DANIELA CRISTINA CEZARETTO

CONTROLE DA QUALIDADE MICROBIOLGICA DE MEDICAMENTOS

CENTRO UNIVERSITRIO DA FUNDAO DE ENSINO OCTVIO BASTOS SO JOO DA BOA VISTA, SP, 2005

DANIELA CRISTINA CEZARETTO

CONTROLE DA QUALIDADE MICROBIOLGICA DE MEDICAMENTOS

Nome do orientador: Eliana P. Chagas Monografia apresentada como requisito da disciplina Trabalho de Concluso de Curso, do Curso de Cincias Biolgicas UniFeob So Joo da Boa Vista SP.

CENTRO UNIVERSITRIO DA FUNDAO DE ENSINO OCTVIO BASTOS SO JOO DA BOA VISTA, SP, 2005

FOLHA DE APROVAO
Ns professores abaixo assinados, declaramos que a monografia apresentada pela aluna Daniela Cristina Cezareto, apresentada no dia novembro de 2005, foi aprovada. 04 de

BANCA EXAMINADORA

Professora Ps - Doutora Eliana Pereira Chagas

ORIENTADOR

Marco Antonio Roqueto

MEMBRO DA BANCA

Professor Mestre Maurio Jos Cividini Matthiesen

MEMBRO DA BANCA

AGRADECIMENTOS

Primeiramente minha me, por ter me auxiliado a transpor as inmeras dificuldades encontradas ao longo da minha graduao, pela confiana e incentivo.

A toda minha famlia pela colaborao e participao durante a realizao deste trabalho.

professora e amiga Dr. Eliana Pereira Chagas que com grande satisfao me orientou neste trabalho e a quem devoto a mais sincera e efetiva admirao e respeito.

UniFEOB e a todos os formandos da 2 Turma do Curso de Cincias Biolgicas, s minhas eternas e inseparveis amigas de trabalho Cristiane Cipola, Natalia Gonalves e em especial minha querida amiga Mariana Suppia, companheiras de incontveis momentos, os quais me recordarei para o resto da minha vida... Meninas sem vocs minha vida universitria no seria a mesma...vocs so muito especiais!!!

Um agradecimento muito especial Professora, Ex-coordenadora do Curso e muito amiga Msc. Daniela F. C. Jacobucci e seu marido e professor Dr. Giuliano Jacobucci, que infelizmente tiveram que nos abandonar no final do curso. Dani e Giuliano....sentimos muitas saudades.

Aos que embora no citados, contriburam de alguma forma para a realizao deste trabalho.

SUMRIO
1. 2. 3. RESUMO....................................................................................................................... 6 INTRODUO ............................................................................................................ 7 CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS........................................ 9 3.1. A INDSTRIA FARMACUTICA E AS POLTICAS DE SADE E DE MEDICAMENTOS .......................................................................................................... 12 4. ANLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS NO ESTREIS 15 4.1. AMOSTRAGEM....................................................................................................... 15 4.2. PREPARAO DA AMOSTRA ............................................................................ 16 4.3. MTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS..................................... 16

4.3.1.Em meio slido, com semeadura da amostra em profundidade (pour plate) ........................................................................................................................... 16 4.3.2. Em Meio Slido, Com Semeadura Da Amostra Em Superfcie ........... 17 4.3.3. Membrana Filtrante ......................................................................................... 17
4.4. PESQUISA DE PATGENOS ESPECFICOS ....................................................... 18 4.5. MTODOS RPIDOS.............................................................................................. 18 5. ANLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS ESTREIS...... 20 5.1. ASPECTOS MICROBIOLGICOS......................................................................... 21 5.2. OBTENO DE PRODUTOS ESTREIS.............................................................. 22 5.3. PROCESSOS ESTERILIZANTES .......................................................................... 22 5.4. TESTE DE ESTERILIDADE .................................................................................. 23 5.4.1. Amostragem ....................................................................................................... 24 5.4.2. Preparo da Amostra ......................................................................................... 25 5.5. MTODOS DE INOCULAO ............................................................................. 26 5.5.1. Inoculao Direta ............................................................................................. 26 5.5.2. Inoculao Indireta ou Filtrao................................................................... 28 5.6. CONTROLE DA EFICINCIA DE ESTERILIZAO ......................................... 33 6. TESTE DE PIROGNIO .......................................................................................... 36 6.1. ENDOTOXINAS ..................................................................................................... 37 6.2. NVEIS PIROGNICOS.......................................................................................... 38

6.3. PIROGNIOS DE FONTES DISTINTAS .............................................................. 39 6.4. PROCESSOS DE DESPIROGENIZAO ............................................................ 40 6.5. TESTE DE PIROGNIO POR MTODO IN VIVO ............................................... 41 6.5.1. Fundamento do Mtodo ................................................................................. 42 6.5.2. Modelo Animal................................................................................................. 42 6.5.3. Amostra .............................................................................................................. 44 6.5.4. Coelho ................................................................................................................. 45 6.6. DETERMINAO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS POR MTODO IN VITRO ............................................................................................................................... 46 6.6.1. Mecanismo de Reao .................................................................................... 47 6.6.2. Ponto Final de Gelificao ............................................................................ 47 6.7. OUTROS MTODOS............................................................................................... 48 7. 8. 9. CONCLUSO............................................................................................................. 50 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 52 ANEXO: ...................................................................................................................... 56

1. RESUMO

A expresso Controle de Qualidade de Medicamentos abrange todos os princpios que devem ser seguidos pelos fabricantes e autoridades governamentais para garantir que a medicao que os mdicos e o pblico recebem seja incua e eficaz. A importncia do controle de medicamentos pode ser evidenciada se pensarmos que nossa prpria vida depende deles. Visando a obteno de produtos de qualidade, toda indstria farmacutica deve, alm de seguir as boas prticas de fabricao, possuir laboratrios de controle de qualidade, onde devem ser executadas anlises empregando-se processos fsicos, qumicos e biolgicos, com a finalidade de assegurar e confirmar a qualidade do produto fabricado. Alguns dos problemas de produo e controle de medicamentos so regulamentados por legislao especifica. A qualidade microbiana de medicamentos deve ser definida frente a diversos fatores, entre os quais, de elevada importncia, o fato de ser consumido por pessoas debilitadas por vezes inclusive imunodrepimidas. Cargas microbianas muito elevadas podem tambm facilmente comprometer a estabilidade do produto. O objetivo deste trabalho compilar informaes sobre o controle da qualidade microbiolgica de medicamentos, e os testes que so realizados no controle da qualidade. Deve se levar em considerao o fato de haver uma grande escassez de literatura especfica sobre o assunto.

2. INTRODUO
A expresso Controle de Qualidade de Medicamentos abrange todos os princpios que devem ser seguidos pelos fabricantes e autoridades governamentais para garantir que a medicao que os mdicos e o pblico recebem seja incua e eficaz. A importncia do controle de medicamentos pode ser evidenciada se pensarmos que nossa prpria vida depende deles (SANTORO, 1988). A preocupao relativa qualidade, quando associada atividade produtiva, foi sempre aspecto inerente ao ser humano, que busca aperfeioar, desenvolver, superar limites, independente da atividade que exera, a fim de atender aos anseios da sociedade como consumidora (PINTO et al., 2000). O rgo responsvel pela fiscalizao das boas prticas de fabricao a Secretaria Nacional de Vigilncia Sanitria, da qual fazem parte a Diviso Nacional de Alimentos (DINAL), a Diviso de Cosmticos (DICOP), a Diviso de Substncias Domsticas (DISAD) e a Diviso de Medicamentos (DIMED). Toda a regulamentao sobre medicamentos est baseada na Lei n 6.360, de 23 de setembro de 1976, com o Decreto n 79.094 de 5 de janeiro de 1977. A atuao desta legislao no comrcio se faz sobre o produtor e o consumidor (ANVISA, 2005). Visando a obteno de produtos de qualidade, toda indstria farmacutica deve, alm de seguir as boas prticas de fabricao, possuir laboratrios de controle de qualidade, onde devem ser executadas anlises empregando-se processos fsicos, qumicos e biolgicos, com a finalidade de assegurar e confirmar a qualidade do produto fabricado. Alguns dos problemas de produo e controle de medicamentos so regulamentados por legislao especfica (BPF, 1990). Os produtos submetidos vigilncia sanitria, respeitando suas particularidades, devem ser produzidos, armazenados, transportados e dispensados de forma a apresentarem segurana necessria para o uso e consumo. Considera-se neste caso, que os medicamentos, os fitoterpicos, os insumos farmacuticos, cosmticos, saneantes e outros produtos devem respeitar limites microbianos (PINTO et al., 2000). O limite microbiano de medicamentos e seus insumos pode se constituir em ausncia

8 absoluta de formas viveis (estreis) ou sua presena em grandezas definidas, restritas ou no a determinadas cepas microbianas para produtos no estreis. (PINTO et al., 2000). A qualidade microbiana de medicamentos deve ser definida frente a diversos fatores, entre os quais, de elevada importncia, o fato de ser consumido por pessoas debilitadas por vezes inclusive imunodrepimidas. Cargas microbianas muito elevadas podem tambm facilmente comprometer a estabilidade do produto. Conseqncias deste comprometimento esto associadas perda da eficcia teraputica, seja por degenerao do princpio ativo, seja por alterao de parmetro fsico fundamental para sua atividade, como por exemplo, o pH. Aspecto igualmente importante consiste na alterao das propriedades fsico-quimicas que podem indiretamente afetar a ao teraputica, comprometendo a biodisponibilidade do produto, assim como a aceitao pelo consumidor (ANSEL et al., 2000). Fatores essenciais para que se atinjam nveis adequados de qualidade microbiolgica no produto terminado envolvem as fontes diretas de contaminao, acarretadas por fluidos gasosos, gua, demais matrias primas e material de acondicionamento. Ainda existem fontes indiretas como decorrentes de procedimentos de limpeza, de instalaes inadequadas, manipuladores no paramentados ou submetidos a exames mdicos peridicos, equipamentos com limpeza adequada, particularidade nos pontos crticos e sem procedimentos validados (SILVA, 1997). O objetivo deste trabalho foi compilar informaes sobre o controle da qualidade microbiolgica de medicamentos, e sobre os testes que so realizados no controle da qualidade. Considerando-se o fato de haver uma grande escassez de literatura especfica sobre o assunto.

