MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL ANTRAXULUI

Microbiologia i diagnosticul de laborator al antraxului

Clasificarea:

Familia Bacillaceae Genul: Bacillus Specii: Bacillus anthracis (patogen, agentul antraxului) Bacillus cereus (intoxicaii alimentare), Bacillus polymyxa (genul Paenibacillus), Bacillus brevis (genul Brevibacillus), Bacillus subtilis bacili antracoizi, produceni de AB Bacillus anthracis a fost prima bacterie la care a fost demonstrat rolul ei n patogenia unei infecii. n 1877, Robert Koch a izolat microorganismul n cultur pur, demonstrnd capacitatea lui de a forma endospori i a produs antraxul experimental inoculndu-l la animale.

 Caracterele morfobiologice ale B.anthracis

Bacil mare (5-6 m x 1 m), cu extremitile drepte (tiate), gram-pozitiv, imobil (antracoizii sunt mobili), n produse patologice se prezint sub form de lanuri scurte, iar n cultur lanuri lungi (tulpin de bambus). Tulpinile virulente formeaz capsul polipeptidic (acidul D-glutamic). Sporul este ovoid, n poziie central, nu deformeaz celula. Sporogeneza are loc n cultur, n sol i n esuturi i exsudate din animale moarte (n prezena oxigenului), dar nu n snge sau esuturi de animale vii.

 Caractere de cultur

B.anthracis nu este exigent nutritiv, cultiv pe medii uzuale. Facultativ-anaerob, t optim 35-37 grade, pH 7-7,4. Peste 24 ore de incubare formeaz colonii R, mari, cu contur neregulat, opace, plate, uscate, rugoase (coam de leu, cap de meduz). Nehemolitice pe gelozsnge (antracoizii sunt hemolitici). Pe geloz-ser, n exces de CO2, formeaz colonii S (producerea capsulei). Pe mediu cu 0,5-1 UI de penicilin B.anthracis formeaz lanuri din forme globulare - colier de perle (proprietate absent la antracoizi). n bulion peptonat formeaz flocoane la fundul eprubetei, cu supernatantul clar. B.anthracis este sensibil la fagul gamma.

The following figures (5, 6, and 7) from the CDC are reliable images of Bacillus anthracis grown as described in the figure legends.

 Caractere biochimice

Activitate proteolitic lichefiaz gelatina n form de brad inversat, peptonizeaz laptele, diger serul coagulat, nu produce H2S. Activitate zaharolitic fermenteaz unele glucide: glucoza, maltoza, zaharoza, tregaloza, etc. Nu fermenteaz lactoza i arabinoza. Rezistena n mediul extern: formele vegetative sunt slab rezistente, sporii rmn viabili n sol decenii, se distrug la fierbere n 30-40 min.

 1.

Factori de patogenitate Capsula polipeptidic, codifict de plasmida pX02. Inhib fagocitoza i puterea bactericid a sngelui. Capsula joac un rol important n etapele iniiale ale infeciei. Formarea capsulei are loc in vivo i in vitro, pe medii cu ser i n atmosfer cu 5 % CO2.

2. Exotoxina antraxului, codificat plasmidic (pX01)

Este constituit din 3 componente: Factorul I, edematogen (EF), care este o adenilatciclaz. Acumularea de cAMP duce la modificarea permeabilitii membranare cu producerea edemului. inta celulele endoteliale (efect - oc hipovolemic, oc septic) Factorul III, letal (LF), responsabil de efectele letale ale toxinei anthrax. Este o proteaz Zn++ dependent care induce producerea citokinelor de ctre macrofage i limfocite (efect recie inflamatoare, oc septic) Factorul II, antigen protector (PA), induce sinteza Ac antitoxici protectori. PA este responsabil de fixarea toxinei pe receptorii celulelor sensibile.

 Aparte, aceti factori exercit activitate biologic

nesemnificativ la animal. Din contra, combinaii din doi sau trei factori toxici determin urmtoarele consecine la animale experimentale: PA+LF = activitate letal PA+EF = produce edem PA+LF+EF = edem i necroz cu efect letal EF+LF = inactiv Acest experiment sugereaz c toxina antraxului are structur clasic de citotoxin bacterian de tip A-B cu PA n calitate de B-fragment (de fixare pe receptori celulari) i cu factorii EF i LF cu funcie de fragment A (activ), care acioneaz n interiorul celulei.

 1. 2. 3.

