Krotscheck, C.,
2004, Production of leaf protein concentrate from ryegrass (Lolium perenne x multiflorum) and
alfalfa (Medicago sativa subsp. sativa). Comparison between heat coagulation/centrifugation and
ultrafiltration, Desalination, 163: 253-259.


78.- Friedman, M., 1996, Food browning and its prevention: an overview, J Agric Food Chem.,
44: 63153.


79.- Rawel, H., Kroll, J., Kulling, S., 2007, Review of the effect of non-protein components on
the degradability of proteins, Biotechnol. Adv., 25: 611613.


80.- Dunker, A., Rueckert, R., 1969, Observations on molecular weight determinations on
polyacrylamide gel, J. Biol. Chem., 244: 5074-5080.


81.- Rybicki, Ed.; Purves, M., 1996, SDS poliacrylamide gel electroforesis (SDS-PAGE), 3ra
edicin. Molecular Biology Techniques Manual. http://www.mcb.uct.ac.za//sdspage.htm 05-01-
2009.


82.- Smith, S., Ellis, R., 1981, Light-stimulated accumulation of transcripts of nuclear and
chloroplast genes for ribulosebisphosphate carboxylase, J. Mol. Appl. Genet., 1: 127-137.


83.- Georges, E., Mushynski, W., 1987, Anomalous behaviour of a protein during SDS/PAGE
corrected by chemical modification of carboxylic groups, Eur. J. Biochem., 165: 281-287.


84.- Varga, E., Scengyel, Z., Recaey, K., 2002, Chemical pretreatments of corn stover for
enhancing enzymatic digestibility, Appl. Biochem. Biotechnol., 98-100: 7387.


85.- Grabski, A., Burgess, R., Preparation of protein samples for SDS-polyacrylamide gel
electrophoresis: procedures and tips, Innovations, 13:10.




86.- Jideani, I., Owusu, R., Muller, H., 1994, Protein of acha (Digitaria exilis Stapf): solubility
fraccionation, gel filtration, and electrophoresis of protein fractions, J. Agric. Food Chem., 51:
51-59.


87.- Tern M., 2007, Fraccionamiento y caracterizacin de las protenas del follaje de yuca
(Manihot esculenta Crantz) tratado con amonaco, Trabajo especial de grado, Departamento de
Qumica, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela, 48 p.


88.- Covenin 1156-79, Alimentos para animales. Determinacin de Humedad.


89.- A.O.A.C. Official Methods of Analysis, 1990, 13
th
, Association of Official Analytical
Chemists, 125 p.


90.- Lowry, O., Rosebrough, N., Farr, A., Randall, R., 1965, Protein measurement with the
Folin phenol reagent, Anal. Chem., 16: 190-210.


91.- Urribarr, L. Ferrer, A., Colina, A. 2004, Extraccin y precipitacin de las protenas
solubles del pasto elefante enano (Pennisetum purpureum Schum cv. Mott), Rev. Fac. Agron,
L.U.Z., 21: 268-279.


92.- Laemmli, U. K., 1970, Cleavage of structural proteins during assembly of the head of
bacteriophage T4, Nature, 227: 680-685.


93.- Blum, H., Beier, H., Gross, J., 1987, Improved silver staining of plant protein, RNA and
DNA in polyacrylamide gel, Electrophoresis, 8: 93-99.


94.- Maldonado, R., Pacheco, E., 2004, Estudio de la composicin qumica y factores
antinutricionales de la harina de comfrey (Symphytum officinale L.), Maracay, Rev. Fac.
Agron., 30:51-61.


95.- Ferrer, A., Byers, F. M., Sulbarn de Ferrer, B., Dale, B. E., Aiello, C. 2000, Optimizing
ammonia pressurization/depressurization processing conditions to enhance enzymatic
susceptibility of dwarf elephant grass, Appl. Biochem. Biotechnol, 84: 163-179.


96.- Ferrer A, Byers F.M., Sulbarn-de-Ferrer B., Dale B.E., Aiello, C., 2002, Optimizing
ammonia processing conditions to enhance susceptibility of legumes to fiber hydrolysis. Alfalfa,
Appl. Biochem. Biotechnol., 98: 123-134.




97.- Mondor, M.; Ippersiel, D.; Lamarche, F.; Boye, J., 2004, Production of soy protein
concentrates using a combination of electroacidification and ultrafiltration, J. Agric. Food
Chem., 52(23): 69916996.


98.- Cassab, G., 1998., Plant cellular wall proteins., Annu. Rev. Plant Physiol., 49: 281-309 p.


99.- Jeong, G., Park, E., Wahlig, V., Burapatana, V., Park, D., Tanner, R., 2004, Effect of pH on
the Foam Fractionation of Mimosa pudica L. Seed Proteins, Ind. Eng. Chem. Res., 43:422-427.


