ISPIT II deo (elektrohemija i separacija)

Elektrohemija: 15 pitanja Maks.: 25 bodova Min.: 13 bodova Separacija: 5 pitanja Maks.: 10 bodova Min.: 6 bodova

Zavrni ispit
Maks.: 25 + 10 = 35 Min: 13 + 6 = 19

Instrumentalne metode

SEPARACIONE METODE

dr Nataa Peji, vanr.prof.

2

PLAN PREDAVANJA
Uvod u separacione instrumentalne metode Principi razdvajanja Elektroforeza (princip i podela) Hromatografija (princip i podela)

LITERATURA
1. M. Medenica, D. Maleev, Eksperimentalna

fizika hemija www.pharmacy.bg.ac.rs/predmeti/instrumentalne metode (5MRF20INM)/Udbenik: M. Medenica, D. Maleev: Eksperimentalna fizika hemija 2. M. Medenica, Skripta: Instrumentalne metode, deo C

INSTRUMENTALNE METODE

Optike
(spektroskopske i nespektroskopske)
(refrakcija, rotacija, apsorpcija, emisija, difrakcija, rasipanje)

Elektroanalitike
(Q, U, I, )

Separacione

VE STE NAUILIIM
Detekcija i merenje karakteristinog signala za kvalitativnu i kvantitativnu analizu

SEPARACIONE METODE
"Klasine" Instrumentalne

Destilacija, ekstrakcija, itd.

Hromatografija, elektroforeza, itd.

Kvalitativna analiza: Boja, rastvorljivost, Tm, Tk, indeks refrakcije, itd. Kvantitativna analiza: Gravimetrijska i titrametrijska merenja

Kvalitativna analiza: tR, VR, oblik pika Kvantitativna analiza:

Merljive fiziko-hemijske osobine (provodljivost, potencijal, apsorbancija, fluorescencija, itd.)

SEPARACIONE METODE
CENTRIFUGA ( (veliini, obliku)) MASENA SPEKTROMETRIJA ( m/e)

HROMATOGRAFIJA

ELEKTROFOREZA

U analitike i preparativne svrhe

7

HROMATOGRAFIJA

Gasna hromatografija (GC)

Tena hromatografija (LC i HPLC)

Fluidna hromatografija pri superkritinim uslovima (SFC)

ELEKTROFOREZA

Planarna

Kapilarna

Osobine molekulaosnova za separaciju

VELIINA (MASA) Ultrafiltracija Ultracentrifugiranje Hromatografija iskljuenjem

NAELEKTRISANJE Elektroforeza Jonoizmenjivaka hromatografija Masena spektrometrija

POLARNOST Tena hromatografija Gasna hromatografija

OBLIK Afinitetna hromatografija Imunohemijske metode Enzimske metode

ELEKTROFOREZA

Elektrokinetika pojava Kretanje koloidnih i drugih naelektrisanih estica kroz neku sredinu (rastvor, gel i sl.) uslovljeno prisustvom i delovanjem homogenog elektrinog polja

Metoda Separaciona metoda razdvajanje komponenata smee (naelektrisanih estica istog, ili predznaka) u polju jednosmernog elektrinog napona
10

10

Istorija Istorija
Arne Tiselius 19021971

elektroforeza
. 37 19
4 a 19 ov jus eli Tis lija e 8.

pokretne granice (slobodna)

Nobelova nagrada za hemiju (elektroforeza pokretne granice razdvajanje smee serum proteina)

Problemi: :: Problemi Problemi: Problemi

nekompletna separacija (mnogi proteini imaju isto ukupno naelektrisanje komplikovana aparatura i skupa

Zbog toga ZONSKA

11

Princip Princip

RAZDVAJANJE KOMPONENATA SMEE NA OSNOVU:

PREDZNAKA NAELEKTRISANJA (KATJONI KA KATODI ANJONI KA ANODI)

POKRETLJIVOSTI ESTICE ISTOG PREDZNAKA

ZAVISI OD: KOLIINE naelektrisanja veliine i oblika estice jaine elektrinog polja T, karakteristika potporne sredine

na osnovu razliitih M proteina (SDSPAGE)

12

12

Podela Podela
ELEKTROFOREZA Prema nainu izvoenja
Elektroforetske tehnike:

Zonska (na vrstoj podlozi) (pokretljivost) Pokretne granice pH=const.