Structura antigenic a B.anthracis Ag polipeptidic capsular (induce Ac neprotectori) Ag polizaharidice somatice termostabile (depistate n reacia de precipitare Ascoli) Toxina (componentul PA), induce formarea Ac protectori, neutralizani

 Epidemiologia i patogeneza antraxului

Sursa de infecie animalele erbivore bolnave de antrax (ovine, caprine, bovine, suine). Solul contaminat cu spori este un rezervor de germeni important i permanent (decenii). Transmiterea: - prin contact direct cu animalele bolnave sau produse contaminate (carne, piei, ln, blan, etc), puni i nutreuri contaminate, cu ptrunderea agentului prin tegumentul lezat - aerogen, prin inhalarea sporilor de B.anthracis - pe cale alimentar (consum de carne de la animale bolnave de antrax insuficient prelucrate termic) n majoritatea cazurilor antraxul se manifest ca boal profesional a ngrijitorilor de animale, personalului de la abatoare, ntreprinderi de prelucrare a produselor animaliere, veterinarilor, zootehnicienilor, mcelarilor, tbcarilor, etc.

 Formele clinice de antrax

I. Antraxul cutanat , pustula malign (forma cea mai

frecvent). Sporii intr printr-o leziune a tegumentului, germineaz i prolifereaz la poarta de intrare, cu dezvoltarea unui edem gelatinos local caracteristic.

La poarta de intrare, peste 12-36 ore de la penetrare, apare o papul, care evolueaz rapid ntr-o vezicul, apoi n pustul cu coninut sanguinolent. La spargerea pustulei se formeaz o leziune necrotic, prezentnd n centru o escar neagr nconjurat de vezicule satelite. Leziunea se localizeaz mai frecvent pe mini, fa, ceaf, etc. Ptrunderea n snge determin diseminarea sistemic a bacteriei.

II. Antraxul pulmonar apare la inhalarea sporilor de B. anthracis , care sunt nglobai de macrofagele alveolare unde ei germineaz i se multiplic, determinnd o pneumonie foarte grav cu edem.

Urmeaz infectarea ganglionilor limfatici mediastinali cu dezvoltarea unei necroze hemoragice. Pacientul manifest febr, stare de ru, mialgie, tuse ne-productiv. Din ganglionii limfatici infecia poate trece n snge. Decesul poate surveni n 24 h.

III. Anthraxul digestiv apare n urma consumului de

carne infectat. n mucoasa intestinal se dezvolt procese identice cu cele din antraxul cutanat (enterocolit ulceroas). Clinic: vom i diaree, cu snge n masele fecale.

Poate urma invazia ganglionilor limfatici mezenterici i a sngelui, asociat cu prostraie profund, oc i moarte. Meningita poate apare (foarte rar) ca urmare a oricrei forme de antrax

 Diagnosticul de laborator al antraxului

Se efectueaz numai n laboratoare specializate cu respectarea unor reguli stricte de securitate. Prelevate (n funcie de forma clinic): exsudat din leziunea cutanat, sput, snge, LCR, materii fecale, bioptate din ganglioni limfatici, probe necroptice, probe de la animalul suspect i elemente din mediul extern

 1.

Examenul microscopic direct n frotiuri pregtite din prelevate i colorate Gram sau cu albastru de metilen se observ bacili mari cu morfologia caracteristic, izolai sau n lanuri scurte. Sporii sunt rareori prezeni.

2. RIF


I.

II.

III.

Examenul bacteriologic Prelevatele monomicrobiene se nsmneaz pe geloz i geloz-snge, iar cele polimicrobiene se nclzesc n prealabil 10 min la 75 grade C. Incubarea la 37 C timp de 24 ore. Sngele n bulion glucozat, repicri zilnice timp de 7 zile pe gelozsnge. Examinarea coloniilor crescute, selecia celor suspecte i acumularea lor Identificarea culturii pure acumulate i diferenierea de antracoizi.

 Examenul biologic

Se inoculeaz prelevatele la cobai sau oareci, care sunt foarte sensibili la infecie. Dup moartea lor (36-48h) bacilii sunt depistai n frotiuri din snge i organe. Depistarea Ag polizaharidice termostabile n prelevate (reacia de precipitare inelar Ascoli) Diagnosticul serologic. Ac anti-antrax pot fi depistai la convalesceni n RP sau RFC Diagnosticul imunologic (proba cutanat alergic). Se pune n eviden starea de hipersensibilizare prin inocularea intradermic a 0,1 ml de antraxin (extract din tulpina vaccinant de B.anthracis). Reacie pozitiv edem i hiperemie cu diametrul de peste 8 mm.

Tratamentul antraxului - Antibiotice (peniciline, cefalosporine, fluorochinolone) - Imunoglobulina antiantrax Profilaxia specific a antraxului - Depistarea i izolarea animalelor bolnave, incinerarea animalelor moarte sau ngroparea adnc a cadavrelor i acoperirea cu var nestins - Vaccinarea animalelor - Imunizarea personalului expus cu vaccin viu atenuat , vaccin acelular (elaborat din tulpini acapsulate avirulente, coninnd proteina PA). n curs de elaborare vaccin cu PA i antigen capsular.