A RAPID PHAGE PLAQUE COUNT METHOD FOR THE DETECTION

OF BACTERIA AS APPLIED TO THE DEMONSTRATION OF

INTERNALLY BORNE BACTERIAL INFECTIONS OF SEED'
H. KATZNELSON AND M. D. SUTTON
Di v i s i o n o f Ba c t e r i o l o g y a n d Da i r y Re s e a r c h , a n d Di v i s i o n o f Bo t a n y a n d Pl a n t
Pa t h o l o g y ,
Sc i e n c e
Se r v i c e , De p a r t m e n t o f Ag r i c u l t u r e , Ot t a w a , Ca n a d a
Re c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n J a n u a r y 2 2 , 1 9 5 1
Th e d e t e c t i o n o f b a c t e r i a i n v a r i o u s n a t u r a l s u b s t r a t e s u s u a l l y i n v o l v e s i s o -
l a t i o n o n s e l e c t i v e m e d i a f o l l o w e d b y s p e c i f i c i d e n t i f i c a t i o n o n t h e b a s i s o f m o r -
p h o l o g i c a l , c u l t u r a l , a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . Du r i n g t h e p a s t 1 5 y e a r s
i n c r e a s i n g u s e h a s b e e n m a d e o f s p e c i f i c b a c t e r i o p h a g e s f o r i d e n t i f y i n g o r t y p i n g
b a c t e r i a l s p e c i e s a n d s t r a i n s ; t h i s m e t h o d h a s p r o v e d o f d i s t i n c t v a l u e i n m e d i c a l
a n d e p i d e m i o l o g i c a l w o r k , e s p e c i a l l y w i t h e n t e r i c o r g a n i s m s , s t a p h y l o c o c c i ,
s t r e p t o c o c c i , a n d o t h e r b a c t e r i a ( Cr a i g i e , 1 9 4 6 ) . Fo r p u r p o s e s o f c l a s s i f i c a t i o n ,
s p e c i f i c p h a g e s h a v e b e e n w i d e l y u s e d t o s e p a r a t e c l o s e l y r e l a t e d g r o u p s , s p e c i e s ,
a n d s t r a i n s o f b a c t e r i a ( Cr a i g i e , 1 9 4 6 ; Sm i t h e t a l . , 1 9 4 6 ) . Ba c t e r i a l v i r u s e s a r e
a l s o b e i n g r e c o g n i z e d a s u s e f u l t o o l s i n t h e r a p i d i d e n t i f i c a t i o n o f p l a n t p a t h o -
g e n i c b a c t e r i a ( Th o m a s , 1 9 4 7 ; Th o r n b e r r y e t a l . , 1 9 4 9 ) ; o r g a n i s m s d i s t i n g u i s h -
a b l e o n l y b y p a t h o g e n i c i t y m a y b e s e p a r a t e d r e a d i l y b y s p e c i f i c p h a g e s ( Th o r n -
b e r r y e t a l . , 1 9 4 8 ) . Ev e n w i t h t h i s t e c h n i q u e , h o w e v e r , a n e s s e n t i a l p r e l i m i n a r y
s t e p i s t h e i s o l a t i o n o f t h e o r g a n i s m , w h i c h m a y o r m a y n o t b e d i f f i c u l t , d e p e n d i n g
o n t h e d e g r e e o f c o n t a m i n a t i o n o f t h e s p e c i m e n s , e x t e n t o f i n f e c t i o n , a g e o f
l e s i o n s , a n d s o o n . In o r d e r t o e l i m i n a t e t h i s s t e p b u t w i t h o u t l o s i n g s p e c i f i c i t y ,
a m e t h o d w a s p r o p o s e d ( Ka t z n e l s o n , 1 9 5 0 ) i n v o l v i n g t h e a d d i t i o n , t o a s a m p l e
s u s p e c t e d o f h a r b o r i n g a s p e c i f i c o r g a n i s m , o f a k n o w n n u m b e r o f p a r t i c l e s o f a
h o m o l o g o u s p h a g e a n d d e t e r m i n i n g t h e n u m b e r a f t e r a s u i t a b l e i n c u b a t i o n
p e r i o d . A s i g n i f i c a n t r i s e i n t h e n u m b e r o f p a r t i c l e s w a s c o n s i d e r e d t o i n d i c a t e
t h e p r e s e n c e o f t h e h o m o l o g o u s b a c t e r i a . Th i s h y p o t h e s i s w a s b a s e d o n t h e w e l l -
e s t a b l i s h e d f a c t t h a t o n e s u s c e p t i b l e b a c t e r i a l c e l l i n f e c t e d w i t h o n e p h a g e p a r t i c l e
m a y l i b e r a t e a s m a n y a s 1 0 0 o r m o r e p a r t i c l e s ( b u r s t s i z e ) , d e p e n d i n g o n t h e
s p e c i e s a n d e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s ( De l b r i i c k , 1 9 4 2 ) . So m e o f t h e r e s u l t s o b -
t a i n e d a n d f a c t o r s i n v o l v e d ( p h a g e s p e c i f i c i t y , s t r a i n r e s i s t a n c e , a n d c o n t a m i n a -
t i o n ) h a v e b e e n o u t l i n e d b r i e f l y i n a p r e v i o u s r e p o r t ( Ka t z n e l s o n , 1 9 5 0 ) . De t a i l s
o f t h e t e c h n i q u e , i t s a p p l i c a t i o n , a n d g e n e r a l u s e f u l n e s s w i l l b e g i v e n i n t h i s p a p e r .
No s a t i s f a c t o r y r a p i d m e t h o d i s a v a i l a b l e f o r d e t e c t i n g i n t e r n a l i n f e c t i o n o f
s e e d b y p h y t o p a t h o g e n i c b a c t e r i a . Am o n g t h e m o s t s e r i o u s o f t h e s e r e s p o n s i b l e
f o r d a m a g e a m o u n t i n g t o m i l l i o n s o f d o l l a r s a n n u a l l y a r e Ps e u d o m o n a s p h a s e o l i -
c o l a a n d X a n t h o m o n a s p h a s e o l i , c a u s i n g h a l o a n d c o m m o n b l i g h t , r e s p e c t i v e l y , o f
b e a n s . Se r o l o g i c a l t e c h n i q u e s m a y h o l d s o m e p r o m i s e i n d e t e c t i n g t h e s e o r g a n -
i s m s i n s e e d , b u t p l a n t p a t h o l o g y l a b o r a t o r i e s a r e n o t g e n e r a l l y e q u i p p e d t o u s e
' Co n t r i b u t i o n No . 3 1 2 ( J o u r n a l Se r i e s ) f r o m t h e Di v i s i o n o f Ba c t e r i o l o g y a n d Da i r y
Re s e a r c h a n d No . 1 0 7 1 f r o m t h e Di v i s i o n o f Bo t a n y a n d Pl a n t Pa t h o l o g y .
6 8 9
H. KATZNELSON AND M. D. SUTTON
t h e m . At p r e s e n t , f i e l d i n s p e c t i o n a n d p l a n t i n f e c t i o n a r e c h i e f l y u s e d a l t h o u g h
b o t h a r e t i m e - c o n s u m i n g a n d e x p e n s i v e . Co n s e q u e n t l y , a n e f f e c t i v e l a b o r a t o r y
d i a g n o s t i c p r o c e d u r e i s h i g h l y d e s i r a b l e . Th e p h a g e p l a q u e c o u n t t e c h n i q u e w a s
t h e r e f o r e a p p l i e d t o t h i s s p e c i f i c p r o b l e m , b u t w i t h t h e p o s s i b i l i t y i n m i n d o f i t s
g e n e r a l a p p l i c a t i o n i n t h e d e t e c t i o n o f o r g a n i s m s i n a n y s u b s t r a t e o r f r o m a n y
s o u r c e .
METHODS AND RESULTS
Is o l a t i o n , s p e c i f i c i t y , a n d s t a b i l i t y o f p h a g e s . Ty p i c a l p h a g e s w e r e i s o l a t e d f o r
P. p h a s e o l i c o l a a n d X . p h a s e o l i f r o m a m i x t u r e o f s o i l , c o m p o s t , a n d s e w a g e ,
w h i c h w a s s u s p e n d e d i n n u t r i e n t b r o t h , i n o c u l a t e d h e a v i l y w i t h o n e o r t h e o t h e r
o f t h e t w o b a c t e r i a l s p e c i e s , a n d i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 4 8 h o u r s .