Slobodna (u rastvoru)

Izotahoforeza ( elek. pokretljivost) pHLpHT)

Izoelektrino fokusiranje ( pI) pH const.

papir, gel

kapilara

u kapilari
Zonska elektroforeza je sli slina hromatografiji, hromatografiji, osim to je migracija uslovljena dejstvom elektri elektrinog polja, umesto mobilnom fazom

13

13

Podela Podela
ZONSKA ELEKTROFOREZA Prema obliku podloge
1 1
Planarna Kapilarna

2 2

Podloga: papir, celuloza-acetat, polimerni gel (L: 210 cm) potopljena u pufer jednostavna spora ne moe se automatizovati loa kvantifikacija potrebne velike koliine uzorka (L)

kapilara (L: 40100 cm, R: 2575 m) kvarc koji sadri sinanolne grupe kompleksna brza moe se automatizovati dobra za kvantitivnu analizu potrebne male koliine uzorka (nL)

14

14

VE STE NAUILIFH HROMATOGRAFIJA

PROCES U kome dolazi do razdvajanja komponenata smee tako da komponente u veoj (ili manjoj) meri prelaze u drugu fazu sa kojom je smea dovedena u dodir METOD
Razdvajanje Izolovanje Identifikaciju Odreivanje u preparativne svrhe kvalitativna kvantitativna

Razdvajanje komponenata smee izmeu DVE FAZE razliite pokretljivosti (stacionarne i mobilne) faze
15

15

Istorija Istorija
Mikhail Tswett (18721919)

hromatografija adsorpciona

19 06 .g

od .

razdvajanje sastojaka zelenog lia (hlorofil, ksantofil) CaCO3 kao adsorbens, petrol-etar/etanol kao mobilna faza odvojeni pigmenti (obojene trake u koloni)
16

16

VE STE NAUILIFH PRINCIP

Rastvor analizirane smee u MOBILNOJ fazi proputa se kroz STACIONARNU fazu Raspodela komponenata uzorka (rastvorljive u mobilnoj fazi) izmeu faza uzrokovana je fiziko-hemijskim procesima: ADSORPCIJA PODELA IZMEU DVA RASTVARAA (RASTVORLJIVOST), ili JONSKA IZMENA POSLEDICA Komponente smee se raspodeljuju izmeu faza i pod uticajem mobilne faze kreu se kroz stacionarnu fazu brzinama
Prelazak komponente izmeu faza deava se sve dok odnos cs i cm (NERNSTOV KOEFICIJENT RASPODELE) ne dostigne const. vrednost

K =

cs cm

K = f (prirode komponenti, osobina faza, T i afiniteta komp. prema fazama)

17

17

Podsetiti se:
Teorijski principi i tehnike izvoenja adsorpcione, particione i jonoizmenjivake hromatografije

1. M. Medenica, D. Maleev, Eksperimentalna fizika hemija www.pharmacy.bg.ac.rs/predmeti/instrumentalne metode (5MRF20INM)/udbenik.pdf

M. Aleksi, Hromatografija-teorijski principi

www.pharmacy.bg.ac.yu/predmeti/fizika_hemija/predavanja_200708/Hromatografija skripta. pdf
18

18

VE STE NAUILIFH Faze (stacionarna i mobilna) u hromatografiji:

ne meaju se imaju pokretljivosti

MOBILNA FAZA gas tenost

STACIONARNA FAZA
vrsto telo ( porozno ili granulisano) sloj tenosti adsorbovan na vrstom telu jonoizmenjiva

