PRACTICA # 4 LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA POLIFENOLOXIDASA COMO INDICADORA DEL EFECTO DEL MANEJO DE LOS PRODUCTOS HORTOFRUTICOLAS EN CAMPO Y DE SU TRASLADO

A LOS CENTROS DE ACOPIO

INTRODUCCION La cosecha y el manejo del material vegetal causa inevitablemente daos que traen como consecuencias superficies cortadas, rotas, abrasiones y magulladuras. La subsecuente disrupcin de las clulas expone a las enzimas y sus sustratos a condiciones diferentes de su medio ambiente celular. En muchos casos, las enzimas pueden ponerse en contacto con sustratos potenciales, de los cuales estn normalmente separadas por barreras a base de membranas. Como consecuencia se lleva a cabo una serie de reacciones indeseables tales como: la produccin de etileno, cicatrizacin de heridas, cambios de coloracin, y el desarrollo de aromas y sabores desagradables en el tejido daado. Entre las reacciones indeseables que ocurren en las clulas daadas de algunos frutos se encuentran aqullas que involucran la oxidacin de compuestos fenlicos por medio del sistema enzimtico llamado Polifenoloxidasas, que dan como resultado la formacin de productos finales de color caracterstico. El sistema enzimtico polifenoloxidasa (E.C.1.10.3.2) es tambin conocido como fenolasa, tirosinasa y catecoloxidasa. La naturaleza de estas enzimas es de oxidorreductasas, se encuentran dentro del grupo de las hidroxilasas y se considera que estn asociadas principalmente con los cloroplastos y otros plastos. Un ejemplo tpico es la formacin de melaninas a partir de la tirosina mediante una cadena de reacciones de las cuales las dos primeras son catalizadas por una polifenoloxidasa: Tirosina 3-4-dihidroxifenilalanina 3-4-dioxifenilalanina cido 5-6-dihidroxidihidroindol-2-carboxlico cido 5-6-dioxidihidroindol-2-carboxlico (de color rojo) cido 5-6-dihidroxindol-2-carboxlico 5-6-dihidroxi-indol melaninas (pardo oscuro - negro) La formacin de las melaninas es responsable del desarrollo de la coloracin negra o gris en las clulas daadas del tubrculo de papa y de otros materiales vegetales. Otros sustratos comnes para las polifenoloxidasas son: el cido clorognico y el cido paracumaril-qunico, sin embargo, los pigmentos derivados de ellos no tienen colores vistosos. El color marrn de las manzanas magulladas resulta probablemente del uso de los flavanos como sustratos, mientras que en el caso de los pltanos, el principal sustrato es la dopamina y, en algunas bayas el principal sustrato lo constituyen las antocianidinas. La reaccin con estas ltimas conduce a la prdida de pigmentacin

deseable de los frutos. La presencia de las polifenoloxidasas y sus sustratos potenciales trae como consecuencia el inevitable cambio de coloracin del tejido daado. Se ha reportado que este sistema enzimtico es muy sensible al pH, de ah que no se observen las reacciones antes mencionadas en frutos como los ctricos, ya que su pH es demasiado bajo, lo cual inhibira a la enzima.

OBJETIVO El estudiante determinar la ausencia o presencia de la enzima polifenoloxidasa en diversos productos hortofrutcolas. El estudiante determinar los efectos del manejo postcosecha de los productos hortofrutcolas sobre la actividad de la enzima polifenoloxidasa. El estudiante se familiarizar con los mtodos de manejo de enzimas en el laboratorio. MATERIAL Material vegetal (9 pltanos, 9 manzanas, 9 papas, 9 naranjas, 1 2 productos por equipo) 1 extractor de jugos 1 licuadora 2 vasos de precipitados de 500 mL 6 vasos de precipitados de 50 mL Hielo Buffer fosfato PO4 (pH 6.5) Tela para hacer queso (gasa, estopilla, o manta de cielo) Catecol en buffer fosfato (PO4) 0.5M Guantes de cirujano 6 Pipetas de 1 mL 2 propipetas 4 cubetas para espectrofotmetro papel seda toallas de papel espectrofotmetro. Se realizarn las lecturas a 420 nm. 9 cuadritos de Parafilm

METODO TRATAMIENTOS Escoja al azar tres productos de la misma especie. Arroje al suelo cada uno de ellos desde una distancia aproximada de un metro de altura. Escoja otros tres productos de esa misma especie al azar y entierre su ua en unas cuatro regiones diferentes. Los otros tres productos servirn como testigos. Todos los productos se almacenarn a temperatura ambiente y los tratamientos se aplicarn al empezar la sesin de laboratorio. La extraccin de la enzima contenida en el producto debe ser inmediatamente despus de cada tratamiento.

EXTRACCION DE LA POLIFENOLOXIDASA 1.- Homogenice 2.5 g de tejido vegetal en 10 mL de buffer PO4 a pH 6.5 fro. 2.- Exprima el homogeneizado a travs de la gasa. Mantenga el homogeneizado en un bao de hielo. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA POLIFENOLOXIDASA 1.- El sustrato es catecol .06M en buffer PO4 (pH 6.5). Djese reposar 2 horas antes de usarse (0.3303 g/50 mL) a temperatura ambiente. 2.- Tome 0.5 mL del extracto de polifenoloxidasa (proveniente de los productos hortofrutcolas bajo estudio) y permita que adquiera la temperatura del laboratorio. 3.- Aada 0.1 mL del extracto de enzima (a temperatura ambiente) a 8.9 mL de sustrato en la cubeta del espectrofotmetro en caso de que dicha cubeta tenga 9 mL de capacidad. Mzcle rpidamente. 4.- Mida el aumento en absorbancia a 420 nm por 2 minutos a intervalos de 15 segundos. 5.- Calcule el cambio en densidad ptica (O.D.) por minuto por gramo de peso fresco (gpf). Grafique el cambio en O.D. por minuto por gramo de peso fresco (eje de las Y's) contra el tiempo (eje de las X's). REPORTE Se elaborar un reporte siguiendo las normas de un artculo cientfico: Ttulo Resultados Discusin Conclusiones Literatura Consultada

BIBLIOGRAFIA Burton, W.G. (1982). Physiological Responses to Stress and Disease. In: PostHarvest Physiology of Food Crops. Cap. 9. ed. Longman,E.E.U.U. pp. 218-219. Grisebach H. y K. Hahlbrock (1974). Metabolism and Regulation of Secondary Plant Products. In: Enzymology and Regulation of Flavonoid and Lignin Biosynthesis in Plants and Plant Cell Suspension Cultures. Runeckles, V.C. (ed.) Recent Advances in Phytochemistry. Vol. 8. ed. Academic Press. Londres, pg. 33. IUB Enzyme Nomenclature (1979). Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry on the Nomenclature nd Classification of Enzymes. Academic Press Inc. Londres pp. 105. Stafford, H.A. and I. Ragai K. (1992). Phenolic Metabolism in Plants. In: Helen A. Stafford and Ibrahim Ragai K. (eds.) Proceedings of the Thirty-first Annual Meeting of the Phytochemical Society of North America's Symposium on Phenolics. Recent Advances in Phytochemistry V. 26. Plenum Press, E.E.U.U. 411pp.

PREPARACIN DEL BUFFER:

5.68 g de KH2PO4

Buffer Fosfato .06M 4.16 g de K2HPO4 . 3H2O ajustado a pH de 6.5 para 1000 mL.

Sustrato Catecol .06M:

6.6606g de catecol en 1000 mL de buffer fosfato .06M