Aciunea factorilor fizici, chimici i biologici asupra bacteriilor 4. 1.

Definiii de baz
Septic nseamn contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecia unei plgi). Aseptic nseamn lipsit de microbi, indiferent dac microbii sunt patogeni sau nepatogeni. Asepsia reprezint ansamblul de metode prin care evitm contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur, medicamentelor injectabile etc. Antisepsia reprezint nlturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plgi. Se realizeaz cu ajutorul substanelor antiseptice, netoxice pentru tegument (ex. alcool etilic 70, tinctur de iod 5%, KMnO4 0,1%, detergeni cationici etc). Contaminare, este un termen utilizat n instituiile sanitare (deosebit de contaminarea radioactiv) care se refer, n general, la contactul cu microorganisme condiionat patogene sau patogene (capabile s produc infecii sauboli infecioase ). Decontaminarea reprezint utilizarea agenilor fizici / chimici pentru a ndeprta, a inactiva sau a distruge unele sau toate microorganismele condiionat patogene sau patogene de pe suprafee sau obiecte, astfel nct acestea s nu mai poat reprezenta o surs de infecie sau de transmitere a infeciei, iar obiectele sau suprafeele s poat fi manipulate i / sau utilizate n siguran. Sanitizarea reprezint totalitatea msurilor pentru asigurarea sntii publice. Prezervarea presupune prevenirea multiplicrii unor microorganisme n produse farmaceutice, vaccinuri, alimente etc. Curarea reprezint utilizarea agenilor fizici i / sau chimici pentru a ndeprta murdria (materie organic i anorganic) de pe suprafee (inclusiv tegument) sau obi ecte, prin procedee mecanice sau manuale, pregtind astfel suprafeele sau obiectele pentru utilizare n siguran sau, pentru trecerea la o alt etap de decontaminare. Detergentul este un produs sintetic pentru curare. Detergenii pot fi anionici, cationici, amfoterici i neionici. Nu prezint aciune antimicrobian. Detergentul enzimatic este un produs sintetic pentru curare care conine o enzim. Echipamentul de protecie este un echipament special (mbrcminte, mnui, ochelari etc) purtat de personalul care manipuleaz produse dezinfectante i realizeaz dezinfecia. Enzima este o protein care descompune murdria ntr-o form care poate fi uor ndeprtat de produsul de curare. Are rol de catalizator pentru reacie, mrind puterea de curare a produsului. De exemplu: amilaza acioneaz asupra urmelor de amidon; lipaza acioneaz asupra urmelor de grsimi i uleiuri; proteaza acioneaz asupra materiei proteice. Produsul de curare este un agent chimic care ndeprteaz murdria (materie organic i/sau anorganic) de pe suprafee sau obiecte, dar nu prezint activitate antimicrobian (bactericid, virucid, fungicid sau sporicid) i care nu reduce nivelul de contaminare microbian. Splarea minilor este procedura prin care se elimin murdria i se reduce flora tranzitorie prin aciune mecanic, utiliznd ap i spun (Figura nr. 1, Film nr. 1). Factori care influeneaz eficacitatea metodelor de control: - mrimea populaiei bacteriene; - timpul de expunere la agentul decontaminant (creterea timpului de expunere crete rata distrugerii); - efectul concentraiei, a temperaturii i a pH-ului (o concentraie mai mare crete rata distrugerii);

