Universidade Federal do Triângulo Mineiro

Departamento de Ciências Biológicas

Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatório de Prática

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA E DE

MATERIAIS NO LABORATÓRIO DE
MICROBIOLOGIA

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos

Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Preparo de meios de cultura e materiais para elaboração de práticas no laboratório
de Microbiologia.

INTRODUÇÃO
Em um laboratório de microbiologia, é importante que existam equipamentos e
normas para proporcionar segurança e exatidão nos resultados. Para isso, segundo a
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), são precisos equipamentos mínimos
para seu funcionamento adequando, como: estufa bacteriológica, forno de Pasteur,
autoclave, microscópio binocular, centrifugador de baixa rotação, homogeneizador, banho-
maria de pequena dimensão, destilador para água, balança para tarar tubos, balança
comum com uma ou duas casas decimais, bico de Bunsen, geladeira e capela de fluxo
laminar.
Com estes equipamentos, pode-se então dar início à prática de microbiologia, sem
riscos de contaminação e com segurança.

MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os seguintes equipamentos:
Autoclave
Papel pardo
Barbante
Pipetas
Balão de fundo chato
Balança de precisão
Espátula de madeira
Meio de cultura sólido
Água destilada
Placa de Petri
Tubo de ensaio
Bico de Bunsen
Fita crepe termossensível
Ponteiras descartáveis

Preparação dos meios de cultura

Foram preparados os meios de cultura: ágar MacConkey, ágar Mueller-Hinton, ágar
manitol, meio SIM, ágar Uréia e ágar sangue.
Na preparação do ágar MacConkey, preparou-se 500mL de ágar com uma
concentração de 51,5g/L. Para isso, pesou-se 25,75g de meio de cultura sólido em uma
balança de precisão, com o auxílio de uma espátula de madeira. Essa quantidade foi
adicionada a um balão de fundo chato e, então, adicionou-se 500mL de água destilada. O
preparado foi homogeneizado, lacrado e autoclavado. Na retirada, o meio estava a 121ºC,
sendo resfriado em água corrente, até 45ºC. Posteriormente, este foi adicionado a placas
de Petri para solidificação. O bico de bunsen foi utilizado para a retirada de possíveis
bolhas no meio.
Os demais meios de cultura foram preparados á semelhança do anterior, porém
com concentrações diferentes:
Ágar Mueller-Hinton: 500 mL à concentração de 36g/L.
Ágar manitol: 500 mL à concentração de 111g/L.
Meio SIM: 100 mL à concentração de 30g/L.
Ágar Uréia: 95 mL à concentração de 25,2g/L.
Ágar sangue: 800 mL à concentração de 40g/L à 5% de sangue humano

Processo de autoclavagem
Foi utilizado invólucro de papel pardo, para envolver pipetas, ponteiras, tubos de
ensaio e o gargalo do balão de fundo chato. Identificou-se o material com fita crepe
termossensível, o nome dos meios de cultura e os volumes das pipetas. Estes foram
lacrados com barbante. Em seguida adicionou-se água destilada para cobrir a resistência
da autoclave e, posteriormente, inseriu os materiais na autoclave. Esta foi fechada e
ligada durante 30 minutos a 121ºC. Após esse tempo, aguardar a saída do vapor e
diminuição da pressão, abrindo a autoclave e retirando os materiais com cuidado.

http://www2.phoenix.ind.br/?id=474

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a solidificação dos meios, estes são armazenados, podendo ser utilizados
para culturas e em prova bioquímicas para análise de microrganismos.
Os equipamentos autoclavados estarão prontos para serem utilizados, com uma
capacidade de armazenamento de até 15 dias.
Segundo o manual da ANVISA “Segurança e Controle de Qualidade no Laboratório
de Microbiologia Clínica”, todos os materiais e resíduos do laboratório deverão ser
descontaminados antes de serem utilizados e descartados através de um método de
descontaminação aprovado, como a esterilização por calor úmido (autoclave). Outras
medidas para diminuir os riscos no laboratório referem-se, principalmente, a:
Pipetagem: É contra-indicada a pipetagem, com a boca, de material clínico
(sangue, liquor, urina, etc.) ou de suspensões bacterianas. Deve-se utilizar, sempre que
possível, pipetas automáticas ou bulbos de borracha;
Flambagem de Alça Bacteriológica: Deve ser feita através de chama, que deve
estar entre o manipulador e a alça, sempre que for feito a manipulação de material
biológico ou durante transferência de massa bacteriana;
Disseminação de Esporos de Fungos: Ao se trabalhar com fungos, particularmente
os filamentosos, recomenda-se o uso de cabines biológicas.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo:
Atheneu, 2005.

2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São

Paulo: MEDSI, 2001

3. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA: Segurança e Controle de

Qualidade no Laboratório de Microbiologia Clínica. Disponível em:
<www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_2_2004.pdf>. Acesso em: 12 nov.
2009

4. MANUAL DE BIOSSEGURANÇA dos Ambulatórios da Faculdade de Odontologia da

PUCRS. Disponível em: <http://www.pucrs.br/odonto/manual.pdf>. Acesso em: 12 nov.
2009

5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS COM PROVAS BIOQUÍMICAS. Disponível em:

<www.microbiologia.ufba.br/aulas/provas%20bioquimicas.doc>. Acesso em: 12 nov. 2009

6. AUTOCLAVES VERTICAIS. Disponível em:

<http://www.stermax.com.br/manuais/MANUAL_VERTICAIS.pdf>. Acesso em: 12 nov.
2009
 Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Departamento de Ciências Biológicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatório de Prática

COLETA, SEMEADURA E COLORAÇÃO DE GRAM

DE AMOSTRAS CLÍNICAS

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos

Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Coletar amostras de fossas nasais, orofaringe e urina, para semeadura e
identificação pelo método de Gram.

INTRODUÇÃO
Quando se suspeita de uma doença infecciosa, devem ser solicitados cultivos
apropriados ou técnicas dirigidas à detecção sorológica de antígenos e anticorpos. Em
muitas instituições e comunidades, pode-se contar com patologistas, microbiologistas e
técnicos para auxiliar os médicos na seleção das amostras adequadas para cultivo, e
solicitar as provas apropriadas para alcançar o máximo isolamento ou detecção do
microrganismo. É possível que a colheita apropriada de uma amostra para cultivo seja a
etapa mais importante na confirmação final de que um microrganismo é responsável pelo
processo de enfermidade infecciosa. Uma amostra mal colhida pode resultar em fracasso
no isolamento de microrganismos importantes.
As infecções urinárias estão entre as enfermidades mais freqüentes na prática
médica, sendo que o sexo feminino é o mais afetado devido à proximidade do ânus com a
abertura urinária e ao fato da uretra feminina ser mais curta do que a masculina entre
outros fatores, o que proporciona a predominância de enterobactérias neste sítio
anatômico, sobretudo Escherichia coli.
É altamente recomendável que os microbiologistas efetuem exames microscópicos
diretos das amostras enviadas para cultivo. Não só pode ser possível proporcionar ao
médico um rápido diagnóstico presuntivo, mas também a detecção de microrganismos
específicos pode servir como guia para selecionar os meios de cultura apropriados e
fornecer uma valiosa comparação de controle de qualidade com os isolados recuperados.
A coloração de Gram, descoberta há pouco menos de 100 anos, é utilizada com muita
freqüência para o exame microscópico direto de amostras e subcultivos.

MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os seguintes materiais:
Swab
Espátula de madeira
Bico de bunsen
Ágar sangue
Ágar MacConkey
Ágar manitol
Amostras biológicas
Alça de platina
Tubos de ensaio
Lâmina
Cristal violeta
Lugol
Álcool etílico 95%
Fucsina de Gram
Óleo de imersão
Microscópio ótico
Pipeta automática
Ponteiras descartáveis
Soro fisiológico
Coleta e semeadura de material
Foram coletas amostras clínicas dos próprios estudantes, utilizando-se um swab
para material das fossas nasais e um para a orofaringe.
Nas fossas nasais, esfrega-se o swab, umedecido com soro fisiológico, com
movimentos circulares delicados, pressionando-o contra a parede lateral do nariz,
conforme desenho abaixo:

http://www.saude.rs.gov.br/dados/12424086612881241803265859Normas%20laboratoriais%20coleta%20Inf
luenza%20AH1N1.pdf

Após a coleta, o material é semeado por técnica de esgotamento no ágar manitol,

próximo à chama do bico de bunsen.

Na orofaringe, colhe-se swab, umedecido com soro fisiológicos, na área posterior

da faringe e tonsilas, evitando tocar na língua, abaixando esta com a espátula de madeira,
conforme desenho abaixo:

http://www.saude.rs.gov.br/dados/12424086612881241803265859Normas%20laboratoriais%20coleta%20Inf
luenza%20AH1N1.pdf

Após a coleta, o material é semeado por técnica de esgotamento no ágar sangue,

próximo à chama do bico de bunsen.
A urina foi coletada previamente de um paciente do Hospital Escola, e foi feita a
técnica de semeadura em esteira, no meio MacConkey, próximo à chama do bico de
bunsen.

Coloração de Gram
Após o crescimento nos meios de cultura, foi feito um esfregaço do material em
duas lâminas, conforme o esquema abaixo. Na primeira, foram utilizadas três colônias
diferentes do meio ágar sangue. Na segunda, foram utilizadas uma colônia do ágar
manitol (A) e uma colônia do ágar MacConkey (B). Deixar secar ao ar.

Após isso, deve-se fixar o material na lâmina, passando-a três a quatro vezes
através da chama do bico de bunsen, de modo que o material não seja removido durante
o procedimento durante o procedimento de coloração.
Coloca-se a lâmina sobre um suporte para coloração e cobrir a superfície com
solução de cristal violeta. Após um minuto, lavar bem com água destilada. Cobrir o
esfregaço com solução de lugol durante dois minutos. Lavar novamente com água
destilada. Sustenta-se a lâmina entre os dedos polegar e indicador e cobrir a superfície do
esfregaço com álcool durante alguns poucos segundos. Lavar com água corrente e
colocar novamente a preparação sobre suporte para coloração. Adiciona-se fucsina de
Gram durante um minuto e lavar com água corrente. Coloca-se a lâmina em posição
vertical deixando que o excesso de água escorra e o esfregaço seque. Examinar o
esfregaço com óleo de imersão na objetiva de 100x no microscópio óptico.