100.- Gaggiotti, M., Inta, R., Los alimentos y su valor nutritivo, XXI Curso internacional de
lechera para profesionales de Amrica, p.p. 26,
http://www.inta.gov.ar/rafaela/seminario/9seminario/articulos/Gaggiotti.pdf. 28-09-2008


101.- Maninder, K., Narpinder, S., 2007, Characterization of protein isolates from different
Indian chickpea (Cicer arietinum L.) cultivars, J. Food Chem., 102: 366374.


102.- Ohta, E., De Alcantara, P., 2006, Evaluation of the use of volatile electrolyte system
produced by ammonia and carbon dioxide in water for the salting-out of proteins: Precipitation of
porcine trypsin, Biochem, Eng. J., 30: 124129.


103.- Aluko, R., Yada, R., 1997, Some physicochemical and functional properties of cowpea
(Vigna unguiculata) isoelectric protein isolate as a function of pH and salt concentration, J.
Food Sci. Nutr. Rev., 48: 31-39 p.


104.- Adebowale, K., Lawal, O., 2003, Foaming, gelation and electrophoretic characteristics of
mucuna bean (Mucuna pruriens) protein concentrates, Food Chem., 83: 237246.


105.- Spreitzer, R., Salvucci, M., 2002, Rubisco: Structure regulatory interactions, and
possibilities for a better enzyme, Annu. Rev. Plant. Biol., 53: 449-475.


106.- Ferrer, A., Sulbarn de Ferrer, B., Byers, F., Dale, B., Aiello, C., 1997, Aumento y
aprovechamiento de potencial nutritivo de forrajes y residuos mediante procesos amoniacales y
enzimtico para la alimentacin de animales rumiantes y monogstricos, 1
er
Encuentro de
Productores Agrcolas con la Biotecnologa. Fundacite-Zulia, J. B. Editores, Maracaibo, p.p. 171-
194.







NDICE DE FIGURAS


Pgina
Figura 1. Estructura molecular de la celulosa, mostrando los enlaces glicosdicos. 18
Figura 2. Estructura esquemtica de la hemicelulosa y sus unidades estructurales. 19
Figura 3. Representacin grafica de la estructura de la lignina... 20
Figura 4. Alcoholes precursores de la lignina
31
... 21
Figura 5. Representacin esquemtica del efecto de los pretratamientos. 26
Figura 6. Curva de calibracin de Lowry 38
Figura 7. Efecto de la temperatura y la relacin slido/liquido sobre el rendimiento
de extraccin de las protenas del LT a pH 5,83 (agua destilada) y 20 min

40
Figura 8. Efecto del tratamiento sobre el rendimiento de extraccin de las protenas
de la lenteja acutica a las mejores condiciones de extraccin para la LNT y LT..

42
Figura 9. Determinacin del punto isoelctrico de las protenas de la LT a 25C.. 46
Figura 10. Contenido de protena cruda determinado por el mtodo de micro-
Kjeldahl de los precipitados obtenidos de la LT..

47
Figura 11. Efecto de la temperatura sobre el rendimiento de precipitacin de las
protenas de la LT

48
Figura 12. Anlisis SDS-PAGE empleando teido con azul de Coomassie para las
protenas concentradas de la LT. (1) Banda para las protenas estndar. (2-10
Bandas para las protenas de los concentrados proteicos obtenidos a diferentes pH).



50














NDICE DE TABLAS


Pgina
Tabla 1. Composicin qumica de la Lemna obscura no tratada y tratada a
diferentes condiciones con amonaco...

34
Tabla 2. Extraccin y precipitacin de las protenas del LNT. 37
Tabla 3. Extraccin de las protenas del LT con agua destilada y solucin de
hidrxido de calcio a diferentes valores de pH, 30 C, relacin slido/lquido 1:15 y
tiempo de 45 min..


39
Tabla 4. Extraccin de las protenas del LT con agua destilada a pH del agua
destilada, 30C, relacin slido/lquido 1:15 y diferentes tiempos de extraccin...

39
Tabla 5. Efecto de la temperatura sobre el rendimiento de extraccin de las
protenas de la LT....

41
Tabla 6. Efecto de la relacin slido-lquido sobre el rendimiento de extraccin de
las protenas de la LT...

41
Tabla 7. Efecto del tratamiento amoniacal sobre el pH, relacin slido/lquido,
tiempo, temperatura y rendimiento de extraccin

44
Tabla 8. Efecto del tratamiento amoniacal sobre la temperatura, pI y rendimiento de
precipitacin.

48
Tabla 9. Comparacin de los rendimientos de extraccin, precipitacin global y la
concentracin de protenas en LNT y LT

49