I mmunodifusion AGI D (Agar Gel I mmunodifusion Test)

Interaksi Antigen-antibody imunodifusiSalah satu uji serologi adalah imunodifusi precipitasi

test . Dalam metodeini menggunakan prinsip antigen-antibody. Antibody dalam metode ini
disebutprecipitins. Raksi yang terjadi jika antigen yang terlarut dan akan menimbulkansuatu
precipitasi. Jika partikel-partilek dari antigen berbentuk dalam larutan makareaksi yang
terjadi adalah terbentuknya cincin precipitasi.Reaksi precipitasi terjadi adanya kombinasi
antara antibody yang terlarutdengan substansi yang terdapat antigen. Hal yang perlu
diperhatikan dalamdeteksi ini adalah menggunakan gel agarose. Gel agarose ini digunakan
sebagaimatrix
combining

diffusion
precipitasi.Imunodifusi Antibodi dicampurkan di dalam agar. Antigen yangdimasukkan di
dalam lubang akan berdifusi dan bereaksi dengan antibodimembentuk lingkaran presipitasi
putih. Diameter lingkaran dapat dipakai sebagaiukuran konsentrasi antigen, bila
dibandingkan dengan larutan antigen yangdiketahui konsentrasinya.
Assay kompleks Ag-Ab
bertujuan mendeteksi antigen atau antibodi; cara inipaling banyak digunakan di bidang
diagnostik atau biomedis. Secara teknis relatif sederhana dan murah. Prosedur seperti reaksi
aglutinasi, imunodifusi ganda danpresipitasi berazaskan model ini. Biasanya dalam model ini
tidak menggunakanlabel dan kepekaannya terbatas, meskipun demikian reaksi imunodifusi
dapatmendeteksi 0,005 g protein/ml suspense.Alat dan bahan yang dgunakan dalam uji
serologis
immunodifusion
adalahsebagai berikut:1.

Agarose2.

Distilled water3.

Slide mikroskop4.

60
0
C5.

PBS (
Phospate Buffer Saline)
pH 7,2






1. UJI PRESIPITASI


Presipitasi adalah hasil kombinasi antara antigen terlarut dengan antibodi terlarut
menghasilkan suatu komplek yang terlihat(tidak larut)
Proses presipitasi pertama kali ditemukan oleh Kraus tahun 1897 saat kultur bakteri enterik
membentuk presipitat bila dicampur dengan antibodi spesifik.
Media : cair(zona ekuivalen) atau semisolid /gel(prozone effect)
Pembentukkan presipitat terjadi apabila konsentrasi Ag dan Ab seimbang (zona
ekivalen = ZE)
ZE sempit Ag bersifat mudah larut
ZE lebar Ag bersifat tdk mudah larut, BM besar, & multikomponen Ag
Konsentrasi Ag berlebih Komplek Ag-Ab yg terbentuk larut kembali disebut
postzone effect
Konsentrasi Ab berlebih Komplek Ag-Ab yg terbentuk tetap larut disebut prozone
effect
Faktor yg mempengaruhi :
Aviditas Ab stabilitas komplek Ag-Ab
Suhu (optimal 0-37
o
C)
pH (netral = 6-7,5), pH < 6 ; >7,5 mudah disosiasi
Molaritas (molaritas < 0,15 M) ; >0,15 M men-cegah presipitasi
.
Terdapat beberapa cara pengujian pada metode presipitasi, yakni:

A. Uji tabung
Dengan mencampur pada tabung, masukkan dilusi antigen atau antibodi dengan jumlah
tertentu. Dilusi dilakukan dari konsentrasi tinggi (tabung pertama) sampai konsentrasi
terendah (tabung terakhir). Presipitat timbul pada tabung yang mengandung Ag dan Ab
secara proporsional.
Contoh :uji CRP
B. Presipitasi Cincin
Antigen dilapiskan pada serum (antibodi), terjadi difusi setelah mencapai ikatan proporsional
dengan antibodi akan menghasilkan presipitasi berbentuk cincin.
C. Difusi Gel
Pada pengujian ini memungkinkan antigen dan antubodi berdifusi perlahan dari arah
tertentu melalui gel. Pada cara ini homogenitas dan derajat kemurnian dari berbagai antigen
dapat diuji. Pita presipitasi terbentuk pada setiap antigen dapat saling bertemu, atau
bersilangan menunjukkan:
- bersambungan, antigen identik secara imunologik (terhadap serum uji)
- bercabang, antigen berhubungan sebagian
- bersilangan, menunjukkan antigen tidak berhubungan