3. CONTROLE DE QUALIDADE DE MEDICAMENTOS

Em 1962, um Congresso nos Estados Unidos comeou a exigir dos fabricantes que fossem empregados mtodos adequados para a boa fabricao de medicamentos. Ficou estipulado que as empresas farmacuticas fossem instaladas em locais satisfatrios, com equipamentos adequados, pessoal bem capacitado, que cada lote de medicamento fosse preparado de acordo com a frmula modelo detalhada, que fossem aplicados os controles devidos durante o processo de fabricao, analisados os produtos terminados e efetuado minucioso controle em relao ao acondicionamento, embalagem e rotulao dos medicamentos (SANTORO, 1988). A qualidade algo que se obtm como resultado da considerao de todos os fatores que, de uma maneira ou de outra, entra na concepo, desenvolvimento, produo, distribuio e uso dos frmacos. Atualmente cada vez maior a preocupao de assegurarse a ministrao de medicamentos eficazes. Dentre os conceitos de qualidade, devem ser considerados alguns parmetros: frmacos; Manuteno da potncia, eficcia teraputica e aspecto at o momento do uso; Liberao do ingrediente ativo, de tal maneira exercida a mxima Contedo do princpio ativo dentro dos limites experimentais; Uniformidade do contedo em cada dose; Ausncia de contaminantes, incluindo a contaminao cruzada com outros

disponibilidade biolgica (SILVA, 1997). O departamento e controle de qualidade no fornecem somente laudos de anlise, mas tem a competncia de especificar normas e colaborar nos setores de compras, almoxarifado, produo, formulao, acondicionamento, embalagens e vendas (SILVA, 1997). Na dcada de 1960, dois movimentos ocasionaram grande influncia na indstria farmacutica. O primeiro, das aes regulatrias, agrupadas sob a denominao de Boas Prticas de Fabricao, introduziram a confiabilidade do processo produtivo. A adoo deste sistema de trabalho era macia em grande parte dos pases. Paralelamente, a engenharia de qualidade tomava nfase, carregando consigo o conceito de Controle Total

10 de Qualidade, ficando explcito que a qualidade de produtos no alcanada por inspeo, mas deve ser construda durante o processo de fabricao. O conceito de controle total de qualidade de produtos farmacuticos e cosmticos consiste no esforo organizado de uma empresa, no sentido de projetar, produzir, manter e assegurar as caractersticas, especificadas em cada produto distribudo para comercializao (PINTO et al. 2000). O segundo movimento desta dcada, tambm de elevado impacto, foi decorrente da influncia japonesa, cujo aprendizado sobre a qualidade, levado extremamente a srio, provocou a busca do defeito zero, alm de introduzir diferentes ferramentas auxiliares, como os cinco S: seiri (organizao), seiton (arrumao), seis (limpeza), seiketsu (asseio) e shitsuke (disciplina), sendo este ltimo o mais difcil de atingir, caracterizando-se por ser o estgio em que a assimilao do conceito tal que todos os S so aplicados de maneira automtica, quase mecnica. Vale ressaltar ainda o Diagrama de Ishikawa, de espinha de peixe ou ainda causa efeito, em que aspectos de motivao, gerenciamento, materiais, mtodos, mquinas e manpower (instruo, habilidade, treinamento, disponibilidade de pessoal) so exaustivamente investigados no sentido de soluo de problemas (CAMPOS, 1992). Pelo exposto pode-se observar que os problemas mais importantes do controle de qualidade de medicamentos so a identificao, pureza, estabilidade, legitimidade, dosagem, absoro e o aparecimento de novas substncias ativas (SANTORO, 1988). Convm ressaltar, que a qualidade do medicamento fator promocional para obteno do lucro, assim como evitar aes judiciais em funo de problemas decorrentes da m qualidade (SILVA, 1997). Os produtos que apresentam substncias que possam causar danos ao consumidor sob condies normais de uso, so chamados de produtos contaminados e podem ser por microrganismos ou no. (NICOLETTI et al, 1997). Para atingir bom nvel de qualidade microbiana nos produtos farmacuticos fundamental que se conheam as fontes e os mecanismos responsveis por esta contaminao. Os contaminantes microbianos presentes nas matrias primas sero invariavelmente transferidos ao produto, acrescidos dos microrganismos oriundos de equipamentos e ambientes produtivos, dos operadores envolvidos e dos materiais das embalagens (LIPTON & JEREMIAH, 1994).

11 No caso dos medicamentos, as matrias primas geralmente empregadas se constituem de ps-sintticos, com baixa carga microbiana, porm, aquelas de origem natural podem conter elevadas cargas microbianas (FERREIRA, 2002). A multiplicao de contaminantes ocorre rapidamente em espaos como juntas e vlvulas, onde a gua e resduos do produto se acumulam, ocasionando contaminao persistente e de difcil eliminao, resultando em distintos nveis de risco na dependncia do tipo de produto. A situao preocupante pois residuais de gua podem permanecer nestes espaos, propiciando o crescimento microbiano e subseqente contaminao endotxica causada por endotoxinas (FERREIRA, 2002). Embora a contaminao ambiental seja s vezes considerada menos importante, h evidncias de que a transferncia de microrganismo do ambiente para o produto ocorra quando inexistem condies adequadamente controladas. Contaminantes ambientais de paredes secas compreendem principalmente bacilos Gram positivos, cocos e fungos. Bactrias Gram negativas so mais susceptveis aos procedimentos de secagem, porm nmeros reduzidos podem persistir por perodos considerveis de tempo. Em reas midas como pias e drenos, ocorre acmulo de Pseudomonas e Acinetobacter que no apenas sobrevivem, mas se proliferam nestas condies. Contaminao area principalmente associada poeira e s escamas da pele, se constituem em veculos de esporos bacterianos e cocos (PRISTA et al.,1995). A contaminao derivada dos operadores normalmente significante. Durante atividades normais, a perda de escamas da pele da ordem de 104 escamas por minuto. Os contaminantes por elas transportados so micrococos no patognicos, e estafilococos, mas tambm podem se constituir de Staphylococcus aureus como parte da microbiota normal. Outras bactrias como a Salmonella e Escherichia coli, embora no constituintes da microbiota, podem estar transitoriamente associados pele, na dependncia dos hbitos de higiene dos operadores (PRISTA et al.,1995). Os materiais de acondicionamento de matrias-primas devem ser limpos, alm de adequadamente planejados, para efetivamente proteger o produto. Outro aspecto a considerar a contaminao durante o uso ou estocagem do produto(PRISTA et al.,1995). A capacidade de um microrganismo em promover o processo de deteriorao depende da sua capacidade em produzir enzimas adequadas. O risco maior no caso de

12 produtos farmacuticos reside na extrema versatilidade de caminhos bioqumicos dos microrganismos, possibilitando a sntese de enzimas degradativas. Conseqncias que advm da degradao enzimtica podem ser a queda na potncia, reduo da biodisponibilidade, formao de pigmentos e odores que tornam o produto inaceitvel pelo usurio. A atividade microbiana pode tambm resultar na produo de toxinas ou na degradao do prprio sistema conservante (BPF, 1990). A Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, atravs da Gerncia Geral de Inspeo de Medicamentos e Controle de Produtos, vem constatando a inexistncia, no pas, de uma literatura tcnica que sistematize os ensaios, processos e materiais utilizados por Laboratrios de Controle da Qualidade e Controle da Produo, no sentido de uniformizar as metodologias empregadas, nas anlises de controle de medicamentos (ANVISA, 2005).