- stabilitatea agentului; - structura microorganismului etc. Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori i a sporilor) din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul substanelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative asupra esuturilor gazdei). mpiedic rspndirea bolilor infecioase. Dezinfecia igienic a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fr a aciona asupra florei rezide nte. Dezinfecia chirurgical a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia i cu aciune asupra florei rezidente. Produsul pentru dezinfecie de nivel sczut este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate i virusurile mari necapsulate. Produsul pentru dezinfecie de nivel intermediar este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate i mycobacteriile. Produsul pentru dezinfecie de nivel nalt este un agent chimic care, n condiii bine definite de timp i temperatur, distruge microorganismele, are aciune sporicid i reprezint un potenial sterilizant chimic (Figura nr. 2). Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu n form gazoas), utilizat pentru sterilizarea dispozitivelor medicale critice, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un sterilizant chimic dist ruge toate categoriile i formele viabile de microorganisme, nivelul de supravieuire al acestora fiind mai mic sau egal cu 10-6 (probabilitatea prezenei unui singur microorganism viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egal sau mai mic cu 1/1.000.000). Termenul de valabilitate reprezint perioada de timp n care un produs dezinfectant este eficient, din punct de vedere al concentraiei substanei active i eficacitii antimicrobiene. Timpul de contact (timp de aciune) reprezint perioada de timp n care produsul dezinfectant este n contact direct cu suprafaa sau obiectul care trebuie dezinfectat. Perioada de timp n care produsul antiseptic este n contact direct cu esuturile vii. Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafa sau dintr -un mediu (lichid sau solid). Toate materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s fie sterile nainte de utilizare. Exist o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele de sterilizare sunt destul de variate, dup cum urmeaz: - Metode de sterilizare prin cldur (cldura uscat sau cldura umed); - Metode de sterilizare prin filtrare; - Metode de sterilizare utiliznd radiaiile, dar i - Metode chimice de sterilizare. Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia radiaiilor ultraviolete) i metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilen) sunt utilizate rareori n laborator ul de microbiologie. Sterilizarea va fi ntotdeauna precedat de pregtirea materialului care urmeaz s fie sterilizat, respectiv: splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor curate, necontaminate) urmat de autoclavare, splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor contaminate refolosibile). Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc. trebuie curate perfect, de ex. prin splare cu ajutorul unor detergeni. Dac aceste materiale au fost contaminate cu snge, nainte de splare se vor dezinfecta. Sticlria de laborator este colectat n recipiente speciale i se sterilizeaz prin autoclavare; pipetele vor fi meninute n amestec dezinfectant pn a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile i acele (dei este necesar utilizarea pe scar larg a seringilor i acelor de unic ntrebuinare) contaminate se vor introduce n baie de amoniac 1-2% timp de 15-30 minute, se vor peria n soluie de 1-2% detergent cationic i se vor spla cu jet de ap pentru ndeprtarea substane lor chimice (Figura nr. 3).

Instrumentele de unic utilizare sunt, n general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi izolate (aparate de sutur mecanic toracic, abdominal, vascular etc) sau pot fi furnizate n seturi de instrumente de unic utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se face industrial prin iradiere cu raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de unic utilizare (disposable) confer un plus de siguran, n pofida unui pre relativ ridicat. Exist o serie de metode pentru a controla eficiena sterilizrii, prin indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacitii sterilizrii cu ajutorul radiaiilor, pot fi utilizai spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) (Figura nr. 4).

4. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici

Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici se pot traduce n principiu prin: distrugerea microorganismelor (efect bactericid) i respectiv inhibarea reversibil a multiplicrii microorganismelor (efect bacteriostatic). 4. 2. 1. 1. Influena temperaturii ridicate asupra microorganismelor n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: mezofile (temperatur optim 30-37C), psichrofile (temperatur optim n jur de 20C) i termofile (temperatur optim 50-60C). Prin aciunea cldurii procesele chimice i fizice sunt mult accelerate; distrugerea se produce dup atingerea temperaturii de 50-60C prin ruperea legturilor intramoleculare, mai ales a punilor de hidrogen care menin proteinele i alte macromolecule n stare nativ. Ca urmare protoplasma se denatureaz. Celulele bogate n ap sunt mult mai sensibile la aciunea cldurii dect microorganismele care conin puin ap sau sunt liofilizate. Apa din compoziia microorganismelor absoarbe cldura proporional cu volumul su. Sterilizarea prin cldura are loc n dou variante principale: prin cldur uscat i umed. Sterilizarea prin cldur: a). Sterilizarea prin cldur uscat are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene. Amintim cteva dintre variantele tehnice: a1. Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint introducerea i meninerea n flacra becului Bunsen pn la nroire, pe toat lungimea, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologic (cu bucl sau fir) sau pentru spatul (Figura nr. 5, Film nr. 2). Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de cteva ori) a unui obiect, fr a se atinge temperatura de incandescen. Flambarea se aplic pentru portans, gtul unui recipient de sticl (tub, eprubet, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur i nu reprezint sterilizare. a2. Sterilizarea cu aer cald se realizeaz n etuv (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr. 6). Etuva este o cutie metalic cu perei dubli. Cu ajutorul unor rezistene electrice i a unui termostat se obine i menine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii n interiorul aparatului este realizat cu ajutorul unui sistem de ventilaie (Schema nr. 1). Pentru majoritatea materialelor care urmeaz a fi sterilizate, temperatura din etuv trebuie s ating 180C, pentru o durat de 1 or sau 160C pentru o durat de 2 ore. Pot exista i alte variante, de exemplu n funcie de dimensiunea obiectelor de sterilizat.