Th i s s u s p e n s i o n w a s f i l t e r e d t h r o u g h p a p e r a n d t h r o u g h s t e r i l e Se i t z p a d s . Th e
c l e a r f i l t r a t e w a s t h e n a d d e d t o f r e s h l y i n o c u l a t e d n u t r i e n t b r o t h ( 1 0 m l i n 5 0 - m l
Er l e n m e y e r f l a s k s ) . Af t e r 2 4 h o u r s t h e s e c u l t u r e s w e r e f i l t e r e d a n d t h e f i l t r a t e
a g a i n t e s t e d a g a i n s t t h e o r g a n i s m s . Us u a l l y c l e a r i n g t o o k p l a c e w i t h t h e f i r s t o r
s e c o n d f i l t r a t e ; i f n o t , t h e s e r i a l p a s s a g e s w e r e c o n t i n u e d 5 o r 6 t i m e s b e f o r e t h e
f i l t r a t e w a s d i s c a r d e d . Ty p i c a l p l a q u e s w e r e p r o d u c e d b y m i x i n g i n a p e t r i p l a t e
a s u i t a b l e d i l u t i o n o f t h e a c t i v e f i l t r a t e , a h e a v y s u s p e n s i o n o f s u s c e p t i b l e c e l l s ,
a n d 1 0 m l y e a s t b e e f a g a r . Af t e r t h e a c t i v e f i l t r a t e h a d p a s s e d 1 0 t o 1 2 s e r i a l
f i l t r a t i o n s t h r o u g h Se i t z p a d s , i t w a s t e s t e d f o r s p e c i f i c i t y a g a i n s t a v a r i e t y o f
s t r a i n s o f t h e h o m o l o g o u s o r g a n i s m s a s w e l l a s o t h e r s p e c i e s , w i t h r e s u l t s a s
g i v e n i n t a b l e 1 . It m a y b e s e e n t h a t t h e s e p h a g e s a r e v e r y s p e c i f i c , t h a t f o r X .
p h a s e o l i , f o r e x a m p l e , n o t l y s i n g X . p h a s e o l i v a r . f u s c a n s o r v a r . s o j e n s i s . Su c h
s p e c i f i c i t y h a s a l s o b e e n r e p o r t e d b y Th o r n b e r r y e t a l . ( 1 9 4 8 ) , w o r k i n g w i t h
X a n t h o m o n a s p r u n i p h a g e .
Th e P. p h a s e o l i c o l a p h a g e f i l t r a t e w a s a s s a y e d f o r p o t e n c y b y t h e p l a q u e
m e t h o d . Di l u t i o n s w e r e p r e p a r e d i n n u t r i e n t b r o t h a n d a l i q u o t s t r a n s f e r r e d t o
p e t r i p l a t e s , e a c h o f w h i c h t h e n r e c e i v e d 0 . 6 m l o f a c e l l s u s p e n s i o n f r o m a 2 4 -
h o u r y e a s t b e e f a g a r s l a n t c u l t u r e a n d 1 0 m l o f y e a s t b e e f a g a r . Pl a q u e s c o u l d
b e c o u n t e d a f t e r 6 t o 1 0 h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e . Th e p h a g e f i l t r a t e w a s
s h o w n t o c o n t a i n 1 . 2 X 1 0 7 p a r t i c l e s p e r m l . Ho w e v e r , a f t e r 4 d a y s , w h e n t h e
d i l u t e d s u s p e n s i o n s ( k e p t i n t h e r e f r i g e r a t o r ) w e r e r e p l a t e d , t h e n u m b e r o f
p a r t i c l e s h a d i n c r e a s e d t o 9 . 4 X 1 0 8 p e r m l , i n d i c a t i n g a p p r e c i a b l e d i s a g g r e g a -
t i o n o f t h e s e p a r t i c l e s . Th i s n u m b e r r e m a i n e d c o n s t a n t f o r m o n t h s i n t h e c o l d ,
b u t a t r o o m t e m p e r a t u r e i t f e l l t o 5 . 3 X 1 0 1 i n 4 d a y s . A s i m i l a r r e d u c t i o n i n
p l a q u e c o u n t o c c u r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h t h e X . p h a s e o l i p h a g e .
De t e c t i o n o f i n t e r n a l i n f e c t i o n o f b e a n s . ( 1 ) Di r e c t i s o l a t i o n a n d t y p i n g . Fi f t y
s e e d s f r o m e a c h o f 1 4 s a m p l e s w e r e s u r f a c e - s t e r i l i z e d w i t h c h l o r i n e ( 2 p e r c e n t
f r e e Cl , 1 0 m i n u t e s ) , w a s h e d i n s t e r i l e w a t e r , a n d t h e n s u s p e n d e d i n 2 5 0 m l n u -
t r i e n t b r o t h i n Ma s o n j a r s . Th e s e e d s w e r e t h e n c o m m i n u t e d w i t h a W a r i n g
b l e n d e r . Th e g r o u n d m i x t u r e s w e r e s t r e a k e d o n y e a s t g l u c o s e Ca CO3 a g a r a n d
b o t h s t r e a k e d a n d p l a t e d o n y e a s t b e e f a g a r ; c u l t u r e s w e r e i s o l a t e d o n y e a s t
b e e f a g a r a n d e a c h w a s i n o c u l a t e d i n t o 3 f l a s k s c o n t a i n i n g 1 0 m l n u t r i e n t b r o t h .
On e f l a s k r e c e i v e d 0 . 5 m l o f X . p h a s e o l i p h a g e ; o n e , 0 . 5 m l o f P. p h a s e o l i c o l a
6 9 0
[ V OL. 6 1
INTERNALLY BORNE BACTERIAL INFECTIONS OF SEED
p h a g e , a n d o n e w a s l e f t a s a c o n t r o l . It w a s f o u n d t h a t 3 s a m p l e s o u t o f 1 4 c o n -
t a i n e d o r g a n i s m s t h a t l y s e d w i t h P. p h a s e o l i c o l a p h a g e , a n d o n e w i t h X . p h a s e o l i
p h a g e . W h e n t h e s e e d w a s g e r m i n a t e d p r i o r t o c r u s h i n g , 4 s a m p l e s s h o w e d t h e
p r e s e n c e o f o r g a n i s m s s e n s i t i v e t o t h e P. p h a s e o l i c o l a p h a g e . Th i s w a s a v e r y
l o w r a t e o f i n c i d e n c e o f h a l o b l i g h t i n f e c t i o n i n v i e w o f t h e f a c t t h a t 1 1 o f t h e
s a m p l e s c a m e f r o m f i e l d s r e p o r t e d t o b e i n f e c t e d w i t h h a l o b l i g h t . Su b s e q u e n t
t e s t s s h o w e d a n i n c r e a s e d n u m b e r o f p o s i t i v e s a f t e r a p r e l i m i n a r y i n c u b a t i o n o f
t h e c o m m i n u t e d t i s s u e . In n u t r i e n t b r o t h a t r o o m t e m p e r a t u r e , P. p h a s e o l i c o l a
c e l l s d o n o t m u l t i p l y a p p r e c i a b l y d u r i n g t h e f i r s t 5 h o u r s a f t e r i n o c u l a t i o n , b u t
TABLE 1
Sp e c i f i c i t y o f p h a g e s f o r X a n t h o m o n a s p h a s e o l i a n d Ps e u d o m o n a s p h a s e o l i c o l a
LYSIS w r r H ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ LYSIS
W ITH
X ANTHOMONAS CULITIREZS X . PHIASEOLI PSEUDOMONAS CULTURES
P Ao
PHAGE LPCOLA
( 6 8 5 ) X . b e t i c o l a
-
( 1 3 2 ) P. a e r u g i n o s a
c a m p e s t r i s
-
( 4 9 9 )
i
( 6 8 6 ) " "
-
( 6 7 8 ) " a n g u l a t a
( 7 0 0 ) " c e r e a l i s
-
( 6 7 9 ) " a t r o f a c i e n s
( 6 9 8 ) " h o r d e i
-
( 6 8 0 ) " c o r o n a f a c i e n s
( 6 8 7 ) " j u g l a n d i s
-
( 6 8 1 ) " "
( 6 8 8 ) " m a l v a c e a r u m
-
( 6 2 9 ) " f l u o r e s c e n s
( 6 8 9 ) " p h a s e o l i + ( 6 8 2 ) " g l y c i n e a
( 7 0 5 ) " " + ( 6 8 3 ) " "
i t
= 9 i s o l a t e s , a l l + ( 6 8 4 ) " l a c h r y m a n s
( 6 9 0 ) " p h a s e o l i v a r . f u s c a n s
-
( 6 7 1 ) " p h a s e o l i c o l a +
( 6 9 1 ) " " " "
-
( 6 7 2 ) " +
( 6 9 2 ) " p h a s e o l i v a r . s o j e n s i s
-
( B. O. ) "
i
+
( 6 9 3 ) " p h l e i p r a t e n s i s
-
( Pm 5 ) " " +
( 6 9 4 ) " p r u n i
-
( HB) " " +
( 6 9 6 ) " "
-
( NS1 ) "
i
+
( 6 9 9 ) " s e c a l i s
-
( 6 7 3 ) " p i s i
( 6 9 7 ) " t r a n s l u c e n s f . s p . c e r e a l i s
-
( 6 7 4 ) " "
( 7 0 1 ) " u n d u l o s a -
( 6 7 5 ) " s y r i n g a e
( 7 0 2 ) " v e s i c a t o r i a - ( 6 7 6 ) " "
( 7 0 3 ) " "
-
( 6 7 7 ) " t a b a c i
Al l Ps e u d o m o n a s c u l t u r e s - Al l X a n t h o m o n a s c u l t u r e s
t h e y i n c r e a s e i n n u m b e r d u r i n g t h e n e x t 1 2 t o 1 8 h o u r s . Al l b e a n s a m p l e s u s e d
s u b s e q u e n t l y , u n l e s s o t h e r w i s e s p e c i f i e d , w e r e t h e r e f o r e a l l o w e d t o s t a n d o v e r -
n i g h t p r i o r t o t e s t i n g . Is o l a t i o n o f c u l t u r e s f r o m s u c h s a m p l e s a n d t e s t i n g f o r
l y s i s w i t h b o t h p h a g e s a s i n d i c a t e d a b o v e s h o w e d t h a t t h i s m e t h o d o f d e t e c t i n g
i n t e r n a l i n f e c t i o n o f b e a n s w i t h h a l o o r c o m m o n b l i g h t w a s b o t h r a p i d a n d e f f e c -
t i v e . Ho w e v e r , i n o r d e r t o a v o i d i s o l a t i n g a n d t e s t i n g m a n y c u l t u r e s , t h e m e t h o d
d e s c r i b e d b e l o w w a s e v o l v e d .
