BIOLOGIE TECHNIQUE

Collection dirige par Jol Cnokaert IA IPR Biochimie Gnie biologique Franoise Guillet IGEN Biotechnologies et secteur mdico-social

OPRATIoNS UNITAIRES EN GNIE BIoLoGIQUE

.2. LA PASTEURISATION
Pascal Chillet
Professeur agrg de Biochimie - Gnie biologique

SOMMAIRE

1.1. Objectifs 10 1.2. Dfinition 10 2.1. Facteur temps 2.1.1. Courbe de survie 2.1.2. Temps de rduction dcimale D 2.1.3. Taux de rduction dcimale 2.1.4. Dtermination graphique de D 2.2. Facteurs de variation de la thermorsistance 2.3. Facteur temprature 2.3.1. Droite de rsistance thermique 2.3.2. Facteur dinactivation thermique z 2.3.3. Exemples de valeurs de D et z 2.3.4. Notion de barme 2.4. Valeur pasteurisatrice 2.4.1. Dfinition 2.4.2. Choix de la valeur pasteurisatrice 2.4.3. Intrt de la valeur pasteurisatrice 2.4.4. Calcul de la valeur pasteurisatrice 10 10 11 12 12 12 12 12 14 14 14 14 14 16 16 17

PARTIE 1. Aspects technologiques 1. Objectifs et dfinition de la pasteurisation 10 2. Cintique de destruction des micro-organismes 10

3. Cintique de dgradation du produit 18 4. Dtermination dun barme de pasteurisation 20 5. Pasteurisateur : description et fonctionnement 20
5.1. Sections du pasteurisateur 5.2. changeurs 5.2.1. Dfinition 5.2.2. Principe 5.2.3. Les catgories dchangeurs 5.2.4. Problmes dexploitation 5.3. Conditionnement 5.3.1. Produits traits en vrac 5.3.2. Traitement aprs conditionnement 20 20 20 20 24 28 28 28 28

1.1. Pasteurisation en industrie 1.2. Pasteurisation du lait 1.2.1. Bactries du lait 1.2.2. De la collecte la pasteurisation 1.2.3. Traitements de pasteurisation 1.2.4. Dgradation des constituants du lait 1.2.5. Place de la pasteurisation dans un exemple de procd 1.2.6. Contrles microbiologiques 1.3. Pasteurisation des jus de fruits 1.3.1. Traitements de pasteurisation 1.3.2. Place de la pasteurisation dans un exemple de procd 1.4. Pasteurisation de la bire 1.5. Pasteurisation des ovoproduits

PARTIE 2. Applications 1. Applications industrielles 32

32 32 32 32 32 32 33 34 36 36 36 36 36

Activit 1 - tude dun pasteurisateur pilote Fiche 1.1 - Identification des diffrents lments du pilote de pasteurisation Fiche 1.2 - tude du plan de linstallation Fiche 1.3 - tude dune documentation technique Activit 2 - Fonctionnement et mise en uvre dun pilote de pasteurisation Fiche 2.1 - Mise en route, mise en uvre de la pasteurisation et arrt du pilote Fiche 2.2 - tude dune documentation technique Activit 3 Vrification de lefficacit de la procdure de dsinfection dun pilote Fiche 3.1 - Mise en uvre de la procdure de dsinfection en vue dun contrle microbiologique des eaux de rinage Fiche 3.2 - Ralisation des contrles microbiologiques Fiche 3.3 - tude de cas Activit 4 - Dtermination du temps de rduction dcimale et du facteur dinactivation thermique dun micro-organisme dans une denre alimentaire Fiche 4.1 - Mise en uvre des pasteurisations dun lait artificiellement contamin par S. aureus 55 C, 60 C et 65 C Fiche 4.2 - Ralisation des analyses microbiologiques en vue de la dtermination de D et z de S. aureus dans le lait Fiche 4.3 - tude de cas Activit 5 - Dtermination de lefficacit et de la valeur pasteurisatrices Fiche 5.1 - Mise en uvre de la pasteurisation dun lait artificiellement contamin par E. faecalis Fiche 5.2 - Dtermination de lefficacit pasteurisatrice Fiche 5.3 - Calcul de la valeur pasteurisatrice atteinte Fiche 5.4 - tude de cas Activit 6 - Pasteurisation dune denre alimentaire Fiche 6.1 - Mise en uvre de la fabrication de lait pasteuris partir de lait cru Fiche 6.2 - Ralisation du contrle microbiologique : dnombrement des Enterobacteriaceae daprs ISO 21528-1:2004 Fiche 6.3 - Recherche de lactivit phosphatase alcaline daprs ISO 3356:2009 - FIL 63:2009 Fiche 6.4 - Comparaison des mthodes de dtermination de lactivit de la phosphatase alcaline Fiche 6.5 - tude de cas

