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RECONOCIMIENTO DE LOS TRES AMBIENTES DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA. USO DEL MICROSCOPIO. BIOSEGURIDAD
1.- Con qu finalidad se utiliza la solucin salina o suero fisiolgico? La adicin del suero es para promover el crecimiento de microorganismos menos resistentes. Los sueros ms empleados son: suero de ternera, suero de bovino y algunas veces el suero humano.

2.- Qu es agar? Es un coloide hidroflico obtenido de varias especies de algas rojas. Es utilizado para el cultivo solido de bacterias y otros microorganismos emulsificadores y como medio de soporte para inmunodifusin e inmunoelectroforesis.

3.- Diga en qu momento se requiere el uso de los indicadores y amortiguadores? Un amortiguador se usa cuando se necesita infundir algn cambio en la [H+]. El indicador se usa para dar a conocer la aparicin y desaparicin de un compuesto qumico por un cambio de color o logro de un determinado pH.

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PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN EL MEDIO AMBIENTE. TCNICAS PARA EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS. NECESIDAD DE PRACTICAR LAS TECNICAS ASPTICAMENTE. CULTIVO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS I. EXPERIMENTO N 1: Presencia de microorganismos en el medio ambiente

Fundamentacin: Confirmar la presencia de microorganismos en el medio ambiente, mediante un procedimiento llamado siembra que consiste en acondicionar el microorganismo a un medio de cultivo frtil, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin, pueda desarrollarse y multiplicarse. Materiales 1 placa petri con agar nutritivo, agar sangre. Suero salino. Asa de Kolle Procedimiento Tomar la placa con agar nutritivo y dividirlo en 4 cuadrantes con un plumn indeleble. Dibujar estrias en medio de cultivo. 1 cuadrante: agua de cao. 2 cuadrante: Saliva. 3 Cuadrante: Agua de piso. 4 cuadrante: Agua de Piel. Tomar la placa de agar sangre y tosa en el. Incubar a 37C por 24h.

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Resultados y conclusiones: En el sector con agua de cao no se observa crecimiento de microorganismo. El sector con saliva presenta crecimiento pero no por la saliva porque no contiene microorganismos; esto demuestra que nuestra boca contiene gran cantidad de microorganismos como el Estreptococo mutans. El sector con agua de piso y de piel tambin mostro crecimiento debido a la presencia de microorganismos en el medio ambiente. En el agar sangre se observo la presencia de microorganismos pero ninguno realizo hemolisis, por lo cual no era un Estreptococo B hemoltico.

II. EXPERIMENTO N2: Tcnicas para el aislamiento de microorganismos. Necesidad de practicar las tcnicas spticamente. Fundamento En todos los ambientes habitan mltiples microorganismos de diversos tipos y actividad fisiolgica. Para efectuar el estudio de un organismo en particular es necesario separarlo de la poblacin mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean tcnicas de aislamiento que conduzcan a la obtencin de un cultivo puro. Los mtodos usados son: diluciones seriadas y siembra por vertido en placa, siembra por agotamiento. Material 1 Placa Petri Estril con Agar Nutritivo 1 Placa Petri No Estril con Agar Nutritivo. 2 Tubos de prueba con caldo Nutritivo 1 Pipeta estril de 1 ml. 1 Tubo con caldo de cultivo mixto de bacterias

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Procedimiento: Aislamiento por mtodo de sembrado de estras. Estra Simple Estra por Agotamiento Siguiendo estrictamente las reglas de asepsia aprendidas en experimento 1, con el asa de Kolle, tome una muestra del tubo con caldo de cultivo mixto y dibuje, estras sobre la superficie del medio de cultivo en la placa Petri estril con agar nutritivo. Marque la placa con lpiz de vidrio y lleve a la estufa a 37C por 24 h. Tome la placa Petri no estril y mrquela en su parte posterior colocando No estril, llvela a la estufa a 37C por 24h. Tome los dos tubos de caldo nutritivo y con la pipeta estril transfiera 1 ml de caldo de un tubo a otro y viceversa por 5 veces, usando la misma pipeta, tapone los tubos y llvelos a la estufa a 37C por 24 a 48 h. Resultados En las placas con estras simples, se observa que hay crecimiento pero de un solo tipo de colonia. En las placas de agotamiento por estras, se trata de un mtodo rpido y simple de agotamiento y continuo de inoculo sobre un medio solido contenido en una placa petri. El objetivo es obtener, a partir de un elevado nmero de bacterias, un nmero reducido de ellas distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada una de estas bacterias originara una colonia. Se obtiene diferentes colonias.