Método de diluição da urina

Após a coleta da urina, utiliza-se uma pipeta automática para fazer a diluição em
soro desta. No primeiro tubo, contendo 100μL de soro, adiciona-se 10μL de urina.
Posteriormente, toma-se 10μL desta solução e adicionar no segundo tubo, que contem
1000μL de soro. Homogeneizar e descartar 10μL deste segundo tubo. Foram, então,
semeadas em esteira, em três placas contendo ágar MacConkey, utilizando uma alça de
platina, sendo a primeira placa semeada com a urina sem diluição, a segunda com a urina
da primeira diluição e a terceira com a urina da segunda diluição, conforme esquema:
 Após a incubação por 24 horas a 37ºC, é feita a contagem do número de colônias e
multiplica-se pelo fator de calibração para emitir o resultado em unidades formadoras de
colônias (U.F.C) por mL.

RESULTADOS
Na cultura de ágar sangue, cresceram três tipos de colônias diferentes, todas
apresentando aspecto brilhante:
1. Acinzentada com alfa-hemólise;
2. Amarelada com gama-hemólise;
3. Transparente com gama-hemólise.

Na cultura de ágar manitol (A), cresceu apenas um tipo de colônia, sendo esta rosa
e brilhante.
Na cultura de ágar MacConkey (B), cresceu apenas um tipo de colônia, sendo esta
transparente, permanecendo inalterado a cor do meio.

Após feita a coloração de Gram destas colônias, foram encontrados os seguintes

resultados, de acordo com o esquema:

● Na região 1 da placa de ágar sangue, foram encontrados cocos Gram-negativos e

Gram-positivos.
● Na região 2 da placa de ágar sangue, foram encontrados apenas cocos Gram-
negativos.
● Na região 3 da placa de ágar sangue, foram encontrados apenas cocos Gram-
negativos.
● Na região A da placa de ágar manitol, foram encontrados cocos Gram-positivos.
● Na região B da placa de ágar MacConkey, não foram encontrados microrganismos.

No método de diluição da urina, foi feito a seguinte contagem:

● Sem diluição – Houve crescimento em massa de bactérias.
● Diluição 1:100 – Foram contadas 200 colônias que, ao ser multiplicado pelo fator
de diluição (100), corresponde a 20.000 UFC a cada 10μL. Porém, a contagem
deve ser feita em 1000μL, sendo encontrado 2.000.000 UFC/mL.
● Diluição 1:1000 – Foram encontradas 17 colônias que, ao ser multiplicado pelo
fator de diluição (1000), corresponde a 17.000 UFC a cada 10μL. Porém, a
contagem deve ser feita em 1000μL, sendo encontrado 170.000 UFC/mL.

DISCUSSÃO
Segundo o módulo IV da apostila da ANVISA. O meio Ágar sangue, oferece ótimas
condições de crescimento a maioria dos microrganismos. A conservação dos eritrócitos
íntegros favorecem a formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação
de Streptococcus sp e Staphylococcus sp. A interpretação da cor original do meio é
vermelho. Na beta hemólise, apresenta halo transparente ao redor das colônias
semeadas (lise total dos eritrócitos). Na alfa hemólise, apresenta halo esverdeado ao
redor das colônias semeadas (lise parcial dos eritrócitos). Na gama hemólise (sem
hemólise) há ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros).
Analisando os resultados obtidos da coloração de Gram de colônias retiradas do ágar
sangue, pode-se fazer as seguintes inferências:
• Região 1 – A hemólise presente no ágar sangue é justificada pela presença de cocos
Gram-positivos, sendo estes do gênero Streptococcus produtores de hemolisinas. A
presença de cocos Gram-negativos pode ser justificado por uma mistura de colônias,
uma contaminação ou uma possível lavagem excessiva durante a coloração de Gram.
• Regiões 2 e 3 – A falta de hemólise no ágar sangue pode ser justificada pela presença
de cocos Gram-negativos, não produtores de hemolisinas.

O ágar manitol é seletivo para Staphylococcus sp., através da fermentação do

manitol. Analisando os resultados obtidos da coloração de Gram de colônias retiradas de
ágar manitol, pode-se confirmar que realmente se trata de uma espécie de
Staphylococcus.

O ágar MacConkey, por apresentar cristal violeta como um de seus componentes,

inibe o crescimento de microrganismos Gram-positivos, especialmente enterococos e
estafilococos. Como a concentração de sais de bile é relativamente baixa, em
comparação com outros meios, este meio não é tão seletivo para Gram-negativos. Ele é
utilizado para isolar estes microrganismos e verificar a fermentação ou não de lactose.
Analisando os resultados obtidos da coloração de Gram de colônias retiradas do ágar
MacConkey, não se pode inferir nada, pois estas eram observadas no aumento de 10x,
mas não eram observadas no aumento de 100x.

A urina é um excelente meio de cultura, bactérias contaminantes podem multiplicar-

se quando a mesma é mantida à temperatura ambiente e invalidar os resultados da
cultura. A semeadura deve ser feita com a urina em temperatura ambiente, espécimes
que não possam ser examinados em 2 horas após a micção devem ser refrigerados. As
contagens bacterianas permanecem estáveis por pelo menos 24 horas nessas condições.
De uma maneira geral, utiliza-se a seguinte convenção para a análise dessas culturas:
Acima de 100.000 UFC/mL = indício de infecção
Entre 10.000 a 90.000 UFC/mL = suspeita de infecção
Entre zero a 9.000 UFC/mL = sem significado clínico

Analisando-se os resultados obtidos nas duas diluições, ficou evidente a presença

de uma infecção, devido à presença de mais de 100.000 UFC/mL.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo:
Atheneu, 2005.

2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São

Paulo: MEDSI, 2001

3. FREITAS, Valdionir da Rosa; PICOLI, Simone Ulrich. A coloração de Gram e as

variações na sua execução. NewsLab, São Paulo, SP, v. 14, n. 82, p. 124-128, out. 2006.

4. TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM. Brasília: Ministério da Saúde, Programa

Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS. Série TELELAB, 1997.

5. PROTOCOLOS DE MICROBIOLOGIA CLÍNICA – Urocultura. Disponível em:

<http://www.medcorp.com.br/medcorp/upload/downloads/NEWSLAB_Especial%20Protoc
olos%20de%20Microbiologia%20parte3_200872411239.pdf>. Acesso em: 12 nov. 2009
 Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Departamento de Ciências Biológicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatório de Prática

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE COCOS

GRAM-POSITIVOS

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos

Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Isolar e identificar, através de provas bioquímicas, as espécies de cocos Gram-
positivos mais comuns isolados de seres humanos.

INTRODUÇÃO
Com exceção dos membros da família Enterobacteriaceae, as bactérias Gram-
positivas, principalmente os cocos, são os microrganismos isolados com mais freqüência
a partir de amostras biológicas humanas em laboratórios de microbiologia. Essas
bactérias estão amplamente distribuídas na natureza, e podem ser isoladas de ambientes
ou como habitantes comensais da pele, mucosas e outros sítios. Os cocos Gram-positivos
produzem uma variedade de doenças, incluindo foliculite, furúnculo, carbúnculo, erisipela
e celulite (estreptococos), além de pneumonia e bacteremia (pneumococos). Portanto, o
isolamento e identificação desses microrganismos, a partir de amostras clínicas, sempre
deve ser correlacionado com o quadro clínico do paciente.

MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os seguintes materiais:
Swab
Bico de bunsen
Meios de cultura ágar sangue, Mueller Hinton, ágar DNAse, ágar manitol
Amostras biológicas
Alça de platina
Agulha de platina
Pinça
Lâmina
Cristal violeta
Lugol
Álcool etílico 95%
Fucsina Gram
Óleo de imersão
Microscópio ótico
Peróxido de hidrogênio
Tubos de ensaio contendo plasma de coelho
Solução salina
Discos de antibióticos (novobiocina, bacitracina e optoquina)
Tubos contendo ágar bile esculina, caldo NaCl a 6,5%

Coloração de Gram
Foi feito um esfregaço do material em duas lâminas. Na primeira, foram utilizadas
três colônias diferentes do meio ágar sangue. Na segunda, foram utilizadas uma colônia
do ágar manitol e uma colônia do ágar MacConkey. Deixar secar ao ar.
Após isso, deve-se fixar o material na lâmina, passando-a três a quatro vezes através da
chama do bico de bunsen, de modo que o material não seja removido durante o
procedimento durante o procedimento de coloração.
Coloca-se a lâmina sobre um suporte para coloração e cobrir a superfície com solução de
cristal violeta. Após um minuto, lavar bem com água destilada. Cobrir o esfregaço com
solução de lugol durante dois minutos. Lavar novamente com água destilada. Sustenta-se
a lâmina entre os dedos polegar e indicador e cobrir a superfície do esfregaço com álcool
durante alguns poucos segundos. Lavar com água corrente e colocar novamente a
preparação sobre suporte para coloração. Adiciona-se fucsina de Gram durante um
minuto e lavar com água corrente. Coloca-se a lâmina em posição vertical deixando que o
excesso de água escorra e o esfregaço seque. Examinar o esfregaço com óleo de
imersão na objetiva de 100x no microscópio óptico.

Provas Bioquímicas
Produção de catalase: Colocar 2mL de água oxigenada (H2O2) em um tubo de
ensaio. Utilizando um swab estéril, tocar na colônia de cocos Gram-positivos e mergulhar
no tubo contendo H2O2. Se houver formação de bolhas a reação é positiva; se não formar,
a reação é negativa.