( 2 ) Th e p l a q u e c o u n t t e c h n i q u e . A s u s p e n s i o n o f P. p h a s e o l i c o l a p h a g e c o n -
t a i n i n g f r o m 6 0 0 t o 1 , 0 0 0 p a r t i c l e s p e r m l w a s u s e d a s t h e s t a n d a r d i n m a n y
p r e l i m i n a r y t e s t s d e s i g n e d t o e x p l o r e t h e p o s s i b i l i t i e s a n d p i t f a l l s o f t h e m e t h o d
1 9 5 1 1 6 9 1
H. KATZNEL5 ON AND M. D. 8 UTTON
TABLE 2
Mu l t i p l i c a t i o n o f P. p h a s e o l i c o l a p h a g e i n c r u s h e d b e a n t i s s u e
PLAQUE COUNT
IN
0 . 2 - L s Ai MPE
SERIES ( NOUNS)
0 2 4 6
1 . Nu t r i e n t b r o t h + p h a g e 3 0 3 7 4 5 3 5
2 . Nu t r i e n t b r o t h + p h a g e + 1 d r o p s u s c e p t i b l e b a c t e r i a 2 4 C* C C
3 . Su p e r n a t a n t c e n t r i f u g e d t i s s u e A + p h a g e 2 4 2 0 1 6 2 0
4 . Su p e r n a t a n t c e n t r i f u g e d t i s s u e A + p h a g e + 1 d r o p s u s c . b a c t . 1 8 1 , 1 5 0 C C
5 . Un c e n t r i f u g e d t i s s u e + p h a g e 1 5 2 0 2 4 2 1
6 . Un c e n t r i f u g e d t i s s u e + p h a g e + 1 d r o p s u s c . b a c t . 1 8 1 5 0 1 , 7 5 0 C
7 . Un c e n t r i f u g e d t i s s u e B +y h a g e 2 4 1 , 6 0 0
8 . Un c e n t r i f u g e d t i s s u e B + p h a g e + 1 d r o p s u s c . b a c t . 2 2 C
Su p e r n a t a n t , c e n t r i f u g e d
9 . Ti s s u e A, s t e r i l i z e d + p h a g e 2 7 2 1 _
1 0 . Ti s s u e A, s t e r i l i z e d + p h a g e + b a c t . 2 4 5 0 0
1 1 . Ti s s u e A, s t e r i l i z e d , d i l u t e d i + p h a g e 3 3 3 1 -
1 2 . Ti s s u e A, s t e r i l i z e d , d i l u t e d + p h a g e + b a c t . 2 1 1 , 3 0 0 -
1 3 . Ti s s u e n o t s t e r i l i z e d + p h a g e 2 6 2 1 -
1 4 . Ti s s u e n o t s t e r i l i z e d + p h a g e + b a c t . 2 8 2 4 0
1 5 . Ti s s u e n o t s t e r i l i z e d , d i l u t e d I + p h a g e 2 6 2 5 -
1 6 . Ti s s u e n o t s t e r i l i z e d , d i l u t e d I + p h a g e + b a c t . 2 4 7 5 0 -
No s . 3 t o 8 w e r e i n c u b a t e d o v e r n i g h t p r i o r t o a d d i t i o n o f p h a g e .
No s . 9 t o 1 6 n o t i n c u b a t e d .
*
C- c o n f l u e n t p l a q u e s , l e a v i n g p l a t e c o m p l e t e l y c l e a r .
TABLE 3
In a c t i v a t i o n o f P. p h a s e o l i c o l a p h a g e b y c r u s h e d b e a n s
BEAN CRUSHED r N PLAQUE
COUNT I
0 . 2 x L
SAMPLE W ARING BLENDER TREATMENT ALTER
CRUSHING
O
h r 3
h r
6 h r
1 5 m i n u t e s Su p e r n a t a n t + p h a g e 3 9 3 2 1 8
Ag i t a t e d s a m p l e + p h a g e 2 4 1 4 1 6
1 0 m i n u t e s Su p e r n a t a n t + p h a g e 2 0 0 0
Ag i t a t e d s a m p l e + p h a g e 1 2 0 0
2 5 m i n u t e s Su p e r n a t a n t + p h a g e 3 1 3 0 2 4
Ag i t a t e d s a m p l e + p h a g e 4 1 3 7 2 8
1 0 m i n u t e s Su p e r n a t a n t + p h a g e 3 4 3 9 3 6
Ag i t a t e d s a m p l e + p h a g e 3 0 3 0 3 0
Nu t r i e n t b r o t h + p h a g e 3 4 3 3 3 6
Nu t r i e n t b r o t h + p h a g e + b a c t e r i a 3 0 C C
t o b e d e s c r i b e d b e l o w f o r d e t e c t i n g i n t e r n a l i n f e c t i o n o f b e a n s w i t h t h e h a l o
b l i g h t o r g a n i s m s . Th i s n u m b e r o f p a r t i c l e s w a s p u r p o s e l y c h o s e n t o g i v e a n
e a s i l y c o u n t a b l e n u m b e r o f p l a q u e s w i t h o u t r e c o u r s e t o d i l u t i o n s . To a k n o w n
a m o u n t o f c r u s h e d b e a n s a m p l e - 4 m l i n t h e s e p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t s - w a s
6 9 2
[ V OL; . 6 1
INTERNALLY BORNE BACTERIAL INFECTIONS OF SEED
a d d e d 1 m l o f t h e p h a g e s u s p e n s i o n , a n d 0 . 2 - m l a l i q u o t s w e r e r e m o v e d p e r i o d i -
c a l l y f o r p l a q u e c o u n t i n g . Th e r e s u l t s o f s o m e o f t h e s e t e s t s a r e s u m m a r i z e d i n
t a b l e 2 . Ph a g e m u l t i p l i c a t i o n i n b r o t h i n t h e p r e s e n c e o f t h e s p e c i f i c h o s t w a s
r a p i d , a s e x p e c t e d . Th e p r e s e n c e o f b e a n t i s s u e - e v e n t h a t r e m a i n i n g i n t h e
Fi g u r e 1 . Mu l t i p l i c a t i o n o f p h a g e i n g r o u n d b e a n t i s s u e . A. P. p h a s e o l i c o l a p h a g e ,
n u m b e r o f p l a q u e s w h e n p h a g e i n i t i a l l y a d d e d t o s a m p l e c o n t a i n i n g s u s c e p t i b l e c e l l s . B.