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METABOLISMO BACTERIANO. ENZIMAS DE LOS MICROORGANISMOS. FERMENTACIBACTERIANA

I. EXPERIMENTO N 1: HIDRLISIS DEL ALMIDN 1. OBJETIVO: Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que producen exoenzimas y que atacan substratos importantes como carbohidratos y protenas. El almidn es un polmero de glucosa, se encuentra como material de reserva. Es hidrolizado por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa. Tambin puede ser hidrolizado por los cidos minerales. La primera desdobla las macromolculas de la amilosa y la amilopectina, de las cuales se compone el almidn, en unidades de 6-7moleculas de Glucosa. Con ms tiempo de exposicin, esa enzima logra desdoblar a estos oligosacridos llevndolos a maltosa, punto en el que la enzima maltasa se encarga de desdoblar esta molcula hasta Glucosa. La -amilasa puede desdoblar las molculas de amilosa y amilopectina pero solo a partir de los extremos no reductores de estas molculas. Cada vez son escindidas dos unidades de glucosa en forma de maltosa, punto en el que la maltasa entra en juego. Las molculas de amilasa son desdobladas de esta forma pero las de amilopectina son solo desdobladas en un 50% ya que la enzima no puede desdoblar las ramificaciones propias de esta macromolcula, se hace necesaria entonces la intervencin de la a-amilasa para desdoblarla por completo. -amilasa + Almidn Dextrina + -maltosa -amilasa + Almidn -maltosa Las amilasas son enzimas extracelulares.

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2. MATERIALES: Solucin de yodo (lugol) Cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli 1 Placa de Agar Almidn

3. PROCEDIMIENTO: Dividir en dos sectores la placa de Agar almidn. Inocular en estras cada sector con las cepas de B. subtilis y E. coli. Incubarlo a 37C por 24 h

4. RESULTADOS:

Empleando la solucin de Lugol para evidenciar la hidrlisis, se obtiene:

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Escherichia coli : La muestra presenta color azulado, a partir de lo cual se concluye que la E. coli hidroliza totalmente al almidn.

Bacillus subtilis : al presentar la muestra color pardo marrn, se concluye que el B subtilis hidroliza parcialmente al almidn (poco hidroltico)

5. CONCLUSION: Ambas son capaces de utilizar al almidn como nutriente; sin embargo, la E. coli requiere de ms nutrientes que el B. subtilis.

6. IMPORTANCIA: Conocer el grado de hidrlisis de las bacterias Gram + y Gram como evidencia de su actividad enzimtica y sus requerimientos energticos.

II.

EXPERIMENTO N2: HIDROLISIS DE LA GELATINA

La gelatina es una protena dotada de la propiedad de tomar gel cuando se disuelve en agua caliente. Por tratarse de una protena puede ser atacada por alguna bacteria que la prive de su propiedad gelatinizante. La hidrolisis de la gelatina es una reaccin enzimtica y a la enzima encargada de ello se le llama gelatinasa. 1. OBJETIVO: Conocer y estudiar a la enzima encargada de hidrolizar la gelatina 2. 3. MATERIALES: Cepa de S. Aureus Cepa de B. Subtilis Cepa de E. Coli Asa de kolle en aguja Tres tubos de gelatina nutriente estril PROCEDIMIENTOS:

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Inocule cada uno de los organismos en un tubo de gelatina nutriente por puntura hasta el fondo del tubo, una sola vez Llevar a temperatura ambiente por 2 a 7 das. 4. RESULTADO: Gelatina + S. Aureus: prueba positiva, se observ hidrolisis parcial de la gelatina Gelatina + B. Subtilis: prueba positiva, se observ hidrolisis total de la gelatina Gelatina + E. Coli: prueba negativa, no se observ hidrolisis.

5. CONCLUSIN: Podemos afirmar que dentro de los diferentes microorganismos los bacilos tiene la propiedad de hidrolizar la gelatina y con ello afirmar que poseen la enzima gelatinasa.

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III. EXPERIMENTO N3: PRODUCCIN DE HEMOLISINAS 1. OBEJTIVOS: Conocer que microorganismos tienen la capacidad de secretar exoenzimas que causar lisis en los glbulos rojos. 2. MATERIALES: Cepa de S. Aureus y B. subtilis Agar sangre 3. PROCEDIMIENTO: -Dividir en dos placas Petri

Inocular en estras las cepas en cada uno de los lados. Incubar a 37C por 24-28 h.

4. RESULTADOS:
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En ambos sectores se observ la presencia de hemolisinas. En el cultivo de S. Aureus se vio halos en todo el borde; este debido a que este microorganismo es un gran positivo y productor de hemolisina beta la cual produce una hemolisis completa , la destruccin y decoloracin total de la hemoglobina , y por eso la presencia de una zona hemoltica clara alrededor de la colonia. En el cultivo de B. Subtilis se observ cambio en la coloracin a un tono verdoso esto debido a que este microorganismo elabora un pigmento llamado biliverdina

5. CONCLUSION: -Este experimento nos demuestra que en los diferentes microorganismos producen distintos tipos de hemolisis; el grado de hemolisis se relaciona con su grado de patogeneidad, especialmente los betas hemolticos.

