MTODO DE BIURET

OBJETIVO:
Manejar en el laboratorio el mtodo de Biuret para determinar protenas
Observar y determinar experimentalmente el efecto de pH sobre las protenas de la leche.
GENERALIDADES:
Investigacin bibliogrfica de los estudiantes sobre colorimetra y punto isoelctrico de
protenas
MATERIAL POR EQUIPO:
1 Probeta de 50 ml
2 gradillas
2 pipetas de 10 ml
3 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 1 ml
Tubos de 15 x 100 12 piezas
1 vaso de precipitados de 100 ml
12 tubos de 16 x 15
1 balanza granataria
Papel parafilm para 10 tubos
Si es necesario, 1 embudo y papel filtro
REACTIVOS POR EQUIPO:
Aguas destilada
Solucin de cido actico 0.1 N
Solucin de acetato de sodio 0.1 N
Solucin de casena (concentracin 4 mg/mL)
Reactivo de Biuret 50 mL
APARATOS POR EQUIPO:
1 centrfuga clnica
1 balanza granataria
2 espectrofotmetros
4 celdas
LOS ALUMNOS DEBERN TRAER POR EQUIPO:
6 gr. Aproximadamente de leche en polvo descremada
1 plumn indeleble
Masking tape
Jabn y franela para limpiar
INTRODUCCIN

Colorimetra
La colorimetra es la ciencia que estudia la medida de los colores y que
desarrolla mtodos para la cuantificacin del color, es decir la
obtencin de valores numricos del color.


Espectrofotometra
Se denomina espectrofotometra a la medicin de la
cantidad de energa radiante que absorbe un
sistema qumico en funcin de la longitud de onda,
de la radiacin, y a las mediciones a una
determinada longitud de onda. La principal
aplicacin de la espectrofotometra es la
determinacin de las concentraciones ya sea de
sustancias qumicas o de microrganismos presentes en una solucin.



Como funciona un espectrofotmetro?
El funcionamiento de un espectrofotmetro consiste
bsicamente en iluminar la muestra con luz blanca y
calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra
en una serie de intervalos de longitudes de onda.


Ley de Beer-Lambert
Es una relacin emprica que relaciona la absorcin de luz
con las propiedades del material atravesado. La ley de Beer
tiene en cuenta el rea y el nmero de partculas qu
atraviesa un haz de luz, deduciendo de esto la energa que queda atrapada.
La ley de Beer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad
saliente despus de que en dicho medio se produzca absorcin. La relacin entre ambas
intensidades puede expresarse a travs de la siguiente relacin:


Donde:
I
1
, I
0
: Son las intensidades saliente y entrante respectivamente.
A=lc: Absorbancia, que puede calcularse tambin como:

L: Longitud atravesada por la luz en el medio
C: concentracin del absorbente en el medio.
Es el coeficiente de absorcin:
: Longitud de onda de la luz absorbida.
: Coeficiente de extincin.
La ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una
sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud
del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y , la concentracin de la sustancia puede ser
deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.
Ecuacin de Henderson-Hasselbalch
Formula bioqumica que se utiliza para calcular el pH, de una solucin buffer o tampn, a partir de
Pka (la constante de disociacin del acido) y de las concentraciones de equilibrio del acido o base,
del acido o la base conjugada.

A-] / [AH])



Donde:
S es la sal o especie bsica, y
A es el cido o especie cida
En la ltima ecuacin x puede ser a o b
indistintamente.



Mtodo de Biuret
El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la formacin de un
complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta caracterstico,
que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinacin de un tomo de cobre con
cuatro tomos de nitrgeno. El complejo se basa en la desprotonacin de los grupos amida para formar
el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los
pares de electrones libres de los tomos de oxigeno y de nitrgeno del pptido. Despus de la
adicin del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloracin de Biuret
estable; es necesario considerar la posible influencia de aminocidos libres que forman buffer en
configuracin tris y amoniaco.
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu
2+
y los grupos NH de los enlaces
peptdicos en medio bsico. 1Cu
2+
se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es
directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante
especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y
slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados.










Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptdicos







1. DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO

1.1 Preparacin de una serie de tubos con solucin amortiguadora de acetatos. Coloca en
una gradilla 6 tubos de 15 x 100 rotulados con nmeros consecutivos. Adiciona a cada
tubo las soluciones cido actico y acetato de sodio que
indica la siguiente tabla:

E l volumen final de cada tubo deber ser de 5 ml.

2. PREPARACIN DE LA LECHE
2.1 En un vaso de precipitados de 100 ml disuelve 6 gr. De leche en polvo descremada,
con 50 ml de agua destilada.


NOTA: Aade el agua poco a poco para evitar que se
formen grumos que podran dificultar la obtencin
de una solucin homognea. No debes calentar la
leche para disolverla.





