SEDIMENTACIJSKE

METODE METODE
centrifugiranje
razdvajanje molekula na temelju razlika u
taloenju pri poveanoj gravitacijskoj sili
precipitacija (taloenje)
Sedimentacijske metode
precipitacija (taloenje)
razdvajanje molekula na osnovi razliite topljivosti
pri promjeni uvjeta u otopini
Teorijske osnove centrifugiranja
centrifugalno polje (G) =
2
r
= kutna brzina rotora (radian/s)
r = polumjer rotora (u cm)
preraunato u okretaje u minuti
ili kao viekratnik gravitacijskog polja Zemlje (xg)

2 okret min
-1
=
60
G
4 (okret min )
-1 2
=

2
3600
r
RCS
4 (okret min )
(1.11 10 )(okret min )
-1 2
-5 -1 2
=

2
3600 980
r
r
Podjela centrifugiranja prema namjeni
analitiko centrifugiranje
mjeri fizikalna svojstva tvari koje sedimentiraju
koeficijent sedimentacije S
jedinica je Svedberg (S) = 10
-13
sec
omjer brzine sedimentacije (v ; dr/dt) i centrifugalne omjer brzine sedimentacije (v ; dr/dt) i centrifugalne
sile (
2
r)
preparativno centrifugiranje
r S v
2
=
r
v
S
2

=
Podjela centrifugiranja prema brzini
ultracentrifuguranje
vie od 20.000 okretaja/min
centrifugiranje niske brzine
manje od 10.000 okretaja/min
centrifugiranje visoke brzine
10.000 do 20.000 okretaja/min
Diferencijalno centrifugiranje
uzorak pravilno rasporeen u cijeloj epruveti
nakon centrifugiranja razdvajamo supernatant i
talog
sastav taloga ovisi o brzini i vremenu
centrifugiranja
uvijek kontaminiran esticama koje su se nalazile u uvijek kontaminiran esticama koje su se nalazile u
dnu epruvete prije poetka centrifugiranja
mala
brzina
vea
brzina
velika
brzina
najvea
brzina
Zonalno centrifugiranje
uzorak se nanosi u tankom sloju na vrh epruvete
ispunjene gradijentom gustoe
pod djelovanjem centrifugalne sile estice
sedimentiraju ovisno o svom obliku i gustoi
centrifugiranje prekidamo prije no to estice centrifugiranje prekidamo prije no to estice
stignu do dna epruvete
Izopikniko centrifugiranje
gradijent obuhvaa cijeli raspon gustoa estica
koje elimo razdvojiti
uzorak je jednoobrazno rasporeen u epruveti
gradijent nastaje pod djelovanjem centrifugalne
sile na estice u mediju (npr. CsCl) sile na estice u mediju (npr. CsCl)
estice se zaustavljaju na mjestu gdje je
njihova gustoa jednaka gustoi medija
Osnovni tipovi rotora za centrifugiranje
sa stalnim kutem
fixed angle
ljuljajue koarice
swinging bucket swinging bucket
uspravni
vertical tube
Centrifuga nije igraka
Precipitacija (taloenje)
razdvajanje molekula na osnovi razliite
topljivosti pri promjeni uvjeta u otopini
usoljavanje (salting in)
poveanje topljivosti proteina dodatkom soli
taloe se pri maloj ionskoj jakosti
isoljavanje (salting out) isoljavanje (salting out)
taloenje povienjem ionske jakosti
taloenje organskim otapalima
taloenje selektivnom denaturacijom
temperatura
afinitetno taloenje
umreavanje specifinim reagensima (protutijela,
lektini)
Topljivost proteina ovisi o pH medija
Isoljavanje (salting out)
uklanjanje proteina iz otopine povienjem
koncentracije soli
razmjerno kompleksna teorija
ureenje molekula vode oko hidrofobnih podruja
kompeticija za slobodne molekule vode
agregacija i precipitacija proteina agregacija i precipitacija proteina
hidrofobno
podruje na
proteinu
molekule vode
Svaki protein se taloi u
uskom rasponu
koncentracije soli.
Taloenje amonij-sulfatom
prednosti amonij-sulfata
dobra topljivost (4 mol/l)
prihvatljiva gustoa zasiene otopine (1.235 g/ml)
prihvatljiva cijena
koncentrira proteine u uzorku
stabilizira veinu proteina stabilizira veinu proteina
nedostaci amonij-sulfata
neprikladan iznad pH 8
natrij-citrat
prisutnost tekih metala (ppm)
EDTA u otopini
potrebno ga je naknadno ukloniti
dijaliza, gel filtracija
Primjer taloenja amonij-sulfatom
raspon %
zasienja
% istalo.
enzima
% istalo.
proteina

obogaenje
prvi
pokuaj
0-40
40-60
60-80
80 supern.
4
62
32
2
25
22
32
21

2.8
1.0
Zakljuak: enzim se veinom istaloio u rasponu 40-60% Zakljuak: enzim se veinom istaloio u rasponu 40-60%
drugi
pokuaj
0-45
45-70
70 supern.
6
90
4
32
38
30

2.4
Zakljuak: dobro iskoritenje (prinos); slabije obogaenje
Trei
pokuaj
0-48
48-65
65 supern.
10
75
15
35
25
40

3.0


Nakon taloenja amonij-sulfatom
potrebno je ukloniti viak iona
dijaliza gel-filtracija
Ione amonij-sulfata nije potrebno uklanjati ako nakon
taloenja planiramo kromatografiju hidrofobnih interakcija.
Taloenje organskim otapalima
sloena teorija
smanjenje aktivnosti vode
slino izoelektrinom taloenju
hidrofobne interakcije manje vane
vee molekule se taloe ranije
svojstva otapala
moraju se potpuno mijeati s vodom moraju se potpuno mijeati s vodom
moraju biti nereaktivna i neotrovna
uglavnom etanol i aceton
pri niskim temperaturama
efikasnije taloenje
manja denaturacija proteina
oprez pri izraavanju postotaka
50 ml H
2
O + 50 ml aceton = 95 ml
Afinitetno taloenje (imunoprecipitacija)
Protein G i protein A
protein G 6,5 kD aprotein iz soja Streptococcus
protein A 40-60 kDa protein iz soja Staphylococcus
povrinski proteini bakterija
velik afinitet vezanja imunoglobulina (Fc regiju)
Table 1. Relative Affinity of Immobilized Protein A for Various Antibody Species and Subclasses1-4.
Note: These conditions may vary somewhat based on the salt concentration of the same sample and/or buffer.
Species/Subclass Protein A Protein G
Human IgG1 High High
Human IgG2 High High
Human IgG3 Mod. High High
Human IgG4 Mod. High High
Rabbit IgG High High
Mouse IgG1 Low High
Mouse IgG2a Moderate High
Mouse IgG2b Mod. High High
Mouse IgG3 High High
Rat IgG1 Low Moderate
Table 2. Recommended Column Volumes for Different Antibody Sources
Antibody Source
Recommended bed volume
per ml starting
material
Immune Serum 2 ml
Tissue Culture Supernatant (with 10% fetal bovine serum) 0.2 ml
Tissue Culture Supernatant (serum-free) 0.01 ml
Ascites Fluid 2 ml
Rat IgG2a Low High
Rat IgG2b Low Low
Rat IgG2c High High
Goat IgG Low High