IV.

EXPERIMENTO N 5 : FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS

La fermentacin es un proceso catablico de oxidacin incompleta, que no requiere oxgeno, y el producto final es un compuesto orgnico. Segn los productos finales, existen diversos tipos de fermentaciones. Hay fermentacin natural, cuando las condiciones ambientales permiten la interaccin de los microorganismos y los sustratos orgnicos susceptibles, y artificial, cuando el ser humano propicia condiciones y el contacto referido. La prueba contendr lo siguiente: Agar TSI (3 azucares y hierro) favorece el crecimiento de la mayora de bacterias. Azucares qumicamente definidos: Lactosa, sacarosa y glucosa.

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Un indicador de pH.

NC : no cambio de pH. A : cido. AG : cido y gas. B : bsico. Cuando no hay carbohidratos utilizables en el medio la energa necesaria la obtiene la bacteria de protena y su producto final es gas de amoniaco. 1. MATERIALES: Cultivo de Escherichia coli, Staphilococcus aureus, Y Bacillus S. 3 tubos con TSI en plano inclinado.

2. PROCEDIMIENTO: Sembrar por estra y puntura: o E. coli - TSI o S. aureus - TSI o B. subtilis - TSI Incubar por 24 h. a 37 C

3. RESULTADOS:

E. coli: Se observa que el fondo y la superficie han cambiado.

Ants. De la seimbra

Desp. De la siembra

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Staphilococcus aureus: se observa que tanto la superficie como el fondo han cambiado, esto debido al medio acido.

ANTES

DESPUES

Pseudomona: Se observa que la superficie mantuvo su color esto debido al medio alcalino, con esto se demuestra que no hubo fermentacin de carbohidratos en la superficie. Mientras que al fondo del tubo se muestra claramente la fermentacin de carbohidratos, por la accin del medio acido.

Ants. De la seimbra Desp. De la siembra

Mediante estos experimentos se llega a conocer la accin fermentadora de los microorganismos en un determinado medio.
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En los cultivo de S. aureus y E. coli. Se demostr que si hubo fermentacin por el pH que mantienen.

V.

EXPERIMENTO N 7: REDUCCIN DE CIDO SULFHDRICO 1. OBJETIVO:

Determinar la capacidad bacteriana para producir HS (cido sulfhdrico) Mecanismo: Cuando se realiza la fermentacin de las protenas obtiene como producto cido sulfhdrico, ya que las protenas contienen aminocidos sulfurados, algunas bacterias tienen enzimas que desprenden el cido de azufre de estos aminocidos, el cual es reducido con hidrogeno del sustrato para formar cido sulfhdrico, por lo tanto el azufre funciona como aceptor de H +. H2S + FeO3 FeS + H2SO4 2. 3. MATERIALES: Cultivo de E. Coli y Proteus Vulgaris Tubos de TSI con superficie inclinada (2) PROCEDIMIENTO: Inocular a cada tubo de TSI, las cepas de E. Coli y Proteus respectivamente, por estra y puntura. Incubara 37OC por 24Hrs y observar la formacin de FeS color negro. 4. RESULtADOS:

Ants. De la seimbra

Desp. De la siembra

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E. coli: Se observa que no se produce cido sulfhdrico (no reduce) ni tampoco se produce gas.

Ants. De la seimbra

Desp. De la siembra

Proteus Vulgaris: se observan los cambios por la aparicin de un precipitado negro (FeS) a lo largo de la picadura, tornndose alcalino en la superficie y acido en el fondo. Se produce la reduccin, hay formacin de cido sulfhdrico, utilizndose al azufre del medio como aceptor final de H+. 5. APLICACIN: Es til para la identificacin de bacterias de los gneros Salmonella, Campylobacter y Brucella y permite diferenciar entr especies de Proteus.

VI. EXPERIMENTO N 8 : DEMOSTRACION DE LA PRODUCCION DEL 1. FUNDAMENTO

INDOL

El Indol es un compuesto que se genera mediante la desanimacin reductiva del triptfano y esta reaccin es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Para detectar la produccin de indol se utiliza el medio Caldo triptfano y la lectura de la prueba se realiza con el reactivo de Kovacs; el indol producido reacciona generando una coloracin rosa intensa.

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2. MATERIALES: Cultivo de E.Coli y Bucillus Subtilis Caldo Triptfano 2 tubos con 3cc cada uno Solucin de Kovacs Pipeta de 1cc

3. PROCEDIMIENTO: Se incuba a 37C durante 24 horas y tras la incubacin, aadimos unas gotas de reactivo de Kovacs. Si se ha producido Indol aparecer un anillo rosa fucsia en la superficie del caldo de cultivo.