P. p h a s e o l i c o l a p h a g e ; n u m b e r o f p l a q u e s 6 h o u r s a f t e r p h a g e a d d e d t o t h i s s a m p l e . C. X
p h a s e o l i p h a g e ; n u m b e r o f p l a q u e s w h e n p h a g e i n i t i a l l y a d d e d t o s a m p l e c o n t a i n i n g s u s -
c e p t i b l e c e l l s . D. X . p h a s e o l i p h a g e ; n u m b e r o f p l a q u e s 6 h o u r s a f t e r p h a g e a d d e d t o t h i s
s a m p l e .
s u p e r n a t a n t a f t e r c e n t r i f u g i n g r e d u c e d t h e r a t e o f m u l t i p l i c a t i o n , w h i c h w a s
e v e n m o r e e x t e n s i v e l y r e d u c e d b y t h e u n c e n t r i f u g e d b e a n t i s s u e . St e r i l i z a t i o n o f
t h e b e a n t i s s u e o v e r c a m e i t s i n h i b i t o r y e f f e c t ( c o m p a r e s e r i e s 1 0 a n d 1 4 ) , a s d i d
d i l u t i o n o f t h e s a m p l e s ( s e r i e s 1 2 a n d 1 6 ) . Se r i e s 7 a n d 8 r e p r e s e n t a s a m p l e o f
b e a n s t h a t w a s s u s p e c t e d o f h a r b o r i n g t h e p a t h o g e n . Th i s s u s p i c i o n w a s s u p -
1 9 5 1 ] 6 9 3
H. KATZNELSON AND M. D. SUTTON
p o r t e d b y t h e f a c t t h a t , w h e n p h a g e w a s a d d e d t o t h e s a m p l e , a s t r i k i n g i n c r e a s e
i n - t h e n u m b e r o f p a r t i c l e s o c c u r r e d ( 2 4 t o 1 , 6 0 0 ) , w h i c h i n c r e a s e w a s f u r t h e r
a u g m e n t e d b y t h e a d d i t i o n o f t h e h o m o l o g o u s b a c t e r i a . Th e i n f l u e n c e o f b e a n
t i s s u e o n p h a g e w a s f u r t h e r d e m o n s t r a t e d w i t h t w o v a r i e t i e s o f b e a n s , e a c h
g r o u n d f o r 5 a n d f o r 1 0 m i n u t e s a n d a l l o w e d t o s e t t l e ( t a b l e 3 ) . W i t h s a m p l e 1 ,
a n i n c r e a s e i n t h e g r i n d i n g t i m e f r o m 5 t o 1 0 m i n u t e s r e s u l t e d i n m a r k e d i n -
h i b i t i o n ( o r a d s o r p t i o n ) o f p h a g e p a r t i c l e s , a p h e n o m e n o n p r o d u c e d , t h o u g h t o
a l e s s e r e x t e n t , a s a r e s u l t o f m e r e l y i n c r e a s i n g t h e a m o u n t o f s u s p e n d e d t i s s u e
( c o m p a r e s u p e r n a t a n t a n d a g i t a t e d s e t s ) . Ho w e v e r , a l l b e a n v a r i e t i e s d o n o t a p -
TABLE 4
In t e r n a l i n f e c t i o n o f b e a n s w i t h P. p h a s e o l i c o l a a s i n d i c a t e d b y m u l t i p l i c a t i o n o f
s p e c i f i c
p h a g e , l y s i s o f i s o l a t e s , a n d p a t h o g e n i c i t y t e s t s
PLAQUE COUNT ( IN 0 . 1 ML) ISOLATES FROM SAMPLES
SAMPLE NUMBER _
0 h r 6 h r Ly s i s w i t h p h a g e Pa t h o g e n i c i t y
RT 1 2 4 1 , 2 0 0 * + +
2 3 3 1 , 5 0 0 + +
3 2 7 Ct + +
4 2 6 C + +
5 2 6 C + +
6 3 2 3 6 _ _
7 5 4 4 6 _ _
8 5 0 1 , 2 0 0 + +
9 4 5 C + +
1 0 4 1 1 , 5 0 0 + +
1 1 1 8 C + +
1 2 5 5 5 2 -
_
1 3 2 2 3 , 2 0 0 + +
1 4 3 2 C + +
In f e c t e d b e a n p o d 1 9 C
Di s e a s e - f r e e s e e d 2 5 3 0
*
Pl a q u e s d i s c e r n i b l e , p e r m i t t i n g r o u g h e s t i m a t e .
t C- c o n f l u e n t p l a q u e s , p l a t e c l e a r .
p e a r t o m a n i f e s t t h e s a m e i n h i b i t i n g e f f e c t , a s t h e r e s u l t s w i t h s a m p l e 2 a t t e s t
( t a b l e 3 ) .
Th e m e t h o d f i n a l l y e v o l v e d c o n s i s t e d o f s u r f a c e - s t e r i l i z i n g 5 0 b e a n s e e d s ,
w a s h i n g i n s t e r i l e w a t e r , a n d g r i n d i n g f o r 5 m i n u t e s i n 2 5 0 m l o f s t e r i l e n u t r i e n t
b r o t h i n a W a r i n g b l e n d e r . Th e m i x t u r e w a s h e l d a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r -
n i g h t , t h e n s h a k e n t h o r o u g h l y , a n d a l l o w e d t o s e t t l e f o r 1 h o u r . Te n m l o f t h e
s u p e r n a t a n t w e r e r e m o v e d a s e p t i c a l l y a n d t r a n s f e r r e d t o a s t e r i l e f l a s k . On e m l
o f a s u i t a b l e d i l u t i o n o f p h a g e , c o n t a i n i n g f r o m 4 , 0 0 0 t o 4 , 5 0 0 f a r t i c l e s , w a s
a d d e d t o t h e f l a s k a n d t h e n 0 . 1 m l w a s r e m o v e d f r o m e a c h f l a s k f o r t h e p l a q u e
c o u n t . Af t e r 5 t o 6 h o u r s , a n o t h e r 0 . 1 - m l a l i q u o t w a s r e m o v e d a n d p l a t e d . As
s h o w n i n t a b l e 2 ( s e r i e s 7 a n d 8 ) , f i g u r e 1 , a n d t a b l e 4 , c e r t a i n b e a n s a m p l e s
y i e l d e d s t r i k i n g i n c r e a s e s i n t h e n u m b e r o f v i r u s p a r t i c l e s . Th i s r e s u l t i s t a k e n
6 9 4
[ V OL. 6 1
INTERNALLY BORNE BACTERIAL INFECTIONS OF SEED
t o i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f t h e s p e c i f i c b a c t e r i a l h o s t , P. p h a s e o l i c o l a , i n t h e s e
s a m p l e s , a n a s s u m p t i o n c o n f i r m e d b y o t h e r m e t h o d s t o b e d i s c u s s e d s h o r t l y .
Pl a q u e s w e r e r e a d i l y d i s c e r n i b l e d e s p i t e t h e f r e q u e n t g r o w t h o f s a p r o p h y t i c
b a c t e r i a t h a t w r e r e o f t e n p r e s e n t i n t h e s a m p l e . It w a s f o u n d t h a t s u c h o r g a n i s m s
c o u l d b e e l i m i n a t e d i n l a r g e m e a s u r e b y c e n t r i f u g i n g t h e s a m p l e ; t h i s d i d n o t
a f f e c t t h e p l a q u e c o u n t . It , m a y b e s e e n i n t a b l e 4 t h a t 1 1 o f t h e 1 4 s a m p l e s
t e s t e d p r e v i o u s l y s h o w e d t h e p r e s e n c e o f t h e s p e c i f i c b a c t e r i a l h o s t c e l l s i n s i d e
t h e b e a n s .
Ea c h o f t h e 1 4 s a m p l e s w a s p l a t , e d f o l l o w i n g r e m o v a l o f t h e 1 0 - m l a l i q u o t f o r
t e s t i n g ; c u l t u r e s w e r e p i c k e d a n d t e s t e d i n n u t r i e n t b r o t h ( 1 0 m l i n 5 0 - m l Er l e n -
m e y e r f l a s k s ) f o r l y s i s w i - i t h t h e P. p h a s e o l i c o l a p h a g e . Ev e r y s a m p l e o f b e a n s
s h o w i n g i n t e r n a l i n f e c t i o n b y t h e p l a q u e c o u n t m e t h o d y i e l d e d c u l t u r e s t h a t
* . . , . . . . . . . . . . . . . .
A i
F'i g o ; t e 2 . P- l t h o g e n i c i t y t e s t s o n i b e a n s e e d l i n g . A. Co n t r o l - u n i n o c u l a t e d . B. In o c u l a t e d
w i t h c u l t u r - e n o t l y - s e d b y P. p h a s e o l i c o l a p h a g e . C. In o c u l a t e d w i t h p h a g e - r e s i s t a n t s t r a i n
i s o l a t e d f r o m s e c o n d a r y
g r o w t h i n a l y s e d c u l t u i e o f P. p h a s e o l i c o l a . D. In o c u l a t e d
w i t h
a c u l t u r e
s u s c e p t i b l e t o P. p h a s e o l i c o l a
p h i a g e .
w e r e l y s e d b y t h i s p h a g e , w h e r e a s n o n e o f t h e 3 r e m a i n i n g ( n e g a t i v e ) s a m p l e s
y i e l d e d a n y s u s c e p t i b l e c u l t u r e s . Re p r e s e n t a t i v e c u l t u r e s f r o m a l l s a m p l e s Aw e r e
i n o c u l a t e d i n t o b e a n s e e d l i n g s i n t h e g r e e n h o u s e , a n d o n l y t h e p h a g e - s u s c e p t i b l e
c u l t u r e s f r o m t h e 1 1 s a m p l e s s h o w i n g t h e p r e s e n c e o f h a l o b l i g h t ( t a b l e 4 ) p r o -
d u c e d d i s e a s e a m a r k e d w i l t i n g o f t h e p l a n t s a s i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 2 .