Metode difusi tunggal
Di sini anti serum dalam agar semi solid, zona buffer dari agar dan antigen terpisah secara
vertikal dalam tabung. Garis presipitasi terbentuk dalam zona buffer.
Imunodifusi ganda
Agar dituang pada plat. Dibuat sumur yang terletak ditengah dan sumur-sumur lain
disekitarnya.kemudian ke dalam sumur-sumur dimasukkan antigen dan ke dalam sumur yang
terletak ditengah dimasukkan antibodi.Pita presipitasi terbentuk dalam gel pada posisi Ag dan
Ab mencapai proporsi optimal setelah berdifusi. Dapat dimodifikasi dengan uji mikrodilusi
menggunakan obyek gelas
Immunoelektroforesis
Digunakan untuk mendeteksi Ag dan emisahkan fraksi protein(Ab) dalam serum.
Komponen serum dipisahkan dengan elektroforesis dalam agar gel .
Adapun tahapnya :Dibuat sumur sejajar dengan garis migrasi Ab,lalu ke dalam sumur
yang berisi Ab, dimasukkan antiserum,kemudian dibiarkan berdifusi dan membentuk
presipitas berbentuk busur,sehingga masing-masing fraksi dapat diidentifikasi secara terpisah
.
Elektroforesis "roket"
Metodepengukuran Ag secara kuantitatif,Tahapnya: dilakukan elektroforesis antigen ke
dalam gel yang telah mengandung antibodi. Terjadi reaksi Ag-Ab yang kemudian akan
mengendap pada titik optimum,sehingga apabila reaksi selesai ,presipitas tadi tampak sebagai
kerucut(roket).Panjang masing-masing roket menunjukkan konsentrasi antigen.
Immunodifusi radial tunggal
James Odin adalah orang pertama menggunakan gel untuk reaksi presipitasi, dan tehknik
pertama yang diperkenalkannya adalah single diffusion
Antiserum monospesifik ditambahkan ke dalam gel, kemudian dituang pada slide
petridisk atau lempeng plastik. Dibuat lubang gel, larutan antigen dimasukkan pada lubang.
Terjadi difusi sehingga terbentuk zona sirkuler yang menunjukkan jarak proporsional dengan
jumlah antigen yang ditambahkan pada setiap lubang. Kuantitasi antigen yang diperiksa
diketahui dari perbandingan cincin presipitasi dibandingkan dengan cincin presipitasi kontrol.


2. UJI AGLUTINASI
Teknik ini merupakan metoda klasik dalam penetapan antibody atau antigen
Ag bentuk partikel direaksikan dengan Ab spesifik membentuk Aglutinasi
Reaksi 2 tahap :
o Ab dgn salah satu antigen binding site (Fab) bereaksi dgn Ag
o Fab yg lainnya berikatan dgn Ag lain yg sudah berikatan dgn Ab gumpalan (lattice)
Faktor yang mempengaruhi: Muatan listrik protein,molaritas medium,vaksositas
media,dan fenomena prozone
Jumlah antigen & antibodi hrs seimbang
Contoh pemeriksaan:
o Widal,
o gol darah
o tes kehamilan
Macam-macam Aglutinasi
a. Aglutinasi Direk
Untuk menetapkan Ab terhadap Ag yang berupa partikel atau sel
contoh pemerksaan: reaksi Widal(deteksi antibodi terhadap S.tiphy),penyakit
hemolitik, tes rheumatoid faktor (IgM dan IgG), tes syphilis dan tes kehamilan.
Interpretasi:
Gumpalan Positif
Tidak ada gumpalan Negatif
b. Aglutinasi Indirek
Untuk menetapkan antibodi terhadap Ag yang larut dengan melekatkan dengan
antigen ini terlebih dahulu pada suatu partikel yang di sebut carrier.
Partikel yang digunakan dalam teknik ini adalah lateks, eritrosit, karbon dan lain-lain
Faktor yang mempengaruh: afinitas konjugat antigen terhadap carrier, waktu
inkubasi dengan serum penderita dan interaksi yang terjadi pada lingkungan mikro
(pH dan konsentrasi protein).
Contoh pemeriksaan: tes streptococcus grup A,Treponema pallidum,hormon
tiroid,dan deteksi anti-Hbs
Interpretasi:
Tidak ada gumpalan positif
Ada Gumpalan Negatif