Indol negativo 4. RESULTADOS

Indol positivo

E.Coli (+) Bacteria que si produce indol al agregar gotas de solucin Kovacs Es una propiedad de algunas bacterias que degradan el aminocido triptfano formando Indol. B.Subtilis () Bacteria que no produce indol a pesar de agregar gotas de solucin Kovacs.

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EXPERIMENTO N 9: DETECCION DE LA CATALASA La catalasa es una enzima que est relacionada con la capacidad de una bacteria para utilizar el oxgeno Le falta de esta enzima en los organismos anaerobios es la causa de que el O2 les sea perjudicial. Cuando hay oxigeno estos organismos lo emplean como aceptor final de Hidrogeno para formar Agua Oxigenada, pero esta no puede desdoblarse en H2O y O2 porque falta la Catalasa; por lo tanto el agua oxigenada se acumula y mata a la bacteria. 1. MATERIALES: Cultivo d E.coli y S. aureus Tubos de Triptosa Caldo (2) Agua Oxigenda 3,0 %

2. OBJETIVO: Identificar cules son los microorganismos anaerbicos que exponindolos a un medio donde que contenga agua oxigenada. 3. producen catalasa,

PROCEDIMIENTO: Incubar en cada tubo una de las cepas Incubar a 37 C por 24 horas Cubrir la superficie del caldo con agua oxigenada y observar la presencia de burbujas en el tubo donde hay catalasa. 4. RESULTADOS: 1.- Tubo con E.coli: Negativo

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2.- Tubo con S.Aureus: Positivo (Presencia de burbujas)

5. CONCLUSIONES: - La presencia de burbujas en el tubo que contiene S.Aureus se debe a que este microorganismo produce la enzima catalasa, y por lo tanto el agua oxigenada contenida en el medio trmino siendo disociada en oxigeno (burbujas) y agua. El tubo que contena E.Coli no sufri ningn cambio a simple vista ya que este microorganismo no produce catalasa, por lo tanto se asume que estando en este medio la E.Coli no pudo sobrevivir.

Existen bacterias que pueden vivir estando en un medio que contiene H202 EXPERIMENTO N 10: REDUCCION DE AZUL DE METILENO Se trata de demostrar la oxidacin en los procesos fermentativos, realizada por los grmenes anaerbicos, llamada oxidacin anaerbica, donde el sustrato cede un H +, para lo cual se necesitan aceptores de H +, el azul de metileno acta como aceptor. Azul de Metileno + 2H (azul) Reduccin del azul de Metileno. MATERIALES: Cultivo de E. coli 7.5cc. Tubo de Prueba (3) Pipetas estriles Azul de etileno - 2 H (Incoloro)

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Azul de Metileno de Loeffer Caldo nutritivo 7.5cc

PROCEDIMIENTOS: Rotular los tubos con 1,2,3. Tubo 1 4cc cultivo 1cc de caldo Tubo 2 2.5 cultivo 2.5 caldo Tubo3 1cc. cultivo 4cc de caldo

Mezclar y agregar 1 gota de azul de Metileno a cada tubo. Incubar a 37C. Observar cada 10 minutos hasta los 20 minutos y anotar los cambios de color.

RESULTADOS: El azul de metileno es un aceptor de H, posee la propiedad de cambiar de color al pasar de oxidado (azul) a reducido (incoloro). La E. coli reduce el azul de metileno por eso es observa que se muestra incoloro. Por eso el tubo 1 se ve ms incoloro.

DETERMINACION DE LOS REQUERIMIENTOS MNIMOS PARA EL CRECIMIENTO BACTERIANO. MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y DIFERENCIALES
EXPERIMENTO N 1 Objetivo: Conocer los diferentes nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano. Materiales: Ingredientes necesarios para la preparacin de diferentes medios de cultivo. a) Unicamente Agar (lavado y purificado antes de disolverlo) b) Agar + Minerales (NH4 H2 PO4; Mg SO4; KCl) c) Agar + Minerales + Glucosa d) Agar + Minerales + Glucosa + Fuente de Nitrgeno Orgnico (Peptona) 4 placas Petri estriles.conteniendo los medios de cultivo de a,b,c,y d. Cultivo Escherichia coli. (Sector1), Stafilococcus aureus (Sector2) y candida Albicans (Sector 3).

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Procedimiento: Con un lpiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada placa petri para dividirlo en cuatro sectores y enumera cada sector. Inocule los sectores correspondientes de cada placa con uno de los tres organismos. Deje el cuarto sector de cada placa sin inocular. Vierta las placas, incbelas a 38C por 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los sectores inoculados.