Produção de coagulase: Tocar em 2-3 colônias com a alça de platina flambada e fria e
introduzir em tubo de ensaio contendo 1mL de plasma de coelho. Homogeneizar bem e
incubar em estufa microbiológica à 37ºC. Fazer a primeira leitura com uma hora de
incubação e de hora em hora, até quatro horas. Se negativo, fazer nova leitura com 24
horas. Se houver formação de coágulo, o teste é positivo; se não, o teste é negativo.

Crescimento em ágar manitol salgado: Esta prova é confirmatória para as bactérias da

espécie S. aureus. Tocar as colônias com alça e semear em placa contendo meio ágar
manitol salgado. Incubar a placa em estufa microbiológica à 35-37ºC por 18-24 horas. A
espécie S. aureus é capaz de crescer e fermentar o manitol presente no meio,
modificando a cor do mesmo que originalmente era rosa para amarelo.

Presença de DNAse: Esta prova também é confirmatória para as bactérias da espécie S.

aureus e testa a capacidade da bactéria de produzir a enzima denominada DNAse, capaz
de digerir o DNA. Semear 2 a 3 colônias da bactéria no centro do ágar DNAse. Incubar à
35-37ºC por 18-24 horas. Proceder à leitura adicionando HCl. Se as colônias produzirem
DNAse, ao adicionar o HCl este precipitará o DNA restante no ágar, tornando o meio
opaco e ao redor das colônias será formado um halo transparente.

Sensibilidade à Novobiocina: Fazer uma suspensão bacteriana em tubo contendo salina.

A turvação deve ser semelhante ao tubo 0,5 da escala de MacFarland. Umedecer um
swab estéril na suspensão bacteriana e semear uniformemente em placa contendo ágar
Mueller Hinton. Em seguida, utilizando uma pinça, colocar um disco de Novobiocina no
centro da placa. Fixar o disco comprimindo-o em direção ao meio. Incubar a placa em
estufa microbiológica à 35-37ºC. A leitura é feita com 24 horas; se houver um halo de
inibição do crescimento ao redor do disco de Novobiocina, a bactéria é considerada
sensível; se não houver formação de halo, a bactéria é considerada resistente.

Prova de CAMP: Em placa de ágar sangue, fazer uma estria central com bactérias da
espécie S. aureus hemolítica usando a alça de platina flambada e, em seguida, fazer
estrias perpendiculares à estria central com bactérias do gênero Streptococcus a ser
identificada. A prova é considerada positiva quando são formadas regiões de hemólise em
formato de seta próximo ao crescimento das duas espécies.

Sensibilidade à Optoquina e Bacitracina: Fazer uma suspensão bacteriana em tubo

contendo salina. A turvação deve ser semelhante ao tubo 0,5 da escala de MacFarland.
Semear a placa de ágar sangue com swab estéril umedecido na suspensão em toda a
superfície da placa, uniformemente. Com o auxílio de uma pinça, colocar os discos de
optoquina e bacitracina na placa. Tomar o cuidado de não colocá-los muito próximos um
do outro e nem próximos à borda da placa. Incubar em estufa microbiológica a 37ºC por
18-24 horas. Caso haja a formação de um halo ao redor do disco de optoquina, a bactéria
pertence provavelmente a espécie S. pneumoniae; caso o halo se forme ao redor do disco
de bacitracina, provavelmente é um estreptococos ß-hemolítico do grupo A.

Crescimento em meio Bile-esculina e NaCl a 6,5%: Com a agulha de platina, tocar a

colônia suspeita e introduzir em ágar Bile-esculina. Para o caldo de NaCl, tocar a colônia
com alça e homogeneizar bem a bactéria no meio líquido. Incubar ambos em estufa
microbiológica a 35-37ºC por 18-24 horas. Para o meio bile-esculina, o teste é
considerado positivo se o meio ficar enegrecido. Para o caldo NaCl, o teste é positivo
caso haja turvação e mudança de cor do meio.

RESULTADOS
Analisando-se a lâmina, observou-se cocos Gram-positivos. Iniciou-se a bateria de
testes bioquímicos para duas bactérias diferentes.

Primeiro Teste
Teste da catalase: Houve formação de bolhas, caracterizando um teste positivo. Com isso
confirma-se o diagnóstico de Estafilococos e passa a ser feita identificação do gênero.
Prova da coagulase: Houve formação de coágulo, sendo um teste positivo, indicando
Staphylococcus aureus.
Teste em ágar manitol salgado: Houve crescimento neste meio, indicando teste positivo.
Presença de DNAse: Houve produção de DNAse, indicando teste positivo.
O diagnóstico é provavelmente de Staphylococcus aureus.

Segundo Teste
Teste da catalase: Não houve formação de bolhas, caracterizando um teste negativo.
Com isso confirma-se o diagnóstico para Estreptococos ou Enterococos.
Teste do NaCl: Houve turvação e mudança de cor do meio, sendo um teste positivo
Teste da bile-esculina: Não houve enegrecimento do meio, sendo um teste negativo.
Sensibilidade à Optoquina e Bacitracina: Não houve formação de halo ao redor dos discos
de antibióticos, caracterizando resistência.
Teste de CAMP: Não houver formação de áreas com hemólise, caracterizando um teste
negativo.
O diagnóstico é provávelmente de Streptococcus agalactiae.

DISCUSSÃO
S. aureus é, sem dúvida, o patógeno humano mais importante entre os
estafilococos. É encontrado no ambiente externo e em narinas anteriores de 20% a 40%
dos adultos. Outros sítios de colonização incluem pregas cutâneas, períneo, axilas e
vagina. Embora esse microrganismo possa fazer parte da microbiota humana normal,
pode produzir infecções oportunistas importantes em condições apropriadas.
De acordo com o observado na lâmina, a positividade do teste da catalase foi
suficiente para classificar o gênero como sendo Staphylococcus. Após o teste da
coagulase identificar o microrganismo como S. aureus, os testes em ágar manitol salgado
e DNAse foram apenas confirmatórios, devendo o teste de Novobiocina ser ignorado para
esta espécie.

S. agalactiae é a principal causa de doença nos períodos neonatal e perinatal. Em

mulheres, o microrganismo coloniza vagina e reto, e a colonização vaginal assintomática
é observada em 5% a 35% das mulheres grávidas. Na realidade, a colonização da vagina
pode representar contaminação retal, sendo o trato gastrintestinal o principal reservatório
desse microrganismo. O recém-nascido é colonizado por transmissão vertical, seja no
útero ou durante o parto, a partir da mãe portadora. Entre os lactentes colonizados, a
doença pode aparecer em um a quatro deles para cada 1.000 nascidos vivos. Na maioria,
são beta-hemolíticos, mas por vezes também são alfa-hemolíticos, pelo que não podemos
usar hemólise para pesquisar os S. agalactiae. De acordo com o observado na lâmina, a
negatividade do teste da catalase não foi suficiente para classificar o gênero do
microrganismo, podendo este ser Streptococcus ou Enterococcus. O diagnóstico de S.
agalactiae deu-se primeiramente pela presença de incompatibilidade nos testes de NaCl e
bile-esculina, eliminando a possibilidade de ser do gênero Enterococcus sp. ou outros
Estreptococos sp. Prosseguindo-se para o teste da optoquina e bacitracina, mostrando
que esse microrganismo é resistente a ambos antibióticos. O que separaria S. agalactiae
de dos alfa hemolíticos ( S. viridans e S. pneumoniae) seria a positividade do teste de
Camp, cujo o resultado foi negativo, provavelmente devido à interferência do sangue
utilizado no teste.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo:
Atheneu, 2005.

2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São

Paulo: MEDSI, 2001

3. Microbiologia – Streptococcus. Disponível em:

<http://users.med.up.pt/cc04-10/Microdesgravadas/5_Streptococcus.pdf>. Acesso em: 13
nov. 2009

4. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA: Detecção e Identificação de

Bactérias de Importância Médica. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_5_2004.pdf>.
Acesso em: 13 nov. 2009
 Universidade Federal do Triângulo Mineiro
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Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatório de Prática

BACTERIOSCOPIA

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos

Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Analisar lâminas contendo microrganismos corados por Gram.

INTRODUÇÃO
A morfologia dos microrganismos só pode ser observada ao microscópio. Mas,
devido ao seu reduzido tamanho e ao seu índice de refração muito próximo do índice de
refração da água, não é fácil sua observação microscópica. Sendo também, em geral, não
pigmentados, a observação microscópica só se torna possível aumentando o contraste
entre o meio envolvente e o conteúdo celular.
Para o preparo de um bom esfregaço para exame bacterioscópico, deve-se seguir
normas padronizadas para que os esfregaços sejam bem feitos. O Setor de Microbiologia,
depois de corar as lâminas, tem de observar uma grande extensão destas para conclusão
do diagnóstico. Para permitir o estudo das propriedades das bactérias e classificá-las em
grupos para efeitos de diagnóstico, várias colorações biológicas e procedimentos
específicos foram desenvolvidos. Das colorações há duas que são de interesse
fundamental em Bacteriologia Médica, a coloração de Gram e a coloração de Ziehl-
Neelsen.

MATERIAIS E MÉTODOS
Microscópio Óptico
Óleo de imersão
Lâminas preparadas pela coloração de Gram

Nesta prática deve-se observar as laminas ao microscópio óptico, contendo as

bactérias isoladas, e identificá-las de acordo com seu comportamento tintorial e sua
morfologia.

RESULTADOS
Foram observadas dez lâminas:

1.Análise de liquor, foi isolado Neisseria meningitidis. Diplococos Gram negativos.