2. Mise en uvre lchelle pilote38

39 40 42 44 47 48 50 51 52 53 54 57 58 59 60 63 64 65 66 68 75 76 77 79 81 83

lments de correction des exercices et des tudes documentaires88 Annexes99

Annexe 1 - Schmathque de gnie chimique 99 Annexe 2 - Fiche de prise en charge, de fonctionnement et de libration du pilote 100 Annexe 3 - Fiche de fabrication et de contrle 102 Annexe 4 - Taux de ltalit. Daprs ALINORM 95/13 103 Annexe 5 - Indices NPP et limites de confiance 95 %. Table de Mac Grady 104

Bibliographie105 Crdits109

PARTIE 1

ASPECTS TECHNOLOGIQUES

Entre 1860 et 1864, Pasteur dmontra que la flore non dsirable du mot de raisin pouvait tre limine par un chauffage de quelques secondes 55-65C. Il donna son nom ce procd qui fut utilis un peu plus tard pour allonger la dure de conservation du lait. La pasteurisation est un traitement thermique destin dtruire des micro-organismes par la chaleur. Contrairement la strilisation qui dtruit tous les micro-organismes susceptibles de se dvelopper dans un produit par lapplication dune temprature suprieure 100C, lobjectif principal de la pasteurisation est de dtruire la flore pathogne non sporule et la majorit de la flore non pathogne daltration des aliments. Ces deux procds permettent dallonger la dure

de conservation des produits : ainsi, les aliments pasteuriss prsentent une date limite de consommation de quelques jours avec une conservation une temprature de + 4C alors que les produits striliss se conservent plusieurs mois, voire plusieurs annes, temprature ambiante. Le choix du traitement thermique appliquer dpend ainsi des objectifs souhaits tant au niveau de la rduction biologique que des qualits nutritionnelles et organoleptiques obtenir et du cot du procd mettre en uvre. Diffrentes technologies sont utilises pour pasteuriser les produits agroalimentaires. Le tableau 1 prsente des exemples daliments pasteuriss et des exemples de traitements raliss.

1. OBJEcTIfS ET dfINITIoN dE LA PASTEURISATIoN

1.1. Objectifs
La pasteurisation est une technique utilise trs frquemment en agroalimentaire. Lobjectif est dallonger de faon significative la dure de conservation des aliments. La pasteurisation rduit au maximum les activits biologiques dun produit tout en vitant de modifier ses caractristiques organoleptiques et nutritionnelles. Les activits biologiques dtruites ou inactives par la pasteurisation sont : - les flores non pathognes daltration des aliments; - les flores pathognes et toxinognes (Salmonella, Brucella, Listeria, etc) ; - les enzymes endognes comme la lipoxygnase du soja (oxygnase qui catalyse loxygnation des acides gras polyinsaturs) ou la plasmine prsente dans le lait (protase dont le spectre daction est assez large) ; - les enzymes intracellulaires nuisibles. La pasteurisation, comme tout traitement thermique, doit permettre : - de prserver laspect nutritionnel du produit tel que la non-destruction des vitamines ; - de ne pas modifier ses qualits organoleptiques telles que labsence de brunissement, de dcoloration, de gots de cuit, de rupture de lmulsion, de coagulation des protines, etc. La pasteurisation prsente donc un inconvnient majeur : elle ne dtruit pas les flores sporules.

1.2. Dfinition
La pasteurisation est un traitement thermique des tempratures comprises entre 60 et 100C ayant pour but de dtruire la totalit des micro-organismes pathognes non sporuls et de rduire significativement la flore vgtative prsente dans un produit. Cest un procd de conservation limit pour lequel le produit doit tre conditionn hermtiquement (avec ou sans atmosphre modifie ou sous vide) et rfrigr (le produit pasteuris peut tre en effet conserv +4C de quelques jours quelques semaines).

