Laboratorio de bioqumica vegetal

Practica N1 y N2 Relaciones de color de aminocidos e identificacin de aminocidos en extractos vegetales por cromatografa de capa fina

Presentado a: Luz Adriana Ordoez

Presento: Diego Rincn Dueas (111002830) Alberto Ramrez (111002723)

Universidad de los llanos Facultad de ciencias agropecuarias y recursos naturales Ingeniera agronmica

Introduccin

Los aminocidos son molculas orgnicas con un grupo amino y un grupo carboxlico, existen alrededor de 20 aminocidos en la naturaleza, estos componen a las protenas que son componentes esenciales que necesitan los seres vivos. Todos los aminocidos componentes de las protenas son considerados alfa aminocidos que estn formados por un carbono alfa o quiral y este a su vez est unido a un grupo amino, un grupo carboxilo, un hidrogeno y a una cadena radical.

Objetivos generales
Poder demostrar que por las diferentes reacciones (ninhidrina, xantoproteica, millon, cido glioxilico, pauly, Erlich, nitroprusiano, sakaguchi) podemos demostrar la existencia de un aminocido especfico por su coloracin de reaccin. Conocer cmo se trabaja la cromatografa de capa fina, trazado de lneas de orientacin y ubicacin de los patrones para as lograr una separacin de aminocidos provenientes de un extracto vegetal y soluciones puras.

Objetivos especficos:
Demostrar que la ninhidrina es una agente oxidante que reacciona con todos los alfa aminocidos. Demostrar que el grupo indolico del triptfano reacciona con el cido glioxilico en presencia del cido sulfrico. Lograr la separacin de mezclas con una coloracin bastante clara y evidente. Calcular los valores de Rfs de los patrones ubicados en la placa.

Materiales y reactivos:
Materiales: 10 tubos de ensayo 1 pipeta graduada de 5 ml 1 pipeta graduada de 1 ml 1 Erlenmeyer de 250 ml 1 mortero y pistilo 2 vasos precipitados de 250 ml Guantes de ltex Placas de vidrio con silica gel Capilares Gasa Beaker 50ml Cubas para cromatografa Horno Muestra vegetal (araz) Muestra problema (soya) Centrifuga Tubos de centrifuga Embudo buchner Hielo

Aminocidos: Tirosina 0.5% (C9H11N1O3) Lisina 0.5% (C6H14N2O2) Metionina 0.5% (C5H11NO2S) Triptfano 0.5%( C11H12N2O2) Leucina 0.5% (C6H13NO2) Arginina 0.5% (C6H14N4O2) Cistena 0.5% (C3H7NO2S) Alanina 0.5% ( C3H7NO2)

Reactivos: Solucin de ninhidrina 1% (C9H6O4) cido ntrico concentrado (HNO3)

Solucin de hidrxido de sodio (NaOH) 10M Solucin de nitrito de sodio (NaNO2) Reactivo de milln (Hg2(NO3)2) Acido glacial (CH3-COOH) cido sulfrico (H2SO4) cido sulfanilico (C6H7NO3S) Carbonato de sodio (Na2CO3) Reactivo de Erlich ( Solucin de nitroprusiano de sodio (C5FeN6Na2O.2 H2O) Hidrxido de amonio (NH4OH) Alfa-naftol (C10H8O) Agua de bromo ( Acido asprtico (C4H7NO4)

Procedimiento

Reacciones de coloracin de los aminocidos

Reaccin de la ninhidrina: En 5 tubos de ensayo se agregaron 1 ml de los siguientes aminocidosa cada tubo (Alanina, leucina, triptfano, cistena, arginina), despus se agregaron 5 gotas de solucin de ninhidrina a cada tubo y se llev este resultado a un bao de mara durante 3 minutos. Reaccin xantoproteica: En 5 tubos de ensayo se agreg 1 ml de los siguientes aminocidos a cada tubo (triptfano, tirosina, leucina, metionina, lisina). Enseguida se agreg 0.5 ml de cido ntrico concentrado a cada tubo. Se dejaron enfriar los tubos y despus se agreg NaOH hasta que hubo reaccin. Reaccin de milln: En 5 tubos de ensayo se agreg 1 ml de los siguientes aminocidos a cada tubo (tirosina, metionina, cistena, leucina, lisina).enseguida se agreg a cada tubo 5 gotas de reactivo de millon y se depositaron en un bao de mara durante 15 minutos. Transcurridos el tiempo se sacaron y dejaron enfriar. Cuando estaban fros agregamos 5 gotas de solucin de nitrito de sodio y mezclamos.