W h e n t h e f o r e g o i n g t e s t s w e r e r e p e a t e d , s o m e o f t h e p o s i t i v r e s a m p l e s d i d n o t
g i v e a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f v i r u s p a r t i c l e s . It , w v a s c o n c l u d e d t h a t
l o t s o f s e e d f r o m w h i c h t h e s e s a m p l e s w e e r e t a k e n w e r e n o t h e a v i l y i n f e c t e d a n d
c o n s e ( u e n t l y a l a r g e r n u m b e r o f s e e d s w o u l d h a v e t o b e u s e d . Fo u r l o t s o f 5 0
b e a n s e a c h f o r a g i v e n s a m p l e w e r e t h e r e f o r e t e s t e d w v i t h r e s u l t s a s g i v e n i n
t a b l e 5 . Sa m p l e s RT4 a n d RT5 w e r e a p p a r e n t l y s o m e w h a t m o r e h e a v i l y i n f e c t e d
t h a n s a m p l e RTJ 1 , w h e r e a s s a m p l e s RT6 a n d RT7 w e r e n o t i n f e c t e d , a c c o r d i n g
1 9 5 1 ] 1 6 9 5
H. KATZNELSON AND M. D. SUTTON
t o t h e r e s u l t s o b t a i n e d b y t h i s m e t h o d . In r o u t i n e t e s t i n g , 2 0 0 t o 3 0 0 s e e d s o r
m o r e m a y b e g r o u n d i n b u l k w h e n p o s s i b l e , o r i n s m a l l l o t s , w h i c h m a y t h e n b e
p o o l e d p r i o r t o o r a f t e r i n c u b a t i o n a n d o n l y o n e s a m p l e t a k e n f o r t e s t i n g w i t h
p h a g e , a s i s i n d i c a t e d i n t a b l e 5 .
A s a m p l e o f b e a n s m a y b e v e r y l i g h t l y i n f e c t e d y e t g i v e a p o s i t i v e t e s t Av i t h
p h a g e . Th i s f a c t w a s d e m o n s t r a t e d e x p e r i m e n t a l l y a s f o l l o w v s : Di s e a s e - f r e e s u r -
f a c e - s t e r i l i z e d s e e d s ( 5 0 i n 2 5 0 m l n u t r i e n t b r o t h ) v e r e g r o u n ( d a n d d i v i d e d i n t o
t w o p a r t s , o n e o f w v h i c h ( A) w a s a l l o w e d t o i n c u b a t e o v e r n i g h t a n d t h e o t h e r
( B) d i s t r i b u t e d i n 9 - m l a m o u n t s t o s t e r i l e f l a s k s e a c h o n e o f w h i c h r e c e i v e d 1 m l
o f a s u i t a b l e s u s p e n s i o n o f P. p h a s e o l i c o l a c e l l s o b t a i n e d f r o m a 2 4 - h o u r s l a n t
c u l t u r e . Th e f l a s k s w e r e l e f t o n a l a b o r a t o r y d e s k . On t h e f o l l o w i n g m o r n i n g , A
w a s t r e a t e d a s B a n d a d u p l i c a t e c o n t r o l s e r i e s w i t h n u t r i e n t b r o t h w a s s e t u p .
Al l f l a s k s t h e n r e c e i v e d 1 m l o f a p h a g e s t o c k s u s p e n s i o n c o n t a i n i n g a b o u t 4 , 5 0 0
TABLE 5
Sa m p l i n y o f b e a n s i n r e l a t i o n t o t h e d e t e c t i o n t o f i n t e r n a l i n f e c t i o n w i t h h a l o b l i g h t b y t h e
p h a g e p l a q u i e c o u n t m t i e t h o d
SAMPLE
BEAN LOT PLAQUTE COUNT
_h r _. _ 2 3 4 Co m p o s i t e
h r
RT 4 0 2 6 4 6 2 8 2 0 2 3
6 C 4 1 C 1 5 C
RIT 5 0 7 7 3 4 3 7 2 8 2 2
6 8 1 C C C C
RT 6 0 4 8 4 6 3 6 3 2 4 2
6 4 8 5 2 4 7 3 6 5 2
I{ T 7 0 5 0 6 0 5 1 5 4 5 4
6 6 7 5 6 6 5 4 6 5 0
It T1 1 T 0 4 1 3 5 3 4 1 8 3 7
6 4 0 4 6 3 4 C 4 5 0
RT 1 2 0 2 7 3 5 2 8 4 5 2 8
6 3 2 4 0 2 0 5 2 3 8
p a r t i c l e s p e r m l . Fr o m e a c h f l a s k 0 . 1 m l w a s r e m o v e d a t o n c e f o r a p l a q u e c o u n t ,
a n d f u r t h e r s a m p l e s w e r e r e m o v e d a t 1 , 2 , 4 , 6 , a n d 1 2 h o u r s t h e r e a f t e r . Th e d a t a
o b t a i n e d a r e s h o w Nn i n t a b l e 6 .
Af t e r 1 h o u r , a s t r i k i n g i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f p a r t i c l e s o c c u r r e d i n t h e
f l a s k s t h a t h a d a n i n i t i a l c o u n t o f 3 0 , 0 0 0 , 0 0 0 b a c t e r i a p e r m l , a n d a s i g n i f i c a n t
i n c r e a s e i n t h o s e t h a t h a d 3 , 0 0 0 , 0 0 0 ; a f t e r 2 h o u r s , a n i n c r e a s e o c c u r r e d a l s o i n
t h e f l a s k t h a t h a d a n i n i t i a l c o u n t o f 3 0 0 , 0 0 0 c e l l s p e r m l . Af t e r 1 2 h o u r s , f l a s k s
w i t h a n i n i t i a l c o u n t o f 3 0 c e l l s p e r m l g a v e a n a p p r e c i a b l e i n c r e a s e i n p l a q u e
c o u n t . Ap p a r e n t l y a s u f f i c i e n t b u i l d - u p o f b a c t e r i a l c e l l s w a s r e q u i r e d b e f o r e a n y
d e t e c t a b l e p h a g e i n c r e a s e o c c u r r e d , p e r h a p s b e c a u s e o f t h e f a i l u r e o f t h e v i r t u s
p a r t i c l e s t o c o m e i n t o c o n t a c t w i t h t h e c e l l s w h e n t h e s e w e r e r e l a t i v e l y f e w i n
n u m b e r . Es s e n t i a l l y s i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t h f r a c t i o n A o f t h e g r o u n d
b e a n s a m p l e , e x c e p t t h a t t h e i n c r e a s e i n n u m b e r o f v i r u s p a r t i c l e s w a s m a r k e d l y
6 9 6
[ V OL. 6 1
INTERNALLY BORNE BACTERIAL INFECTIONS OF SEED
d e l a y e d . W h e n b a c t e r i a a n d b e a n t i s s u e w e r e i n c u b a t e d t o g e t h e r o v e r n i g h t p r i o r
t o t h e a d d i t i o n o f t h e p h a g e ( a s i n f r a c t i o n B) , t h e r e w a s s t i l l e v i d e n c e o f i n h i b i -
t i o n o f p h a g e m u l t i p l i c a t i o n b y t h e b e a n t i s s u e , b u t t h e i n c r e a s e i n p l a q u e c o u n t
w a s d i s t i n c t l y m o r e r a p i d t h a n i n f r a c t i o n A, o w i n g
y e r y
l i k e l y t o t h e l a r g e r
TABLE 6
Ph a g e m u l t i p l i c a t i o n i n b r o t h a n d i n c r u s h e d b e a n s a s a f f e c t e d b y t i m e a n d s i z e o f i n o c u l u m *
NUTRIENT BROTH BACTERIA AND
PHAGE ADDESD AT SAME TIM
0
3 0
4 4
4 5
3 8
2 6
2 2
2 5
2 1
2 0
C
2 5 0
5 8
4 8
2 5
2 7
3 5
3 2
4 1
2
C
C
1 6 6
3 4
2 2
2 0
2 5
2 8
4 0
4
C
C
1 3 1
3 8
3 6
2 5
3 1
3 0
6
C
C
C
1 , 3 5 0
8 3
4 8
3 7
4 8
4 2
1 2
C
C
C
C
C
9 6 0
7 4
5 2
5 0
BEAN TISSUZ FRACTION A,
INCUBATED OV ERNIGHT, THEN
BACTERIA AND PHAGE ADDED
AT SAME TINE
0
3 5
4 5
2 8
2 4
2 7
2 6
2 2
2 5
2 4
9 5
4 3
3 3
4 4
3 3
2 2
3 1
2 7
3 2
Ho u r s a f t e r a d d i t i o n o f p h a g e
2
3 7 0
3 5 2
8 5
3 3
2 8
2 6
2 3
3 0
4 0
4
1 , 5 0 0
1 , 4 5 0
2 8 0
3 6
2 5
2 0
3 1
2 1
3 4
6
C
C
C
2 2 5
7 0
3 1
3 0
4 9
3 1
1 2
I01 I
2
C
C
C
C
1 2 0
3 0
3 0
3 1
3 5
2 6
2 4
3 0
3 1
2 3
2 6
2 5
2 6
4 4
2 2
2 6
2 6
2 0
3 6
3 3
3 4
3 7
4 8
6 0 0
4 5 1
3 7 0
2 4 8
1 3 8
7 0
2 5
2 5
3 8
TABLE 7
De t e c t i o n o f i n t e r n a l i n f e c t i o n o f b e a n s w i t h X . p h a s e o l i b y t h e p h a g e p l a q u e c o u n t
t e c h n i q u e
0
3 4
4 4
1 , 8 0 0
3 1
3 5
4 0
5 0
3 1
2 0
4 1
4 0
3 0
2 1
2 8
2 9
3 4
2 1
n u m b e r o f b a c t e r i a i n t h e f o r m e r s a m p l e a s a r e s u l t o f o v e r n i g h t i n c u b a t i o n . It
a p p e a r s a l s o t h a t a s a m p l e o f g r o u n d b e a n s c o n t a i n i n g i n i t i a l l y a s f e w a s 3 c e l l s
p e r m l m i x t u r e w o u l d s t i l l g i v e a p o s i t i v e r e s u l t b y t h e p l a q u e c o u n t m e t h o d . De -
t e c t i o n o f t h e b a c t e r i u m w o u l d t h e r e f o r e a p p e a r p o s s i b l e e v e n t h o u g h o n l y o n e
b e a n i n t h e s a m p l e g r o u n d w a s i n f e c t e d .