3.1. A INDSTRIA FARMACUTICA E AS POLTICAS DE SADE E DE MEDICAMENTOS

O processo industrial farmacutico complexo, vinculando-se s polticas industrial, cientfica tecnolgica e de sade. um processo que exige investimentos em pesquisa e desenvolvimento na produo e no controle de qualidade dos produtos, aquisio de substncias, armazenagem e distribuio dos produtos, entre outros fatores. Para essas aes empregam-se altas tecnologias, mo de obra qualificada em diversas funes e altos investimentos financeiros, inclusive em propaganda (PORTO & FREITAS, 1997). Por ocuparem lugar de destaque no sistema de sade e no tratamento das doenas, tanto nos pases industrializados como nos pases em desenvolvimento, os medicamentos exigem uma poltica nacional especfica. Esta poltica deve estruturar-se de acordo com as necessidades de cada pas e fundamental para garantir eficcia, segurana, qualidade, informao e aspectos de custos e preos dos medicamentos, alm de se mostrar importante para assegurar a utilizao adequada desses produtos por parte da classe mdica e farmacutica (BONFIM & MERCUCCI, 1997). Em 1995, a Organizao Mundial da Sade (OMS) recomendou que o Estado devesse garantir a disponibilidade de acesso eqitativo, assim como a utilizao adequada dos

13 medicamentos e preconizou para a formulao e acompanhamento de poltica de medicamentos de cada pas, uma ampla parceria entre governos representando o interesse pblico e os demais atores do processo: os que utilizam ou iro utilizar medicamentos, os prescritores, os dispensadores e os que fazem, comercializam, distribuem e vendem os medicamentos. Esto ainda includos nessa parceria as universidades, os institutos especializados de pesquisa e instruo, as instituies que formam pessoal na rea mdica, biolgica, odontolgica, de enfermagem e farmcia, as escolas de preparao de pessoal de nvel mdio e de agentes comunitrios de sade, as organizaes desvinculadas do governo, como associaes de profissionais, grupos de consumidores, indstria farmacutica (preferivelmente suas representaes no pas ou internacionais) e as representaes jurdicas. Verifica-se, portanto, que necessria a participao de diversos atores para o estabelecimento de uma poltica de medicamento mais adequada realidade de uma determinada populao (BONFIM & MERCUCCI, 1997). Na indstria farmacutica so detectados riscos para o meio ambiente, para o consumidor e para o profissional envolvido no processo produtivo. Para o meio ambiente, decorrem do armazenamento de grande quantidade de produtos qumicos que podem ser txicos, explosivos e inflamveis. Exploso ou incndio provocados pelos produtos qumicos podem gerar uma combinao de substncias perigosas, resultando em nuvem txica que afetaria no s os trabalhadores de uma indstria, mas tambm a comunidade vizinha e, dependendo da sua extenso, atingiria dimenso catastrfica. O descarte de produtos qumicos tambm se constitui em um problema grave pelos riscos que podem gerar para a comunidade (BONFIM & MERCUCCI, 1997). Sobre os riscos tecnolgicos ambientais, PORTO & FREITAS (1997) comentam sobre a expanso, em nvel mundial, da capacidade de produo, armazenamento, circulao e consumo de substncias qumicas. Explicam que a lgica de desenvolvimento industrial e inovaes tecnolgicas no ramo qumico vm possibilitando um crescimento dos riscos numa velocidade bem maior do que a capacidade cientfica e institucional de analis-los e gerenci-los. Os autores acrescentam ainda que, nos pases de economia semiperifrica como o Brasil, somam-se aos riscos decorrentes da prpria industrializao as fragilidades sociais, institucionais e tcnicas, que acentuam a vulnerabilidade dessas sociedades frente aos riscos tecnolgicos ambientais.

14 Para os consumidores, os riscos resultam tanto de efeitos adversos dos produtos como da qualidade do seu preparo, indicao ou administrao correta, entre outros. Podem-se ampliar esses riscos para a sociedade devido ao estmulo ao consumo de medicamentos por parte da industria farmacutica privada vida de lucros que, para isso, investe de forma macia em propagandas junto ao pblico e, em especial, ao mdico (PORTO & FREITAS, 1997).

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4. ANLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS NO ESTREIS

Produtos no estreis so aqueles nos quais se admite conceitualmente a presena de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as caractersticas de sua utilizao. A ateno no controle de produtos no estreis assegura que a carga microbiana contida no produto, seja no aspecto qualitativo ou quantitativo, no comprometa a sua qualidade final ou a segurana do paciente. O objetivo do controle de qualidade microbiolgica comprovar a ausncia de microrganismos patognicos e determinar o nmero de microrganismos viveis, em funo do tipo de utilizao do produto (PINTO et al., 2000).

4.1. AMOSTRAGEM
A amostragem a ser efetuada para investigao quanto ao atendimento aos padres microbianos deve ser representativa, em termos de abrangncia do volume contido, do nmero de unidades contenedoras, e das operaes unitrias envolvendo risco de contaminao adicional ou de crescimento microbiano. Para que se cumpra tal meta, diferentes critrios devem ser adotados a circunstncias especficas (ALBERT et al., 1989). H que se efetuar a assepsia na rea prxima coleta de amostras, usar preferencialmente recipientes com vlvula de amostragem, ou na sua ausncia, proceder vedao hermtica subseqente. Os recipientes devem ser de boca larga e com capacidade para 100 g ou 100 mL. O transporte deve se dar em condies adequadas de temperatura. No caso de lquidos, importante que se evite o uso de pipetas ou de tubos de vidro, com risco de quebra e liberao de fragmentos no contedo. Nos processos contnuos, a segmentao como incio, meio e fim do processo deve estar contemplada na amostragem. Considerando o produto terminado, toma-se via de regra, uma duplicata da amostra, representando incio, meio e fim do processo de enchimento, admitindo que aps o fechamento do material de acondicionamento introduo de contaminantes no exista mais (CRISTLIA, 2005).

16 A quantidade de amostra a ser coletada depende das anlises, inclusive com reteste. A recomendao das principais farmacopias, para enriquecimento na pesquisa de patgenos, de 10,0 g ou 10,0 mL, alm da contagem total em igual quantidade (CRISTLIA, 2005).

4.2. PREPARAO DA AMOSTRA

A primeira preocupao ao preparar uma amostra consiste na verificao da atividade antimicrobiana do produto devido presena de conservantes na frmula. Estes devem ser inativados com substncias adequadas, conforme sua natureza qumica. A adio de inativantes previamente esterilizados por algum processo eficiente deve ser previamente validada. Outro cuidado importante o ajuste do pH do produto diludo para a faixa de neutralidade, pois isso pode impedir o crescimento microbiano (BAIRD, 1986). A homogeneizao da amostra fundamental no sentido de conduzir a transferncia para etapas subseqentes de forma representativa ainda que a mesma tenha sido diluda, empregando-se, por exemplo, soluo salina peptonada (0,1%), soluo tamponada (pH 7,0) ou caldo lactose. Algumas formas farmacuticas podem exigir tratamento especfico no sentido de permitir o contato ntimo da amostra com o meio diluente. Todas as operaes empregadas de forma a possibilitar a contagem e pesquisa de microrganismo devem ser validadas, assegurando a confiabilidade do ensaio (BAIRD, 1986).

4.3. MTODOS DE CONTAGEM DE MICRORGANISMOS

4.3.1.Em meio slido, com semeadura da amostra em profundidade (pour plate)
Este mtodo consiste na transferncia de 1,0 a 2,0 mL da diluio da amostra para rplicas de placas de Petri esterilizadas. O meio de cultura esterilizado fundido e resfriado a temperatura compatvel com a fisiologia celular (45 48 C), em quantidade de cerca de 20 mL, vertido sobre cada uma das placas contendo as amostras, seguido de homogeneizao com movimentos em S ou 8 sobre a bancada de trabalho, os quais

17 permanecem at solidificao temperatura ambiente. Segue-se incubao das placas, em estufa na posio invertida, 2 a 5 dias de incubao a 30 - 35 C, para bactrias e 5 a 7 dias para fungos e leveduras. Aps estes perodos as colnias so contadas como auxlio de contadores de colnia do tipo Quebec, abrangendo o crescimento tanto na superfcie, quanto na profundidade. O nmero mdio decorrente da rplica correspondente a uma determinada diluio, multiplicado pelo valor da diluio dar o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC) por unidade de peso ou volume da amostra. Este mtodo limitante para amostras que conferem opacidade ao meio, no permitindo a visualizao das colnias desenvolvidas aps a incubao (PINTO et al., 2000). Os meios de cultura devem ter composio completa a fim de propiciar o crescimento de contaminantes. Para a contagem total de bactrias, os meios oficialmente recomendados so principalmente gar casena-soja e gar nutriente; para fungos, gar Sabouraunddextrose e gar batata. Os meios de cultura podem ser incorporados de antibiticos, de acido tartrico (inibidor de crescimento bacteriano) ou de outro agente seletivo (PINTO et al., 2000).

4.3.2. Em Meio Slido, Com Semeadura Da Amostra Em Superfcie

O meio de cultura preparado e distribudo previamente em placas de Petri. Empregando-se pipetas esterilizadas, volumes de 0,1 a 0,5 mL de cada diluio da amostra considerada so distribudos na superfcie do meio de cultura j solidificado, sendo o espalhamento efetuado com movimentos cuidadosos ou com o auxilio de um basto de vidro ou ala de Drigalski. Na dependncia da densidade da amostra, haver absoro total pelo meio. A escolha do meio de cultura, condies de incubao e clculos para determinao de carga contaminante vivel corresponde ao mtodo descrito acima (FISCHER et al., 1996).

4.3.3. Membrana Filtrante

Alquotas do produto sob forma lquida ou suas diluies so filtradas atravs de membranas apropriadas (0,45 m ou 0,20 m de poro e 47 mm de dimetro) constitudas de derivados celulsicos, seguindo-se a deposio de membranas, na mesma posio, sobre

18 placas contendo meio de cultura (ARAUJO & MACEDO, 2001). Esta metodologia, vantajosa por permitir volumes elevados na amostragem e pela acuidade, apresenta recomendao especial para amostras contendo agentes

antimicrobianos. O clculo para determinao do nmero total de contaminantes viveis igual ao mtodo Pour Plate (ARAUJO & MACEDO, 2001).