Reaccin de cido glioxilico: En 5 tubos de ensayo se agreg 2 ml de los siguientes aminocidos a cada tubo (triptfano, leucina, arginina, cistena, tirosina). Enseguida se agreg a cada tubo de ensayo 2 ml de cido glacial y se mezcl bien, inmediatamente se agregaron 2 ml de cido sulfrico cuidadosamente por las paredes de los tubos para que as se formaran dos capas con un anillo violeta en la mitad cuando la reaccin fuera positiva. Prueba de pauly: En 5 tubos de ensayo se agreg 2 ml de los siguientes aminocidos a cada tubo (tirosina, triptfano, arginina, metionina, lisina).enseguida se agreg a cada tubo 1 ml de cido sulfanilico se mezcl bien y se dejaron en hielo durante 10 minutos. Transcurridos los 10 minutos se agreg a cada tubo 1 ml de solucin de nitrito de sodio, se mezcl bien y se lo volvieron a dejar los tubos en hielo durante 5 minutos ms. Transcurrido el tiempo se agreg a cada tubo 2 ml de solucin de carbonato de sodio y se mezcl bien esperando los cambios. Prueba de Erlich: En 5 tubos de ensayo se agreg 0.5 ml de los siguientes aminocidos a cada tubo(triptfano, leucina, lisina,tirosina, metionina). Enseguida se agreg 2 ml de reactivo de Erlich cuidadosamente por las paredes de los tubos y se observaron los cambios. Prueba de nitroprusiano: En 5 tubos de ensayo se agreg 2 ml de los siguientes aminocidos a cada tubo (tirosina, lisina, triptfano, leucina, cistena). Enseguida se agreg 0.5 ml de solucin de nitroprusiano de sodio y se mezcl bien, despus se agreg a cada tubo 1 ml de hidrxido de amonio, se mezcl bien y se esperaron los resultados. Reaccin de sakaguchi: En 5 tubos de ensayo se agreg 3 ml de los siguientes aminocidosa cada tubo (tirosina, lisina, triptfano, leucina, arginina). Enseguida se agreg a cada tubo 1 ml de hidrxido de sodio y se mezcl bien, despus de agrego 3 gotas de alfa-naftol a cada tubo y se volvi a mezclar vigorosamente, inmediatamente se agreg 5 gotas de agua de bromo a cada tubo y se observaron los resultados.

Resultados

Reaccin de la ninhidrina:

Compuestos vegetales y aminocidos.

Triptfano

Observaciones

Resultado

Esta reaccin dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminocidos que tienen un pH entre 4 y 8, pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango. Por eso esta coloracin. Esta reaccin dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminocidos que tienen un pH entre 4 y 8, pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango. Esta reaccin dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminocidos que tienen un pH entre 4 y 8, pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango. Esta reaccin dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminocidos que tienen un pH entre 4 y 8, pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango. Esta reaccin dio negativo puesto que la ninhidrina reacciona con todos los aminocidos que tienen un pH entre 4 y 8, pero el pH de nuestra muestra no estaba entre este rango.

Negativo

Arginina

Negativo

Cistena

Negativo

Alanina

negativo negativo

Leucina

Reaccin xantoproteica Triptfano La reaccin da positiva porque el triptfano tiene un ncleo aromtico y este es el que hace reaccionar en un estado positivo de color amarillo, despus se le agrego NaOH y su coloracin cambio a un color naranja. ( no es alcalino) positiva

Tirosina

Leucina

La reaccin da positiva porque el triptfano tiene un ncleo aromtico y este es el que hace reaccionar en un estado positivo de color amarillo. El color amarillo apareci despus de agregado el NaOH (es alcalino) La reaccin es negativa porque la leucina no posee ncleo aromtico

positiva

negativo

Metionina

La reaccin es negativa porque la metionina no posee ncleo aromtico

negativo

Lisina

La reaccin es negativa porque la lisina no posee ncleo aromtico

negativo

Reaccin de millon Tirosina Este resultado da positivo porque es el nico aminocido que posee un radical hidroxibenceno que hace posible esta coloracin Este resultado da negativo porque este aminocido no contiene el radical hidroxibenceno, dndonos como resultado una coloracin traslucida (transparente) Este resultado da negativo porque este aminocido no contiene el radical hidroxibenceno, dndonos como resultado una coloracin traslucida (transparente) Este resultado da negativo porque este aminocido no contiene el radical hidroxibenceno, sin embargo la muestra tomo una tonalidad blanca. Este resultado da negativo porque este aminocido no contiene el radical hidroxibenceno, dndonos como resultado una coloracin traslucida (transparente) positiva