c. Hambatan aglutinasi (Aglutination Inhibition)
Modifikasi teknik aglutinasi untuk mendeteksi antigen yang larut
Cara kerja:
1. serum atau cairan yang akan diperiksa direaksikan terlebih dahulu dengan antibodi
spesifik.
2. direaksikan dengan Ag yang dilekatkan pada suatu partikel.
3. Dilihat ada tidaknya aglutinasi
Interpretasi:
1. Ag yang ada pada serum atau cairan yang diperiksa, mengikat Ab spesifik sehingga
Ab tidak mampu lagi bereaksi dengan Ag pada permukaan partikel Uji
positif(+)/tidak terjadi aglutinasi
2. Apabila dalam serum atau cairan yang diperiksa tidak tedapat Ag, maka antibodi
yang bebas dapat bereaksi dengan Ag melekat pada permukaan partikel Uji
negatif(-)/terjadi aglutinasi
Contoh Pemeriksaan: uji kehamilan,penetapan FDP,mendeteks
berbagai virus seperti rubella, influenza ,parainfluenza, dan mumps
d. Aglutinasi Pasif Terbalik
Untuk menyatakan Ag yang larut dalam serum atau partikel lain.
Ab spesifik terhadap Ag bersangkutan dilekatkan pada permukaan
carrier,baik eritrosit maupun partikel lain.
Reaksi Aglutinasi
e. fiksasi komplemen

Reaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah
yang tidak dapat dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi.
Melekat pada permukaan sel pathogen dan berperan dalam penghancuran
dengan aktifitas lisis sistem komplemen
Tahap :
1. Pengikatan sejumlah komplemen oleh kompleks Ag Ab
2. Penghancuran Eritrosit yg telah dilapisi hemolisin(sebagai indicator) oleh
komplemen yang tersisa
Interpretasi
o sel darah merah ditambahkan dengan anti-red-cell-antibody, sel darah merah akan
lisis ketika ditambahkan komplemen tes negative(-)
o Serum mengandung antibodi maka complemen akan menfiksasi ikatan antigen dan
antibodi sehingga ketika ditambahkan anti-red-cell antibodi tidak menghasilkan
hemolisis Tes positif(+)
Contoh pemeriksaan :
- Sifilis
- Jamur (Blastomyces, Coccicioides, & Histoplasma)
- Virus Herpes
- Virus Rubella
- Tripanosoma
- Schistisoma

Reaksi pada teknik fiksasi komplemen
3. UJI MUNOFLOURESCENT
Merupakan kombinasi antara zat warna fluoresein dengan antibodi sehingga
menimbulkan warna pendaran ketika dilihat pada mikroskop dengan sinar ultra violet
Mereaksikan antibody dan antigen spesifik dan anti-antibodi yang dilabel dengan
Fluoresence Isothiocyanat (FITC) sehingga terpancar sinar warna hijau atau label
dengan Rodhamin menghasilkan warna merah
Fluorescent Antibody Technique (FAT) untuk penggunaan didalam mikrobiologi
telah diperlihatkan pertama kali oleh Coons, at all pada tahun 1942 dan mulai
diperkenalkan sejak tahun 1962 dalam bidang pemeriksaan parasitologi dengan
memakai tekhnik indirect fluorescent antibody test
Jenis sampel: serum, cairan ludah, cairan otak, cairan mata ,urine,mukosa usus,
mukosa mulut, dan dalam jaringan.
Jenis pemeriksaan : 1. Echerchia antibody,
2. Fluorescent Treponemal antibody (FTA)
3. Legionnella antibody
4. Mumps IgM antibody
5. Q Fever antibody
6. Rocky Mountain Spotted Fever antibody
7. Toxoplasma IgG antibody
8. Typhus antibody
Jenis-jenis Imunoflourecent:

1. Direct immunoflourescent :
Untuk pemeriksaan antigen
Ab dilabel dengan marker fluorescent Ab secara langsung diberikan pada jaringan
yg diinginkan
Cara Pemeriksaan.
1. Sel pada deck cover glass yang diinfeksi dengan virus difiksasi dengan aceton-
20
o
C selama 15 menit.
2. Cuci dengan PBS dan keringkan pada temperature ruangan sampai kering.
3. Masukan deck cover glass pada PBS yang mengandung 1%FCS dan biarkan 15
menit.
4. Siapkan serum sampel dan encerkan dengan PBS sesuai keperluan.
5. Teteskan 20l serum sampel di atas glass obyek.
6. Taruh deck cover glass di atas sampel dengan bagian sel di bawah dan letakkan
dalam kotak dan kertas yang telah dibasahi dengan air.
7. Inkubasi pada incubator denagan temperatur 37
o
C selama 45 menit.
8. Cuci dengan PBS 1%FCS selama 15 Menit.
9. Siapkan Konjugat fragmen Imunoglobulin dengan pengenceran 1:100l.
10. Teteskan Konjugat 20l di atas glas obyek dan letakkan deck cover glass di
atasnya.
11. Inkubasi pada incubator dengan temperatur 37
o
C selama 15 menit
12. Cuci dengan PBS 1%FCS selama 15 menit dan selanjutnya angkat deck cover
glass dan sentuhkan deck cpver glasspada kertas tissue agar airnya berkurang,
sehingga kering tapi basa.
13. Teteskan Glycerin 50% 20l di atas glass obyek dan selanjutnya deck cover
glass di taruh diatasnya dan langsung dilihat hasilnya dengan mikroskop fluorescent
pada pembesaran 40x. catatan preparat ini dapat disimpan pada 4
o
C sampai 2-3
minggu.

2. In-direct immunoflourescent
Untuk mendeteksi antibody terhadap jaringan atau komponen sel tertentu
Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji dengan Ab sekunder yang berlabel
(yang berikatan spesifik dg Ab pertama). Semakin banyak ikatan Ab
sekunder sinyal floresen semakin meningkat
Cara pemeriksaan:
1. Antigen mikroba diletakkan dalam kaca objek dan diberi bahan fiksatif
2. Serum pasien yang telah diencerkan diinkubasi bersama antigen pada
kaca objek, kemudian dicuci
3. Ditambahkan Antibodi berlabel flouresen (konjugat)
4. Kaca objek dicuci hemudian dikeringkan, kemudian dibaca dibawah mikroskop
flouresen
Preparat diamati adanya area terang berfloresensi warna hijau dan dibandingkan
dengan control positif dan negatif. Adanya floresensi hijau menandakan adanya
antibodi terhadap antigen.