4.4. PESQUISA DE PATGENOS ESPECFICOS

Conforme algumas recomendaes farmacopicas e citaes tcnicas mais aceitas, os microrganismos a serem pesquisados, devido presena indesejvel nas formulaes farmacuticas so: Pseudomonas aeruginosa nas preparaes tpicas, principalmente naquelas envolvendo regies prximas aos olhos; Staphylococcus aureus nas preparaes tpicas em geral; Escherichia coli e Salmonella sp nas preparaes orais; Pode tambm ser interessante a pesquisa de outras cepas ou grupos de microrganismos como coliformes (CRISTLIA, 2005). Os procedimentos bsicos sofrem pequenas distines entre as farmacopias de diferentes pases, entretanto, os aspectos bsicos so mantidos, e a enormidade de detalhes desmotiva o detalhamento dos processos (CRISTLIA, 2005).

4.5. MTODOS RPIDOS

A necessidade crescente de respostas que sejam simultaneamente seguras e geis na identificao dos microrganismos tem quebrado o conformismo com as tcnicas convencionais, que vrias etapas devem ser respeitadas, sempre acompanhadas de tempo de incubao compatvel com o metabolismo celular para visualizao de respostas. Assim, considerando passivamente o metabolismo microbiano, muito se tem trabalhado a questo da resposta de forma a torn-la visvel ou de forma detectvel em menos tempo (FISCHER et al., 1996).

19 Opes adicionais existem, e tendem a surgir outras, porm h que se considerar a questo do custo-benefcio da aquisio do equipamento e material de consumo, frente ao benefcio real por ele permitido (FISCHER et al., 1996).

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5. ANLISE DA QUALIDADE MICROBIANA DE PRODUTOS ESTREIS

O conceito de esterilidade refere-se total ausncia de formas viveis de microrganismos capazes se reproduzir. Com o conhecimento atual estatstico envolvendo a morte microbiana, h questionamentos quanto afirmao absoluta da esterilidade dos produtos (PINTO et al., 2000). Segundo as farmacopias, a condio de esterilidade de um produto deve ser considerada com base no fato que o mesmo tenha sido processado em condies timas e que o resultado de uma amostra representativa, submetida ao teste, indique a ausncia de microrganismos viveis (FARMACOPIA BRASILEIRA, 1988, UNITED STATES PHARMACOPEIA, 1995, BRITISH PHARMACOPEIA, 1988). A caracterstica de esterilidade foi inicialmente requerida em produtos para uso parenteral. Mais recentemente, aps inmeros casos de infeces advindas da terapia oftlmica e posterior constatao da m qualidade destes produtos quanto ao aspecto microbiano, foi exigido tambm, que estes medicamentos sejam estreis. A exigncia do teste de esterilidade em pomadas oftlmicas surgiu inicialmente em pases como Sucia, Austrlia e Inglaterra (SAITO et al., 1985). Muito se tem escrito sobre as limitaes do teste de esterilidade, conforme descrito nas diferentes farmacopias. Para uma avaliao objetiva do seu valor, h necessidade do entendimento no apenas dos problemas microbiolgicos envolvendo o prprio teste, mas tambm das dificuldades encontradas na obteno de amostras representativas de um determinado lote. Embora seja ensaio limite, o teste de esterilidade pode ser adaptado para fornecer informao quantitativa sobre o nmero e tipos de contaminantes presentes. Tais informaes so importantes ao se investigar potenciais fontes de contaminao (FARMACOPIA BRASILEIRA, 2000).

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5.1. ASPECTOS MICROBIOLGICOS

H uma variedade de problemas inerentes ao prprio teste de esterilidade no que diz respeito a vislumbrar a caracterstica de esterilidade do produto. Uma vez que a identidade de todos os potenciais contaminantes desconhecida, h certamente um compromisso quando da escolha do meio de cultura. Na prtica, apenas os meios caldo casena-soja e caldo tioglicolato so recomendados nas edies recentes das farmacopias britnica, europia e americana (SAITO et al., 1985). A natureza do produto sob teste pode se constituir em problema do ponto de vista da amostragem. No caso de produtos oleosos, tais como pomadas oftlmicas, as clulas microbianas podem estar na matriz do produto, tornando necessria a extrao com um solvente adequado, como o miristato de isopropila, ou propiciar o contato do contaminante com fatores nutricionais do meio de cultura. De outro lado, o produto pode apresentar em sua composio componentes (inclusive os conservantes) que apresentam atividade antimicrobiana, e que necessitam de inativao por tcnica de diluio ou pela adio de inativador especfico ao meio de cultura. Uma terceira possibilidade, quando aplicvel, consiste na separao fsica de clulas microbianas dos compostos antimicrobianos mediante tcnica de filtrao em membrana. Uma membrana filtrante de bordas hidrfobas usada para esta finalidade, sendo lavada com diluente estril, por exemplo, soluo salina ou gua peptonada (SAITO et al., 1985). Clulas microbianas expostas aos efeitos de compostos antimicrobianos so agredidas de forma sub-letal, assim como, aquelas submetidas a processos de aquecimento. O teste de esterilidade falha em no incorporar mecanismos de recuperao para estas clulas, porm, permite tempo para sua restaurao, diferentemente dos mtodos rpidos que encontram restrio na aplicabilidade (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000).

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5.2. OBTENO DE PRODUTOS ESTREIS

Diversos aspectos no mbito produtivo ou analtico levam a que o controle dos produtos estreis tenha incio com a avaliao das matrias-primas, passe pelo processo produtivo, ambiente e equipamento, de forma a permitir que se assegure condies de reduzido potencial de falha, que ser ento detectado num sistema analtico bem executado. Neste momento, devem ser considerados os possveis caminhos que conduzem a produtos estreis. Estes so definidos em funo da caracterstica termolbil dos princpios ativos ou mesmo da embalagem primria, da estabilidade qumica, custos, disponibilidade de sistemas pr-existentes na planta industrial entre outros (PINTO et al., 2000). Pode-se subdividir a produo dos estreis em dois grandes grupos: os de manipulao assptica e os submetidos esterilizao aps envase (trmica, qumica ou irradiao). No caso de manipulao assptica sempre lembrado o processo de filtrao com suas peculiaridades, embora na abrangncia de itens estreis haja outras possibilidades a se considerar (FISCHER et al., 1996).

5.3. PROCESSOS ESTERILIZANTES

Para tratar dos processos de esterilizao interessante definir o conceito de morte associado aos microrganismos. Um microrganismo definido como morto quando no mais prolifera em meios de cultura onde usualmente isto ocorria: considera-se como forma de constatao a turbidez de meios lquidos ou o surgimento de colnias em meios slidos. Um organismo nico deve ser capaz de proliferar atravs de muitas geraes para ser detectado, portanto um microrganismo que no possa se reproduzir, ou possa faz-lo apenas poucas geraes, pode por este critrio ser considerado morto. Na prtica, no se dispe de meio de cultura que seja ideal ao desenvolvimento de qualquer cepa microbiana. Ademais, organismos que sobreviveram a um potencial processo letal apresentam requisitos metablicos especficos, podendo no ser recuperados em meios de cultura usuais (BLACK, 2002).

23 Outra considerao a ser feita que organismos expostos a agentes letais no morrem todos simultaneamente. O seu nmero decresce exponencialmente com o tempo de exposio; portanto a ausncia de todos os organismos viveis ir ocorrer num tempo infinito de exposio ao agente. Esterilidade , portanto um estado absoluto e que no pode ser garantido. Ainda que cuidadoso planejamento do processo esterilizante seja desenvolvido, apenas aumenta a probabilidade de sucesso no sentido da esterilidade (PELCZAR & REID, 1997). A inativao de microrganismos por agentes esterilizantes envolve dano irreversvel de molculas essenciais clula. Da mesma forma, a exposio a estes agentes pode provocar danos ao produto. Particularmente nas formas de dosagem farmacutica em que o risco envolve reduo da atividade teraputica, ou outros danos especficos graves, freqentemente necessrio assumir um compromisso entre o nvel de garantia de esterilidade ou Sterility Assurance Levei (SAL) aceitvel e o mximo efeito adverso sobre o material (PINTO et al., 2000).

5.4. TESTE DE ESTERILIDADE

Embora a teraputica parental tenha tido origem no sculo passado, o primeiro mtodo oficializado do teste de esterilidade foi na Inglaterra em 1932. Este teste exigia a execuo em produtos sob a forma lquida, mediante utilizao do caldo peptonado e incubao a 37 C durante cinco dias, com vistas deteco de bactrias aerbicas (SAITO et al., 1985). Mais tarde, em 1936, a USP1 XI adotou a mesma metodologia, de maneira a aumentar a credibilidade dos resultados. Na edio seguinte, de 1942, o recurso analtico foi modificado para permitir o desenvolvimento de microrganismos aerbicos e anaerbicos, bem como de microaerfilos. Na USP XIII, a preocupao se estendeu para deteco de fungos, utilizando-se de meio de cultura contendo mel, com incubao a 22- 25 C, durante quinze dias. A inovao marcante ocorreu no fim da dcada de 1960, com a introduo do mtodo de inoculao indireta da amostra, inclusive
1

USP UNITED STATES PHARMACOPEIA.