Metionina

negativa

Leucina

negativo

Cistena

negativo

Lisina

negativo

Reaccin del cido glioxilico

Triptfano

Leucina

Arginina

Esta reaccin da positiva porque el grupo indolico del triptfano reacciona en presencia del cido sulfrico, dando una coloracin violeta en medio de dos fases, en este caso observamos una coloracin con una tonalidad verdosa clara en la parte superior y en la inferior un tono amarillo muy claro y en medio el anillo violeta. Esta reaccin da negativa porque este aminocido no tiene un grupo indolico. Su resultado fue una coloracin traslucida (transparente) Esta reaccin da negativa porque este aminocido no tiene un grupo indolico. Su resultado fue una coloracin traslucida (transparente) Esta reaccin da negativa porque este aminocido no tiene un grupo indolico. Su resultado fue una coloracin traslucida (transparente) Esta reaccin da negativa porque este aminocido no tiene un grupo indolico. Su resultado fue una coloracin traslucida (transparente)

positiva

negativa

negativo

Cistena

negativo

Tirosina

negativo

Prueba de pauly Tirosina Esta reaccin da positiva porque la tirosina posee un fenol, por eso la coloracin. positiva

Triptfano

Esta reaccin da positiva gracias a la amina que tiene el triptfano dando como resultado esta coloracin. Esta reaccin da positiva gracias a la amina con la que cuenta la lisina, dando como resultado una coloracin amarilla con tonos verdes.

positiva

Lisina

positiva

Metionina

Da negativa porque no posee grupos amino ni fenoles ni imidazoles que lo hagan reaccionar. Da positiva gracias a la amina con la que cuenta este aminocido, dando como resultado una coloracin amarilla. positiva

negativa

Arginina

Reactivo de Erlich: Triptfano Este aminocido reacciona con el reactivo de Erlich gracias al grupo indol y aromtico que posee positiva

Arginina

Este aminocido reacciona con el reactivo de Erlich gracias a que posee un compuesto orgnico tal como lo es la amina Este aminocido reacciona con el reactivo de Erlichgracias a que posee un compuesto orgnicotal como lo es la amina Este aminocido reacciona con el reactivo de Erlichgracias a que posee un compuesto orgnico tal como lo es su anillo aromtico Este aminocido reacciona con el reactivo de Erlichgracias a que posee un compuesto orgnico

positiva

Lisina

positiva

Tirosina

positiva

Metionina

positiva

Prueba de nitroprusiano Tirosina Este aminocido no reacciona con la prueba de nitroprusiano porque no posee grupo tiol. negativa

Triptfano

Este aminocido no reacciona con la prueba de nitroprusiano porque no posee grupo tiol.

negativa

Lisina

Este aminocido no reacciona con la prueba de nitroprusiano porque no posee grupo tiol.

negativa

Cistena

Leucina

La cistena reacciona positivamente en la prueba de nitroprusiano gracias al grupo tiol que posee. Dando como resultado una coloracin roja-violeta. Este aminocido no reacciona con la prueba de nitroprusiano porque no posee grupo tiol.

positiva

negativa

Reaccin de sakaguchi:

Tirosina

Da negativa en esta reaccin porque este aminocido no tiene un grupo guanidino que le permita reaccionar.

negativa

Triptfano Da negativa en esta reaccin porque este aminocido no tiene un grupo guanidino que le permita reaccionar. Lisina .Da negativa en esta reaccin porque este aminocido no tiene un grupo guanidino que le permita reaccionar. Arginina La arginina da positivo en la reaccin de sakaguchi gracias al grupo guanidino de esta que reacciona con el alfa-naftol y un agente oxidante tal como el agua de bromo. Esta reaccin dio como resultado un color rojo ladrillo.

negativa

negativa

positiva

Leucina Da negativa en esta reaccin porque este aminocido no tiene un grupo guanidino que le permita reaccionar.

negativa

Procedimiento 2
Identificacin de aminocidos en extractos vegetales por cromatografa de capa fina

Preparacin de la muestra vegetal : En un mortero depositamos el material vegetal que en este caso fue una fruta conocida con el nombre de araz a esta le agregamos 15 ml de agua y maceramos hasta obtener una especie de papilla, luego filtramos con una gaza para retirar la mayor cantidad de solidos que se pueda, inmediatamente de este resultado depositamos 10 ml en un tubo de centrifuga y procedemos a centrifugarlo hasta que haya una fase slida y una fase sobrenadante, la fase sobrenadante la retiramos y la ajustamos a un pH que este entre 2 y 4 en este caso no hubo necesidad porque el pH de nuestra muestra fue de 3.