BEAN TISSUE FRACTION B,
BACTERA ADDED, INCUBATD
OV RCNIGHT, PHAGE ADDED
BACTERIA
PER ML
3 0 , 0 0 0 , 0 0 0
3 , 0 0 0 , 0 0 0
3 0 0 , 0 0 0
3 0 , 0 0 0
3 , 0 0 0
3 0 0
3 0
3
0
6
C
C
C
C
C
C
4 6 0
8 1
4 0
*
P. p h a s e o l i c o l a p h a g e u s e d .
1 2
C
C
C
C
C
C
C
C
4 7
C
C
C
C
8 9 0
2 1 0
3 5
3 2
3 2
SAW PLE
BEAN LOT
RT 3
x 1
X 2
X 3
X 4
PLAQUE COUNT
AT
h r
0
6
0
6
0
6
0
6
0
6
3 6
2 6
6 6
8 5
4 0
3 0
2 , 4 0 0
2 , 5 0 0
2 5
1 6
2
3 1
3 9
5 6
5 6
3 5
2 0
3 6
3 8
3 1
2 5
1 9 5 1 ]
6 0 9 7
H. KATZNELSON AND M. D. SUTr ON
Pr e l i m i n a r y t r i a l s w i t h t h i s m e t h o d o n b e a n s s u s p e c t e d o f h a r b o r i n g t h e c o m -
m o n b l i g h t o r g a n i s m ( X . p h a s e o l i ) w e r e a l s o m a d e . Be a n l o t RT3 a n d f o u r o t h e r
l o t s w e r e t e s t e d b y c r u s h i n g 3 o r 4 s a m p l e s o f 5 0 s e e d s f r o m e a c h l o t i n 2 5 0 m l
n u t r i e n t b r o t h a n d p r o c e e d i n g a s o u t l i n e d a b o v e , e x c e p t t h a t X . p h a s e o l i p h a g e
w a s u s e d . On e m l o f a s u s p e n s i o n o f X . p h a s e o l i c e l l s f r o m a 2 4 - h o u r s l a n t c u l t u r e
w a s u s e d i n t h e s e t e s t s f o r t h e p l a q u e c o u n t . Th e r e s u l t s i n t a b l e 7 a n d i n f i g u r e 1
c o n f i n n t h e p r e v i o u s o b s e r v a t i o n t h a t s a m p l e RT3 c o n t a i n s a s u s c e p t i b l e o r -
g a n i s m , c o n s i d e r e d t o b e X . p h a s e o l i .
An i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n w a s m a d e r e g a r d i n g s a m p l e X - 3 . On e o f t h e b a t c h e s
o f s e e d f r o m t h i s s a m p l e s h o w e d a v e r y l a r g e n u m b e r o f p l a q u e s e v e n a t t h e
i n i t i a l p l a t i n g , a r e s u l t i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f a p h a g e i n t h i s s a m p l e t h a t w a s
a c t i v e o n X . p h a s e o l i . Si n c e c o n t r o l a l i q u o t s o f a l l c r u s h e d s e e d w e r e a l w a y s
p l a c e d i n t h e r e f r i g e r a t o r p r i o r t o o v e r n i g h t i n c u b a t i o n , i t w a s p o s s i b l e t o d e -
t e r m i n e t o w h a t e x t e n t t h e b e a n s w e r e c o n t a m i n a t e d w i t h p h a g e . It w a s f o u n d
t h a t 0 . 2 m l o f t h i s m a t e r i a l y i e l d e d 2 0 p l a q u e s . Th e i n c r e a s e i n n u m b e r o f t h e s e
p l a q u e s a f t e r o v e r n i g h t i n c u b a t i o n m a y b e t a k e n a s e v i d e n c e o f m u l t i p l i c a t i o n
o n a b a c t e r i a l h o s t c l o s e l y r e l a t e d t o , i f n o t i d e n t i c a l w i t h , X . p h a s e o l i . Se v e r a l
s a m p l e s o f b e a n s c o n t a i n i n g t h e h a l o b l i g h t o r g a n i s m , P. p h a s e o l i c o l a , a l s o y i e l d e d
p h a g e s t h a t w e r e a c t i v e o n t h i s o r g a n i s m a n d t h a t i n c r e a s e d m a r k e d l v d u j r i n s r
t h e o v e r n i g h t i n c u b a t i o n p e r i o d .
DISCUSSION
Th e i s o l a t i o n o f s p e c i f i c p h a g e s f o r P. p h a s e o l i c o l a a n d X . p h a s e o l i h a s m a d e
p o s s i b l e t h e r a p i d d e t e c t i o n o f i n t e r n a l l y b o r n e i n f e c t i o n o f b e a n s w i t h t h e s e o r -
g a n i s m s , w h i c h c a u s e h a l o a n d c o m m o n b l i g h t , r e s p e c t i v e l y . Th i s w a s d o n e f i r s t
b y d i r e c t i s o l a t i o n f r o m g r o u n d , ' i n c u b a t e d b e a n t i s s u e f o l l o w e d b y t e s t i n g o f t h e
i s o l a t e s f o r s u s c e p t i b i l i t y t o t h e t w o p h a g e s . In o r d e r t o e l i m i n a t e t h e s e t w o
s t e p s ( i s o l a t i o n a n d t e s t i n g f o r l y s i s ) a p h a g e p l a q u e c o u n t m e t h o d w a s e v o l v e d
a n d h a s b e e n d e s c r i b e d . Ho w e v e r , a s w i t h o t h e r m e t h o d s , c e r t a i n d i f f i c u l t i e s
m a y b e e n c o u n t e r e d i n r e g a r d t o t h e p r a c t i c a l a p p l i c a t i o n o f t h e t e c h n i q u e .
Of p r i m e i m p o r t a n c e i s t h e i s o l a t i o n o f a p h a g e s p e c i f i c t o t h e s p e c i e s o f b a c -
t e r i a i n v o l v e d , a n d p r e f e r a b l y o n e t h a t l y s e s a l l o r m o s t o f t h e s t r a i n s o f t h e
s p e c i e s . A p h a g e s p e c i f i c f o r o n l y o n e s t r a i n o f a p a r t i c u l a r s p e c i e s w o u l d n o t b e
o f a n y u s e , e x c e p t f o r t h e d e t e c t i o n o f t h a t p a r t i c u l a r s t r a i n . So f a r i n t h i s i n -
v e s t i g a t i o n , t h e P. p h a s e o l i c o l a p h a g e h a s l y s e d e v e r y s t r a i n o f t h i s o r g a n i s m t h a t
h a s b e e n t e s t e d . Th e X . p h a s e o l i p h a g e i s e v e n m o r e s p e c i f i c . It h a s l y s e d a l l
s t r a i n s o f t h i s o r g a n i s m , b u t h a s b e e n e n t i r e l y i n a c t i v e t o w a r d s t h e t w o v a r i e t i e s
X . p h a s e o l i v a r . f u s c a n s a n d v a r . s o j e n s i s . Th e s e t w o v a r i e t i e s d i f f e r f r o m X .
p h a s e o l i o n l y i n r e s p e c t t o h o s t p a t h o g e n i c i t y . Th e d i f f i c u l t y o f i s o l a t i n g a s p e c i e s -
s p e c i f i c p h a g e m a y b e r e d u c e d t o s o m e e x t e n t b y c o m b i n i n g v a r i o u s s t r a i n - s p e c i f i c
p h a g e s a n d b y m a k i n g u s e o f t h e p o o l e d p h a g e f o r t h e d e t e c t i o n o f t h e p r e s e n c e
o f t h e s p e c i e s i n a n y s a m p l e .