2.2 En un tubo de ensayo de 16 x 150 mm mide 2 ml de leche
rehidratada preparada como se indico anteriormente y
aade 8 ml de agua destilada, agita cuidadosamente por
inversin. Esta muestra de leche diluida (1:5) se ocupara
para llevar a cabo la determinacin del punto isoelctrico
de las protenas.

Tubo Solucin cido
actico 0.1 N
Solucin de sodio
0.1 N
1 5 ml
2 4 ml 1 ml
3 3 ml 2 ml
4 2 ml 3 ml
5 1ml 4 ml
6 5 ml



3. PUNTO ISOELCTRICO
3.1 Aade 1 ml de la leche diluida (1:5) a cada tubo de solucin amortiguadora que
preparaste en el punto 1.









3.2 Mezcla cuidadosamente por inversin todos los tubos y deja reposar por espacio de
10 minutos. Observa el aspecto de las mezclas preparadas. En el tubo donde observes
grumos de leche suspendidos en la solucin te indicar que las protenas de la leche se
han insolubilizado debido al pH de las solucin este pH es denominado punto
isoelctrico.










3.3 Centrifuga los tubos a 2500 r.p.m durante 10 minutos NO SIN ANTES BALANCEARLOS.
Deber pesar lo mismo que aquel tubo que ocupara el lugar opuesto dentro de la
centrifuga.





3.4 Separa el sobrenadante (cuidando de no suspender el
precipitado acumulado en el fondo del tubo) y transfiere
a tubos limpios de 15 x 100 rotulados con el nmero de tubo que les corresponde.

4. DETERMINACIN DE PROTENAS CON EL MTODO DE BIURET
4.1 Coloca en una gradilla 11 tubos de 16 x 150 mm, rotula uno de ellos como nmero
cero, el cual llevara los reactivos para calibrar el espectofotmetro (blanco de
reactivos o testigos) los siguientes 4 tubos llevarn nmeros consecutivos del 1.








4.2 Aade a cada tubo los reactivos para determinar protenas en la curva de calibracin
(tubos I a IV) y en los sobrenadantes (tubos 1 a 6) de acuerdo a lo indicado en la
siguiente tabla:
CURVA DE CALIBRACIN TUBOS PROBLEMA
Tubo 0 I II II IV V 1 2 3 4 5 6
Solucin
Patrn 4
mg/ml
0
ml
0.2
ml
0.4
ml
0.6
ml
0.8
ml
1
ml
0 0 0 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0
Sobrenadante 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5
Agua 1
ml
0.8
ml
0.6
ml
0.4
ml
0.2
ml
0
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
Reactivo de
Biuret (ml)
4.0 ml a todos los tubos

Nota:
Mezcla cuidadosamente cada reactivo y deja en reposo 30 minutos para favorecer el desarrollo de
color. Antes de iniciar tus lecturas en el espectofotmetro, previo calentamiento de 15, es
necesario calibrarlo con el blanco de reactivos a una absorbancia de cero, con una longuitud de
onda de 570 mm.
Si observas alguna turbidez en alguno de los tubos, es conveniente que filtres antes de hacer la
lectura.

5. RESULTADOS

Tubo I II III IV 1 2 3 4 5 6
D.O 0.082 0.121 0.163 0.202 0.048 0.046 0.048 0.050 0.059 0.048
Mg. De
protena
0.8 1.6 2.4 3.2 0.024 0.023 0.024 0.025 0.02 0.024


Protena mg/ml Mg/100ml
Sobrenadante 1 0.025 2.5
Sobrenadante 2 0.024 2.4
Sobrenadante 3 0.049 4.9
Sobrenadante 4 0.024 2.4
Sobrenadante 5 0.04 4
Sobrenadante 6 0.236 2.36


0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Curva de calibracin.
O.D





Bibliografa
Wikipedia la enciclopedia libre (sitio en internet). Ley de Beer- Lambert. Disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/Ley_de_Beer-Lambert
Scrib (sitio en internet). Colorimetra. Disponible en:
http://es.scribd.com/doc/43700968/Colorimetria-copia-3
Wikipedia la enciclopedia libre (sitio en internet). Ecuacin de Henderson- Hasselbalch. Disponible
en: http://es.wikipedia.org/wiki/Ecuaci%C3%B3n_de_Henderson-Hasselbalch
www. Ehu.es (Sitio en internet). Ecuacin de Henderson- Hasselbalch. Disponible
en:http://www.ehu.es/biomoleculas/buffers/hh.htm
www. Biologa Arizona. Edu (sitio en internet). Ecuacin de Henderson- Hasselbalch. Disponible
en:http://www.biologia.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/ph/HH.html
Scrib (sitio en internet). Mtodo de Biuret. Disponible en:
http://es.scribd.com/doc/42854211/43/Metodo-de-Biuret
Chang, R. (1999), Qumica Edicin breve.Ed.McGraw-Hill, Mxico.
Trudy Mc Kee, James R, (2003), Bioqumica la base molecular de la vida. 3Edicin,
McGraw-Hill, Mxico.