Sterilizarea cu aer cald este indicat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan, pulberi inerte i termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menionat faptul c repetarea sterilizrii, n timp, conduce la declirea oelului) etc. Nu se vor steriliza n etuv soluiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vat, bumbac, fibr sintetic, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator. a3. Incinerarea reprezint arderea pn la obinerea de cenu (Figura nr. 7). Exist anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. n cazul spitalelor, n Romnia au existat astfel de incineratoare n structura unitii sanitare respective. Odat cu procesul de a derare la Uniunea European i respectiv necesitatea aplicrii unor reguli impuse pentru toate rile membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost nchise. Modul n care s-a realizat n perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activitii acestor incineratoare nu a inut cont de situaia real din ara noastr. n lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitar trebuie s ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerrii materiale de unic folosin din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experien etc. b). Sterilizarea prin cldur umed este cea mai eficient metod de sterilizare i are ca mecanism coagularea proteinelor i degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite substane n soluie, sticlrie (cu excepia pipetelor i lamelor), instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultur, aparate de filtrat etc. b1. Autoclavarea este esenial att pentru laboratoarele de microbiologie ct i pentru unitile sanitare n general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de ap realizeaz la 0,5 atmosfere o temperatur de 115C, la 1 atmosfer o temperatur de 121C i respectiv 134C la 2 atmosfere. Autoclavul are ca pies principal un cazan cu perei metalici, care se nchide etan cu un capac prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul cruia, vaporii de ap sunt comprimai la presiunea necesar n vederea sterilizrii (Schema nr. 2). Exist mai multe tipuri de autoclave: - autoclave cu perete simplu verticale orizontale - autoclave cu manta de aburi verticale orizontale. n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflat n cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de jos n sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este nregistrat de un manometru. Pentru punerea n funciune a autoclavului, n dotare exist 2 robinete: unul superior (robinetul de aer i vapori, care permite legtura ntre cazan i mediul exterior) i unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pent ru a evita accidentele exist o supap de siguran care se deschide i permite evacuarea vaporilor atunci cnd, accidental, presiunea vaporilor depete limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea riscului de a veni n contact cu vapori de ap fierbini aflai sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului pn cnd presiunea din interior nu o egalizeaz pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus ntr-un perete exterior solid care la partea inferioar are un spaiu n care se afl sursa de cldur. n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care se aeaz o plac de metal perforat (Figura nr. 9). Pe suport se aeaz materialele care trebuie sterilizate iar faptul c placa este perforat permite trecerea vaporilor de ap produi dup nclzirea apei. n vederea sterilizrii se procedeaz astfel:

 verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care trebuie s fie pn la o distan de 2-3 centimetri de suport; dac nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va utiliza ap distilat); aezm pe suport obiectele i materialele de sterilizat, ambalate corespunztor; nchidem etan capacul, folosind sistemul special de etaneizare cu care este dotat autoclavul pe care l avem la dispoziie; conectm sursa de cldur; deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor (dac rmne aer n cazanul cu presiune eficiena sterilizrii va scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori, vor nclzi n special partea superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rmne n partea inferioar a cazanului) ; nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet cont inuu de vapori; presiunea din cazan ncepe s creasc i este urmrit cu ajutorul manometrului; atunci cnd presiunea atinge valoarea dorit (de ex. 1 atmosfer), reglm sursa de cldur n aa fel nct aceast presiune s fie meninut pentru toat durata sterilizrii (de ex. 30 minute) ; dup trecerea celor 30 minute ntrerupem sursa de cldur i lsm autoclavul s se rceasc pn cnd presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice; deschidem lent robinetul de vapori; deschidem sistemul de etaneizare i capacul autoclavului; lsm obiectele i materialele s se rceasc n autoclavul deschis; atunci cnd temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele sterilizate. b2. Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este o metod de sterilizare prin cldur umed care evit depirea unei temperaturi de 100C. Substanele de sterilizat se menin la 56-100C timp de 30-60 minute, 3 pn la 8 zile succesiv. Astfel, utiliznd medii care permit germinarea, dup prima nclzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar dup rcire are loc germinarea sporilor. n ziua urmtoare sunt distruse prin nclzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar dup rcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat n prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menine permanent deschis robinetul de vapori (i astfel nu se va depi n interior temperatura de 100C), bi de ap sau bi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultur etc. b3-4. Pasteurizarea i fierberea nu reprezint metode de sterilizare, dar sunt utilizate n anumite situaii. Pasteurizarea folosete cldura umed i are aplicaii n conservarea pentru scurt durat a unor alimente (lapte, bere etc). Exist o pasteurizare joas (30 minute la 56 -65C), o pasteurizare medie (15 minute la 65-75C) i o pasteurizare nalt (2-5 minute la 85-90C). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile n form vegetativ dar nu i sporii. Fierberea poate fi utilizat atunci cnd nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar mecanismul de aciune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100 oC, distruge bacteriile n form vegetativ, fungii i virusurile, dar nu i sporii bacterieni. Timpul se nregistreaz dup ce apa a nceput s fiarb. Eficiena acestei metode poate fi crescut prin adugarea de carbonat de sodiu 1-2%. ^inapoi sus 4. 2. 1. 2. Influena temperaturii sczute asupra microorganismelor Temperaturile joase (n jur de 0-4C) au n general un efect bacteriostatic. La temperaturi sczute, reaciile biochimice ncetinesc, multiplicarea poate fi stopat. Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (meninnd viabilitatea germenilor i ncetinind n acelai timp multiplicarea acestora) la o temperatur de circa 4C. O serie de culturi pot fi de asemenea meninute la temperatura frigiderului pentru o durat limitat de timp n vederea prezervrii i posibilitii de a repeta anumite teste de identificare etc.