2.Secreção vaginal (vaginose), observa-se Clue Cells, envolvida por Coco bacilos Gram
positivos, provavelmente Gardnerella sp.
3. Secreção oral, Streptococcus sp.
4.Neisseria sp., diplococos no citoplasma da célula.
5.Secreção vaginal normal. Presença de lactobacilos (de cor roxa) – Flora Doderlaine
6.Secreção vaginal (Candida). Presença de células do epitélio vaginal com bactérias e em
evidencia da Candida, que possui uma tamanho bem acentuado.
7.Fezes (normal), pode-se observar todos os tipos de microrganismos, tanto bacilos
quanto cocos, gram positivos e negativos.
8.Líquido sinovial, observa-se cocos Gram positivos
9.Líquido pleural, observa-se Streptococcus pneumoniae (Pneumococos)
10.Secreção de lesão genital, observa-se bacilos gram negativos possivelmente
Haemophilus ducrey.
DISCUSSÃO

A realização da prática de bacterioscopia teve como fundamento principal

proporcionar conhecimento sobre os aspectos de microrganismo comumente encontrados
em diferentes secreções do organismo humano. As lâminas de microbiotas normais foram
utilizadas para evidenciar que nem toda estrutura do organismo é estéril, e que podem
alojar microrganismos que ao migrar para outras regiões, produzem infecções de
intensidades que vão de leve a grave.
No caso da meningite a bacterioscopia agrupa morfológica e tintorialmente os
agentes, permitindo sua classificação com pequeno grau de especificidade (bacilos Gram-
positivos, bacilos Gram-negativos, diplococos Gram-positivos, diplococos Gram-negatvos,
bacilos álcool–ácido resistentes, leveduras, etc. Pode ser realizada no líquor ou no raspa-
do de pele (na presença de lesões ou sufusões hemorrágicas) e escarro.
Na flora vaginal de mulheres normais são comumente isoladas: Staphylococcus
epidermidis, Streptococcus fecalis, Lactobacillus sp, Corynebacterium sp, E. coli,
Bacteroides fragilis, Fusobacterium sp, Veillonella sp, Peptococcus sp,
Peptostreptococcus sp. além de Staphylococcus aureus , Streptococcus sp (Grupo B - β
hemolítico), Clostridium perfringens, Proteus, Klebsiella. E podem encontrar organismos
potencialmente patogênicos como Pseudomonas, Streptococcus pneumoniae, Listeria
monocytogenes. Na bacterioscopia o ambiente vaginal pode ser classificado:

PADRÃO I = EQUILÍBRIO DO ECOSSISTEMA

•90 a 95% de flora de Doderlein;
•5 a 10% de outras bactérias e
•Ausência ou raros polimorfonucleares(PMN)
PADRÃO II = DESEQUILÍBRIO MODERADO DO ECOSSISTEMA
•50% de flora de Doderlein;
•50% de outras bactérias e
•Moderada quantidade de PMN
PADRÃO III = DESEQUILÍBRIO INTENSO DO ECOSSISTEMA
•Flora de Doderlein praticamente ausente;
•Quase 100% de outras bactérias e
•PMN abundantes
PADRÃO IV = COMPATÍVEL COM VAGINOSE BACTERIANA
•Flora de Doderlein ausente
•Proliferação de bactérias aeróbias e anaeróbias (G. vaginalis)
•PMN raros
PADRÃO VI - presença de Trichomonas vaginalis
PADRÃO VII - presença de fungos do gênero Candida

O Líquido Sinovial (LS) é um ultrafiltrado do plasma, acrescido de ácido hialurônico

sintetizado por sinoviócitos do tipo B. Suas principais funções são as de promover a
lubrificação da articulação, o amortecimento de impactos e nutrir a cartilagem articular. As
principais alterações encontradas no LS seriam decorrentes de traumas, presença de
corpo estranho (cristais/bactérias) e inflamação primária da sinóvia. A não-utilização da
análise laboratorial do LS, nestes casos, aumentaria o erro diagnóstico em 25%
Bacterioscopia: Gram: positivo em cerca de 50% dos casos de Artrite Infecciosa. Nos
casos de etiologia estafilocócica pode chegar a 75%, enquanto que nas Artrites
Gonocócicas é positivo em apenas 25% dos casos; BAAR: positividade baixa, em torno
de 20% dos casos; PAS: também possui baixa positividade.
Em todo o mundo, o Streptococcus pneumoniae é o mais freqüente agente
etiológico de infecções adquiridas na comunidade que acometem o sistema respiratório e
está associado com 3 a 5 milhões de mortes por ano. Nos EUA, é responsável por
500.000 casos anuais de pneumonia, 50.000 casos de bacteremia, 3.000 casos de
meningite e cerca de 7 milhões de casos de otite média aguda.
Haemophilus ducreyi é bacilo Gram-negativo, intracelular, anaeróbico facultativo,
com dimensões de um a 2µm por 0,5µm, com extremidades arredondadas e desprovido
de cápsula ou motilidade. Dispõe-se em cadeias simples ou duplas no interior de
polimorfonucleares. Seu cultivo é difícil, crescendo moderadamente em meios de ágar-
chocolate. É responsável pela doença sexualmente transmissível cancro mole,
caracterizada clinicamente pela presença de ulcerações dolorosas, em número variado,
de bordas irregulares e frequentemente envoltas por halo eritematoso vivo, localizadas
em região genital, anal ou anogenital, acompanhadas ou não de adenopatia satélite.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo:
Atheneu, 2005.

2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São

Paulo: MEDSI, 2001

3. PORTAL DE GINECOLOGIA - Vulvovaginites. Disponível em:

<http://www.portaldeginecologia.com.br/modules.php?name=News&file=print&sid=137>.
Acessado em: 15 nov. 2009

4. SINÓVIANÁLISE: Guia prático. Disponível em:

<http://www.cidmed.com.br/pdf/guia_pratico_sinovianalise.pdf>. Acessado em: 15 nov.
2009

5. MENINGITES – Manual de Instruções Critérios de Confirmação e Classificação.

Disponível em: <ftp://ftp.cve.saude.sp.gov.br/doc_tec/resp/manu_classmen.pdf>.
Acessado em: 15 nov. 2009

6. ZETTLER, Eduardo Walker. A reação em cadeia da polimerase na detecção da

resistência à penicilina em Streptococcus pneumoniae. J. bras. pneumol. vol.30 no.6 São
Paulo Nov./Dec. 2004

7. JUNIOR, W. B.; SHIRATSU, R.; PINTO, V. Abordagem nas doenças sexualmente

transmissíveis. An. Bras. Dermatol. vol.84 no.2 Rio de Janeiro Mar./Apr. 2009
 Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Departamento de Ciências Biológicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatório de Prática

ANTIBIOGRAMA

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos

Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Determinar o perfil de sensibilidade a antimicrobianos de amostras de cocos Gram-
positivos (Staphylococcus e Enterococcus), pelo teste de disco difusão;
Determinar o valor da concentração inibitória mínima (CIM) para a vancomicina, pelo teste
de diluição em caldo;

INTRODUÇÃO
O antibiograma é um teste que oferece como resultado padrões de resistência ou
susceptibilidade de uma bactéria específica a vários antimicrobianos (antibióticos ou
quimioterápicos). Seu objetivo é tanto a análise do espectro de sensibilidade/resistência a
drogas de uma bactéria quanto a determinação da concentração mínima inibitória, esta é
definida como a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano que impede
crescimento visível de um microorganismo no teste de sensibilidade por diluição em ágar
ou caldo.
A técnica de disco-difusão (Kirby-Bauer) e de diluição em caldo são exemplos de
testes de sensibilidade e resistência a antimicrobianos.
Para esses testes deve ter padronização do meio de cultura, inóculo (escala 0,5 Mc
Farland – 108 bactérias/mL) e antimicrobianos. Estes últimos são de acordo com a
bactéria isolada e é fornecido pelo Manual do Clinical and Laboratory Sandards Institute
(CLSI)/NCCLS. Nele pode-se identificar os grupos de drogas sugeridas para os
antibiogramas.
Os antimicrobianos são divididos em classes: beta-lactâmicos, aminoglicosídeos,
glicopepitídeos e macrolídeos. Para obter um teste de qualidade, deve-se observar a
espessura do ágar na placa, o caldo na microdiluição e macrodiluição, pH, estocagem
apropriada das placas, discos, drogas e soluções estoques dos antimicrobianos e
temperatura de incubação.
A técnica de disco-difusão é a mais utilizada, padronizada pelo CLSI, é realizada no
ágar Müeller-Hinton ou sangue. Esta técnica ainda possibilita a flexibilidade na escolha
dos discos, é de baixo custo, fácil execução e interpretação e tem ainda boa
reprodutibilidade. É um teste qualitativo, dando como resultado se o microorganismo é
sensível, intermediário ou resistente. È necessário ainda para realizar a técnica: o inóculo,
os discos impregnados com antimicrobiano e a difusão da droga. A ausência do halo de
inibição indica que o microorganismo é resiste a tal antimicrobiano. A presença do halo de
inibição indica que o microorganismo pode ser sensível, intermediário ou resistente,
dependendo do tamanho deste halo.
A técnica de diluição em caldo é a considerada “padrão ouro”, no Brasil é pouco
utilizado, é de baixo custo, difícil execução e também é padronizada pelo CLSI. Para
realizá-la deve-se determinar a CIM (Concentração inibitória mínima), dada em µg/mL.
Este método é quantitativo (breakpoints), dando como resultado que o microorganismo
pode ser sensível, intermediário ou resistente ao antimicrobiano.

MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os seguintes materiais:
Cultura axênica dos microrganismos em meio sólido
Tubos de ensaio contendo soro fisiológico estéril
Tubo nº0,5 da escala de Mc Farland
Swab
Bico de bunsen
Placas de Petri com ágar Mueller Hinton
Alça de platina
Pinças estéreis
Discos de antibióticos
Tubos de ensaio contendo caldo Mueller Hinton estéril
Solução estoque aquosa de vancomicina
Pipetas automáticas
Ponteiras estéreis
Estufa microbiológica
Tabelas de sensibilidade/resistência a antimicrobianos (CLSI)

Teste de Disco Difusão

Faz-se uma suspensão bacteriana, a partir da cultura de bactérias, com turvação
semelhante ao tubo nº0,5 da escola Mc Farland (aproximadamente 108 bactérias/mL).
Posteriormente, utilizando um swab, inocular a suspensão na superfície da placa de ágar
Mueller Hinton, passando o swab em toda a superfície do ágar e, posteriormente, repete-
se o procedimento outras duas vezes, girando a placa aproximadamente 60º. Após a
placa secar, coloca-se os antimicrobianos sob a superfície da placa com a pinça flambada
e fria, pressionando-os levemente contra a superfície do meio, sendo a distância entre
eles de 24mm, conforme figura abaixo:

http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/practi/antibio1.jpg

A placa é incubada a 35-37ºC por 16-18 horas em estufa microbiológica. Após esse
tempo, mede-se o halo formado e é feita a classificação dos microrganismos.

Teste de Diluição em Caldo

Faz-se uma diluição seriada da solução estoque de vancomicina, transferindo
975µL da mesma para o tubo de ensaio nº1 (concentração final de 256µg/mL do
antimicrobiano) contendo 975µL de caldo Mueller Hinton. Homogeniza-se e transfere
975µl do tubo nº1 para o tubo seguinte (nº2) e assim por diante. Desprezar 975µL do
último tubo (concentração final de 0,5µg/mL). Posteriormente, adiciona-se 25µL de
suspensão bacteriana semelhante ao tubo nº0,5 da escala de Mc Farland
( aproximadamente 108 bactérias/mL) em cada um dos tubos contendo diferentes
concentrações da droga. Faz-se também, um controle positivo (25µL de suspensão
bacteriana em 975µL de caldo Mueller Hinton, para ser o controle de crescimento da
bactéria) e um negativo (1000µL de caldo Mueller Hinton em um tubo de ensaio estéril,
para ser o controle de esterilidade do caldo). A incubação é feita por 24 horas a 35-37ºC
em estufa microbiológica. Após esse tempo, observa-se o crescimento bacteriano nos
tubos. A concentração inibitória mínima (CIM) é a menor concentração de agente
antimicrobiano que inibe completamente o crescimento dos microrganismos nos tubos.
Posteriormente, classifica-se o microrganismo em sensível, intermediário ou resistente.

RESULTADOS
O antibiograma foi utilizado para uma espécie de Enterococcus.
O teste de disco difusão foi feito utilizando os seguintes antimicrobianos:
Oxaciclina, Penicilina, Azitromicina, Clindamicina, Vancomicina, Claritromicina,
Eritromicina e Sulfazotrim (Sulfametoxazol e Trimetoprim). Foram encontrados os
seguintes resultados:

Bactéria
Antimicrobiano, Tamanho do halo Resultado
Concentração e Sigla (mm)
Oxaciclina – OXA – 1mcg 23 S
Penicilina – PEN – 10mcg 15 R
Azitromicina – AZI – 15mcg 22 S
Clindamicina – CL – 2mcg 30 S
Vancomicina – VC – 30mcg 19 S
Claritromicina – CLA – 15mcg 27 S
Eritromicina – ERI – 15mcg 27 S
Sulfazotrim – SFT – 25mcg 28 S

Para o teste de diluição em caldo, a concentração inibitória mínima de vancomicina

encontrada foi de 4µg/mL.
È importante destacar que em um dos grupos a concentração inibitória mínima
encontrada foi de 32 µg/mL. Significando resistência a vancomicina.

DISCUSSÃO

Enterococcus são cocos Gram-positivos que geralmente se dispõem em pares e

cadeias curtas. Freqüentemente, a morfologia microscópica destes microrganismos não
pode ser diferenciada de algumas espécies de Streptococcus. Enterococcus são
anaeróbios facultativos e a temperatura ótima de crescimento é 35°C, embora a maioria
dos microrganismos se desenvolva entre 10 e 45°C. Apresentam crescimento rápido em
meios de cultura suplementados com sangue, produzindo colônias brancas após 24 horas
de incubação. As colônias são, em geral, não hemolíticas, mas podem ser alfa ou
betahemolíticas. Enterococcus podem ser cultivados na presença de altas concentrações
de sal (NaCl a 6,5%), toleram sais biliares a 40% e podem hidrolisar a esculina. Estas
propriedades básicas podem ser utilizadas para distinguir enterococos de outros cocos
Gram-positivos, catalase negativos. São necessários testes fenotípicos selecionados,
como por exemplo: reações de fermentação, hidrólise da pirrolidonil-beta-naftilamida,
motilidade, produção de pigmento para diferenciar as espécies de enterococos
 Enterococcus sp. são comensais do trato intestinal humano e de outros animais,
mas também são causadores de infecções nosocomiais e de endocardite subaguda.
Durante as duas últimas décadas, a resistência a drogas entre os cocos Gram-positivos
tem aumentado. A emergência de enterococos multirresistente é um desafio à terapia, que
tem sido paralelo à ocorrência de enterococcus resistentes a vancomicina (VRE) pela
primeira vez relatado em 1988. Desde então, resistência à teicoplanina e/ou vancomicina
começou a aparecer em todo o mundo. VRE freqüentemente expressa resistência
adicional a múltiplos antibióticos, incluindo ampicilina e aminoglicosídeos, incluindo
resistência a altos níveis de gentamicina e estreptomicina. Devido ao aumento da
resistência a antimicrobianos, tem-se direcionado atenção ao desenvolvimento de novos
agentes antimicrobianos, como quinupristina-dalfopristina e linezolida. No entanto, pouco
após a aprovação destes dois medicamentos, bactérias resistentes começaram a ser
encontradas. Em geral, tem sido relatado que quinupristina-dalfopristina possui atividade
inibitória contra E. faecium, incluindo os VRE que são resistentes a outros agentes
clinicamente disponíveis.
BIBLIOGRAFIA

1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo:

Atheneu, 2005.

2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São

Paulo: MEDSI, 2001

3. Camargo, Ilana L. B. Cunha. Estudo dos fatores de virulência em Enterococcus sp.

isolados no Brasil. Tese apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Biociências
Aplicadas à Farmácia, área de concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia,Curso de
Doutorado. Ribeirão Preto, 2005.
 Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Departamento de Ciências Biológicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatório de Prática

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS

GRAM-NEGATIVOS (BGN)

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos

Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Isolar e identificar e espécies os Bacilos Gram-negativos mais comuns isolados em
seres-humanos, a partir de processos bioquímicos empregados em testes de identificação
de bacilos Gram-negativos.

INTRODUÇÃO
Os bacilos Gram-negativos pertencentes às Enterobacteriaceae são as bactérias
isoladas com mais freqüência de amostras biológicas. Distribuídos amplamente na
natureza, esses microrganismos são encontrados no solo, água, plantas e no trato
intestinal de seres humanos e animais. Portanto, os membros dessa família podem ser
suspeitos em virtualmente qualquer tipo de doença infecciosa e isolados de qualquer
amostra recebida no laboratório.
As Enterobactérias são bacilos anaeróbios facultativos e não produtores de
esporos, são fermentadores de glicose e produtores de endotoxinas e exotoxinas, além
de serem citocromo oxidase negativa. Devido ao grande número de espécies, uma bateria
de provas bioquímicas deve ser feita, afim de caracterizar definitivamente um membro.

MATERIAIS E MÉTODOS
Bico de Bunsen
Alça de platina
Agulha de Platina
Pinça
Placas contendo meio ágar MacConkey
Tubos contendo meio de identificação bioquímica O/F
TSI ( Tríplice açúcar e ferro)
SIM (sulfeto-indol-motilidade)
Uréia de Christensen
Citrato de Simmons
Fenilalanina
Caldo Descarboxilase de Moeller (lisina, ornitina, arginina)
Voges-Proskauer (VP)
Vermelho de Metila (VM)
Óleo Mineral estéril
Estufa microbiológica
Tabelas de Identificação

Provas Bioquímicas:

Fermentação da lactose - Bacilos islados da urina são cultivados em meio MacConkey, e

observar se estas colonias conseguem utilizar a lactose presente no meio e produzir
colônias róseas (fermentadoras de lactose) ou colônias transparentes (não fermentadoras
de lactose).

Prova da Oxidação-Fermentação (OF) da glicose – O meio OF é usado para determinar

se um organismo pode sintetizar carboidratos de forma oxidativa ou fermentativa.
Microrganismos sacarolíticos degradam a glicose através de fermentação ou oxidação. O
produto final da fermentação é uma mistura de ácidos orgânicos. Entretanto, a quantidade
de ácidos formados pela degradação oxidativa da glicose é pequena, quando comparada
com a fermentação. Portanto, para a detecção, é necessário que a reação se dê no meio
de Hugh e Leifson (Meio OF). O meio OF difere dos meios de fermentação de
carboidratos, por apresentar uma concentração de peptona de 0,2%, concentração de
carboidratos de 1% e concentração de ágar de 0,3% (semi-sólido). A baixa relação entre
proteínas e carboidratos reduz a formação de aminas alcalinas, que podem neutralizar a
pequena quantidade de ácidos fracos formados pelo metabolismo oxidativo. A maior
quantidade de carboidratos aumenta a quantidade de ácidos que pode ser potencialmente
produzidos. O meio OF pode ser usado como um teste simples de utilização de glicose
pela via oxidativa, assim como para outros carboidratos: lactose, maltose, sucrose, xilose
e frutose. As reações positivas são indicadas por uma coloração amarela, evidenciada
pelo indicador azul de bromotimol, que se torna amarelo em meio ácido. Uma coloração
verde ou azul esverdeado indica uma reação negativa. O teste para glicose é feito em
duplicata, e em um dos tubos o meio é recoberto com óleo mineral. A bactéria será
considerada: oxidativa, se produzir ácido apenas no tubo sem óleo (exposto ao ar);
fermentadora, se produzir ácido em ambos os tubos; e assacarolítica, se ambos os tubos
permanecerem com pH alcalino após a incubação. Procedimento: com agulha de platina,
flambada e fria, tocar em uma colonia da bactéria Gram-negativa. Introduzir a agulha até
¾ dos dois tubos de ensaio contendo meio OF-glicose semi sólido. Um dos tubos é
mantido aberto enquanto no outro deve ser adicionado uma camada de óleo mineral
estéril. O teste é considerado positivo quando o meio muda a cor de verde para amarelo.
Os organismos oxidativos irão produzir reação ácida somente no tubo aberto, mantendo o
tubo fechado inalterado. Já aqueles que são fermentativos, irão produzir reação em
ambos os tubos.

