ELECTROFOREZA

2
Electroforeza = metoda ce se bazeaza pe
migrarea componentilor dintr-o proba, supusa
unei diferente de potential, intr-o solutie sau
printr-un suport solid poros (hartie
cromatografica, gel), separarea explicandu-se
prin vitezele de migrare diferite ale
componentilor incarcati electric pozitiv sau
negativ, care sunt atrasi de polii opusi ai
campului electric, proportional cu natura,
marimea si sarcina lor.
3
Mobilitatea electroforetica
= viteza cu care se deplaseaza particulele
purtatoare de sarcini electrice, in camp electric in
conditiile experimentale date


In care:
d = distanta de migrare parcursa in timpul t (m);
E = gradientul de potential (V/m);

0
= mobilitatea electroforetica (m
2
/V/s).

E t
d

4
Mobilitatea electroforetica vatriaza functie de :
Factori ce depind de particula:
marimea
natura
forma
sarcina
gradul de hidratare si disociere
coeficientul de frecare


5
Mobilitatea electroforetica vatriaza functie de :
Factori ce depind de solutia de electrolit:
natura
concentratia
forta ionica
pH-ul
vascozitatea
temperatura
6
Tipuri de electroforeza
Electroforeza de frontiera
Electroforeza zonala sau pe suport Utilizata in principal pentru unele studii
fundamentale privitoare la natura si puritatea
proteinelor
Principui: migrarea proteinelor intr-o solutie
tampon de electroliti, intr-un aparat cu o celula
in forma de U din stical transparenta astfel
incat sa se poata observa migrarea proteinelor
cu un spectrometru/ spetrofotometru

7
Solutie de
electrolit
Solutie de
proteine
A+B+C
+ - - +
A+B+C
A+B
A
B+C
C
8
Electroforeza zonala
Migrarea analitilor este stabilizata de faptul ca
lichidul in care se produce, se gaseste intr-un suport
sau mediu poros (acetat de celuloza sub forma de folii,
hartie de filtru speciala, gel)

Avantaj: pe aceste suporturi se pot identifica mai
usor zonele de migrare sau zonele de concentartie
9
Electroforeza orizontala pe suport
+ -
Elecrtozi
Banda
suport
Placi de sticla
pentru fixarea
benzii
Bacuri
cu electroliti
10
Factori care influenteaza electroforeza
Natura moleculelor separate
Marimea moleculelor
Mobilitatea
Natura
Sarcina
Aparatura
suportul
11
Factori care influenteaza electroforeza
Curentul electric
Deplasarea electroforetica este proportionala cu
Mobilitatea
Campul electric
Timpul de trecere a campului electric


d = distanta parcursa de particula
U
0
= mobilitatea particulei (V/cm)
E = tensiunea (V)
t = timpul de trecere al curentului
t E U d
0
12
Factori care influenteaza electroforeza
pH - ul
In cazul acizilor si bazelor tari (electroliti tari)
pH-ul nu influenteaza migrarea
Natura solutiei
natura sarurilor
natura acizilor
natura bazelor influenteaza
natura altor substante mobilitatea
existente in solutie

13
Electroforeza pe gel
14
Electroforeza capilara
Cea mai noua si mai utilizata tehnica electroforetica
utilizata pentru separarea speciilor incarcate cu sarcini
electrice
Pentru efectuarea separarilor se efectueaza un
montaj automatizat ale carui elemente principale sunt:
tub capilar
sistem de introducere a probei
sistem de detectie
electrozi de platina
sursa de alimentare cu curent
15
Electroforeza capilara
16
Avantajele electroforezei capilare:
timpi de analiza relativ scurti;
volume mici de proba;
cantitati mici de solventi (tampon);
posibilitatea automatizarii intregului ciclu de
analiza;
poate opera atat in medii apoase cat si in medii
neapoase;
detectia se face in capilar (UV);
sensibilitate inalta.
17
Fluxul electroosmotic
La pH > 3 peretele capilarului se incarca
negativ acumularea de sarcini pozitive la
suprafata fluxului de lichid de electroliti, in
contact cu peretele capilarei = fluxul
electroosmotic
fluxul electroosmotic se deplaseaza in
directia catodica

18
Peretetle
capilarului
Stratul
rigid
Stratul
de difuzie
19
Fluxul electroosmotic este influentat de:
Compozitia solutiei de electroliti
pH
forta ionica
vascozitatea
forta dielectrica
Temperatura
Introducerea unor aditivi

20
Analitii purtatori de sarcini sau ionizati sufera
doua deplasari care se insumeaza sau se
exercita in sens contrar:
o deplasare datorita mobilitatii lor
electroforetice
o deplasare datorita mobilitatii fluxului
electroosotic

OBS: analitii neincarcati cu sarcina se
deplaseaza doar sub actiunea fluxului
electroosmotic
21
Miscarea unui analit incarcat pozitiv
+
-
+
+
-
Miscarea unui analit neutru
Miscarea unui analit incarcat negativ
+
-
-
U
ep
= mobilitatea electroforetica

U
eo
= mobilitatea electroosmotica
U
R
= mobilitatea rezultanta
22
Separarea unui amestec de cationi, anioni
si compusi neutrii
+
+
-
-
cationi
neutrii
anioni
R
a
s
p
u
n
s
u
l

d
e
t
e
c
t
o
r
u
l
u
i

Timpul de migrare
23
Capilarul
Este din silice si este acoperit la exterior cu un
strat de poliimida pentru a-i oferi rezistenta si
flexibilitate
Stratul de poliimida este intrerupt in dreptul
detectorului
Lungimea sa poate varia intre 10 si 100 cm
Diametrul interior intre 25 si 100 m
Pentru realizarea de separari reproductibile
capilarul este fixat intr-o incinta termostatata

24
Mediul de migrare
Este o solutie apoasa de electroliti-tampon sau un
gel impregnat cu o astfel de solutie
Pentru optimizarea separarii sau a detectiei se
poate varia pH-ul sau forta ionica, sau se pot
adauga diversi compusi solutiei de electroliti:
solventi organici
agenti tensioactivi anionici / cationici
ciclodextrine
agenti chelanti / sechestranti
compusi ionici continand cromofori si fluorofori
sau grupari electroactive care sa faca posibila
detectia

25
Sistemul de introducere a probei
Cantitatile de proba injectate sunt de
ordinul a cativa nL
Introducerea probei se poate face:
Manual
Hidrodinamic
Electromigrare
26
Sursa de alimentare cu curent
Curentul este furnizat de un generator de
curent continuu si poate atinge 30 kV
Utilizarea unor tensiuni inalte este posibila
datorita:
diminuarii efectului Joule din cauza
rezistentei mari a capilarei din silice
dispersarea buna, eficienta a caldurii intre
suprafata mare a peretilor capilarei si
volumul mic de solutie de electrolit care
umple capilara
27
Sistemul de detectie
Se utilizeaza detectori:
spectofotometrici
spectrofluorimetrici

electrochimici de conductivitate
SM

Mai putin
utilizate
Cele mai
utilizate
28
APLICATII
29
Separarea unui amestec de cationi
30
Separaea unui amestec de vopsele
31
Separarea unui amestec de compusi
aromatici
32
Separarea unui amestec de medicamente
anti-SIDA