19

19

Podela Podela
HROMATOGRAFIJA Prema mehanizmu razdvajanja

Adsorpciona
adsorpcioni koeficijenti
u koloni

Podeona(particiona) Jonoizmenjivaka
koeficijenti rastvorljivosti afinitetu sastojaka prema jonskoj izmeni
u koloni

U koloni Na hartiji i na tankom sloju

20

20

Adsorpciona hromatografija
Razdvajanje zasnovano na razlici u afinitetu adsorpcije sastojaka uzorka prema povrini vrste faze (razdvajanje na osnovu adsorpcionih koeficijenata)

Ovde je delimi delimino zastupljen i proces adsorpcije

Podeona hromatografija

Razdvajanje bazirano na razlici u rastvorljivosti sastojaka uzorka

Gasna hromatografija razlike u rastvorljivosti sastojaka uzorka u nepokretnoj (STACIONARNOJ) fazi Tena hromatografija razlika u rastvorljivosti sastojaka uzorka u pokretnoj (MOBILNOJ) i nepokretnoj (STACIONARNOJ) fazi

Jonoizmenjivaka hromatografija
Razdvajanje bazirano na razlici u afinitetu sastojaka uzorka prema jonskoj izmeni
21

21

Podela Podela
HROMATOGRAFIJA Prema fizikom stanju mobilne i stacionarne faze

Gasna (mobilna) Gasno tena Gasno vrsta

Tena (mobilna) Teno tena Teno vrsta

22

22

Podela Podela
HROMATOGRAFIJA Prema obliku hromatografske podloge

Planarna
(hromatografija otvorene podloge)

U koloni
(kapilara i punjena kolona)

Stacionarna:
Kristalna voda inkorporirana u silika-gel H2O kojom je natopljena traka filter-papira

Stacionarna:
Kapilara: film tenosti ili vrsti adsorbens Punjena kolona: vrsti zrnasti materijal

Mobilna: tenost koja se kree pod dejstvom kapilarnih sila, ili zemljine tee

Mobilna: tenost koja se kree pod dejstvom sile zemljine tee i /ili p

23

Podela Podela
Prema primenjenoj radnoj tehnici
ELUIRANJE

FRONTALNA ANALIZA Na stacionarnu fazu se const. dodaje RASTVOR UZORKA i samo komponenta koja se najbre kree dobija se u istom stanju RETKO SE KORISTI

ISTISKIVANJE Na stacionarnu fazu se nanosi rastvor uzorka, a onda supstancija koja istiskuje komponente uzorka i tako ubrzava njihovo kretanje SAMO KVALITATIVNA

Uzorak se unosi u kolonu, jedan kraj papira, ili tankog sloja vrste stac. faze i ISPIRA MOBILNOM FAZOM (ELUENTOM) KVALITATIVNA I KVANTITATIVNA

24

24

ELUIRANJE (ispiranje; RAZVIJANJE!!!)

glavna tehnika razdvajanja kod hromatografije u koloni podrazumeva ispiranje prisutnih molekulskih vrsta kroz kolonu stalnim dodavanjem istog rastvaraa proces moe biti zaustavljen dok su svi sastojci uzorka jo na podlozi, ili se moe nastaviti dok svi sastojci ne napuste hromatografsku podlogu

ELUENT MOBILNA FAZA kojom se vri ispiranje

ELUAT RASTVOR koji IZLAZI iz kolone

1) izokratsko: uvek ista mobilna faza 2) gradijentno: sastav mobilne faze se menja za vreme eluiranja
(npr. 50% metanol (5 min), 60% metanol (drugih 5 min), 70% metanol (treih 5 min), itd.)
25

25

ELUIRANJE

DETEKCIJA
Na kraj kolone postavi se detektor koji reaguje na prisustvo analita: signal detektora u funkciji vremena daje dijagram sa nizom pikova