n funcie de viteza cu care are loc rcirea, ntlnim situaii diferite, cu urmtoarele posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene. a). Congelarea lent, la temperaturi mai mici -21,3C are efecte bactericide prin formarea de cristale de ghea i prin hiperconcentrarea salin cu denaturarea proteinelor; b). Congelarea brusc la -70C are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea n mas a apei fr apariia cristalelor de ghea; c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezint congelarea brusc concomitent cu desicaia (deshidratarea n vid). O suspensie microbian n mediu protector, liofilizat, poate fi pstrat n fiole nchise timp ndelungat (de exemplu vaccinul BCG). ^inapoi sus 4. 2. 1. 3. Filtrarea Microorganismele pot fi reinute mecanic i electrostatic n porii unui filtru. Trecerea unui lichid printr o substan prevzut cu pori care va reine microorganismele din lichidul respectiv poart numele de sterilizare prin filtrare. De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porelan, sticl poroas, azbest impregnat cu caolin, pmnt de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din ce n ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloz cu poroziti ntre 8 i 0,025 mm (Figura nr. 11). n vederea filtrrii sunt necesare o serie de piese precum: un recipient n care se introduce lichidul care urmeaz a fi filtrat, un recipient n care se va colecta lichidul sterilizat, o plnie care se monteaz etan ntre cele 2 recipiente, o pomp de vid care va aspira lichidul din primul n al doilea recipient, prin membrana filtrant. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare nainte de nceperea filtrrii. Exist i alte variante tehnice. Cu o importan practic particular ar fi de menionat filtrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguran biologic (clasa II i clasa III), filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12). Sterilizarea prin filtrare este utilizat pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultur (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse n cazul sterilizrii prin cldur etc. ^inapoi sus 4. 2. 1. 4. Radiaiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin ruperea legturilor de hidrogen, oxidarea legturilor duble etc. Radiaiile UV sunt utile n sterilizarea suprafeelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultur, alte manevre aseptice etc) n cazul n care nu exist cabinete de siguran biologic cu flux laminar dar i atunci cnd avem la dispoziie astfel de cabinete de siguran biologic i dorim s sterilizm incinta n care am prelucrat spre ex. produse n care exist Mycobacterium tuberculosis. Lmpile cu UV sunt numite lmpi germicide. Astfel de lmpi sunt plasate de ex. i n instituiile sanitare n care sunt internai pacieni cu tuberculoz (Figura nr. 13). Radiaiile ionizante se pot utiliza n sterilizri industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unic ntrebuinare etc). ^inapoi sus 4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin aciune mecanic, micare activ a coninutului celular, formare n mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se mic energic i se izbesc de membran (fenomenul de cavitaie) i creterea temperaturii la 50-80C. Sporii rezist acestor efecte. ^inapoi sus 4. 2. 1. 6. Presiunea osmotic Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) n medii hipertone are efecte letale asupra unor bacterii. n medii hipotone are loc acumularea de ap n celula bacterian; aceasta devine turgescent i peretele bacterian cedeaz.