Resultado: No hay crecimiento en las 3 primeras placas petri debido a que los requerimientos de las bacterias son importantes para su crecimiento y estas 3 placas no cumplen con ello. En la cuarta placa petri si hay presencia de crecimiento porque si cumple con los requerimiento nutricionales bacterianos permitiendo su desarrollo.

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II. EXPERIMIENTO N 2: Medios selectivos y diferenciales Objetivo: Conocer los diferentes medios de cultivo, que permitan el aislamiento e identificacin de bacterias. Materiales: Agar nutriente Porcin de Agar-Cloruro de sodio Porcin de rojo fenol-Agar Cultivo de Staphylococcus epidermidis y Alcaligenes (Pseudomona).

Procedimiento: Con el lpiz de cera dividida cada placa en tres sectores: el primero etiqutelo Alcaligenes faecalis el segundo S. Epidermidis y el tercero djelo sin rotular. Use el asa de Kolle para sembrar en estras cada sector de la placa con el cultivo correspondiente. Invierta las placas Petri e incbelas por 24 horas a 37C.

Resultados: En el AGAR NUTRIENTE la seudomona crece y libera tiocianina. En el AGAR CLORURO DE SODIO la gran concentracin de sal limita el crecimiento bacteriano. En AGAR FENOL-AGAR toma un color rojizo.

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III. TINCIN DIFERENCIAL Se denomina Coloracin Diferencial cuando se emplean dos o ms reactivos. La ms empleada en la bacteriologa es la coloracin Gram y la coloracin para bacilos cido alcohol resistentes. Coloracin Gram La tincin Gram se compone de cuatro reactivos diferentes: El Cristal Violeta que es el colorante bsico inicial que tie todas las bacterias, el segundo reactivo es el lugol que acta como mordiente (sustancia que aumenta la unin del colorante y el substrato). El tercer reactivo es el alcohol-acetona que acta como decolorante. Mucho microorganismos retienen el cristal violeta permaneciendo teidos y tomando el nombre de bacterias Gram positivas; otro grupo de mircroorganismos pierde el color fcilmente por accin del decolorante, al aadirse la safranina que es de color rojo, toman este segundo colorante, denominndose microorganismos Gram negativos. Materiales:

Solucin Cristal Violeta de Genciana Solucin de Lugol Alcohol Acetona Fucciana bsica o Safranina Lmina portaobjeto, Asa de Kolle, Solucin salina. Cepas de Estafilococos aureus y Eschericha coli.

Procedimiento: Frotis y fijado de la muestra Cubrir la muestra con solucin de cristal violeta durante 1 minuto Lavar ligeramente con agua de cao Cubrir la muestra con solucin de lugol durante 1 minuto Lavar con agua de cao Decolorar con alcohol-acetona hasta que el alcohol-acetona no arrastre color. Lavar con agua de cao. Colorear con safranina por 30 segundos Lavar, secar y observar

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Examinar el preparado al microscopio con objetivo 100x de inmersin (aceite). Las bacterias Gram positivas se tien de azul oscuro; las bacterias Gram negativas aparecen rojo rosadas. Se realizo la prueba de acuerdo al procedimiento indicado. Luego se hizo una toma de muestra del agar sangre y del agar simple y se los tio con Gram: Estafilococo aureus y E. coli.

Resultados:

Microscpicamente

E. coli

S. aureus

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I. EXPERIMENTO N1: Evaluacin de antibiticos por el mtodo disco difusin. Materiales:

Cultivo de S. aureus, E. coli. Disco de antibiograma para gram + y gram -. Placas petri con agar nutritivo TSA. Mechero, asa de kolle, hisopo estril.

Procedimiento: Sembrar con hisopo estril en la superficie de las placas cada sp. Aspticamente colocar con pinzas los discos de antibiograma en cada placa. Incubar por 24 hrs. a 37C y dibujar los resultados. Resultados: Se pudo observar mediante el tamao del halo: E. coli resistente a ciprofloxacina, gentamicina. Parcialmente resistente a amikacina. S. aureus resistente a oxacilina, ampicilina. Sensible a nitrofurantoina.

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I. EXPERIMENTO N 1: Efecto de la Concentracin de iones H+ El pH de una solucin es el valor negativo del logaritmo en base 10 de su concentracin de iones hidrgeno en mol x lt. pH = - log H + Segn Bronsted y Lowry (1923), un cido se caracteriza por su tendencia a perder H+, mientras que una base se caracteriza por su tendencia a asociarse con H+. Por lo tanto, los cidos aportan con una concentracin determinada de H+. Aplicando la frmula encontraremos que a mayor concentracin de H +, menor pH (mayor acidez). El pH puede ejercer una accin bactericida segn la concentracin de hidrgenos y la especie de la bacteria sometida a dicho pH.