2. CINTIQUE dE dESTRUcTIoN dES MIcRo-oRGANISMES

2.1. Facteur temps
2.1.1. Courbe de survie On dtermine diffrents temps le nombre de micro-organismes survivants suite lexposition une temprature ltale constante. La figure 2 montre lallure de la courbe : log N = f(t)
10
PARTIE 1 - ASPECTS TECHNOLOGIQUES

t N0 N

Temps dexposition des micro-organismes la chaleur Nombre de micro-organismes avant traitement thermique, donc linstant t = 0 Nombre de micro-organismes survivants linstant t

EXEMPLES DALIMENTS

EXEMPLES DE MODES DE PASTEURISATION

Lait Crmes Jus de fruits Pures de fruits, concentrs de tomates Bire

Pasteurisateur changeur plaques (15 s 72C). Pasteurisateur changeur plaques (15 s 82C). Pasteurisateur changeur tubulaire (10 s 97C). Pasteurisateur changeur surface racle (90-95C). Traitement aprs conditionnement en tunnel de pasteurisation (20 min 65C). Pasteurisateur changeur tubulaire (2 - 6 min 57-65C).

Ovoproduits

2 Inuence du temps sur le nombre de micro-organismes survivants une temprature ltale constante

1 Exemples daliments pasteuriss et de modes de pasteurisation

La relation log N = f(t) est appele courbe de survie ou cintique de destruction microbienne. Cette relation est linaire, autrement dit, les micro-organismes exposs une temprature ltale constante, suivent une loi de destruction dordre 1 en fonction du temps. Le temps ncessaire pour dtruire une fraction de la population est donc indpendant de la concentration initiale en micro-organismes. Plus le nombre initial de micro-organismes (N0) est important, plus le temps de pasteurisation doit tre long. De mme, plus les micro-organismes sont thermorsistants, plus la dure de pasteurisation doit tre grande.

Soit D =

2,303

, alors :

N0

Nombre (ou concentration) de micro-organismes avant traitement thermique Nombre (ou concentration) de micro-organismes survivants linstant t Temps dexposition des micro-organismes la chaleur Temps de rduction dcimale

Nombre de micro-organismes (.L-1) Nombre de micro-organismes (.L-1) s ou min s ou min

2.1.2. Temps de rduction dcimale D

k D
Temprature ltale dexposition la chaleur Constante de vitesse Temps de rduction dcimale

t D

La cintique de destruction microbienne tant dordre 1, alors : et en sparant les variables : Cette quation sintgre entre linstant initial t = 0 et linstant t, ce qui correspond aux valeurs N0 et N :

Si t = D, alors :

et

Ainsi, D est la valeur que prend t pour D est donc le temps permettant de dtruire 90% des micro-organismes initiaux. En dautres termes, cest le temps ncessaire pour rduire dun facteur 10 la concentration en micro-organismes la temprature .

En utilisant le logarithme dcimal, on obtient :

5. 2. CINTIQUE PASTEURISATEUR DE DESTRUCTION : DESCRIPTION DES ET MICRO-ORGANISMES FONCTIONNEMENT

11

2.1.3. Taux de rduction dcimale Le taux de rduction dcimale (ou nombre de rductions dcimales) appel aussi efficacit pasteurisatrice (E) la temprature est :
ou

t (min) N
(micro-organismes.L-1)

10 3

3.103 7.102 2.102 6.101 10

E = log

N0 N

Une rduction dcimale n correspond un taux de survivants Lquation prcdente peut alors scrire : ou La dure du traitement est : t = n x D.
n ou E N0
Taux de rduction dcimale ou nombre de rduction dcimale ou efficacit pasteurisatrice Nombre (ou concentration) de micro-organismes avant traitement thermique Nombre (ou concentration) de micro-organismes survivants linstant t Temps dexposition des micro-organismes la chaleur Temps de rduction dcimale Nombre de micro-organismes (.L-1) Nombre de micro-organismes (.L-1) s ou min s ou min

Tracer sur papier millimtr la courbe log N = f(t). En dduire graphiquement le temps ncessaire pour passer de 103 102 micro-organismes.L-1. Ce temps est le temps de rduction dcimale D72.