Prova de glicose/lactose (ágar TSI) – O ágar Tríplice Açúcar é um meio empregado na

triagem de enterobactérias. O meio é enriquecido pela incorporação de quatro compostos
protéicos, possibilitando um bom crescimento bacteriano. É um meio sólido e inclinado
(base e ápice) em tubo, que originalmente é de cor vermelha. Ele contém glicose (0,1%),
lactose (10%) e sacarose (10%), citrato férrico entre outras substâncias. É utilizado para
determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar carboidratos específicos
existentes no meio básico com ou sem produção de gás ou H2S.
• Fermentação da glicose: a concentração de glicose no meio é de apenas 0,1%,
obtendo-se assim uma quantidade relativamente pequena de ácido. Inicialmente, todo o
meio torna amarelo devido à degradação da glicose. Após algumas horas, os
microrganismos começam a decompor oxidativamente a peptona, produzindo uma
alcalinização na superfície do meio. No fundo do tubo, a degradação protéica é
insuficiente para reverter o pH ácido estabelecido, e o meio mantém-se amarelo. Todas as
enterobactérias fermentam a glicose.
• Fermentação da lactose e da sacarose: o meio possui uma concentração maior
desses açúcares (10%), permitindo que as bactérias que utilizam a lactose, com ou sem
sacarose, produzam quantidades relativamente altas de ácido, suficiente para superar a
reação alcalina desenvolvida na superfície do meio. O tubo permanece totalmente com
coloração amarela. O indicador de pH do meio é o vermelho de fenol.
• Produção de gás: ocorre formação de gás devido à degradação de moléculas de
ácido fórmico, sendo evidenciado pelo aparecimento de bolhas ou rachaduras no meio.
• Produção de H2S: é evidenciada pelo aparecimento de um precipitado de
coloração negra (sulfeto de ferro), proveniente da reação do H2S com o citrato férrico
amoniacal contido no meio.
Procedimento: BGN é inoculado nesses meios com uma agulha de platina que deve ser
introduzida até quase o final do tubo. Após semeadura, estriar a superfície inclinada do
ágar.

Prova H2S - Em meio SIM o BGN é inoculado com uma agulha de platina até o fim do
tubo sem encostar na parede do tubo. Observa-se a produção de H2S quando altera a
coloração do tubo de inalterado para preto.

Prova Indol – Em meio sim semeia-se a colônia de BGN, e após o crescimento adiciona-
se o reagente de Kovac´s (cor amarela) ao longo das paredes do tubo de modo q não se
misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto
rosado. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após
adição de do reagente, são indol positivas.

Prova da Motilidade – No Meio ágar SIM inocula-se em linha reta o BGN, com uma agulha
de platina ate ¾ do tubo. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem
deslocando-se na linha de inoculação, turvando o meio. Enquanto que motilidade
negativa o crescimento só será na zona da picada.

Prova do Citrato – O ágar Citrato de Simmons é um meio sólido e inclinado, em tubo, de

cor originalmente verde. Citrato de sódio é um composto orgânico simples encontrado
como um dos metabólitos do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs). Algumas
bactérias podem obter energia utilizando o citrato como única fonte de carbono. Esta
característica é importante para a identificação de alguns membros de
Enterobacteriaceae: E. coli é citrato negativo, enquanto as espécies de Enterobacter e
Klebsiella são positivas. O meio a ser empregado para o teste inclui citrato de sódio e
fosfato de amônia como única fonte de carbono e nitrogênio e deve ser isento de
proteínas e carboidratos. As bactérias que produze a enzima citrase conseguem utilizar o
citrato como única fonte de carbono e utilizam o nitrogênio do sal de amônio produzindo
amônia, alcalinizando o meio. O indicador utilizado é azul de bromotimol, que em pH
ácido é amarelo e em pH alcalino é azul. Caso a bactéria consiga utilizar o citrato o meio
que era verde tornará azul devido a alcalinização. Caso isso não aconteça, o meio
permanecerá verde (citrato negativo). Procedimento: No meio inclinado de Ágar Citrato de
Simmons, inocula-se o BGN com agulha de platina em linha reta. Após a incubação, as
culturas citrato positivas são identificadas pela presença de crescimento, na superfície da
rampa, acompanhada de coloração azul no meio da cultura.

Prova do citrato

Prova da Uréia – O ágar Uréia de Chirstensen é um meio sólido e inclinado em tubo, de

cor amarela. A urease é uma enzima que hidrolisa a uréia em amônia e dióxido de
carbono. A reação é utilizada na identificação de bactérias produtoras de urease. A
amônia é um produto que alcaliniza o meio levando a um aumento do pH e, em
conseqüência, uma mudança de coloração do indicador de pH. Em laboratórios clínicos,
são utilizados rotineiramente dois meios para identificação da urease: caldo Stuart e ágar
de Christensen. Quando acontece a viragem do pH devido a presença da enzima o meio
passa a ter coloração rosa por meio do indicador de pH vermelho de fenol. Procedimento:
é semeado com alça bacteriológica, onde uma porção do crescimento bacteriano é
transportada paro o meio e semeada em estrias no ápice.

Prova da urease

Prova da Fenilalanina – Este meio é sólido e inclinado em tubo. Tem cor originalmente
bege. A desaminação de fenilalanina forma ácido fenilpirúvico. Dentre os membros da
família Enterobacteriaceae, apenas as espécies de Proteus, Morganella e Providencia
possuem a enzima necessária para a desaminação de fenilalanina. O teste consiste na
detecção de ácido fenilpirúvico, após crescimento do microrganismo em meio contendo
aminoácido. O aparecimento de uma coloração verde escura após a adição de uma
solução de cloreto férrico a 10% (três a cinco gotas) indica resultado positivo.
Procedimento: Inocular a bactéria em ágar fenilalanina e, após incubação a 35ºC por 18-
24horas, adicionar 4 a 5 gotas de reagente de cloreto férrico. O desenvolvimento de uma
intensa cor verde, indica uma prova positiva.

Prova da fenilalanina

Caldo base de Moeller (Prova da utilização dos aminoácidos) - A prova consiste em três
tubos contendo como base o caldo descarboxilase de Moeller e fechado com óleo
mineral. Em cada um dos tubos é adicionado um aminoácido diferente (lisina, arginina e
ornitina), para detecção de enzimas específicas para estes substratos. A enzimas
descarboxilases hidrolisam o grupo carboxil (COOH) de aminoácidos, formando aminas
alcalinas e dióxido de carbono. A reação é específica, cada aminoácido é descarboxilado
por uma enzima particular. Lisina e ornitina são os aminoácidos testados rotineiramente
na identificação de Enterobacteriaceae. A lisina é descarboxilada em cadaverina e a
ornitina em putrescina. A reação se dá em anaerobiose. O meio contém o indicador de pH
púrpura de bromocresol, que em pH ácido é amarelo e em pH alcalino é púrpura. Quando
a bactéria é adicionada, ela quebra a dextrose presente e acidifica o meio, mudando a cor
de roxo para amarelo-esverdeado. Este meio ácido estimula a atividade das
descarboxilase (caso a bactéria o tenha) que quebram os aminoácidos, produzindo
substâncias diferentes. Tudo isso eleva o pH do meio, mudando a cor novamente para
roxo. Logo, o teste é considerado positivo se, após o período de incubação, apresentar
cor roxa (púrpura). Se a bactéria não produz as descarboxilase, o meio fica amarelo. Por
isso a necessidade de um tubo branco para poder fazer a comparação das cores sendo
este da cor original do meio. Procedimento: Inocular a bactéria no caldo base de Moeller
em quatro tubos (um para controle, um para arginina, um para ornitina e outro para lisina)
e adicionar 1mL de óleo mineral. Após a incubação, se for positiva, o tubo controle
encontra-se amarelo e os tubos contendo aminoácidos encontram-se púrpuras.

Prova do Vermelho de Metila (VM) – um meio líquido e amarelado em tubo. É um teste

quantitativo para identificar espécies bacterianas que produzem ácidos orgânicos (láctico,
acético e fórmico) a partir da fermentação da glicose, visto que as bactérias que seguem a
via de fermentação de ácidos mistos produzem ácidos suficientes para manter o pH
abaixo de 4,4 (cor vermelha). Muitas espécies de Enterobacteriaceae utilizam essa via de
fermentação da glicose. A formação desses ácidos pode ser detectada pelo indicador
vermelho de metila, que tem seu ponto de viragem no pH 4,4. Escherichia coli apresenta
teste VM positivo, enquanto Enterobacter aerogenes, VM negativo. Procedimento:
Semear o caldo com um cultivo puro do microrganismo e incubar a 35ºC por 48-72 horas.
Após incubação, adicionar 5 gotas de reagente de vermelho de metila. O desenvolvimento
de uma cor vermelha estável na superfície do meio, indica uma prova positiva.