Materiales: Cepas de E.coli o Estafilococo en suspensin Reactivos: HCL 1.0N y NAOH 1.ON Medio de Cultivo: Caldo Peptonado.

Procedimiento: Es tres tubos con caldo de cultivo estriles, realizar la siembra de E. coli en asadas. A cada tubo agregarle gota HCL 1.0N, NAOH 1.0 N hasta que en los tubos se obtengan los siguientes pH: 2 y 9 respectivamente. El tercer tubo servir de control. Volver a taponar los tubos e incubar a 37C por 24 hrs. Despus de este tiempo, leer por turbidez.

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Resultados: Tubo1: sin crecimiento de E. coli en medio cido. Caldo peptonado trasparente. Tubo2: crecimiento de E. coli en medio alcalino. Caldo peptonado turbio. Tubo3: por fallas de procedimiento tambin se observo crecimiento de E. coli. Debi haber sido trasparente el caldo peptonado.

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II. EXPERIMENTO 2: Efecto del calor Materiales: Cepas de E.coli o Estafilococo Equipo: Bao Mara y estufa Medios de cultivo: caldo peptonado

Procedimiento: Empleando tres tubos de caldo peptonado, realizar la siembra de E.coli. Someter a dos de los tubos a la accin del calor por bao Mara, graduando en 40C y 100C por 10 minutos respectivamente. El tercer tubo no se somete a la accin del calor para que sirva de control. Retirar los tubos del bao Mara e incubar los tres tubos a 37C por 24 horas. Realizar la lectura por turbidez. Resultados: Tubo 1 (Experimental) 40C Turbidez Si ++ Tubo 2 (Experimental) 100C No. Trasparencia Tubo 3 (Control) Si +

La E. coli presenta temperatura optima de crecimiento 40C pero puede presentar crecimiento a temperatura ambiente porque su lmite de temperatura va de 8-47C

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III. EXPERIMENTO N 3: ACCION OLIGODINMICA DE LOS METALES PESADOS Las sales solubles de mercurio, arsnico, plata, cobre y otros metales pesados, alteran la actividad enzimtica formando mercptidos con grupos sulfhidrilo de residuos de cistena. La reaccin inicial es reversible, y si se agregan grupos SH extraos en forma de glutation o tioglicolato de na, muchas de las clulas se recuperan. La capacidad de unin de los mercuriales se extiende en un amplio rango de ligandos a dems de los grupos que contienen SH, por ejemplo carboxilados, fosfatos y aminas. Materiales: - Cepas de E. coli Estafilococo - Reactivo: Mercurio Cromo. No3Ag al 1% - Medios de cultivo: caldo peptonado - Equipo: Estufa Procedimiento: - Realizar la siembra de una cepa de E. coli en dos tubos de caldo y en dos placas con Agar nutritivo hacer la siembra en toda la superficie del agar. - A uno de los tubos, agregarle 5 a 10 gotas de mercurio cromo o nitrato de plata. El otro constituye el control. - Incubar a 37C por 24 horas. La lectura se hace por turbidez en la siembra en caldo y por halo de inhibicin en agar. Resultados: Tubo Problema Tubo Control Si No No Si Si No

AgNO3 1% Crecimiento (Turbidez) Precipitacin

- Tubo problema: no hay crecimiento bacteriano = accin oligodinamica de los metales. - Tubo control: si hay crecimiento bacteriano.

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Materiales (Observacin del crecimiento): Placa petri (3) con agar nutritivo o TSA dividido en 2 sectores cada uno Isopos de algodn estril (3) Solucin antisptica, alcohol yodado Un tubo con caldo nutritivo estril Procedimiento: En el sector 1 toque con sus dedos varias zonas, lavase las manos con agua y jabn squese y toque con sus el sector 2, lavase las manos por segunda vez y toque el sector 3 lavase las manos por tercera vez y toque el sector 4. En otra zona de su piel aplique el desinfectante por 2 minutos sobre esta zona humedezca con caldo nutritivo y siembra esta con el hisopo estril en la zona 5. Aplique el desinfectante por dos minutos ms y repita lo anterior para sembrar en el sector 6. Incube a 37C por 24 hrs. observe y comente los resultados. Resultados: 1 placa petri: en el 1 sector hay crecimiento bacteriano debido a que no hubo una buena asepsia, en el sector 2 gracias al lavado de manos hubo disminucin del crecimiento bacteriano. 2 placa petri: sector 3 y 4 gracias al lavado de manos varias veces hubo un menor crecimiento bacteriano. 3 placa petri: no hubo crecimiento bacteriano porque se hizo una asepsia con desinfectante y alcohol yodado.