24 com a adoo do sistema fechado na Farmacopia Europia em 1976 e na USP de 1980. No Brasil, a metodologia da segunda edio da Farmacopia Brasileira era explicitas nos mesmos moldes da USP, visto ser traduo integral da mesma. Na ltima edio foram incorporados detalhes e cuidados no que diz respeito ao procedimento, mantendo-se, porm, o perodo de acordo com a edio anterior, ou seja, 7 dias no caso do mtodo indireto (filtrao) e 14 dias para o mtodo direto (SAITO et al., 1985). Como pode ser observado, pela evoluo da metodologia, a preocupao inerente melhoria de teste de esterilidade visa verificar com mais segurana a qualidade do processo esterilizante empregado durante a fabricao de medicamentos estreis, bem como manipulaes asspticas, levando-se em considerao o aspecto probabilstico da esterilizao (SAITO et al., 1985).

5.4.1. Amostragem
Sendo o teste de esterilidade um ensaio limite, exige-se critrio de amostragem que procure oferecer segurana no resultado final, quando extrapolado ao lote. Portanto, a retirada de amostras a serem submetidas ao teste deve estar relacionada com a fase de processamento, visto que este ensaio complementa as informaes sobre a perfeita execuo de cada processo operacional esterilizante e/ou manipulao (SAITO et. al., 1985). A segurana do resultado do teste ser maior quanto maior for a quantidade das amostras ensaiadas, quando outros parmetros so obedecidos, controlados ou comprovados como eficazes. Entretanto, como existem problemas de ordem prtica e econmica interessante estabelecer, no critrio de amostragem, quanto de cada lote deve ser submetido ao teste (SAITO et. al., 1985). Convm salientar que o conceito de lote ou partida diferente do aspecto legal, devendo referir-se ao total de unidades com igual risco de contaminao. Em se tratando de matriaprima, cada embalagem deve ser submetida amostragem. Por outro lado, a abertura de todos os frascos de matria-prima estril nem sempre possvel, quer sob o aspecto de segurana, quer sob o aspecto econmico e de praticidade. Segurana, porque normalmente trata-se de barricas, vidros ou outros tipos de recipientes lacrados e o fato de abr-los

25 implicaria na possibilidade de introduo de contaminantes viveis, ainda que com todos os cuidados de amostragem (PINTO et al., 2000). Se o teste de esterilidade for executado em produtos a granel (bulk), oriundos de manipulao totalmente assptica ou de filtrao esterilizante, h de se efetuar amostragem de cada recipiente, visto que cada um apresenta condio particular de risco de contaminao. Esta amostragem deve ser criteriosa quando o produto for suspenso, alm de tomar todos os cuidados de manipulao assptica, no sentido de no alterar a homogeneidade da disperso. A prova de esterilidade nesta etapa de fabricao omitida por muitos fabricantes, preferindo correr o risco de rejeio do produto na fase final. Outros recorrem a esta omisso fundamentada num histrico anterior, cujas condies gerais de local de fabricao, bem como os procedimentos padronizados na sua manipulao foram constatados como seguros (FISCHER et al., 1996; PINTO et al., 2000). A 24 edio da UNITED STATES PHARMACOPEIA (2000) passa a apresentar tabelas contendo valores mnimos de unidades a serem testados para distintos tamanhos de lotes de injetveis de pequeno e grande volume, antibiticos, produtos no injetveis, e slidos, com particularidades para antibiticos. Tambm introduz tabelas indicativas de quantidades a serem amostradas dos recipientes, no caso de produtos lquidos e slidos. A amostragem de ampolas esterilizadas em autoclave deve ser realizada aps o teste de vazamento ou integridade, a fim de se evitar resultado falso-positivo. Outros cuidados devem ser observados quanto localizao do material na autoclave, visto que pode haver zonas mortas no seu interior. Este problema torna-se muito mais crtico quando se trata de injetveis de grande volume, pois h a probabilidade de o aquecimento no ser to uniforme em todos os frascos de uma carga de autoclave (CRISTLIA, 2005).

5.4.2. Preparo da Amostra

A execuo do teste de esterilidade em produtos farmacuticos deve ser precedida de preparao das amostras, de maneira a se evitar resultados falsos (CRISTLIA, 2005). Consiste em efetuar um tratamento, visando desinfeco da superfcie externa dos frascos, ampolas, ou outros materiais de acondicionamento e ou embalagem, pelo uso de solues anti-spticas volteis ou no, tais como fenol a 5%, lcool iodado,

26 formaldedo a 5%, lcool isoproplico, etc. Este tratamento, em funo da natureza da substncia e da concentrao utilizada, exige um tempo de contato, que deve ser determinado experimentalmente frente aos contaminantes mais provveis de estarem presentes nestas amostras. Alm disto, a eficincia dessas solues deve ser comprovada periodicamente (CRISTLIA, 2005).

5.5. MTODOS DE INOCULAO

5.5.1. Inoculao Direta
So adotadas duas possibilidades de inoculao da amostra ao meio de cultura sendo as razes para o emprego de uma ou outra tcnica decorrentes de fatores diversos como facilidade e disponibilidade circunstanciais, alm da eficincia desejada ou limitaes de ordem econmica(LEITE, 1998). Qualquer que seja a forma de inoculao da amostra, entretanto, fundamental que se avalie e comprove a no interferncia ocasionando falso-negativo. Para tanto, a prtica consiste em promover inculo de 10 a 100 unidades formadoras de colnia (UFC) de cepas determinadas, em srie de tubos de meio de cultura contendo amostra (condio do teste), paralelamente srie de tubos sem amostra residual (representando a capacidade promotora de crescimento do meio de cultura). A forma de comprovar a no interferncia da amostra sobre o resultado analtico, etapa fundamental para a validao da metodologia constatando aps o tempo de incubao de sete ou quatorze dias nas condies definidas, equivalncia de turbidez entre o tubo contendo ou no amostra (LEITE, 1998). Este foi o mtodo utilizado desde a oficializao inicial da prova de esterilidade em 1932 e tem sido aplicado at os dias atuais. Consiste na inoculao de quantidades ou volumes pr-estabelecidos da amostra em volumes estipulados de diversos meios de cultura, na forma lquida ou mediante semeadura da amostra em nutriente slido. Portanto, com esta tcnica deve haver, de cada unidade, uma tomada de ensaio, a qual ser introduzida num tubo de ensaio ou frasco contendo meio de cultura previamente

27 esterilizado e controlado quanto ausncia de contaminao e comprovado quanto capacidade promotora de crescimento (SAITO et al., 1985). Todas as farmacopias indicam alquotas a serem transferidas para o meio de cultura a partir de cada unidade integrante da amostra representativa do lote. Evidentemente que quando o volume pequeno, de 0,5 a 1,0 mL, geralmente se recomenda a tomada integral desta quantidade, mas conforme aumenta-se o volume efetua-se apenas uma tomada parcial. O mtodo de inoculao direta simples e de fcil execuo, porm, conforme a natureza da amostra exigem-se recursos intermedirios, a fim de que o resultado do teste seja vlido (CRISTLIA, 2005). Amostras semi-slidas hidrossolveis so facilmente testadas, mediante fluidificao das mesmas com lquidos fisiolgicos. Amostras slidas ou lquidas, constitudas por substncias antimicrobianas devem ser testadas mediante critrios corretos, procurando-se impedir a interferncia desta atividade intrnseca no crescimento dos contaminantes eventualmente presentes. Enquadram-se aqui todos os produtos contendo conservantes, por serem de dose mltipla, ou nica, como nos casos dos imunobiolgicos. No caso de frmacos antimicrobianos, quando existem inativadores especficos que sejam compatveis com a fisiologia do microrganismo, estes devem ser previamente neutralizados. Quando as substncias ativas antimicrobianas no oferecem possibilidades para inativao especfica, deve-se recorrer a outros processos. A possibilidade que se apresenta consiste na diluio prvia da amostra, de modo que a concentrao desta substncia no meio de cultura seja inferior concentrao mnima inibitria, e desta forma incorrendo na baixa representatividade de amostragem (CRISTLIA, 2005). Para segurana dos resultados do teste, aps o perodo de incubao, recomenda-se a comprovao da eficincia do sistema inativador pela inoculao de microrganismos padro. Estes em nmero inferior a 100 microrganismos por tubo. Podem ser representados por Clostridium sporogenes. So ainda recomendados Sacharomyces cerevisae e Micrococcus luteus, tendo em vista o espectro de sensibilidade ser mais amplo (LEITE, 1998). Quando a amostra a ser testada est sob a forma de suspenso ou se trata de p insolvel no meio de cultura, este aspecto pode trazer problemas na observao, no

28 permitindo distino entre a turvao original e a resultante do crescimento microbiano. Neste caso, certifica-se da presena de contaminante vivel mediante a subcultura executada entre terceiro a stimo dia de incubao. Esta sub-cultura pode ser efetuada em meio lquido de mesma natureza ou tambm por semeadura em meio slido. Como alternativa pode-se recorrer observao microscpica da suspenso, mas cansativa e falha (PINTO et al., 2000). A limitao do mtodo de inoculao direta reside na probabilidade de se aprovar um lote contaminado, devido amostragem restrita e risco de atividade inibitria exercida pelo residual do produto. De forma resumida pode-se apontar como vantagens da inoculao direta a sua simplicidade e histrico de uso, pouca manipulao, requer pouco treinamento e caracteriza-se por baixo nvel de contaminao acidental. As suas desvantagens so baixa representatividade da amostra, consumo elevado de meios de cultura e de vidraria, possibilidade de resduos de agentes inibitrios, tempo de incubao, restrio para volumes a partir de 100 mL e interferncia da turbidez do produto, embora contornvel por sub-cultura ou reao fsico-qumica

(FARMACOPIA BRASILEIRA, 2000).