Prova de Voges-Prouskauer (VP) – É um meio líquido em tubo, de cor amarelada (meio

de Clark-Lubs). Uma outra via de fermentação de glicose que as bactérias podem utilizar
é a via de acetoína (acetil metil carbinol). O ácido pirúvico é formado pela degradação
fermentativa da glicose (via Embdem-Myerhoff) e é metabolizado pela via de butileno
glicol, em acetoína , um produto final neutro. O acetil é convertido em diacetil, pela ação
de hidróxido de potássio a 40% e oxigênio atmosférico. O diacetil é convertido em um
complexo vermelho pela ação catalítica de α-naftol e creatina. Espécies dos gêneros
Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e Serratia produzem acetoína e apenas pequenas
quantidades de ácidos mistos, que podem ser insuficientes para diminuir o pH do meio de
vermelho de metila. Procedimento: semear o caldo com u cultivo puro do microrganismo e
incubar a 35ºC por 24 horas. Em seguida, adicionar 0,6mL de α-naftol a 5% e 0,2mL de
KOH a 40%. Uma prova positiva é indicada pelo desenvolvimento de cor vermelha após
15 minutos ou mais da adição dos reagentes.

RESULTADOS
O bacilo Gram-negativo isolado apresentou as seguintes características em relação
às provas bioquímicas:

Prova da Oxidação-Fermentação (OF) da glicose – Produção de reação ácida em ambos

os tubos, mostrando-se tratar de um fermentador.

Prova de glicose/lactose (ágar TSI) – Apresentou a base ácida e o ápice alcalino.

Prova H2S - Não houve produção de H2S

Prova da Motilidade – O microrganismo apresentou crescimento apenas na zona da
picada, sendo negativa sua motilidade.

Prova do Indol – Ao adicionar-se o reagente de Kovac's, houve formação de anel incolor,

sendo classificado como uma reação negativa.

Prova do Citrato – Houve crescimento na superfície do meio e aparecimento de coloração

azul, típicos de reação positiva.

Prova da Uréia – Formou-se uma coloração rosa, indicando reação positiva.

Prova da Fenilalanina – Após a adição do cloreto férrico no tubo, não houve alteração na
coloração, sendo indicativo de reação negativa.

Prova da Arginina – No tubo controle (sem aminoácido), a bactéria mostrou-se viável,

abaixando o pH do meio e mudando sua coloração para amarelo turvo. Como o tubo
contendo arginina mostrou-se púrpura, essa reação é positiva.

Prova da Lisina – O tubo apresenta coloração púrpura, sendo uma reação positiva.

Prova da Ornitina – O tubo apresenta coloração levemente púrpura, sendo uma reação
positiva.

Prova do Vermelho de Metila (VM) – Não houve alteração da cor do meio, sendo uma
reação negativa

Prova de Voges-Prouskauer (VP) – Não houve alteração da cor do meio, sendo uma
reação negativa.

Esses resultados são característicos de Klebsiella pneumoniae.

DISCUSSÃO
K. pneumoniae é isolada com mais freqüência de amostras clínicas e pode causar
uma forma clássica de pneumonia primária. Não é comum encontrar essa bactéria na
orofaringe de pessoas normais, mas pode haver uma prevalência de 20% em pacientes
hospitalizados. Essa colonização pode ser a fonte das infecções pulmonares que
geralmente ocorrem em pacientes em condições debilitantes, como alcoolismo, diabetes
melito e doença pulmonar obstrutiva crônica. A pneumonia tende a ser destrutiva, com
necrose extensa e hemorragia, resultando na produção de escarro. Esta bactéria também
pode causar uma variedade de infecções extrapulmonares, incluindo enterite e meningite,
infecções urinárias e septicemia.
Apesar da maior parte dos testes serem compatíveis com K. pneumoniae, há
algumas considerações a serem feitas:
•A positividade da prova da ornitina não é característica. Isso pode ter ocorrido por tempo
insuficiente para a viragem do pH;
•Os testes VM e VP foram negativos não apenas para a bactéria em questão, mas sim
para todas as outras bactérias dos outros grupos. Isso pode ser resultado de alguma
alteração do teste ou de seus reagentes.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo:
Atheneu, 2005.

2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São

Paulo: MEDSI, 2001

3. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA: Detecção e Identificação de

Bactérias de Importância Médica. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_5_2004.pdf>
Acesso em: 13 nov. 2009
 Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Departamento de Ciências Biológicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatório de Prática

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DAS MICOSES

E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS

Marcus Vinicius Naghetini dos Santos

Rafaella Kizzy Inácio dos Reis

Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO

Diferenciar as colônias de fungos filamentosos e leveduriformes de acordo com as

características macroscópicas;
• Executar técnicas de macro e microcultivo para fungos filamentosos, identificar
diferentes tipos de fungos filamentosos com base nas características de cultivo
(macrocultivo) e na morfologia das estruturas fúngicas.
• Identificar as leveduras em espécie com base nos seus aspectos macroscópicos e
microscópicos e por meio de provas bioquímicas (zimograma e auxinograma).

INTRODUÇÃO

A identificação dos fungos é, em grande parte, baseado em sua morfologia. Como

eles habitam os mais variados substratos, apresenta em decorrência uma variação de
tipos morfológicos,dos mais simples aos mais complexos. Considera-se no seu estudo,
aspectos da morfologia macroscópica (colônias filamentosas, cremosas, cotonosas,
pulverulentas, formação de pigmentação,etc) como também da morfologia microscópica.
A unidade estrutural dos fungos é representada pela hifa, e o conjunto destes
elementos é denominado micélio. O micélio vegetativo exerce as funções de assimilação
de alimentos e fixação em substratos, podendo se diferenciar em estrutura de frutificação
que serve à reprodução.

Micélio Vegetativo
Constituído por um aglomerado de hifas, pode ser dividido de acordo com sua morfologia
em três tipos:
1. Unicelular: caracteriza as leveduras que são constituídas por células arredondadas,
ovóides ou ligeiramente alongadas e que podem se reproduzir por brotamento,
cissiparidade
ou por outros processos.
2. Filamentoso: caracteriza os bolores, podendo apresentar-se septado ou cenocítico. As
hifas podem se diferenciar em estruturas e funções variáveis recebendo, então,
denominações
diversas: rizóides, apressórios, anastomoses, hifas artrosporadas, etc.
3. Pseudomicélio: caracteriza um gênero de levedura (Candida). É formada de
brotamentos sucessivos de células em determinadas condições de cultivo.

Micélio de Frutificação ou Endocárpio

Cumpre as funções de preservação e disseminação da espécie mediante a formação de
células especiais denominadas esporos, que são elementos de resistência. Estes podem
ser hialinos, pigmentados, simples, septados apresentando várias formas características
que definem, às vezes, gêneros ou espécies de fungos.

Os esporos, de acordo com sua origem, podem ser assexuados ou sexuados e

tanto um como outro podem estar ou não no interior de determinadas estruturas.

Esporos de origem assexuada

1. Ectósporos: esporos que se formam na extremidade de hifas especiais denominadas
conidióforos. Esses esporos são denominados conídios. Ex.: Aspergillus, Penicillium.
2. Endósporos: esporos produzidos no interior de estruturas denominadas esporângios.
Os esporos, nesses casos, são denominados esporangiósporos. Ex.: Rhizopus
Esporos de origem sexuada
1. Ectósporos: esporos formados na extremidade de basídios denominados
basidiósporos. Ex.: Basidiomicetos
2. Endósporos: esporos no interior de células denominadas ascos. Os esporos, nesse
caso,são denominados ascósporos. Ex.: Piedraia hortai.

MATERIAIS E MÉTODOS

Identificação de Fungos Filamentosos:

Bico de bunsen
Alças de platina em gancho
Placas de Agar Sabouraud
Placas de Agar Batata dividido em cubos
Placas de Petri estéreis para microcultivo contendo lâmina, lamínula e algodão (segundo
técnica de Ridela)
Agua destilada estéril
Pinça
Frascos com lactofenol-azul de algodão
Lâminas de microscopia
Culturas em tubo de ensaio de diferentes fungos filamentoso

-Macrocultivo
Semear um pequeno fragmento da cultura do fungo filamentoso no centro da placa de
Agar Sabouraud, utilizando a alça de platina em gancho. Identificar a placa e incubar por
uma semana à temperatura ambiente.

-Microcultivo
Colocar sobre a lâmina, dentro da placa de Petri, um cubo de Agar batata, com auxílio de
pinça ou da própria alça, semear fragmentos do fungo filamentoso nos 4 cantos do Agar
batata, cobrir a preparação com lamínula estéril, comprimindo-a suavemente sobre o cubo
de Agar batata; umedecer o algodão hidrófilo com água destilada estéril, criando assim
uma câmara úmida; identificar as placas e incubar à temperatura ambiente.
-Leitura: retirar a lamínula, cuidadosamente, e colocá-la sobre uma lâmina contendo 1
gota de lactofenol-azul de algodão e examinar ao microscópio com objetiva de 10 e 40x.

Identificação de Fungos Leveduriformes:

Bico de bunsen
Alças de platina
Pinças
Lâmina
Lamínulas
Vidraria para microcultivo (lâmina, lamínula e algodão)
Agar Sabouraud
Agar fubá-tweed80
Ágar base de carboidratos
Agar base para carboidratos
Agar base para nitrogênio
Peptona
Nitrato de potássio
Açúcares liofilizados (dextrose, sacarose, trealose, lactose, galactose, maltose, rafinose,
melibiose, inositol, ramnose, xilose).
Salina estéril
Tubo n° 5 da escala de McFarland
Pipetas
Ponteiras
Estufa microbiológica
Culturas de fungos leveduriformes

-Prova do tubo germinativo:

Com uma alça de platina calibrada (0,001ml), retirar uma pequena porção de uma
colônia de levedura e emulsioná-la de forma asséptica em 0,5 ml de soro. Evitar, se
possível, o uso de soro humano, que pode ter anticorpos ou ainda antifúngicos.
Incubar a 37°C por um período de 2 a 3 horas em estufa bacteriológica. Findo este
período, deve-se remover uma gota da suspensão e montar uma preparação do tipo
lâmina-lamínula, para observação microscópica. O tubo germinativo, quando o teste for
positivo,
aparecerá como filamento fino e cilíndrico, originado do blastoconídio da levedura, no qual
não se observa nenhuma zona de constrição, quer na base ou ao longo de sua extensão.