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CUESTIONARIO Qu es SIEMBRA POR ESTRA? Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de ensayo, all se extiende por toda la superficie con el asa bacteriolgica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra en la parte ms cerca de la boca del tubo. Medio de cultivo: agar base inclinado. Instrumento: asa o aguja bacteriolgica. Qu es SIEMBRA POR AGOTAMIENTO? Con ste procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las colonias y aislarlas fcilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estras. Esto puede realizarse de varias formas: a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras. Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operacin sin tomar con el asa nuevo material. b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una estra luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el ltimo cuadrante aparecern las colonias aisladas c- El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estra a partir del depsito y as sucesivamente. Medio de cultivo: solido en placa de Petri. Instrumento: Asa Kolle. Finalidad: Obtener colonias aisladas Qu es AGAR NUTRITIVO? Es un medio para fines generales utilizado en el examen de agua y productos lcteos; tambin para el cultivo de la mayora de microorganismos menos fastidiosos; de la misma manera para el transporte de cepas; para el cultivo preliminar de muestras sometidas a exmenes bacteriolgicos y para aislar organismos en cultivos puros. Composicin Extracto de carne 3g Peptona 5g Agar 15g pH final 6.8

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Qu es AGAR SANGRE? Se prepara a partir de un medio base al cual se le aade sangre, lo que permite aislar y cultivar organismos fastidiosos y exigentes. El pH ligeramente cido, del medio base favoreces reacciones hemolticas precisas. Composicin Infusin de corazn vacuno 500g. Triptosa 10g pH 6.8 Cloruro sdico 5g Agar 15g Qu es AGAR ALMIDN? Es un medio para cultivos de organismos que se analizan para determinacin de hidrlisis del almidn o para estudios comparativos. Composicin Extracto de carne 3g Almidn soluble 10g Bacto Agar 12g pH final 7.5 +/- a.2 a 25C Qu es AGAR GELATINA? Se utiliza para determinar la licuefaccin de la gelatina por organismos proteolticos, facilitando el recuento directo en la placa, para la determinacin de poblaciones bacterianas y para el aislamiento de cultivos puros. Sin embargo su uso es limitado en procedimientos de siembra y aislamiento, ya que, la incubacin tiene que realizarse a 20C (temperatura ms baja que la optima para mucho microorganismos), adems muchos organismos tienen la capacidad de licuar y atacar a la gelatina. Composicin Extracto de carne 3g Peptona 5g Gelatina 120g pH final 6.8 +/- 0.2 a 25C. Qu es AGAR TSI? Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico. Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego
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con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Frmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de carne 3.0 Suspender 62,5 g del polvo por litro de Pluripeptona 20.0 agua destilada. Mezclar bien y calentar Cloruro de sodio 5.0 con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 Lactosa 10.0 minutos hasta disolucin total. Llenar Sacarosa 10.0 hasta la tercera parte de los tubos de Glucosa 1.0 ensayo. Esterilizar a 121C por 15 Sulfato de hierro y amonio 0.2 minutos. Enfriar en pico de flauta Tiosulfato de sodio 0.2 profundo. Rojo de fenol 0.025 Agar 13.0 pH final: 7.3 0.2 Qu es CALDO TRIPTONA? Es un medio de cultivo microbiolgico que presenta abundante triptfano, se utiliza para la reaccin del indol (liberacin de triptfano). Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante la enzima triptofanasa. Qu significa CALDO MIXTO? Es decir tiene como finalidad ser un medio selectivo y un medio diferencial. Qu significa CALDO TIOGLICOLATO? Se utiliza para pruebas de esterilidad para ciertos productos biolgicos que estn turbios. Contienen tioglicolato para neutralizar el efecto bacteriosttico de preservantes mercuriales. No contiene agar, lo que le hace adecuado para probar materiales viscosos y aparatos que tengan tubos con pequeas aberturas. Composicin Extracto de levadura 5g Casitona 10g L-cistina 12g Tioglicolato sdico 0.5g Cloruro sdico 2.5g Dextrosa 5.5g Qu es un MEDIO SELECTIVO? El medio de cultivo selectivo favorece el crecimiento de organismos pero tambin inhibe el crecimiento de otros. Este medio contiene compuestos qumicos que favorece e inhibe el crecimiento de ciertos microorganismos, este medio tambin tiene ciertos tintes que provoca que ciertas bacterias fermentadoras de lactosa crezcan y se tie de dicho color caracterstico del tinte.