An o t h e r d i f f i c u l t y i s t h e p o s s i b l e o c c u r r e n c e o f r e s i s t a n t s t r a i n s i n a s a n p l e
o f s e e d , t h e r e b y g i v i n g a f a l s e n e g a t i v e . Th i s o b s t a c l e m a y b e o v e r c o m e t o s o m e
e x t e n t b y t h e u s e o f a p o o l e d p h a g e s t o c k , a s i n d i c a t e d a b o v e . It i s p o s s i b l e , o f
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[ V OL. 6 1
INTERNALLY BORNE BACTERIAL INFECTIONS OF SEED
c o u r s e , t h a t s u s c e p t i b l e a s w e l l a s r e s i s t a n t c e l l s m a y b e p r e s e n t i n a s e e d s a m p l e ,
w h i c h w o u l d t h e n b e n o d r a w b a c k t o t h e a p p l i c a t i o n o f t h e t e c h n i q u e . W i t h t h e
b e a n s a m p l e s t e s t e d f o r t h e p r e s e n c e o f h a l o b l i g h t ( P. p h a s e o l i c o l a ) , t h e p r o b l e m
o f r e s i s t a n c e d i d n o t a r i s e , a s e v e r y s a m p l e t h a t g a v e a p o s i t i v e r e a c t i o n b y t h e
p l a q u e c o u n t m e t h o d y i e l d e d p h a g e - s u s c e p t i b l e p a t h o g e n i c c u l t u r e s b u t n o
p h a g e - r e s i s t a n t p a t h o g e n i c c u l t u r e s ; a n d e v e r y s a m p l e t h a t g a v e n o r e a c t i o n
w i t h t h i s p r o c e d u r e y i e l d e d n e i t h e r p h a g e - s u s c e p t i b l e n o r p h a g e - r e s i s t a n t p a t h o -
g e n i c c u l t u r e s .
Th e p r e s e n c e i n t h e s e e d o f a p h a g e a c t i v e o n t h e b a c t e r i a l p l a n t p a t h o g e n
b e i n g s t u d i e d m a y c a u s e c o n f u s i o n . W h e r e v e r t h e n u m b e r o f p l a q u e s a t t h e i n -
i t i a l p l a t i n g w a s g r e a t l y i n e x c e s s o f t h o s e a d d e d ( s e e X 3 - 1 , t a b l e 7 ) , t h e p r e s -
e n c e o f a n e w p h a g e w a s s u s p e c t e d . V e r i f i c a t i o n o f i t s p r e s e n c e w a s m a d e b y
p l a t i n g t h e b e a n t i s s u e ( a s a m p l e o f w h i c h w a s a l s o r e m o v e d a s e p t i c a l l y t o t h e
r e f r i g e r a t o r b e f o r e o v e r n i g h t i n c u b a t i o n ) a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . Si n c e a s t r i k i n g
i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f p a r t i c l e s u s u a l l y o c c u r r e d d u r i n g t h e o v e r n i g h t i n -
c u b a t i o n , i t m a y b e c o n c l u d e d t h a t t h e s p e c i f i c b a c t e r i a m u s t h a v e b e e n p r e s e n t
t o p e r m i t t h e i n c r e a s e . Su c h p h a g e s s h o u l d b e i s o l a t e d a n d t h e i r s p e c i f i c i t y d e -
t e r m i n e d t o r u l e o u t t h e c h a n c e o f t h e i r b e i n g p o l y v a l e n t a n d c a p a b l e o f r e -
p r o d u c i n g o n o t h e r s p e c i e s o f p a t h o g e n i c o r n o n p a t h o g e n i c b a c t e r i a ( Fu l t o n ,
1 9 5 0 ) .
V a r i o u s o t h e r p r o b l e m s r e l a t i n g t o t h e a p p l i c a t i o n o f t h i s t e c h n i q u e m a y a r i s e ,
d e p e n d i n g o n t h e n a t u r e o f t h e p h a g e , t h e b a c t e r i a l s p e c i e s i n v o l v e d , t h e d e g r e e
o f c o n t a m i n a t i o n o f m a t e r i a l s s u s p e c t e d o f h a r b o r i n g t h e s u s c e p t i b l e b a c t e r i a l
t h e n a t u r e o f t h e s u b s t r a t e c o n t a i n i n g t h e p a t h o g e n i c o r g a n i s m s , t h e m e d i u m
u s e d f o r p l a q u e c o u n t s , a n d t h e p e r i o d o f p r e - a n d p o s t - s a m p l i n g i n c u b a t i o n . Th e
n u m b e r o f p h a g e p a r t i c l e s a d d e d t o a s a m p l e i s - a r b i t r a r y ; s u f f i c i e n t s h o u l d b e
u s e d t o p e r m i t r e a d y c o n t a c t w i t h s u s c e p t i b l e c e l l s i n t h e s a m p l e a n d t o o v e r -
c o m e i n h i b i t i o n o r a d s o r p t i o n b y t h e c o n s t i t u e n t s o f t h e s a m p l e b u t n o t s o m a n y
a s w o u l d n e c e s s i t a t e t h e d i l u t i o n o f t h e s a m p l e p r i o r t o m a k i n g p l a q u e c o u n t s .
In t h e m e t h o d o u t l i n e d a b o v e , 0 . 1 m l o f t h e p h a g e - b e a n m i x t u r e g a v e f r o m 2 0
t o 5 0 p l a q u e s p e r p l a t e , a n d f r o m 3 0 t o 6 0 t i m e s t h a t n u m b e r a f t e r 5 o r 6 h o u r s ,
i f h o s t c e l l s w e r e p r e s e n t . Th e s a m p l i n g p e r i o d ( 0 t o 6 h o u r s ) i s a l s o a r b i t r a r y ,
t h e l e n g t h o f t i m e d e p e n d i n g o n t h e r a t e o f m u l t i p l i c a t i o n o f t h e p h a g e , t h e
n u m b e r o f h o s t c e l l s p r e s e n t ( t a b l e 6 ) , a n d t h e d e g r e e o f c o n t a m i n a t i o n o f t h e
s a m p l e w i t h v a r i o u s u n r e l a t e d b a c t e r i a . A s h o r t c o n t a c t p e r i o d b e t w e e n p h a g e
a n d s a m p l e i s d e s i r a b l e , a s o v e r g r o w t h b y t h e s e u n r e l a t e d o r g a n i s m s w o u l d n o t
b e s e r i o u s . By c e n t r i f u g a t i o n , b y t h e u s e o f s u i t a b l e i n h i b i t o r s , o r b y i n c r e a s i n g
t h e v o l u m e o f c e l l s o f t h e h o m o l o g o u s b a c t e r i a u s e d w h e n p l a t e s a r e p o u r e d f o r
p l a q u e c o u n t s , t h e n u m b e r s o f s u c h o r g a n i s m s m a y b e r e d u c e d a p p r e c i a b l y . A
s e l e c t i v e p l a t i n g m e d i u m f o r p l a q u e c o u n t o r a s e l e c t i v e l i q u i d m e d i u m f o r o v e r -
n i g h t i n c u b a t i o n o f t h e m a t e r i a l b e i n g s t u d i e d p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f p h a g e ,
w o u l d b e p a r t i c u l a r l y a d v a n t a g e o u s , a s w o u l d a l s o b e a s h o r t i n c u b a t i o n p e r i o d
f o r t h i s m a t e r i a l . On t h e o t h e r h a n d , a s u f f i c i e n t l y l o n g i n c u b a t i o n o f t h e m a -
t e r i a l b e f o r e t h e a d d i t i o n o f t h e p h a g e i s v e r y n e c e s s a r y , e s p e c i a l l y w i t h s a m p l e s
t h a t a r e n o t h e a v i l y l o a d e d w i t h t h e d e s i r e d b a c t e r i a . Al s o n e c e s s a r y i s a p h a g e -
1 9 5 1 ]
6 9 9
H. KATZNELSON AND M. D. SUTTON
s a m p l e c o n t a c t p e r i o d s u f f i c i e n t l y l o n g t o g i v e a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e n u m b e r
o f v i r u s p a r t i c l e s .