5.5.2. Inoculao Indireta ou Filtrao

A tcnica de inoculao indireta foi introduzida em 1957 por Holdowsky e seguida de estudos por diversos pesquisadores. Baseia-se no tratamento prvio da amostra com solubilizao ou lavagem em lquidos fisiolgicos, seguida de filtrao esterilizante e inoculao da membrana filtrante ao meio de cultura. Com isto, o produto a ser testado no entra em contato com o meio de cultura. Em 1964, esta tcnica foi introduzida como oficial, tendo sido adotada nos Estados Unidos da Amrica do Norte, constando em USP, alm de outras farmacopias, bem como mantida nas edies subseqentes (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 1995). Este mtodo foi no incio aplicado especificamente para substncias antibiticas, principalmente aquelas que no podiam ser inativadas com vistas ao teste por inoculao direta. Em 1964, muitas vantagens do mtodo eram mencionadas, embora ainda no estivesse universalmente oficializado. Dados comparativos entre a inoculao direta e indireta de antibiticos mostravam grande eficincia na deteco de

29 contaminantes viveis nestes produtos, quando testado pelo mtodo de filtrao (PINTO et al., 2000). A membrana filtrante empregada geralmente constituda de steres de celulose, com dimetro de 47 mm, de borda hidrfoba e tamanho de poro de 0,45 0,02 m. Existe certa divergncia na escolha de filtros para uso industrial e laboratorial de teste, pois, no primeiro caso emprega-se, geralmente, o de 0,22 m enquanto que em provas de esterilidade o de 0,45 m O comparativo das caractersticas das membranas de 0,22 m e 0,45 m apontam para a primeira uma reteno "absoluta", importante na obteno de filtrado estril, porm uma vazo lenta. A membrana de 0,45 m ainda eficaz na reteno de microrganismos, com a vantagem de ser tambm adequada para a preservao da viabilidade, pois compatibiliza melhor com a morfologia e fisiologia celular. Da ser a opo de escolha para o teste de esterilidade (SAITO et al., 1985). Os sistemas filtrantes empregados no controle de qualidade de medicamentos podem ser mltiplos ou unitrios, necessitando, basicamente, de porta-filtro e recipiente para transferncia da amostra ou lquidos de lavagem. O filtrado a ser recolhido poder ser coletado em frasco coletor nico ou individualizado. O processo de filtrao efetuado sob presso negativa, com valor mximo da ordem de 70 cm de Hg e vazo da ordem de 55 a 75 mL por minuto. Portanto, as amostras devem ser hidrossolveis ou solveis em solventes apropriados (FISCHER et al., 1996). As quantidades estabelecidas de amostra podem ser transferidas para recipiente contendo gua peptonada 0,1% a fim de proceder dissoluo e ou diluio da mesma e submeter esta soluo filtrao. A insolubilidade de alguns produtos em gua peptonada exige introduo de certos recursos. Aps filtrao da amostra deve haver lavagem da membrana com soluo peptonada contendo os inativadores especficos ou solubilizantes, a fim de que quantidade residual de antibitico no seja transferida juntamente com a membrana, para o meio de cultura (FISCHER et al., 1996). No caso de se empregar sistema fechado, como Steritest ou equivalente, dispensa a preocupao do corte ou transferncia da membrana, uma vez que a mesma est inserida no cartucho e permanece aps a filtrao do produto e lavagens, recebendo ento o meio de cultura sem que tenha de ser deslocada ou manuseada.

30 Esta situao constitui-se em grande vantagem de facilidade operacional e segurana do teste (PINTO et al., 2000). A prova de esterilidade, como qualquer outro processo analtico, impe a necessidade de controle do prprio teste, sendo neste caso atravs de controles negativo e positivo, alm do acompanhamento das condies do ambiente durante sua execuo (CRISTLIA, 2005). Buscando-se resumir tambm para o mtodo indireto as caractersticas negativas e positivas, deve-se dizer que como desvantagens apresenta maior nvel de manipulao e preparaes prvias exigem maior treinamento tcnico, impedimento de aplicao para suspenses, leos, cremes e pomadas no solubilizveis e aumenta o risco de falsopositivos. O emprego de sistema fechado reverte situao em alguns aspectos, trazendo facilidade operacional, reduzindo treinamento necessrio, permitindo que apenas um analista execute o teste e minimizando falso-positivos. As suas vantagens consistem em maior representatividade estatstica, reduo de falso negativos, reduo no consumo de meios de cultura e abrangncia a produtos com volumes de 1,0 mL at, por exemplo, 5,0 L (CRISTLIA, 2005). A finalidade do teste de esterilidade consiste em detectar microrganismos contaminantes em produtos que j sofreram algum tratamento esterilizante, durante o ciclo de fabricao. A partir deste estgio deve ser manipulado assepticamente, a fim de no violar a sua esterilidade. Portanto, no do conhecimento do analista qual o contaminante vivel residual ou agente de recontaminao do produto, antes de efetuar o ensaio. Por esta razo a escolha do meio de cultura de vital importncia no sentido de oferecer condies ideais para multiplicao de microrganismos, os mais diversos, com exigncias diferentes para seu crescimento. Alm disso, o contaminante foi submetido a condies adversas quando o processo esterilizante por morte, seja de ao qumica ou fsica (FISCHER et al., 1996). Atualmente, os cdigos farmacuticos adotam mtodos que requerem utilizao de meios de cultura, sob a forma lquida, capazes de promover o crescimento de bactrias mesfilas e psicrfilas, alm de fungos (SILVA, 1997). Desde a introduo inicial da metodologia em 1932, diversos nutrientes foram propostos e adotados, atravs das revises constantes das farmacopias, sempre

31 procurando oferecer condies que abrangessem o crescimento de maior gama de contaminantes (UNITED STATES PHARMACOPIA, 1995). Estudos comparativos entre diversos meios de cultura tm demonstrado que o meio de tioglicolato pode i n i b i r o crescimento de algumas cepas de Bacillus e Clostridium, sugerindo sua substituio por ditionito-tioglicolato, tambm conhecido como meio de Clausen. Verificou-se efeito inibitrio de tioglicolato quando testado frente a 22 cepas de Clostridium, tendo sido comprovada sua ao inibitria sobre quase todas. Isto no aconteceu quando ditionito de sdio foi adicionado ao meio fluido contendo ambos os gneros, seja o inculo sob a forma vegetativa ou esporulada, acusando no serem afetados pela composio do meio. A toxicidade devida ao tioglicolato pode estar sendo influenciada por outros constituintes do meio, conseguindo-se eliminar tal ao no caso de associao ditionito-tioglicolato. Alm disto, o ditionito age como estabilizante do tioglicolato, permitindo que o meio apresente condies timas para sua utilizao durante dois meses, quando armazenado em refrigerador (FARMACOPIA BRASILEIRA, 1998). A constatao da presena de leveduras e bolores em produtos estreis teve incio em 1942, quando a USP introduziu um meio contendo mel. Modificaes posteriores foram sugeridas, aparecendo o meio de Saboraud, por sua vez com outras alteraes. Posteriormente, a mesma introduziu o emprego do meio de casena-soja como substituto de Sabouraud (UNITED STATES PHARMACOPIA, 2000). A Organizao Mundial da Sade, em 1972, recomendava que se revisasse melhor as especificaes inerentes aos meios de cultura para teste de esterilidade, bem como se estabelecesse prova mais sensvel para os fungos, sugerindo, tambm, que se efetuasse o ensaio prvio dos meios empregados para o teste de amostras (KOROLKOVAS, 1988). Outra preocupao inerente aos meios de cultura reside na comprovao de sua eficcia ou capacidade promotora de crescimento, o que deve ser verificado, pelo menos para cada lote do mesmo. Ainda, como o nosso pas depende da sua importao, h que se pensar na possibilidade de condies distintas entre diferentes embalagens do mesmo lote, ocasionadas por transporte e ou armazenamento em condies adversas (KOROLKOVAS, 1988).