Preparacin de la Muestra problema: En un mortero depositamos el material o la muestra a trabajar en este caso fue una soya en harina, le agregamos 10 ml de agua y procedimos a macerar, luego filtramos con la gaza para retirar la mayor cantidad de slidos. El lquido que nos qued lo depositamos en tubo de centrifuga y procedemos a centrifugar para que haya una separacin de fases solido-liquido. La fase sobrenadante resulto con un pH de 7 y la ajustamos a un pH de 3 con una gota de cido ntrico

Preparacin de la placa de cromatografa: a la placa que ya estaba preparada con el absorbente silica gel procedimos a trazar las lneas de medicin, una lnea en la parte superior e inferior con una medida de 2 cm desde el borde de cada lado. Luego que ya tenamos trazada la lnea que estaba alejada del borde 2 cm procedimos a hacer la medicin de los puntos donde iban a estar los patrones. Estos puntos fueron de 2 en 2cm en la recta horizontal hasta tener 8 puntos los cuales estaran dedicados a cada patrn

Despus que terminamos la placa y colocamos los patrones cada uno en un punto correspondiente, esto se hizo con un capilar colocando la punta de este con mucha suavidad 3 veces en cada punto. Despus procedimos a guardar la placa en la cuba de vidrio la cual contena butanol-CH2COOH-agua durante aproximadamente 1 hora, luego la sacamos y medimos la medida que estaba desde los 2 cm hasta la parte donde se notara hmedo, luego llevamos la placa al horno donde la dejamos 3 minutos a una temperatura de 110, cuando transcurri el tiempo la sacamos y la atomizamos con la solucin de ninhidrina, luego la volvimos a meter al horno otros 3 minutos para desarrollar la coloracin.

Resultados
Se midieron los desplazamientos de color que tuvieron los aminocidos al entrar a la cmara de vidrio la cual contena butanol-CH2COOH-agua y al ser atomizados con la solucin de ninhidrina su desplazamiento fue:

Patrn 1: Triptfano (3.4 cm) Patrn 2: Acido asprtico (3.0 cm) Patrn 3: Tirosina (3.5 cm) Patrn 4: Cistena (2.5 cm Patrn 5: leucina (1.9 cm) Patrn 6: Alanina (3.1 cm) Patrn 7: Muestra vegetal (araz) (3.0 cm) Patrn 8: Muestra problema (soya en polvo) (4.2 cm)

Tras haber terminado todos los pasos de la cromatografa procedemos a calcular su Rfs utilizando las medidas que nos dieron en cada muestra patrn de aminocidos. Rfs resulta de la distancia recorrida por una sustancia (aminocido) desde el origen (d) y la distancia del origen al frente del disolvente (h) Rfs= d/h

Muestras Triptfano Acido asprtico Tirosina Cistena Leucina Alanina Muestra vegetal (araz) Muestra patrn( soya en harina)

Rfs calculado 0.45 0.4 0.46 0.33 0.25 0.41 0.38 0.53

Rfs terico 0.60 0.2647 0.12 0.3529

Porcentaje de error
133.33 66.175 36.36 141.16

Preguntas
4.1 Por qu razn se dice que la reaccin de la ninhidrina permite la determinacin cuantitativa de los aminocidos? Rta: La Ninhidrina es utilizada con fines cuantitativos para la determinacin de aminocidos. Reacciona con todos los aminocidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloracin que vara de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado prpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloracin producida por la ninhidrina es independiente de la coloracin original del aminocido. La reaccin con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificacin de todos los aminocidos primarios se evala midiendo la absorcin de la luz con la longitud de onda de 540 nm. 4.2 A qu se debe que cuando la ninhidrina reacciona con los aminocidos haya desprendido de CO2? Rta: Esto se debe a que la ninhidrina es un agente oxidante poderoso liberando un oxgeno y reducindose y convierte al aminocido en aldehdo + CO2 + NH3; desprendiendo del grupo carboxilo (COOH) un carbono y un oxgeno para unirse con el oxgeno de la ninhidrina as formando el CO2 y el hidrogeno pasa a formar parte de la molcula del amoniaco. 4.3 Por qu la prolina y la hidroxiprolina no producen el derivado de color violceo o purpura cuando reaccionan con la ninhidrina? Rta: La prolina Y la hidroxiprolina al reaccionar con la ninhidrina no produce un color purpura debido a que estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino dando como coloracin final amarilla. 5.2 Cmo se calcula el Rf de las muestras en ese tipo de cromatografa? Rta: Rfs resulta de la distancia recorrida por una sustancia (aminocido) desde el origen (d) y la distancia del origen al frente del disolvente (h) Rfs= d/h. 5.3 Que reaccin ocurre al aplicar a los aminocidos la ninhidrina? Cuando los aminocidos se calientan con un compuesto que se llama ninhidrina, ocurre una reaccin compleja y se produce un color azul brillante. Este reactivo es til para determinar la presencia de aminocidos en algunas muestras o en las manchas que durante la cromatografa en papel de hidrolizados de protenas 5.4 Cmo reacciona la prolina con la ninhidrina? La prolina da coloracin amarilla. Por su sensibilidad esta reaccin se emplea para valoracin cuantitativa de aminocidos por colorimetra