2.2. Facteurs de variation de la thermorsistance

D dpend du micro-organisme considr, de son tat physiologique, de la temprature et du milieu dans lequel il est prsent. Ainsi, D caractrise la thermorsistance dun micro-organisme dans des conditions physico-chimiques bien dfinies. Les micro-organismes sont plus facilement dtruits lorsquils se trouvent en phase exponentielle de croissance. Il existe deux types de flores : - les micro-organismes dtruits par un traitement 63C pendant 30 min (ou par un traitement quivalent) = flore thermosensible ; - les micro-organismes rsistants un traitement 63C pendant 30 min (ou par un traitement quivalent) = flore thermorsistante. La thermorsistance des micro-organismes varie en fonction des caractristiques physico-chimiques de laliment telles que le pH, lactivit de leau (lAw quantifie dans un aliment la disponibilit de leau mobilisable pour les ractions biochimiques) et la teneur en lipides : - plus le pH de laliment est loign de la neutralit, plus les micro-organismes sont sensibles la chaleur ; cest pourquoi les aliments sont classs selon leur pH en trois classes.
Aliments acides Aliments modrment acides Aliments peu acides

t D

2.1.4. Dtermination graphique de D La courbe de survie log N = f(t) permet de dterminer D. Linverse de la pente de cette droite est D (figure 3).
Sur une reprsentation graphique en coordonnes semi-logarithmiques, la dtermination de D se ralise par interpolation (figure 4). Exercice 1 partir des courbes de survie en chelle semilogarithmique de la figure 5 obtenues pour le mme micro-organisme, dterminer le paramtre D aux trois tempratures de traitement diffrentes. Exercice 2 Un chantillon contamin avec 3.103 Enterococcus faecalis.L-1 est pasteuris pendant 10 min 72C. On dtermine la quantit de micro-organismes survivants (N) aprs diffrents temps de traitement thermique (t).
12
PARTIE 1 - ASPECTS TECHNOLOGIQUES

pH < 4,5 4,5 < pH < 5,3 pH > 5,3

- plus lAw de laliment est faible, plus les microorganismes sont thermorsistants et donc plus le traitement par la chaleur est inefficace ; - plus laliment est gras, plus les micro-organismes seront rsistants la chaleur car les lipides sont de mdiocres conducteurs de la chaleur.

2.3. Facteur temprature

2.3.1. Droite de rsistance thermique La figure 6 montre la relation existant entre le temps de chauffage et la temprature ltale dexposition la chaleur permettant dobtenir un taux de rduction donn.

3 Dtermination de D partir de la

courbe log N = f(t)

4 Dtermination de D partir de la

courbe N = f(t)

5 Courbes de survie pour le mme

micro-organisme obtenues 55 C, 65 C et 75 C

6 tude de linuence du temps de chauffage

sur la temprature de traitement permettant dobtenir un taux de rduction donn

2. CINTIQUE DE DESTRUCTION DES MICRO-ORGANISMES

13

5.2.3.2. Les changeurs spirale

Ils sont forms de deux canaux en acier inoxydable enrouls en spirale dans lesquels les liquides circulent contre-courant (figures 22 ).
5.2.3.3. Les changeurs tubulaires

Les liquides circulent dans des tubes en acier inoxydable (figure 23 ). On distingue diffrents types dchangeurs tubulaires (figure 24 ) : - les changeurs monotube et multitube : le produit alimentaire circule dans un ou plusieurs tuyaux au centre et les fluides thermiques circulent dans la partie extrieure ; - lchangeur annulaire : le fluide thermique circule dans deux tuyaux, un central et lautre annulaire externe ; le produit alimentaire est propuls dans un canal annulaire intermdiaire. Une variante de ce type dchangeur a t mise au point : il sagit des tubes passage de courant

(TPC). Les parois du tube ne sont pas chauffes par un autre fluide mais par effet Joule. En effet, le tube est parcouru par un fort courant lectrique sous basse tension produisant de la chaleur. Celle-ci est transfre directement entre la paroi interne du tube et le produit alimentaire. Ce systme prsente certains avantages tels que : monte en temprature linaire, matrise de la rgulation de la temprature plus fine, encombrement rduit
5.2.3.4. Les changeurs surface racle

Ils sont utiliss lorsque le produit est visqueux et pteux. Ce type dchangeur est compos dlments tubulaires dans lesquels le fluide thermique circule dans lespace annulaire et le produit dans lespace central (figure 25 ). Le canal central est muni dun rotor quip de lames qui raclent continuellement la surface intrieure de transfert, vitant au produit de sy dposer, et qui mlangent le produit chauff ou refroidi (figure 26 ).