In a p p l y i n g t h e m e t h o d d e s c r i b e d a b o v e t o t h e d e t e c t i o n o f i n t e r n a l l y b o r n e
i n f e c t i o n o f s e e d ( a s w i t h b e a n b l i g h t s ) , i t i s p r o p o s e d t o a d d a m i x t u r e o f X .
p h a s e o l i a n d P. p h a s e o l i c o l a p h a g e s t o t h e i n c u b a t e d m a t e r i a l a n d m a k e p l a q u e
c o u n t s i n s e p a r a t e p l a t e s c o n t a i n i n g t h e d i f f e r e n t t e s t o r g a n i s m s . By t h i s m e a n s ,
a s a m p l e o f b e a n s f r o m a n u n k n o w n s o u r c e c o u l d b e t e s t e d r o u t i n e l y f o r e i t h e r
c o m m o n o r h a l o b l i g h t a t t h e s a m e t i m e . A m o r e g e n e r a l a p p l i c a t i o n o f t h i s
p r o c e d u r e m i g h t b e , f o r e x a m p l e , i n t h e d e t e c t i o n o f t h e p r e s e n c e o f c e r t a i n t y -
p h o i d s t r a i n s i n s u s p e c t e d m a t e r i a l b y p o o l i n g a n u m b e r o f s t r a i n - s p e c i f i c p h a g e s
f o r t h i s o r g a n i s m . Su c h a t e s t m a y b e p l a c e d o n a s e m i q u a n t i t a t i v e b a s i s b y
d i l u t i n g t h e m a t e r i a l t o b e t e s t e d p r i o r t o t h e p r e l i m i n a r y i n c u b a t i o n .
ACKNOW LEDGMENT
Th e a u t h o r s a r e g r e a t l y i n d e b t e d t o Dr s . W . H. Bu r k h o l d e r , W . A. F. Ha g -
b o r g , H. R. Th o m a s , H. H. Th o r n b e r r y , a n d S. S. Iv a n o f f f o r c u l t u r e s o f t h e
p h y t o p a t h o g e n i c b a c t e r i a u s e d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n .
SUMMARY
Sp e c i f i c p h a g e s f o r Ps e u d o m w n a s p h a s e o l i c o l a a n d X a n t h o m o n a s p h a s e o l i h a v e
b e e n i s o l a t e d f r o m a m i x t u r e o f s o i l , c o m p o s t , a n d s e w a g e . Th e y w e r e f o u n d t o
p r o d u c e t y p i c a l p l a q u e s a n d t o b e s t a b l e f o r m a n y m o n t h s i n t h e r e f r i g e r a t o r .
Th e s e p h a g e s h a v e b e e n u s e d s u c c e s s f u l l y i n d e t e c t i n g i n t e r n a l l y b o r n e i n f e c t i o n
o f b e a n s e e d b y d i r e c t i s o l a t i o n f r o m g r o u n d , i n c u b a t e d b e a n t i s s u e , f o l l o w e d
b y d e t e r m i n a t i o n o f t h e s u s c e p t i b i l i t y o f t h e i s o l a t e s t o t h e s e p h a g e s .
To e l i m i n a t e t h e n e e d f o r i s o l a t i o n a n d t e s t i n g f o r l y s i s , a r a p i d p h a g e p l a q u e
c o u n t t e c h n i q u e w a s d e v e l o p e d . Th e m e t h o d c o n s i s t s o f g r i n d i n g s u r f a c e - s t e r i -
l i z e d b e a n s ( 5 0 s e e d s i n 2 5 0 m l n u t r i e n t b r o t h ) f o r 5 m i n u t e s i n a W a r i n g b l e n d e r
a n d i n c u b a t i n g t h e m i x t u r e o v e r n i g h t . Ne x t m o r n i n g , 1 0 m l o f t h e s u p e r n a t a n t
i n t h e j a r a r e r e m o v e d t o a s t e r i l e f l a s k a n d a k n o w n n u m b e r o f v i r u s p a r t i c l e s
a r e a d d e d . Sa m p l e s f o r p l a q u e c o u n t s a r e t a k e n i m m e d i a t e l y a n d 6 h o u r s l a t e r .
If t h e h o m o l o g o u s o r g a n i s m s a r e p r e s e n t i n t h e o r i g i n a l b e a n s a m p l e , a s t r i k i n g
i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f p h a g e p a r t i c l e s o c c u r s . By t h i s m e t h o d , 1 1 o u t o f 1 4
s a m p l e s o f b e a n s w e r e s h o w n t o c o n t a i n P. p h a s e o l i c o l a , c a u s a l o r g a n i s m o f h a l o
b l i g h t . By c u l t u r e i s o l a t i o n s f r o m a l l s a m p l e s i t w a s s h o w n t h a t o n l y t h e 1 1
s a m p l e s t h a t g a v e p o s i t i v e r e a c t i o n s w e r e p a t h o g e n i c t o b e a n s e e d l i n g s ; n o n e o f
t h e o t h e r 3 s a m p l e s y i e l d e d e i t h e r p h a g e - s u s c e p t i b l e o r p h a g e - r e s i s t a n t p l a n t -
p a t h o g e n i c s t r a i n s .
Be a n t i s s u e e x e r t e d a m e a s u r a b l e i n h i b i t o r y e f f e c t o n t h e P. p h a s e o l i c o l a
p h a g e .
Fo r a t e s t o f s e e d t h a t c a r r i e s o n l y a l o w p e r c e n t a g e o f i n f e c t i o n , a l a r g e r
s a m p l e t h a n t h a t i n d i c a t e d a b o v e i s r e q u i r e d . Th e s a m p l e m a y b e c o m m i n u t e d
i n s m a l l l o t s a n d p o o l e d , e i t h e r b e f o r e o r a f t e r o v e r n i g h t i n c u b a t i o n , t o y i e l d
o n l y o n e c o m p o s i t e s a m p l e f o r p h a g e t e s t i n g .
7 0 0
[ V OL. 6 1
1 INTERNALLY BORNE BACTERIAL INFECTIONS OF SEED
By t h e m e t h o d h e r e d e s c r i b e d , t h e p r e s e n c e o f a s f e w a s 3 b a c t e r i a p e r m l o f
g r o u n d b e a n t i s s u e m a y b e d e t e c t e d a f t e r t h i s m a t e r i a l h a s b e e n i n c u b a t e d o v e r -
n i g h t .
Pr e l i m i n a r y t e s t s i n d i c a t e t h a t t h i s m e t h o d m a y b e a p p l i e d a l s o t o t h e d e -
t e c t i o n o f X . p h a s e o l i .
Th e s a m e m e t h o d w o u l d a p p e a r a p p l i c a b l e t o t h e d e t e c t i o n o f a n y b a c t e r i a l
s p e c i e s o r s t r a i n f o r w h i c h a s p e c i f i c p h a g e c a n b e i s o l a t e d .
REFERENCES
CRAIGIE, J . 1 9 4 6 Th e s i g n i f i c a n c e a n d a p p l i c a t i o n o f b a c t e r i o p h a g e i n b a c t e r i o l o g i c a l
a n d v i r u s r e s e a r c h . Ba c t . Re v s . , 1 0 , 7 3 - 8 8 .
DELBRYt CK, M. 1 9 4 2 Ba c t e r i a l v i r u s e s ( b a c t e r i o p h a g e s ) . Ad v a n c e s i n En z y m o l . , 2 , 1 - 3 2 .
FULTON, R. W . 1 9 5 0 Ba c t e r i o p h a g e s a t t a c k i n g Ps e u d o m o n a s t a b a c i a n d P. a n g u l a t u m .
Ph y t o p a t h o l o g y , 4 0 , 9 3 6 - 9 4 9 .
KATZNELSON, H. 1 9 5 0 Th e d e t e c t i o n o f i n t e r n a l l y - b o r n e b a c t e r i a l p a t h o g e n s o f b e a n s
b y a r a p i d p h a g e - p l a q u e - c o u n t t e c h n i q u e . Sc i e n c e , 1 1 2 , 6 4 5 .
SMITH, N. R. , GORDON, R. E. , AND CLARK, F. E. 1 9 4 6 Ae r o b i c m e s o p h i l i c s p o r e f o r m i n g
b a c t e r i a . U. S. De p t . Ag r . , Mi s c . Pu b . 5 5 9 .
THOMAS, R. C. 1 9 4 7 Th e b a c t e r i o p h a g e r e a c t i o n f o r i d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a . Oh i o
Ag r . Ex p t . St a . , Te c h . Bu l l . 1 1 .
THORNBERRY, H. H. , BRAUN, A. C. , AND ELROD, R. P. 1 9 4 9 Ap p l i c a t i o n o f t h e b a c t e r i o -
p h a g e - l y s i s t e c h n i q u e f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f p l a n t p a t h o g e n i c b a c t e r i a . Ph y t o p a t h -
o l o g y , 3 9 , 1 5 2 - 1 5 4 .
THORNBERRY, H. H. , EISENSTARK, A. , AND ANDERSON, H. W . 1 9 4 8 St u d i e s o n t h e b a c -
t e r i o p h a g e o f X a n t h o m o n a s p r u n i . Ph y t o p a t h o l o g y , 3 8 , 9 0 7 - 9 1 1 .
1 9 5 1 ] 7 0 1