5.5 Que aminocidos contienen las frutas como la naranja, pltano y manzana? La naranja el pltano y la manzana son unos de los alimentos pertenecientes a la categora de las frutas frescas los cuales contienes los siguientes aminocidos cido asprtico ,cido glutmico ,Alanina ,Arginina ,Cistena, Fenilalanina, Glicina ,Hidroxiprolina, Histidina ,Isoleucina Leucina ,Lisina ,Metionina, Prolina, ,Tirosina ,Tirosina ,Triptfano , Estos aminocidos se combinan para formar protenas. 5.6

Conclusiones Los Aminocidos son molculas esenciales que necesitamos los seres vivos para la formacin de protenas, estas protenas desempean funciones mltiples, como materiales de construccin, como sustancias transportadoras, como hormonas, enzimas, componentes en la coagulacin sangunea y sustancias de defensa. Los seres humanos debemos consumir alimentos para adquirirlos ya que nuestro organismo no es capaz de sintetizarlos. En la naturaleza existen alrededor de 20 aminocidos que tienen como forma estructural un grupo carboxilo, un grupo amino, un hidrogeno y a una cadena radical. En la identificacin de aminocidos en el laboratorio es necesario realizar reacciones qumicas que al momento de aplicar reactivos a las muestras patrn nos arrojaran resultados positivos o negativos, cada una las reacciones identificara que aminocido se tiene dependiendo del grupo que se encuentre en su estructura dando como resultado un tipo de coloracin final. Con la reaccin de la Ninhidrina se identifican los aminocidos que tienen en su estructura el grupo amino, aminas primarias y amoniaco dando como resultado un color amarillo. En la reaccin Xantoproteica se identifican los aminocidos que en su estructura poseen un ncleo aromtico como resultado un color naranja (Triptfano y Tirosina). En La reaccin de milln se identifican los aminocidos que contienen en su estructura el radical hidroxibenceno como resultado un color rojo (Tirosina). En reaccin de Acido Glioxilico se identifican los aminocidos que tienen en su estructura el grupo indolico como resultado un color purpura (Triptfano). En la reaccin de Pauly identificamos los aminocidos que contienen en su estructura aminas, fenoles e imidazoles como resultado colores azofuertemente coloreados (Tirosina, Triptfano, Lisina, Arginina). En la reaccin de Erlich se identifican los aminocidos que contienen en su estructura grupos ndoles, aminas, aromticos y ureicos dando como resultado complejos coloreados (Tirosina, Triptfano, Lisina, Arginina, Metionina). En la reaccin de Nitroprusiato se identifican los aminocidos que tienen en su estructura los grupos tioles como resultado un color rojo (cistena) y en la reaccin de Sakaguchi se identifico como aminocido la Arginina por su grupo guanidino que forma su estructura como resultado un color rojo.

La cromatografa de capa fina es muy til al momento de identificar aminocidos en muestras vegetales con la ayuda de procesos en el laboratorio y despus de ingresar la placa a una cmara durante una hora y dejando que el eluyente ascienda antes de unos 2cm del extremo superior, se retira y se lleva al horno para realizar el respectivo secado, por medio de luz UV se puede visualizar los resultados obtenidos, se observaron varios puntos y varias manchas a las que realizamos mediciones y calculamos el Rfs de las Muestras patrones, muestra vegetal (Araz) y muestra problema, con estos datos pudimos identificar el tipo de aminocido que se encuentra presente en las respectivas muestras(teniendo como causas de error el instrumento de medicin una regla ya que dependiendo de la inclinacin no es muy precisa)

Bibliografa

CAMPBELL, Petter N. SMITH, Antony. Bioqumica Ilustrada, Masson S.A. 2006. BEYER, Hans. WALTER Wofgong. Manual de Qumica Orgnica, Edit. Revere S.A. 1987. 19 edicin alemana, Versin espaola.