32 De modo geral, as farmacopias recomendam inoculao de 10 a 100 unidades formadoras de colnias (UFC) microrganismos viveis podendo ser de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans, Clostridium sporogenes, Bacteroides vulgatus, Plectridium sphenoide, entre outros. Incubar todos os tubos nas condies idnticas do teste propriamente dito e observar o aparecimento de turvao at o stimo dia para um controle positivo (CRISTLIA, 2005). O tempo de incubao de cinco dias, conforme o primeiro mtodo oficial de 1932, persistiu durante outras revises. Entretanto em 1927, j se dava nfase para necessidade de sete dias para incubao a 37 C. No decorrer das revises farmacopicas houve mudanas, passando a se adotar perodo de sete, dez e quatorze dias de incubao. Entretanto, a USP de 2000 amplia o tempo de incubao para 14 dias para casos de inoculao indireta, exceto quando a esterilizao trmica tenha sido empregada no produto terminado (SAITO et al., 1985). O resultado do teste de esterilidade, desde a poca de sua oficializao, foi fundamentado em observao macroscpica do crescimento microbiano, manifestado sob a forma de turvao do meio lquido ou aparecimento de colnias no meio slido. A deciso da FDA2 de que se um tubo apresentar contaminao deve-se proceder o reteste, usando 40 unidades do produto. Se acusar algum crescimento deve-se efetuar o segundo reteste, sendo que para aprovao do lote no deve haver crescimento nos tubos deste reteste (SAITO et al., 1985). Em se tratando de prova de esterilidade com auxlio do processo filtrante da amostra, o controle negativo efetuado pelo menos para cada dia de trabalho, abrangendo o ciclo de esterilizao de todo material empregado no teste, tem grande importncia na interpretao do resultado. O aparecimento de turvao em qualquer dos meios de cultura contendo a membrana deve ser motivo para novo teste. Os mesmos critrios discutidos para caso de inoculao direta so vlidos na deciso que aprova ou rejeita um lote quanto ao teste de esterilidade (CRISTLIA, 2005). Outros tipos de mtodos rpidos tm sido considerados, permanecendo, entretanto como preocupao a questo de tempo de recuperao envolvido para proliferao de microrganismos submetidos a danos ou estresses decorrentes do prprio processo
2

FDA Foog and Drugs Administration

33 industrial, prejudicando a manifestao da viabilidade e dessa forma conduzindo a resultados falso-negativos (CRISTLIA, 2005).

5.6. CONTROLE DA EFICINCIA DE ESTERILIZAO

Com o intuito de cada vez mais se assegurar a eficincia dos processos esterilizantes, visto que o prprio teste de esterilidade numa amostra representativa no tem condio absoluta de informao sobre a esterilidade do conjunto das unidades submetidas ao processo, foi introduzido o uso de indicadores de esterilizao (ALBERT et al., 1989). O emprego de indicadores fsicos, qumicos e biolgicos citado como recurso de controle do processo esterilizante. Indicadores fsicos baseiam-se em temperatura de fuso dos mesmos, com alterao de cor, quando a autoclave ou o forno atinge uma determinada temperatura. O inconveniente destes casos pode estar no fato de no indicarem por quanto tempo o material interno esteve submetido quela temperatura de fuso, embora j se tenha chegado a indicadores com gradientes de colorao em funo desse tempo (BAIRD, 1986). Evidentemente, os indicadores mais aconselhados so os biolgicos. Estes so esporos de cepas de microrganismos devidamente selecionados quanto resistncia ao processo esterilizante. Portanto, devem ser espcies menos susceptveis a um determinado processo, seja fsico ou qumico. A utilizao destes microrganismos, na forma vivel, concomitantemente operao industrial esterilizante, d provas mais seguras sobre a eficcia do tratamento. Esta comprovao verificada quando so oferecidas aos indicadores condies adequadas para seu crescimento (BAIRD, 1986; PINTO et al., 2000). A ausncia de crescimento indicao de que o processo foi eficiente sobre os microrganismos, podendo-se considerar tal fato abrangente aos contaminantes normais do produto. Permite-se, ento, afirmar que houve eficincia esterilizante do processo empregado (BLACK, 2002). A eficincia de um processo esterilizante pode ser medida de trs maneiras: pelo histrico do processo contendo diversos dados, pelos estudos de inativao de uma srie

34 de microrganismos e pelo uso de indicadores biolgicos. O primeiro mtodo aplicvel quando todos os parmetros so conhecidos e estabelecidos, como ocorre na esterilizao por calor mido. Evidentemente que estes parmetros devem ser estabelecidos para cada processo, mediante estudo de cintica, sendo uma das maneiras mais indicadas a de construir curvas de inativao de diversos microrganismos, particularmente dos mais resistentes a este processo escolhido, em funo da compatibilidade do material a ser esterilizado. Esta a situao de maior aplicabilidade para a liberao paramtrica dos produtos (CRISTLIA, 2005). A utilizao de indicadores biolgicos deve ser criteriosa, inoculando-se o prprio produto com os mesmos, de modo a assemelhar-se ao mximo condio em que se encontra o contaminante natural frente ao processo. por isto que se deve conhecer o estado de contaminao em que se encontra o produto, antes de ser submetido esterilizao, de modo que o indicador seja, em nmero e resistncia, superior ao vivel natural. Convm frisar que quanto maior o nmero de inculos, tanto maior ser a confiabilidade do resultado (CRISTLIA, 2005). A validao do mtodo deve ser estabelecida e documentada, demonstrando inclusive as caractersticas de exatido, sensibilidade, especificidade e

reprodutibilidade. Inclui etapas de qualificao da instalao, operacional, do desempenho e do mtodo de teste (LEITE, 1998). Quando se discutem diversos aspectos analticos do teste de esterilidade, observa-se que no decorrer das ltimas dcadas houve uma evoluo na metodologia. Entretanto, existem ainda pontos fundamentais que constituem a limitao do mtodo, no que diz respeito segurana de informaes. A falta de certeza absoluta quanto ao estado de esterilidade do total de unidades pertencentes ao lote uma questo de inferncia estatstica, razo pela qual o critrio de amostragem importante (LEITE, 1998). A probabilidade de rejeio ou aprovao de um lote industrial, fundamentada em amostragem de 20 recipientes, apresenta chance de 67% em considerar como estril um lote cuja contaminao de 2%. Por outro lado, um lote com 10% de unidades contaminadas ser seguramente rejeitado quando a amostragem abranger

100 itens (PINTO et al., 2000).

35 Em outras palavras, pode-se afirmar que com este nmero de amostras, a probabilidade de aceitar o lote como isento de contaminao ser zero. Logo, com menor nmero de unidades tem-se pequena probabilidade de rejeio como lote contaminado e maior possibilidade em aceit-lo como estril.

Outras limitaes de ordem prtica e econmica persistem, pois a prpria metodologia, empregada para evidenciar a presena de contaminante vivel falha, por no propiciar abrangncia necessria quanto ao crescimento de todos os tipos microbianos (PINTO et al., 2000). No que diz respeito ao reteste, por vezes executado sem a necessidade real, existem sempre envolvimentos do custo do mesmo, da reviso da documentao, alm do desgaste oral e de relacionamento, e atraso nas vendas, podendo ser esta repassada a concorrentes (CRISTLIA, 2005). Devido s possveis graves conseqncias para a empresa, mas tambm questo tica, a tomada de deciso da liberao e do reteste, deve ser feita pelo gerente da rea de controle ou garantia de qualidade, conforme o organograma da empresa, mas sempre com cincia e compartilhando responsabilidade com o farmacutico responsvel e a alta administrao da empresa (ANSEL et al., 2000).

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6. TESTE DE PIROGNIO
Embora o conhecimento cientfico que se tem sobre pirognio tenha sido adquirido nos ltimos 50 anos, o estudo sobre a febre, especulaes sobre suas causas, mecanismos e efeitos so to antigos quanto a medicina, datando de mais de 2.000 anos atrs. Os primeiros mdicos gregos visualizavam a febre mais como mecanismo teraputico que patofisiolgico. A idia de que a febre pudesse ter valor teraputico sobreviveu por sculos, sendo que inicialmente injees intravenosas de material ptrido eram administradas a animais em carter experimental. Em etapa subseqente, preparaes altamente pirognicas preparadas de clulas mortas de Salmonella typhosa foram empregadas como vacinas(PINTO et al., 2000). Nem todos os autores viram a febre como benfica; no incio do sculo XIX dois farmacuticos franceses, Pelletier e Caventue isolaram um antipirtico, a quinina. Como resultado, estudos em animais permitiram conhecer os efeitos de pirexia e antitrmicos (FARMACOPEIA BRASIELIRA, 1998). Durante a ltima dcada do sculo XIX, Centanni conduziu estudos significantes quanto aos agentes responsveis pela febre. Entre outros, ele descreveu um procedimento para isolar a toxina bacteriana responsvel pela ao febril. Mantendo culturas de bactrias Gram negativas sob autlise durante longos perodos, procedendo a filtrao esterilizante e ento submetendo a fracionamento em lcool, ele obteve p branco altamente pirognico, a partir de larga variedade de bactrias. Centanni foi o primeiro a reconhecer a relao causa-efeito entre endotoxina (pirotoxina) e a febre. Ele foi tambm o primeiro a demonstrar o "terceiro tipo de imunidade", posteriormente chamada de tolerncia pirognica, evidenciada aps injees repetidas de endotoxina. (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1998). Os microbiologistas demonstraram a seguir que as endotoxinas eram encontradas em muitas bactrias. Este trabalho foi grandemente facilitado pela descoberta de Gram em 1884, quanto a processo de colorao que recebeu seu nome. Os investigadores rapidamente aprenderam que endotoxinas estavam associadas exclusivamente a Gram negativas. Na passagem do sculo, vrios pesquisadores estavam preocupados com febres que s vezes acompanhavam injees, bem como outros efeitos colaterais