4. 2. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor chimici

Exist o serie de substane chimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene. Alte substane chimice (antibioticele i chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic selectiv. Antisepticele i dezinfectantele sunt substane cu aciune antimicrobian neselectiv, alterndstructuri i funcii comune microorganismelor i organismelor superioare. Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente i mucoase. Dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafee i structuri care nu sunt vii. O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aa cum am menionat anterior, trebuie s existe o etap de pregtire a materialelor n vederea sterilizrii. Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc, trebuie curate perfect, de ex. prin splare cu ajutorul unor detergeni. Dac aceste materiale au fost contaminate cu snge, nainte de splare se vor dezinfecta. Substanele antiseptice i dezinfectante se pot clasifica n funcie de mecanismul de aciune, dup cum urmeaz: a). Substane care denatureaz proteinele (au n general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii i derivaii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). b). Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu, KMnO7 1, util n antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2, soluie 3% n ap, utilizat n antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii lor (hipoclorii, cloramine, soluii iodurate etc. Exist i diferite clase de compui halogenai cu poten mai mare, cum ar fi cei care au n componena lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substana folosit este necesar realizarea concentraiei corespunztoare. c). Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [srurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), srurile de argint, compui de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C 9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc. d). Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizri limitate datorit proprietilor caustice i toxicitii sale; este etalonul fa de care se msoar activitatea antimicrobian a antisepticelor i dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc], detergenii [anionici (spunuri, perlan etc), cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul. Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70, diferii derivai halogenai, hipermanganatul de potasiu 1, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substane antiseptice. Dorim s menionm i s subliniem c att n cazul antisepticelor ct i n cazul dezinfectantelor este important ca substana utilizat s aib concentraia corespunztoare, s fie aplicat pentru o durat de timpcorespunztoare, s se afle n termenul de garanie. Aceeai substan chimic (de ex. cloramina) poate intra n categoria antisepticelor sau n categoria dezinfectantelor, n funcie de concentraie (concentraia este mai mare n al doilea c az). n continuare vom prezenta pe scurt cteva exemple de substane dezinfectante. Dorim s menionm faptul c, pn n prezent, nu exist nici un dezinfectant ideal. Exist numeroase substane i numeroi productori de antiseptice i dezinfectante. Hipocloriii: soluiile de hipoclorit se prepar periodic (se inactiveaz dup mai mult de 24 ore),

 concentraia n clor activ este diferit n funcie de scopul urmrit (ex. 2.500 ppm clor activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate); au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, sporilor bacterieni, fungilor (100 ppm n o or), virusurilor (200 ppm n 10 minute); efectul este diminuat considerabil n prezena substanelor organice (n special proteine), maselor plastice, detergenilor. Derivaii fenolici: din cauza toxicitii, potenialului carcinogenetic i corozivitii, fenolii nu se folosesc ca atare, ci sub forma derivailor fenolici; soluiile fenolice se prepar periodic (dup cel mult 24 ore); concentraia poate fi diferit n funcie de scopul urmrit (de obicei este de 2-5%);

au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV este inactivat de soluia 0,5%); efectul este diminuat pe suprafeele de cauciuc, lemn sau material pl astic. Glutaraldehida: cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2%, la un pH alcalin; are efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ (n cazul mycobacteriilor este necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor; datorit faptului c nu corodeaz metalele (aa cum se ntmpl n cazul substanelor prezentate mai sus) se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice; nu poate fi folosit pentru suprafee, datorit vaporilor iritani i timpului mare de expunere; ideal pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de timp n containere meninute nchise. Iodoforii: sunt substane care complexeaz iodul pe care l elibereaz n soluii apoase; au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu nveli lipidic); sunt inactivai de substane organice (n special proteice), mase plastice, detergeni; pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor, dezinfecia pipetelor contaminate. Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O): exercit activiti bactericide prin alkilarea acizilor nucleici i prin nlocuirea hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH); sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrui; acest tip de sterilizare se utilizeaz pentru materiale care nu rezist atunci cnd sunt supuse aciunii temperaturii sau radiaiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc.); fiind o substan exploziv, etilenoxidul este utilizat n camere speciale n care se menine o presiune negativ, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi combinat cu aceast substan n ncperi de oel speciale; o alt variant de protecie ar fi combinarea cu hidrocarburi fluorinate. indiferent de varianta folosit trebuie respectate toate recomandrile productorului; exist o serie de inconveniente n ceea ce privete acest tip de sterilizare (pot s apar efecte carcinogenetice i afectarea sistemului nervos etc., dar e posibil afectarea ntregului organism); sterilizarea este n principiu influenat de: concentraia etilenoxidului, temperatur, umiditatea relativ i timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraiei va reduce la jumtate timpul necesar pentru sterilizare).

