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PRÁCTICA Nº 3

TEMA: “La Coloración Gram” y “Microscopía Directa”

OBJETIVO:
• Conocer la composición química de las bacterias y su
relación con la coloración Gram.
• Observar microscópicamente los agentes patógenos de
un exudado y de una bacteriuria.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA:

La evolución de la tecnología ha proporcionado desde 1676,


con Antonio Van Leevenhoek, espectaculares cambios en los
aparatos para visualizar microorganismos; con el microscopio
electrónico es posible observar inclusive elementos
estructurales, sin embargo, el microscopio de luz ordinaria
mantiene su vigencia, importancia y utilidad como
herramienta de trabajo diagnóstico.

Existen varios tipos de microscopios:

1. Campo PR* 0,2 mm , no se


brillante (luz) puede observar virus * PR. Poder de
2. Campo oscuro Permite observar resolución.
bacterias muy delgadas.
PR 0,02 mm El poder de
3. Contraste de Permite análisis detallado
resolución es la
fases de estructuras internas
propiedad de
4. Fluorescencia Tiñe microorganismos
con colorantes nitidez de la
fluorescentes imagen, depende
5. Electrónico Mejor resolución. Permite de la longitud de
observar virus onda de la luz
utilizada y de la
característica de apertura numérica que tiene el lente objetivo,
la misma que mejora cuando se utiliza un líquido de mayor
índice de refracción que el aire, entre el objetivo y el objeto
(aceite de inmersión)

PROCESOS PARA LA OBSERVACION AL MICROSCOPIO


1. Examen Directo: No se utiliza colorante. Es el sistema
más sencillo de preparación de muestras para su examen
microscópico. Aunque este método permite visualizar
microorganismos y material celular de gran tamaño, con
frecuencia resulta difícil analizar detalles internos. La muestra
se puede suspender en agua o suero fisiológico (preparación
en fresco)
2. Tinción Simple: Se utiliza un solo colorante, por lo que
todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad
(Tinta china, Azul Metileno, etc.)
3. Tinciones diferenciales. Se utilizan diversas tinciones
diferenciales para teñir cada tipo de microorganismo o
componente del material celular. La tinción de Gram es la
más conocida y utilizada de forma generalizada, y constituye
el fundamento de la clasificación fenotípica de las bacterias.

PROCEDIMIENTO:

Examen directo de orina.-.En un frasco estéril se recolecta


directamente la primera orina de la mañana, a mitad de la
micción, previo lavado de las zonas genitales con agua simple.
Luego, con una pipeta Pasteur tomar una gota de dicha
muestra y colocar en una placa portaobjetos, tapar con un
cubreobjetos y llevar al microscopio para su observación.

La coloración de Gram en la muestras de orina


permite evaluar el tipo de bacteria, la presencia
de piuria y determinar si hubo una adecuada
recolección de la muestra.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

Al observar con los lentes de menor aumento 10X y 40X, se


visualizan células epiteliales, piocitos, fibras mucoides y
pequeñas agrupaciones bacterianas de difícil identificación,
debido a su transparencia y refringencia. Por lo que su
interpretación se realiza con cruces:

+ Bacterias en el 25 % del +++ Bacterias en el 75 %


campo del campo
++ Bacterias en el 50 % del +++ Bacterias en el 100 %
campo. + del campo

COLORACION GRAM

El diagnóstico rápido de microorganismos presentes en fluidos


corporales estériles, es de gran importancia para el
diagnóstico de infecciones, razón por la cual, la tinción de
Gram constituye una herramienta de utilidad en el diagnóstico
etiológico; sin embargo, la sensibilidad de esta técnica es
variable según el tipo de muestra y la carga bacteriana
presente en ella.

En el examen microscópico de orina el método de tinción de


Gram suele corresponder según algunas publicaciones a una
sensibilidad de 90 a 94% de los casos con resultado positivo en el
que aparece un germen por campo. La especificidad es bastante
baja.

Sin embargo este procedimiento es recomendable en el


diagnóstico microbiológico por ser accesible, económico,
sencillo y fácil en manos expertas.