RADIOIMMUNOASSAY
Radioimmunoassay pertama kali dikembangkan oleh Rosalyn Yalow
dan Solomon A. Berson dari amerika serikat, pertama kali mereka bekerja
untuk mempelajari tentang hormon khususnya insulin yaitu hormon yang
mengatur kadar gula dalam darah .
Teknik RIA merupakan cara diagnostik yang mampu mengukur
konsentrasi antigen maupun antibodi yang berkadar rendah, sehingga
memungkinkan untuk mendeteksi adanya kelainan tubuh secara dini.
Prinsip dasarnya dalah reaksi antara antigen dan antibodi di dalam
reaksinya adalah sifat kekhususannya, sebuah antigent yang bereaksi
dengan antibody yang spesifik untuknya dan tidak mengadakan reaksi silang
(cross reaction) dengan tipe antigent yang sama. Bahan pereaksi dalam
radioimmunoassay ialah antigen radioaktif dan antibody spesifik.
Terdapat dua cara pemeriksaan RIA:
A. Reaksi antigen antibodi dalam larutan (liquid phase )/Kompetitif
1. Antibodi diimobilisasi (ditempelkan) pada suatu fase padat misalnya dinding tabung
plastic
2. Sampel pasien Ag ditambahkan bersama dengan sejumlah tertentu Ag berlabel
radioaktif yang akan berinteraksi dengan antibodi yang timbul.
3. Ag-Ag berlabel-Ab bereaksi kompetitf dan membentuk kompleks Ag-Ab-Ag berlabel
4. Pemisahan kompleks Ag-Ab-Ag berlabel dengan mengendapkannya secara kimiawi
menggunakan ammonium sulfat,asam trichlorasetat/polietilen glikol,maupun
mereaksikannya dengan antibody kedua atau filtrasi dengan gel
B. Reaksi pada zat padat atau partikel (solid phase)/Non Kompetitif/Sandwich
1. Melekatkan Ag atau Ab pada suatu partikel
2. Mereaksikannya dengan specimen(Ag) yang akan di uji.
3. Ditambahkan Ab berlabel
4. Terbentuk kompleks Ab-Ag-Ab berlabel,lalu dipisahkan dan diukur radioaktivitasnya
5. Banyaknya Ab berlabel yang terikat pada kompleks merupakan kadar Ag dalam
spesimen
Keuntungan : Sensitivitas dan presisi yang tinggi ,Mudah dikerjakan,
Pekerjaannya lebih cepat dan tidak memerlukan sampel yang besar.
Kerugian : Reagen kurang stabil, Memerlukan proteksi terhadap bahan
radioaktif (radioactive hazardous)
Contoh pemriksaan : HBsAg,anti HBs,macam-macam
hormone,macam-macam pertanda ganas,dan IgE spesifik
ELISA
ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva
Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di
dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor.
Untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu
sampel dengan menggunakan enzim
Syarat Enzim:tidak boleh mengurangi sifat imunologi Ag/Ab,didapat dalam keadaan
murni,bersifat stabil.
Contoh Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase,,glukosa oksidase,dan beta
galaktosidase
Prinsip ELISA: mereaksikan (Ag) dalam sampel dengan Ab yang dilabelkan dengan
enzim.Kompleks Ag-Ab enzim yang terbentuk kemudian dipisahkan ,lalu diinkubasi
dengan substrak kromeogenik yang berwarna ketika dihidrolisis dengan
enzim.Intensitas warna yang terbentuk diukur dengan alat Colorimetri
dan merupakan parameter Ag yang diuji
Contoh pemeriksaan : utk deteksi fungsi hati, fungsi trombositopenia,
gangguan fungsi hormonal
Jenis-jenis ELISA:
A. Metode Kompetitif
Untuk menguji antigen
Tahapnya:
1. Ab spesifik dilekatkan pada partikel(benda padat) seperti bagian dalam dinding
tabung atau sumur
2. Sampel(serum) bersama Ag berlabel enzim direaksikan dengan Ab tersebut.Ag
dalam specimen apabila ada akan bersaing dengan Ag enzim untuk mengikat Ab
3. Setelah reakan yang tidak bereaksi dibuang dengan pencucian,dimasukkan
substract,lalu diinkubasi.Hidrolisis substrat oleh enzim yang terikat pada kompleks
akan menyebabkan perubahan warna,dan intensitas perubahan warna merupakan
kadar Ag enzim yang terikat dan merupakan parameter Ag dalam sampel.


A. Metode Non Kompetitif
Untuk menguji Ab
Tahapnya:
1. Ag dilekatkan pada permukaan benda padat
2. Spesimen yang mengandung Ab direaksikan dengan Ag tersebut,setelah itu
kelebihan specimen dicuci
3. Antiimunoglobulin yang dilabel enzim dimasukkan kemudian diinkubasi dan
kelebihannya dicuci
4. Setelah itu dimasukkan substract kromogenik yang selanjutnya dihidrolisis oleh
enzim yang terdapat pada kompleks Ag-Ab-Ag enzim.Banyaknya substrat yang
dihidrolisis sesuai dengan banyaknya enzim pada kompleks,sehingga hal itu dipakai
sebagai parameter kadar Ab dalam specimen.


C. Metode Sandwich
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak
terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik
dengan antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan,
yang akan berikatan dengan antibodi primer
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat
dapat dibuang
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi
sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan
kuantitas dari antigen