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Qu es un MEDIO DIFERENCIAL? El medio de cultivo diferencial es el que facilita la deteccin de diferentes clases de bacterias a base de cambios visibles en el medio de cultivo o diferencias en la apariencia de las colonias, este medio tambin utiliza ciertos tipos de tintes que tien ciertos tipos de bacterias. DIFERENCIAS ENTRE MEDIO SELECTIVO Y DIFERENCIAL. La diferencia de este medio con el medio selectivo es que el selectivo solo provoca que algunas bacterias en especfico se tian mientras que el diferencial tie todas las bacterias para as poder diferencias una de otras. Qu es el ANTIBIOGRAMA? Se entiende por antibiograma el estudio de la sensibilidad "in vitro" de las bacterias a los antibiticos. Por extensin, se suele incluir el estudio de la sensibilidad a las sulfamidas y otros quimioterpicos. Utilidad: La razn por la cual es conveniente el estudio del antibiograma de una bacteria determinada radica en el hecho de la diferente sensibilidad a los antibiticos de las distintas especies bacterianas y, ms an, en el hecho de que en numerosas especies existen grandes diferencias de sensibilidad a un determinado antibitico entre unas y otras cepas. El antibiograma es un mtodo de diagnstico rpido y preciso Con ayuda del antibiograma se puede escoger el antibitico ms adecuado para el tratamiento de una enfermedad. Mtodo de la difusin en medio slido Se siembra, con el germen a estudiar, una placa de un medio de cultivo adecuado. Sobre la superficie del medio se colocan discos de papel impregnados con el antibitico o quimioterpico a ensayar. Si el germen estudiado es sensible, en torno al disco se observar un halo, en el cual no hay proliferacin de bacterias. Si el germen es resistente al antibitico, crecer uniformemente y no habr ningn halo de inhibicin en torno al disco de papel. Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS: Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual. Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento. Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efecto teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la posologa).

TIPOS DE HEMLISIS Fundamento Muchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo hacen responden de diferente manera segn realicen o no la lisis de los glbulos rojos (hemlisis) producida por la accin de una enzima llamada hemolisina Podemos diferenciar tres tipos de hemlisis:
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Hemlisis alfa: es una hemlisis parcial y la zona de crecimiento aparece rodeada de un halo de color verdoso. Hemlisis beta: en este caso la hemlisis es total y el halo que rodea a las colonias es totalmente transparente. Hemlisis gamma (no hemlisis): el microorganismo en cuestin no es capaz de realizar la hemlisis y por tanto no existe halo alrededor de la colonia.

EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN TINCIN GRAM Alcohol acido en la coloracin de Ziehl Neelsen. El alcohol-acido se usa para decolorar la muestra en una tincin de Ziehl Neelsen, la cual es una tcnica de tincin diferencial que se basa en que las paredes celulares de ciertos paracitos y bacterias contienen cidos grasos de cadena larga que les confiere la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-acido, despus de la tincin con colorantes bsicos. S o l u c i n de Lugol y alcohol acetona en la coloracin Gram. Solucin de Lugol: El Lugol se aplica como mordiente, el lugol est formado por yodo (I2 ) en equilibrio con yoduro de potasio (KI), el cual est presente para solubilizar el yodo. El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. Poe eso se le llama mordiente porque como es estable esta interaccin (con el cristal violeta) quedan e n a m b o s t i p o s d e bacteria. De no ponerlo, este complemento no se formara y el cristal violeta saldra del medio ante el lavado con agua. Tindose todo Gram (-). Alcohol acetona: Sirve para decolorar, ya que en la misma es soluble el complejo yodo/cristal violeta. Los organismos GRAM + no se decoloran mientras los GRAM - si lo hacen. Entonces permite que el complemento cristal violeta lugol salga de la clula al debilitar la pared de los GRAM (-).

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Por qu se emple la tincin negativa o de contraste? Porque tie el fondo de la preparacin y no el microorganismo, aumentando de este modo su contraste, mostrando la imagen exacta de los microorganismos, nos permite apreciar el tamao real de estos. Se usa tambin para la tincin de capsulas, la presencia de estos indica patogenecidad. EXPLIQUE EL USO DE TINTES EN LA TINCIN DIFERENCIAL Alcoholcido en la coloracin de Ziehl-Neelsen. El uso de este alcohol sirve para intentar decolorar la muestra de bacterias fijadas con calor en la muestra, si este alcohol q es m uy fuerte no llega a decolorar a las bacterias pero si a los espacios, y seguido a esto la aplicacin del color contraste azul de metileno, se podra deducir la estructura de l a pared bacteriana compuesta por cido miclico lo cual le confiere una propiedad hidrofbica y cerosa por eso su resistencia a este acido alcohol. Solucin de Lugol y Alcohol-Acetona en la coloracin Gram. El lugol acta como un fijador entre el primer colorante bsico aplicado y la muestra de bacterias, mientras que el alcohol acetona funciona como el decolorante, casi similar al acido alcohol, pero con menor potencia.

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