-Zimograma (Fermentação de carboidratos):

Preparar a suspensão de leveduras: em um tubo de ensaio,adicionar 10 ml de salina
estéril; tocar as colônias da levedura e adicionar ao tubo. Observar a turvação deve ser
semelhante ao tubo n°5 da escala de McFarland.
Colocar 400 ul da suspensão de leveduras em tubos de ensaio contendo o meio de
fermentação; foram utilizados 5 tubos contendo 8 mil de meio-base, um tipo de açúcar
(dextrose, sacarose, lactose, galactose e maltose) e tubo de Durhan invertido. Fechar os
tubos com tampa de rosca e incubar em estufa a 35°C. Fazer a primeira leitura com 24hrs
de incubação. A leitura é considerada positiva se houver a formação de bolhas de gás
dentro do tubo de Durhan.

-Auxanograma (Assimilação de carboidratos):

No centro de uma placa de Petri grande, coloca-se 2,5 ml da suspensão da levedura
preparada anteriormente, para zimograma. Em seguida, coloca-se 50 ml de meio-base de
assimilação de carboidratos previamente fundido (temperatura de aproximadamente
50°C). Homogeniza-se com movimentos circulares suaves e esperar solidificar. Após
solidificação, adicionar pequenas quantidades de cada um dos 12 carboidratos a serem
testados:

1 - Celobiose 4 - Inositol 7 - Melibiose 10 - Sacarose

2 - Dextrose 5 - Lactose 8 - Rafinose 11 - Trealose
3 - Galactose 6 - Maltose 9 - Ramnose 12 - Xilose

Os açúcares são distribuídos na superfícies da placa com auxilio de uma espátula,

em pequenas porções. Deve-se manter distância entre os pontos de inoculação. Para
facilitar a colocação dos açúcares e a leitura dividir a placa em 12 campos e enumerar.
Incubar a placa a 35°C, com face que contém o meio com açucares voltada para cima e
fazer a leitura entre 24-96 horas.
A leitura é considerada positiva quando houver turvação no local onde foi
adicionada o açúcar. Usar uma tabela padrão para identificação da espécie da levedura.
-Auxanograma ( Assimilação de nitrogênio):
No centro de uma placa de Petri pequena, coloca-se 1 ml da suspensão da levedura
preparada anteriormente, para o zimograma. Em seguida coloca-se 20 ml de meio-base
para assimilação de nitrogênio, previamente fundido (~50°C). Homogeneizar com
movimentos circulares suaves e esperar solidificar. Após solidificar dividir a placa em duas
metades com a caneta. De um lado, colocar nitrato de potássio. Incubar a placa a 35°C e
fazer a leitura entre 24-96 horas. A leitura deve ser interpretada da seguinte forma: a
peptona serve como controle positivo, pois todas as leveduras metabolizam esta
substancia; o nitrato de potássio só é metabolizado por fungos não patogênicos. Usar
uma tabela padrão para identificação da espécie da levedura.

-Microcultivo de leveduras:
Coloca-se sobre a lâmina de microscopia o meio Agar Fubá-Tween80, previamente
fundido (~50°C), cobrindo toda a superfície da lâmina. Deixar o meio solidificar. Com
auxílio de alça de platina esterilizada, tocar levemente a colônia da levedura (cultura de
24-48 horas). Semear a levedura na superfície do meio de cultura fazendo de três a
quatro estrias paralelas, eqüidistantes 3 a 4 mm umas das outras (ver esquemas abaixo).
Cobre-se as estrias com lamínula esterilizada. Pressionar delicadamente a lamínula com
uma pinça para retirar o ar retido entre a lamínula e a superfície do Agar. Identificar a
placa e incubá-la à 35°C, por 48-96 horas, dentro de uma placa de Petri esterilizada;
umedecer o algodão hidrófilo esterilizado com água destilada estéril e deixar no interior da
placa, criando assim uma câmara úmida. Examinar as lâminas ao microscópio óptico com
objetivas de 10 e 40x e observar as estruturas formadas ( hifas, pseudo-
hifas,blastoconídios, clamidioconídios e artroconidios).
-Teste da uréia:
Inocular as leveduras a serem identificadas em Agar uréia com o auxilio da agulha de
platina e incubar à 37°C, por 24 h. Este teste irá avaliar a produção da enzima uréase
pela levedura, a partir da hidrólise da uréia.

-Meio de cultura cromogênico para Candida (Chromoagar):

Inocular as leveduras a serem identificadas no Chromoagar com auxilio da alça de platina
e incubar a 37°C, por 24 h.

RESULTADOS

Na identificação de fungos filamentosos:

Na placa de Agar Sabouraud observou-se no um fungo de textura aveludada,
formato rugoso, de coloração amarelada no verso, e no anverso com coloração rosa com
o centro esverdeado.
Na leitura do microcultivo foi observada uma estrutura como a do desenho abaixo,
que é sugestivo para Penicillium sp.

Na identificação de fungos leveduriformes:

-Prova do tubo germinativo: Não foi observado a formação de tubo germinativo, excluindo
a possibilidade de ser C. albicans ou C. dubliniensis.
-Zimograma: nesta prova foi observada a presença de bolhas somente no tubo da
dextrose e de maltose, colocando um resultado entre Candida albicans e Candida
parapsilosis,segundo a tabela de fermentação de carboidratos e as espécies
relacionadas.
-Auxinograma (assimilação de carboidratos):

1 – Celobiose (-) 4 – Inositol (-) 7 – Melibiose (-) 10 – Sacarose (+)

2 – Dextrose (+) 5 – Lactose (-) 8 – Rafinose (-) 11 – Trealose (+)
3 – Galactose (+) 6 – Maltose (+) 9 – Ramnose (+) 12 – Xilose (+)

Este resultado segundo a tabela com as espécie de fungos leveduriformes indica

ser Candida albicans ou Candida parapsilosis.

-Auxinograma ( Assimilação de nitrogênio):

Turvou na presença de peptona – sugerindo um FUNGO PATOGÊNICO
-Microcultivo de leveduras:
Na leitura da lâmina deve-se procurar estruturas de reprodução por toda a lâmina, esta
estrutura de reprodução neste caso possui características coloniais satélites como
aranha, e um aspecto arborescente.
-Teste da uréia: prova negativa
-Meio de cultura chromagar: Observa-se uma coloração roseada. Confirmando não ser C.
albicans.

DISCUSSÃO

A identificação de um fungo desconhecido isolado de uma amostra biológica não é

necessariamente difícil, se forem realizadas algumas observações preliminares. Na
maioria dos casos não é difícil diferenciar a colônia lisa, entre pastosa e mucóide, de uma
levedura que cresce sobre a superfície de um meio de isolamento primário da colônia de
aspecto cotonoso ou lanoso de um bolor. Todos os isolados devem ser considerados
potencialmente patogênicos; entretanto, certos grupos, incluindo fungos dimórficos,
dermatófitos e certos fungos filamentosos negros, de crescimento lento, estão quase
sempre relacionados com doenças quando recuperados de amostras biológicas. Portanto,
devem ser identificados sem qualquer dúvida, e os informes devem estar disponíveis o
mais rápido possível, para que o tratamento antimicótico possa ser instituído. Aspecto do
crescimento, velocidade de crescimento e pigmentação das colônias são observações
úteis para essa decisão inicial.
Nos fungos filamentosos o a identificação segundo a analise de microcultivo e do
macrocultivo indicou o fungo da espécie Penicillium. Nas espécies de Penicillium
pequenos conídios esféricos estão dispostos em longas cadeias, a partir das
extremidades de fiálides, cujas pontas são rombas e parecem cortadas. As colônias de
Penicilium usualmente apresentam diversas tonalidades de verde, embora tenham sido
encontradas variantes amarelas e marrom-amareladas. Em geral, é observada uma faixa
branca estreita na margem de crescimento externo da colônia.
Na análise de fungos leveduriformes a identificação sugeriu a espécie Candida
parapsilosis, uma das especies de candida diferentes de C. Albicans. Estas fazem parte
da microbiota normal de superfície cutâneas e mucocutâneas, e apenas em raras
ocasiões foram consideradas como agentes de doença clínica. Entretanto várias espécies
foram associadas a virtualmente todas as formas de candidíase. Em uma revisão de 1591
casos de candidíase divulgados em 37 trabalhos entre 1952 e 1992, verificaram que as
espécies de Cândida não-albicans haviam sido os agentes causais de 46% das infecções
sistêmicas; C. tropicallis foi responsável por 25% das infecções, C. glabrata por 8%, C.
parapsilosis por 7%, e C.kruzei por 4%.
Candida parapsilosis apresenta-se, desde os anos 80, como um importante
patógeno hospitalar de fungemias, sendo responsável por 7% a 15% das candidemias na
maioria das séries publicadas nos EUA e Europa. Sua ocorrência é ainda maior em
crianças e recém-nascidos prematuros internados em unidades de terapia intensiva, onde
a prevalência de candidemias por C. parapsilosis é de 17 a 50% dos casos.
Caracteristicamente, C. parapsilosis prolifera-se em soluções contendo glicose, tem
grande capacidade de produzir biofilme e freqüentemente coloniza a pele. Vários estudos
estabelecem claramente uma associação entre a utilização de cateter venoso em posição
central e maior ocorrência de fungemia por C. parapislosis. Isolados clínicos desta
espécie são sensíveis a anfotericina B e aos tiazólicos. Em países da América Latina C.
parapsilosis tem sido reconhecida como a segunda principal causa de infecção invasiva
em diferentes casuísticas já publicadas no nosso meio.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo:
Atheneu, 2005.

2. KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. São

Paulo: MEDSI, 2001

3. COLOMBO,A.L.; Guimarães,T. Epidemiologia das infecções hematogênicas por

Candida spp.Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.36 no.5 Uberaba Sept./Oct. 2003

4. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA: Detecção e Identificação dos

Fungos de Importância Médica. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_7_2004.pdf>
Acesso em: 15 nov. 2009