22 Circulation des uides dans un changeur spirale

23 Schma dun changeur tubulaire multitube

26

PARTIE 1 - ASPECTS TECHNOLOGIQUES

24 Circulation des uides dans les changeurs tubulaires monotube (a), multitube (b) et annulaire (c)

25 Coupe transversale dchangeur surface racle

26 Schma montrant le canal central muni dun rotor

quip de lames dun changeur surface racle

5. PASTEURISATEUR : DESCRIPTION ET FONCTIONNEMENT

27

PARTIE 2

Applications

ACTIVIT 6

Pa STEURI S aT IO N D U N E D E NR E a L I mE N Ta IRE

Dans le lait, la prsence despces pathognes pour lhomme prsente un danger pour le consommateur. La prsence de bactries commensales est lindice de souillures et compromet sa conservation. Objectif Afin de dtruire la totalit des micro-organismes pathognes et de rduire la flore vgtative prsente dans le lait pour allonger sa dure de conservation, on se propose : de produire du lait pasteuris partir de lait cru ; de raliser les contrles prconiss sur le produit fini1.
1

aux denres alimentaires. Le rglement (CE) N 1441/2007 a pour objectif de contrler lacceptabilit du procd, de mettre en vidence

Le contrle microbiologique est ralis selon la rglementation (CE) en vigueur concernant les critres microbiologiques applicables

lorigine dun ventuel dysfonctionnement et de procder des actions correctives. Dans le cadre dun lait pasteuris, lhygine du procd rfrence ISO 21528-1:2004.

de pasteurisation est contrle par un dnombrement des Enterobacteriaceae en fin de procd de fabrication par la mthode danalyse de La recherche de lactivit phosphatase alcaline permet de contrler lefficacit de la pasteurisation ralise. En effet, lactivit phosphatase 3356:2009 - FIL 63:2009.

alcaline du lait disparat aprs un traitement de basse pasteurisation. Le contrle est ralis par la mthode danalyse de rfrence ISO

Comptences
Prparer le pilote dans le contexte de production de lait pasteuris partir de lait cru. Vrifier lors de la mise en route du pasteurisateur et avant la pasteurisation du lait cru que lensemble de linstallation ne prsente pas de dysfonctionnement. Conduire la fabrication de lait pasteuris. Effectuer les contrles ncessaires la validation du contrle qualit. Comparer les mthodes de dtermination de lactivit de la phosphatase alcaline. Raliser les oprations de nettoyage et dsinfection de linstallation. Effectuer larrt et la mise en scurit des installations. Prsenter et ordonner les valeurs exprimentales. Exprimer des rsultats. Analyser et interprter les rsultats.

Tches professionnelles
Mettre en uvre la fabrication. Fiche 6.1 Raliser le contrle microbiologique : dnombrement des Enterobacteriaceae. Fiche 6.2 Rechercher lactivit phosphatase alcaline. Fiche 6.3 Comparer les mthodes de dtermination de lactivit phosphatase alcaline Fiche 6.4 76 77 79 81

tude de cas Analyse dune documentation technique, de protocoles et de rsultats exprimentaux. Fiche 6.5 Documents ressource Mise en route, mise en uvre de la pasteurisation et arrt du pilote. Fiche de prise en charge, de fonctionnement et de libration de poste. Fiche de fabrication et de contrle. Indices NPP et limites de confiance 95 % - Table de Mac Grady.
Fiche 2.1 Annexe 2 Annexe 3 Annexe 5

83 48 100 102 104

ACTIVIT 6

75

Fiche 6.1

Mise en uvre de la fabrication de lait pasteuris partir de lait cru

Ractifs
- Lait cru : 20 L - Produits nettoyants (soude, acide nitrique) et dsinfectant du circuit produit Diagramme de procdure

1. Prparation des circuits de chauffe et de refroidissement 2. Prparation du circuit produit Zones de chambrage dterminer Dbit : 110-120 L.h-1 3. Nettoyage et dsinfection du circuit produit

Ralisation de lopration unitaire

- Raliser les oprations de mise en route du pasteurisateur (fiche 2.1). - Mettre en uvre la fabrication : haute pasteurisation 72C pendant 40 s de 20 L de lait cru. - Raliser les oprations de mise en arrt de linstallation. - Remplir la fiche dutilisation du pilote de pasteurisation au cours de la procdure (annexe 2).