4. 2. 3. Produsele biocide
Directiva 98/8/CE definete produsele biocide dup cum urmeaz: Substane active i preparatele coninnd una sau mai multe substane active, condiionate ntr -o form n care sunt furnizate utilizatorului, avnd scopul s distrug, s mpiedice, s fac inofensiv i s previn aciunea, sau s exercite un alt efect de control asupra oricrui organism duntor, prin mijloace chimice sau biologice (vezi directiva CE). Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curenie, detergenii sub form de pulbere sau lichid i alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect biocid. Produsele biocide includ: produsele utilizate pentru dezinfecia suprafeelor mari inerte, a aerului, a echipamentului medical, a mobilierului, sau pentru dezinfecia i curarea acestora; produsele pentru dezinfecia / sterilizarea instrumentarului, endoscoapelor, .a., prin imersie; produsele dezinfectante / antiseptice pentru tegumente, spunurile dezinfectante, spunurile antiseptice, spunurile antibacteriene / antimicrobiene, gelurile de curare antibacteriene / antimicrobiene, soluiile de curare antibacteriene / antimicrobiene (dup cum sunt denumite de productor); produsele dezinfectante/antiseptice pentru mucoase, ex. pentru igiena oral, .a.; erveele umede dezinfectante,

detergenii i produsele de curare care au activitate biocid dovedit (distrug sau inhib multiplicarea bacteriilor, fungilor sau a altor microorganisme). n aceast categorie ar putea intra i substanele sintetizate de Bacillus thuringiensis din genul Bacillus, cu efect biopesticid.

4. 2. 4. Efectele antimicrobiene ale factorilor biologici

4. 2. 4. 1. Interrelaiile microbiene n cadrul nielor ecologice proprii n natur microorganismele nu se dezvolt izolat. Relaiile pot fi de comensualism, simbioz sau antagonism, noiuni care vor fi prezentate ulterior. n cadrul relaiilor de antagonism, acesta se poate datora vitalitii mai mari a speciilor antagoniste sau elaborrii de ctre specia antagonist a unor substane nocive pentru speciile concurente. Aceste substane pot avea (ex. antibioticele i bacteriocinele) sau nu (ex. acidifierea mediului) aciune selectiv. 4. 2. 4. 2. Bacteriofagul Bacteriofagii sunt virusuri care paraziteaz bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1 -T7 cu specificitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperii n 1915. Prof. Mihai Ciuc obine n anul 1921 primele tulpini lizogene. n 1949 se nfiineaz n Romnia un Centru naional pentru bacteriofagi. Fagii au o structur mai complex dect cea a virusurilor obinuite. Se descriu (Figura nr. 14): 1. capul fagului are form de prism hexagonal bipiramidal. Conine ADN dublu catenar helicoida l sau ARN nconjurat de capsida format din capsomere (nveli proteic); fagii ARN pot avea un numr mic de gene (ex. 3) n timp ce fagii ADN pot avea pn la 150 gene; 2. coada fagului are structur proteic, simetrie helicoidal; are rol de adsorbie, ajutnd fagul s penetreze bacteria. Se descriu urmtoarele formaiuni: - cilindrul axial; - teaca cozii; - placa bazal (cu croetele de fixare); - fibrele cozii (formnd un strat n jurul tecii cozii).