HROMATOGRAM DETEKTORureaj koji meri promene

u sastavu eluata merenjem nekih fiziko-hemijskih osobina
26

26

HROMATOGRAFIJE U KOLONI

Gasna hromatografija (GC)

Tena hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC)

27

27

HROMATOGRAFIJA OSNOVNI ZAJEDNIKI POJMOVI

28

28

HROMATOGRAF
Ureaj kojim se vri hromatografsko razdvajanje komponenata smee

GC(HP) LC(HP)

HPLC(HP)

29

29

HROMATOGRAM

Zone (razdvojene komponente) rasporeene u stacionarnoj fazi (u planarnoj hromatografiji: papir, ili tanki sloj na kome su zone)
unutranji

Grafiki prikaz odziva detektora (koncentracije analita u eluatu ili neke druge veliine (srazmerne koncentraciji)) u funkciji vremena ili zapremine eluata OD = f(t), tj. c = f(t) OD = f(V), tj. c = f(t) spoljanji
30

30

Tipovi hromatograma

i kod elektroforeze

1 1

UNUTRANJI sastojci analize: prelaze udaljenosti na podlozi za isto vreme detektuju se na samoj podlozi

SPOLJANJI

2 2

sastojci analize: prelaze isti put u vremenu detektuju se van podloge

hromatografija u koloni planarna hromatografija

31

31

2 2 A A
Diferencijalni c = f(t)

SPOLJANJI HROMATOGRAM Integralni Ukupna koliina = f(t) detektor belei ukupnu koliinu izeluiranih sastojaka u vremenu

B B

detektor belei promenu koncentracije komponente (u mobilnoj fazi) u funkciji vremena eluiranja
OD
c/mmolcm
-3

OD
c/mmol
t

32

32

Diferencijalni i integralni hromatogram

A A

B B

33

33

HROMATOGRAM
Grafiki prikaz (zapis) hromatografskog razdvajanja

Veliina merenog signala (OD) u funkciji vremena zadravanja komponente smee u koloni t ili

Veliina merenog signala (OD) u funkciji zapremine mobilne faze koja je potrebna da eluira komponentu iz kolone V
34

34

KARAKTERISTIKE HROMATOGRAMA (hromatografskog pika)

Pik = hromatografska kriva deo diferencijalnog hromatograma koji belei detektor pri eluiranju jednog sastojka iz kolone

1 1 2 2 3 3 4 4

mrtvo vreme

retenciono vreme (nekorigovano i korigovano)

retenciona zapremina (nekorigovana i korigovana)

retencioni faktor

35

35

Retencija (zadravanje)
Komponente se razdvajaju jer se zadravaju u stacionarnoj fazi razliito vreme

1 1
Retenciono vreme

mrtvo vreme vreme od momenta unoenja uzorka do pojave pika mobilne faze

2 2
Retenciono vreme

Nekorigovano rastojanje od starta do pika date kom.

Korigovano rastojanje od pika prazne zapremine do pika date komponente

3 3
Retenciona zapremina
36

36

Karakteristike hromatograma

Definicije
OD
t0 mrtvo vreme(retenciono vreme u mobilnoj fazi) tR ukupno vreme zadravanja, od trenutka ubacivanja uzorka do max. pika

t0

tR korigovano retenciono vreme (retenciono vreme u stacionarnoj fazi) h visina pika ( rastojanje izmeu osnovne linije i vrha pika ) W irina pika W0,5 irina pika na h

t/min Vazduni pik (kod GC) Prazna zapremina

37

37

zi a zr i ki i t a em t a

2 2

RETENCIONO VREME (L/v)

t R = t + t0
, R

REDUKOVANO (KORIGOVANO) RETENCIONO VREME

t = tR t0
, R
mobilne faze

t0 (L/u) vreme od momenta unoenja uzorka do pojave pika

38

38

Karakteristike hromatograma
VR

OD

Definicije
VR,
V0 prazna zapremina (zapremina mobilne faze koja bez zadravanja stie do detektora) VR zapremina mobilne faze potrebne da se data komponenta eluira iz kolone VR korigovana retenciona zapremina