Lait cru

4. Mise en uvre de la pasteurisation. chambrage = 72C tchambrage = 40 s

Lait pasteuris

5. Nettoyage et dsinfection du circuit produit 6. Arrt du pasteurisateur

7. Contrles microbiologiques : dnombrement des Enterobacteriaceae daprs ISO 21528-1 :2004. 8. Recherche de lactivit phosphatase alcaline daprs ISO 3356:2009 FIL 63:2009.

76

PARTIE 2 - APPLICATIONS

Fiche 6.2

Ralisation du contrle microbiologique : dnombrement des Enterobacteriaceae daprs ISO 21528-1:2004

Raliser un dnombrement des Enterobacteriaceae sur le lait cru et le lait en fin de procd de fabrication selon la mthode danalyse de rfrence (ISO 21528-1) laide de la technique du NPP avec pr-enrichissement.

Ractifs
Eau peptone tamponne (EPT)
Peptone Chlorure de sodium Phosphate disodique Phosphate monopotassique Eau 10,0 g 5,0 g 9,0 g 1,5 g qsp 1 L

Glose nutritive
Extrait de viande Digestat enzymatique de tissus animaux Chlorure de sodium Agar agar bactriologique Eau 3,0 g 5,0 g 5,0 g 9,0 g qsp 1 L

Bouillon tamponn la bile, au vert brillant et au glucose : bouillon dEnrichissement slectif pour les Enterobacteriaceae (bouillon EE)
Peptone pancratique de glatine Bile de buf Glucose Phosphate disodique Phosphate monopotassique Vert brillant Eau 10,0 g 20,0 g 5,0 g 6,45 g 2,0 g 15 mg qsp 1 L

Glose glucose
Digestat enzymatique de casine Extrait de levure Chlorure de sodium Glucose Pourpre de bromocrsol Agar agar bactriologique Eau 10,0 g 1,5 g 5,0 g 10,0 g 15 mg 9,0 g qsp 1 L

Ractif loxydase
Dichlorohydrate de N, N, N, Nttramthyl-p-phnylne diamine Eau 1,0 g 100 mL

Glose glucose bilie au cristal violet et au rouge neutre (glose VRBG)

Peptone pepsique de viande Extrait autolytique de levure Glucose Sels biliaires Chlorure de sodium Rouge neutre Cristal violet Agar agar bactriologique Eau 7,0 g 3,0 g 10,0 g 1,5 g 5,0 g 30,0 mg 2 mg 13,0 g qsp 1 L

1/2
ACTIVIT 6

77

Protocole
tape 1 Pr-enrichissement en milieu non slectif - Une suspension mre (SM) est ralise en ajoutant 10 mL de lait 90 mL dEPT. - Introduire 10 mL de SM dans chacun des 3 tubes nots 100 . - Introduire 1 mL de SM dans chacun des 3 tubes nots 10-1 contenant 9 mL dEPT. - Ajouter 1 mL de SM dans 9 mL dEPT et mlanger : on obtient la SM dilue au 1/10e. - Introduire 1 mL de SM dilue au 1/10e dans chacun des 3 tubes nots 10-2 contenant 9 mL dEPT. - Incuber 18 h 2 h 37 C. tape 2 Enrichissement en milieu slectif liquide - Ensemencer chaque tube contenant 10 mL de bouillon EE avec 1 mL de chaque culture en EPT incube. - Incuber 24 h 2 h 37 C. tape 3 Isolement et slection pour confirmation - Raliser un isolement sur glose VRBG partir de chaque tube incub. - Incuber 24 h 2 h 37 C. - Contrler la prsence de colonies prsumes tre des colonies dEnterobacteriaceae. tape 4 Confirmation biochimique - partir de chaque glose, repiquer une colonie caractristique sur glose nutritive. Si aucune colonie caractristique nest prsente, repiquer une colonie non caractristique sur glose nutritive ; en effet, certaines entrobactries provoquent la dcoloration du milieu ou de leurs colonies. Si la culture prsente diffrents types de colonies, repiquer chaque type de colonies. - Incuber 24 h 2 h 37 C. - Pour chaque souche, rechercher loxydase. Si aucune coloration violette napparat dans les 10 s, conclure le test oxydase ngative. - Pour chaque souche oxydase ngative, mettre en vidence la fermentation du glucose : ensemencer la glose glucose par piqre centrale et incuber 24 h 2 h 37 C. La souche utilise le glucose par voie fermentaire si le milieu est color en jaune. tape 5 Interprtation statistique Mthode du Nombre le Plus Probable (NPP) - Un tube est considr comme positif si la souche donne des colonies caractristiques sur glose VRBG, est oxydase ngative et fermente le glucose. - Dterminer le NPP : . pour chaque dilution, affecter un chiffre de 0 3 correspondant au nombre de tubes positifs;