Esta técnica se fundamenta en la estructura de la pared


bacteriana.
Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de
peptidoglucano que contiene ácidos teicoico y lipoteicoico, por
lo contrario las bacterias Gram negativas poseen una capa de
peptidoglucano delgada y una membrana externa que
contiene lipopolisacáridos, fosfolípidos y proteínas, además de
un espacio periplasmático entre la externa que contiene
proteínas de transporte, degradación y síntesis de la pared
celular.

Colorante Básico-Catión (+) Bacteria (-) = Si tiñe

Colorante Ácido- Anión (-) Bacteria (-) = No tiñe.

En este caso los colorantes se usan para contrastar el fondo


del campo que rodea a la bacteria.

Las tinciones diferenciales, a más de permitir la identificación


morfológica de la bacteria, hacen posible observar partes
constitutivas de su estructura.
MATERIALES:

Microscopio por dos estudiantes.


Placa con bacterias Gram+
Placa con Bacterias Gram –
Set de tinción Gram
Mechero Bunsen
Aceite de inmersión.
Placas coloreadas de Gram+, Gram-

PROCEDIMIENTO

1. Fijación de la placa al calor: con la ayuda de una asa estéril


realizar la extensión de la muestra sobre un portaobjetos,
posteriormente secar la muestra con la llama de un
mechero para fijarla.
2. Coloración con cristal violeta: colorante básico que al 1
reaccionar con la bacteria cargada negativamente min
reacciona corleándole.
3. Lavado con agua
4. Mordiente con solución yodada: Forma un complejo 1
insoluble con el cristal violeta, fijando la tinción y min
aumentando la afinidad entre el colorante y las bacterias
5. Lavado con agua
6. Decoloración con alcohol-acetona: se usa disolventes 30
orgánicos. seg
7. Lavado con agua
8. Contratincion con safranina: colorante básico de diferente 30
color que el primero. seg
9. Lavado con agua y secado

En las bacterias Gram +, el cristal violeta es fijado por la


solución yodada y atrapado en la gruesa capa de
peptidoglucano, por el contrario el decolorante se disemina
por la membrana externa gramnegativa y elimina el cristal
violeta de la capa delgada del peptidoglucano, así las
bacterias Gram - se visualizan mediante el colorante de
contraste rojo.
INTERPRETACION

La Tinción Gram además permite la identificación taxonómica


de las bacterias, es así que podemos encontrar distintos tipos
bacterianos, permitiendo clasificar las bacterias según
distintos parámetros.

FORMAS BÁSICAS:

1. Esfericas : Cocos
2. Cilindricas: Bacilos
3. Espirales: Espiroquetas: espiral rígida
Espiroqueta: espiral flexible y ondulada
4. Vibrios En forma de coma
5. Variación de la 1.Protoplastos.- Se generan por acción de
forma la lisozima o penicilina sobre las bacterias
gram positivas.
2. Esferoplastos.- Se generan por acción
de EDTA sobre bacterias gramnegativas.
3. Formas “L”.- Se generan por acción de
la penicilina sobre protoplastos y
esferoplastos.
B. POR LA AGRUPACIÓN

Cocos 1. Micrococos: aparecen aislados y


dispersos
2. Diplococos: aparecen en parejas.
3. Estafilococos: similares a racimos de
uvas
4. Estreptococos: forman cadenas
5. Sarcinas: grupos de 8 cocos
6. Tetracocos: grupos de 4 cocos.
Bacilos 1.Diplobacilos: dos bacilos juntos
2. Estreptobacilos: cadenas de bacilos
3. Empalizados: bacilos lado con lado, en
V, X o Y
POR LA COLORACIÓN

• Cocos gram positivos: Streptococos, Stafilococo


• Cocos gram negativos: Neisserias
• Bacilos gram negativos: Enterobacterias: E. Coli, etc
• Bacilos gram positivos:
- Formadores de esporas: Clostridium y Antracis
- No formadores de esporas: Corynebacterium,
Listeria, Lactobacilos

TEMA DE CONSULTA. Otros tipos de tinciones en


Microbiología
- Morfología Externa de las bacterias

BIBLIOGRAFÍA
• MURRAY, Patríck R PhD, Microbiología Médica, quinta
edición, El Sevier, España 2007.
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gram para el diagnóstico de infección urinaria. Rev.
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