V0

V/mL

Prazna zapremina
39

39

zi a zr i ki i t a em t a

3 3

RETENCIONA ZAPREMINA

VR = VR, + V0

VR = t R u
u brzina protoka mobilne faze (cm3 s1)

REDUKOVANA (KORIGOVANA) RETENCIONA ZAPREMINA

VR, = VR V0

VR, = t r, u
40

40

4 4

RETENCIONI FAKTOR (k')

Mera zadravanja komponente u koloni

Def.

Matematiki izraz

t R t0 t k = = t0 t0
,

, R

41

41

Vrste hromatografije u zavisnosti od sistema koji se analizira

Ispitivani sistem Gasovi i isparljive supstancije Supstancije razliitog hemijskog tipa Supstancije slinog hemijskog tipa Neorganske i jonske supstancije

Vrsta hromatografije Gasna Podeona Adsorpciona Jonoizmenjivaka Hromatografija na tankom sloju i papiru Jonoizmenjivaka i gel hromatografija Gel hromatografija
42

Jonske od nejonskih Bioloki uzorci i jedinjenja velike M

42

HROMATOGRAFSKA ANALIZA

Va Vano za hromatografsku hromatografsku analizu analizu:

vrsta stacionarne faze; sastav i priroda mobilne faze sastav i priroda analiziranog uzorka tehnika injektiranja uzorka i injektorski sistem (posebno kod GC) T, p, brzina protoka mobilne faze izbor detektora (osetljivost) hromatogram

43

43

PRIMENA HROMATOGRAFIJE
Kvalitativna analiza
identifikacija (preko tR, t'R, VR,V 'R, oblika pika) tR je karakteristina vrednost na T = const., protoku i za datu kolonu dodatne identifikacije pomou IR, NMR ili MS

Kvantitativna analiza

odreivanje koliine na osnovu h = f(c), P = f(c) (automatski (pomou integratora) ili raunski kalibracija

44

44

HROMATOGRAM HROMATOGRAM
Nesteroidni anti-inflamatorni lekovi 1. 2. 3. 4. 5. Ketoprofen Naproksen Fenoprofen Ca Flurbiprofen Ibuprofen

Uslovi: Kolona: Kaseisorb LC ODS 2000 4.6mml.D.250mm Mobilna faza: CH3CN/H2O/CH3COOH T: 25C Brzina protoka: 1 mL/min Detekcija: UV na 254 nm

t/min

45

45

Poreenje elektroforeze i hromatografije

metoda
Primena Agens Nain izvoenja Separacija

Elektroforeza
preparativne i analitike svrhe elektrino polje planarna (vsta podloga: papir, gel) kapilara naelektrisanje, veliina i oblik

Hromatografija
mobilna faza planarna (otvorene podloge) kolona (kapilara i punjena kolona) polarnost raspodela izmeu 2 faze (razliiti koeficijenti raspodele) spektrofotometar, fluorimetar, itd. hromatogram OD = f(vreme provedeno u koloni) OD = f(zapremina eluata) Retenciono vreme organska jedinjenja (lako (GC) i teko isparljiva (HPLC) 46

Detekcija Zapis razdvajanja Kvalitativna analiza Analiziraju se

UV/VIS, MS, itd. elektroforezogram (elektroforegram) OD = f (migraciono vreme) Migraciono vreme joni, koloidni rastvori, vitamini, lekovi, proteini, organske kiseline

46

I Z V O D

Separacione instrumentalne metode (principi razdvajanja) Elektroforeza (ta je, princip, podela) Hromatografija (ta je, princip, podela) Hromatogram (karakteristike, definicije i matemati matematiki izrazi za karakteristi karakteristine veli veliine) Poreenje elektroforeze i hromatografije

47

47