. former un nombre avec cette suite de 3 chiffres: le 1er chiffre correspond la dilution 100, le 2e chiffre correspond la dilution 10-1 et le 3e chiffre correspond la dilution 10-2 ; . lire la valeur du NPP dans la table de Mac Grady (annexe 5). - Calculer la concentration bactrienne : . soit N en ufc dEnterobacteriaceae.mL-1 . N = NPP/dilution correspondant au 1er chiffre . N = NPP/100 Donnes pour le dnombrement des Enterobacteriaceae dans le lait pasteuris en fin de procd de fabrication - Plan dchantillonnage . nombre dunits constituant lchantillon : n = 5 ; . nombre maximal de rsultats pouvant prsenter des valeurs comprises entre m et M, pour le nombre dchantillons n ralis : c = 2. - Limites : . critre fix par arrt : m < 1 UFC.mL-1 ; . seuil limite dacceptabilit : M = 5 UFC.mL-1. - Interprtations.
RSULTATS Les valeurs des 5 units de lchantillon sont infrieures ou gales m. Les valeurs pour 1 ou 2 units de lchantillon sont comprises entre m et M et les valeurs pour les autres units de lchantillon sont infrieures ou gales m. Les valeurs observes pour 3 ou 4 ou 5 chantillons sont comprises entre m et M (c/n > 2/5). Au moins une valeur des 5 units de lchantillon est suprieure M. QUALIT Satisfaisante

Acceptable

Insatisfaisante

Analyse du protocole et des rsultats exprimentaux

[Une tude de cas est propose fiche 6.5] 1. Schmatiser le protocole opratoire du dnombrement des Enterobactriaceae dans le lait pasteuris selon la norme ISO 21528-1. 2. La suspension mre a t prpare en ajoutant 10 mL de lait 90 mL deau peptonne tamponne. On obtient une dilution 10-1. Expliquer pourquoi les trois tubes dans lesquels on transfre trois volumes de 10 mL de cette dilution 10-1 sont nots 100 (et non 10-1). 3. Expliquer lintrt de la mise en culture en bouillon EE. 4. Justifier lutilisation du milieu VRBG pour le dnombrement des Enterobacteriaceae. 5. Prsenter les rsultats des dnombrements des Enterobacteriaceae dans le lait cru et dans le lait pasteuris. 6. Interprter les rsultats du contrle microbiologique. 2/2

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PARTIE 2 - APPLICATIONS

Fiche 6.3

Recherche de lactivit phosphatase alcaline daprs ISO 3356:2009 - FIL 63:2009

Dterminer lActivit Phosphatase Alcaline (APA) sur le lait en fin de procd de fabrication selon la norme internationale (ISO 3356:2009 - FIL 63:2009).

Principe

Le lait est incub en prsence dun substrat de la phosphatase alcaline (PAL), le phnylphosphate disodique, en milieu alcalin. Si cette enzyme na pas t inactive par le traitement thermique, la raction libre du phnol. Aprs inactivation de lenzyme et prcipitation des protines, on dose le phnol form par le ractif de Gibbs (dibromo-quinone chlorimide) : la coloration bleue lie la production de dibromo-indophnol est mesure par photomtrie une longueur donde de 610 nm.