Toate proteinele fagice pot conduce la apariia de anticorpi, descoperire utilizat n studierea nrudirii dintre diferii bacteriofagi. Relaii bacteriofag-bacterie ntre bacteriofag i bacteria gazd se pot stabili dou tipuri de relaii: - de tip litic sau productiv (Figura nr. 15); - de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16). Relaiile sunt strict specifice i sunt mediate de receptori. Ciclul litic are mai multe etape i anume: 1. Adsorbia: Ataarea este specific. Exist receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniial reversibil (prin fibrele cozii), apoi ireversibil (prin croetele plcii bazale). Adsorbia fagic modific permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene. 2. Penetrarea: Fagul elibereaz muramidaza care lizeaz mureina din peretele bacterian. Teaca cozii se contract i antreneaz cilindrul axial prin peretele bacterian, ducnd apoi la injectarea ADN -ului fagic n citoplasma bacterian; 3. Multiplicarea: Dup aproximativ 4-5 minute, funcia ADN-ului bacterian este blocat i preluat de ADN-ul fagic ce coordoneaz sinteza componentelor proprii. Se sintetizeaz un numr nsemnat de proteine virale. 4. Maturarea (ansamblarea) fagului 5. Liza bacteriei (ex. datorit sintezei unor enzime asemntoare lizozimului) i eliberarea bacteriofagului matur, virulent. Bacteriile lizosensibile permit adsorbia, penetrarea i multiplicarea fagilor viruleni pn la realizarea lizei celulei bacteriene. Evidenierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene n mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunztor duce dup cteva zeci de minute (uneori chiar i cteva zile) la limpezirea mediului; pe mediu solid, nsmnat uniform, inocularea fagului litic duce la apariia unei zone de liz, clar, bine circumscris (spotul de bacteriofagie), metod utilizat n lizotipie; dac se amestec o suspensie de fagi cu o pictur de cultur (pur) bacterian, iar tulpina respectiv are receptori potrivii bacteriofagilor i aceast suspensie se amestec cu geloz nclzit putem transfera suspensia ntr-o plac Petri; bacteriofagii infecteaz bacteriile; dup circa 30 minute bacteriile sunt lizate i elibereaz fagii; acetia difuzeaz prin geloz i infecteaz bacteriile situate n apropiere i ciclul se reia; o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potrivii) nu sunt infectate i n timp se multiplic iar cultura bacterian opacizeaz mediul; dup circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacterian (bacterii nelizate), aceste arii numindu -se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii viruleni sunt clare, n comparaie cu plajele mai puin clare produse de bacteriofagii temperai (fagii viruleni sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua dect n ciclul litic) Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleai etape, iniial. Dup adsorbie i penetrare, ADN-ul fagic: fie se integreaz liniar n cromozomul bacteriei gazd i se replic sincron cu aceasta, fie se circularizeaz i ataat de membrana citoplasmatic se replic sincron cu diviziunea bacteriei. Bacteria a devenit lizogen, se reproduce i transmite descendenilor fagul latent (profag, fag temperat). n anumite condiii profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12). Proprietile bacteriei lizogene: 1. este imun fa de un fag omolog profagului;

2. pot aprea fenomene importante din punct de vedere genetic: transducia; conversia genetic (cu producerea de exotoxine de ctre unele bacterii lizogenizate, cum ar fi toxina difteric, toxina scarlatinoas, toxina botulinic de tip C e tc); recombinarea genetic (atunci cnd o bacterie parazitat de doi fagi diferii, dar nrudii, elibereaz la sfritul ciclului litic pe lng tipurile parentale i tipuri de fagi care nsumeaz unele din proprietile celor doi fagi parentali) etc.; inducia fagic (sub influena unor ageni inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul i rectig virulena, devine fag virulent, i produce liza bacteriei respective). Bacteriile lizorezistente nu permit infecia cu un fag fie datorit lipsei receptorilor specifici, fie datorit unei stri de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii viruleni omologi profagului gzduit. Fagul defectiv reprezint profagul care persist indefinit n stare latent (nu se reactiveaz). Aplicaii practice ale fenomenului de bacteriofagie: fagii viruleni sunt un element de echilibru ecologic n mediul natural de via al bacteriilor (n nia ecologic respectiv); fagii temperai pot avea un rol deosebit n reasortarea mate rialului genetic al bacteriilor, ntruct atunci cnd se detaeaz (inducie) de cromozomul bacterian pot antrena poriuni din ADN -ul bacterian; fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorit specificitii relaiei fag-bacterie); anumite mutante ale fagilor se folosesc n ingineria genetic drept vectori ai ADN recombinant (ex. fagii Charon Lambda); fagii reprezint un model pentru studii teoretice i practice privind virusurile i oncogeneza, precum i alte aspecte ale biologiei moleculare; s-au evideniat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic i antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilitii la un anumit tip fagic) este una dintre cele mai fine metode de diagnostic bacteriologic i epidemiologic, pentru identificarea lanurilor de transmisie a germenilor i pentru determinarea originii unei epidemii.