Ractifs
NOM DU RACTIF Solution tampon de borate - hydroxyde de baryum pH 10,6 0,1 PRPARATION A : dissoudre 25,0 g de [Ba(OH)2, 8 H2O] dans 500 mL deau distille. B : dissoudre 11,0 g de H3BO3 dans 500 mL deau distille. Chauffer A et B 50 C. Mlanger A et B puis refroidir rapidement 20 C. Ajuster le pH 10,6 0,1 par addition dhydroxyde de baryum. Filtrer. Avant utilisation, diluer avec de leau distille au 1/2. Dissoudre 6,0 g de NaBO2 (ou 12,6 g de NaBO2, 4 H2O) et 20,0 g de NaCl dans 1 L deau distille. Diluer au 1/10e la solution tampon de couleur I. Dissoudre 0,1 g de Na2C2H5PO4, 2 H2O dans 100 mL de solution tampon borate hydroxyde de baryum dilu. Dissoudre 3,0 g de ZnSO4, 7 H2O et 0,6 g de CuSO4, 5 H2O dans 100 mL deau distille.

Solution tampon de couleur I Solution tampon de couleur II Substrat tamponn Dfcant zinc - cuivre

Ractif de Gibbs : solution de 2,6-dibroDissoudre 40 mg 1 mg de C6H2Br2CINO dans 10 mL dthanol 96 % (v/v). moquinone chlorimide (BQC) Solution de sulfate de cuivre Solution de NaOH 0,5 mol/L Solutions talons de phnol Dissoudre 200 mg 2 mg de C6H5OH dans 100 mL deau. Diluer cette solution au 1/10e. Utiliser cette solution pour prparer les solutions talons de phnol contenant 2 g, 5 g, 10 g et 20 g de phnol par mL. Dissoudre 0,05 g de CuSO4, 5 H2O dans 100 mL deau distille.

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ACTIVIT 6

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Protocole
Prparation de la gamme dtalonnage - Tous les tubes auront une composition comparable et seront traits de la mme faon : 1 mL de solution talon de phnol, 1 mL de solution de sulfate de cuivre, 5 mL de solution tampon de couleur II, 3 mL deau distille et 0,1 mL de BQC. - Mlanger. Laisser la coloration se dvelopper 30 min temprature ambiante. - Mesurer A610 par rapport un blanc ractif. Dtermination - Introduire 1 mL de lait dans deux tubes essai. Utiliser lun des deux tubes comme essai blanc. - Placer le tube essai blanc bouch dans leau bouillante pendant 2 min. Refroidir temprature ambiante sous leau froide. - Ajouter 10 mL de substrat tamponn dans chaque tube et incuber 37 C pendant 60 min. - Placer les deux tubes dans leau bouillante pendant 2 min. Refroidir temprature ambiante sous leau froide. - Ajouter 1 mL de dfcant zinc - cuivre dans chaque tube. Filtrer le contenu de chaque tube. Pipeter 5 mL de chaque filtrat dans un tube essai. - Ajouter dans chaque tube 5 mL de solution tampon de couleur I et 0,1 mL de solution BQC. Laisser la coloration se dvelopper 30 min temprature ambiante. - Mesurer A610 de lessai par rapport lessai blanc. - Si A610 de lessai > A610 de la solution talon de phnol la plus concentre, recommencer la dtermination en diluant lchantillon de lait (utiliser comme diluant lchantillon de lait port bullition afin dinactiver la PAL). Expression des rsultats - Calculer lactivit phosphatasique : ap = 2,4 m fd avec : ap : activit phosphatasique en g de phnol par mL de lait ; m : masse de phnol en g ; fd : facteur de dilution de lchantillon pour essai. - Exprimer le rsultat dessai une dcimale.

Analyse du protocole et des rsultats exprimentaux

[Une tude de cas est propose fiche 6.5] 1. crire la raction catalyse par la phosphatase alcaline. 2. tablir un tableau de prparation de la gamme talon de phnol. 3. Retrouver le facteur 2,4 de la formule : ap = 2,4 x m fd 4. Prsenter les rsultats obtenus. 5. Exploiter les rsultats exprimentaux de la gamme dtalonnage. 6. Convertir A610 de lessai en g de phnol en se rfrant la courbe dtalonnage. 7. Calculer lactivit phosphatasique en g de phnol par mL de lait. 8. Interprter le rsultat de la dtermination de lAPA. Donne : limite suprieure accepte pour le lait pasteuris : 4 g de phnol par mL. 9. Conclure sur lacceptabilit du procd en prenant en compte les rsultats du contrle microbiologique et de la recherche de lAPA.

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PARTIE 2 - APPLICATIONS