37 associados administrao parenteral de agentes teraputicos. Porm a eliminao de bactrias por esterilizao trmica ou filtrao no eliminava a pirogenicidade destas preparaes. O primeiro entendimento da assim chamada "febre das injees" decorreu das investigaes relatadas por Hort e Penfold em 1912 (FARMACOPEIA BRASIELEIRA, 1998). Estes pesquisadores foram os primeiros a planejar e padronizar o teste de pirognio em coelhos. Com este teste, foram capazes de classificar bactrias em pirognicas e no pirognicas, o que as correlacionava com o esquema Gram de classificao bacteriana. Culturas mortas foram comparveis s viveis quanto induo de febre. Tambm, estes pesquisadores demonstraram que a pirogenicidade de gua destilada era relacionada concentrao bacteriana. Eles concluram que uma substncia termoestvel era a provvel causa das febres de injeo (FARMACOPEIA BRASIELEIRA, 1998). Os pirognios so divididos em duas classes. Exgenos so aqueles que se originam fora do corpo e induzem elevaes trmicas quando injetados em animais e no homem. Embora o lipopolissacardeo (endotoxina) seja o mais significativo, h outros produtos, de constituio qumica diversa, que tambm produzem elevao de temperatura quando injetados sob condies apropriadas. Como fonte de pirognio exgeno menciona-se grande variedade de origens, desde bacteriana, de fungos e vrus, bem como componentes de bactrias Gram negativas e de bactrias Gram positivas, assim como pirognios no microbianos, como alguns frmacos, esterides, fraes do plasma, e o adjuvante sinttico muramil dipptide (PINTO et al., 2000). O pirognio endgeno (PE), entretanto produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estmulo de pirognios exgenos. O pirognio endgeno consiste de substncia homognea, sintetizada por diferentes clulas do hospedeiro aps exposio ao pirognio exgeno, sendo considerado o mediador primrio da febre (PINTO et al., 2000).

6.1. ENDOTOXINAS

As endotoxinas so complexos de alta massa molecular associados membrana externa de bactrias Gram negativas, e se constituem na mais significante fonte

38 de pirognio para a indstria farmacutica. Endotoxinas no purificadas podem conter lpideos, carboidratos e protenas, porm quando purificadas so denominadas de lipopolissacardeos (LPS) para enfatizar sua natureza qumica. Por isso, como nos produtos farmacuticos podem ser encontradas unidades no purificadas nas fases em processo ou nos produtos terminados, prefere-se a terminologia de endotoxinas (BLACK, 2002). Suas caractersticas de universalidade, relativa estabilidade trmica, e capacidade de provocar profundas alteraes fisiolgicas quando administrada via parenteral tornam sua deteco e eliminao um considervel desafio ao produtor de parenterais, de artigos vinculados sua administrao ou de prteses (PINTO et al., 2000).

6.2. NVEIS PIROGNICOS

A questo de nveis pirognicos torna-se crucial ao considerar os limites de liberao para os produtos farmacuticos. Em 18 de janeiro de 1980, o Bureau of Drugs publicou um ensaio cujo ttulo era Guidelines for Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Test for Human and Veterinary Injectable Drugs and Medicai Devices. Este documento estabeleceu 50,0 pg/mL (0,5 ng/Kg) como limite final de liberao de produtos farmacuticos no intratecais. Posteriormente, foi proposta reduo para 35,0 pg/mL (PEARSON, 1985). Quando considerado sob evidncia cientfica, 100,0 pg/mL um limite de liberao aceitvel para parenterais de grande volume e proporciona um significante fator de segurana sobre o teste de pirognio em coelhos, segundo a USP. Conseqentemente, foi sugerida a reavaliao do Bureau of Drugs no sentido do estabelecimento de 100,0 pg/mL (1,0 ng/Kg) como limite final de liberao para endotoxinas em parenterais de grande volume (PEARSON, 1985). importante ter em mente que, quando o teste oficial em coelhos foi desenvolvido, no houve tentativas no sentido de definir os nveis de endotoxina que fossem pirognicos a coelhos ou humanos. Em 1956, Westphal obteve resultados indicando que a dose pirognica mnima de endotoxina purificada de Salmonella abortus equi por kilograma foi comparvel em humanos e coelhos. Estes resultados foram confirmados por

39 pesquisadores que reconheceram a importncia de determinar a sensibilidade relativa de coelhos e humanos a vrias endotoxinas, uma vez que o teste de pirogenicidade era feito objetivando segurana no uso de medicamento parenteral em humanos (PEARSON, 1985). Um trabalho do Limulus Amebocyte Lysate Task Force, desenvolvido pela Parenteral Drug Association (PDA) permitiu obter dados importantes para a confirmao e ampliao dos estudos anteriores, e inclusive inferir que, sob condies timas, a sensibilidade do teste de pirognio em coelhos USP se aproximava de 1,0 ng da endotoxina comercial E. coli, podendo este valor ser tomado como ponto de referncia para limites de endotoxina em parenterais de pequeno volume. Infelizmente o trabalho no se estendeu a parenterais de grande volume (DABBAH et al., 1980). Os limites atualmente considerados aceitveis para endotoxina bacteriana so: para produtos farmacuticos e biolgicos 5 UE/Kg; radiomarcadores 2,5 UE/Kg; parenterais de grande volume 0,5 UE/mL; gua para injeo 0,25 UE/mL; drogas intratecais 0,2 UE/mL; correlatos at 200 UE/unidade e correlatos intratecais 0,06 UE/unidade (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000).

6.3. PIROGNIOS DE FONTES DISTINTAS

Adicionalmente s endotoxinas de bactrias Gram negativas, uma variedade de outras substncias produzem reaes pirognicas. A maioria das cepas de estreptococos grupo A produz toxinas eritrognicas que causam avermelhamento da pele. Esta exotoxina comprovadamente uma potente fonte de pirognios. Adicionalmente produo de febre, a exotoxina estreptoccica tambm desenvolve suscetibilidade ao choque endotxico letal, entre outros efeitos (PEARSON, 1985). Mycobacterium tuberculosis tambm produtora de duas substncias pirognicas, alm de ser a principal causa de tuberculose em humanos. Esta bactria pode produzir febre pela interao com fagcitos, granulomas reativos ou via reao sistmica (PEARSON, 1985).

40 Embora enterotoxinas estafiloccicas estejam mais associadas com envenenamento agudo por alimentos, so tambm potentes pirognios com atividade em coelhos, a partir de 1 mg/Kg. Em adio a enterotoxina estafiloccica, outras exotoxinas pirognicas tm sido isoladas de Staphylococcus aureus (PEARSON, 1985). Vrus so provavelmente responsveis por mais episdios pirognicos em humanos que qualquer outro agente isolado. Leuccitos de coelhos tm sido incubados na presena de vrus, mas os mecanismos envolvidos permanecem no esclarecidos. Injeo intravenosa de vrios tipos de vrus em animais induz a produo concomitante de pirognio endgeno e interferon, que eventualmente sejam coincidentes (PEARSON, 1985). Quanto aos fungos, tambm tm se mostrado altamente pirognicos quando injetados via intravenosa em animais experimentais, permanecendo no claro o mecanismo indutor.Devem adicionalmente ser consideradas as fontes no microbianas de pirognio, particularmente a induo por frmacos como alguns antibiticos e esterides, e polinucleotdeos como o cido polinosinico-policitidlico (PEARSON, 1985).

6.4. PROCESSOS DE DESPIROGENIZAO

A despirogenizao pode ser obtida de duas formas, seja pela inativao ou remoo das endotoxinas. A inativao pode ser obtida pela detoxificao da molcula material de acondicionamento, os demais so extremamente especficos ou apenas se justificam em medicamentos ou produtos biolgicos de altssimo valor agregado (PELCZAR & REID, 1997). Deve permanecer muito fortemente sedimentada a importncia de trabalhar todo o processo produtivo em condies adequadas de higiene, dos operadores e ambiente, alm de empregar matrias primas com baixas cargas microbianas, processos validados, pessoal qualificado e treinado. Em suma, aplicar todos os conceitos de Boas Prticas de Fabricao, de forma que o produto seja obtido apirognico no primeiro processamento, dispensando preocupaes quanto a reprocessos ou tratamentos adicionais (ABIFARMA, 1978).

41 Todas as etapas crticas devem ser monitoradas, por exemplo, com controles peridicos de guas armazenadas, ainda que na condio ideal de temperatura mnima de 80 C, sob agitao, ao menos trs vezes ao dia. No caso da gua recm destilada, nunca utiliz-la sem um teste prvio quanto a endotoxinas. Da mesma forma, validar periodicamente estufas ou tneis de despirogenizao, respeitando atendimento de um mnimo de trs redues decimais na concentrao de endotoxinas (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000). Todas as monitoraes de processo, assim como testes de matrias-primas, com particular ateno s de origem natural, e do produto terminado, devem empregar tcnicas analticas validadas, seja com a metodologia clssica empregando coelhos ou diferentes mtodos empregando a tcnica in vitro do LAL3 (CRISTLIA, 2005).

6.5. TESTE DE PIROGNIO POR MTODO IN VIVO

Desde 1954, tem havido congressos e simpsios em que se discutem as questes inerentes metodologia oficial para deteco de substncias pirognicas. Nestes ltimos anos a preocupao est se voltando, cada vez mais, a derivaes, detalhamentos e ampliao do mtodo alternativo in vitro, que j ganhou confiabilidade, mas enfrenta ainda limitaes, sejam reais ou derivadas do desconhecimento. Dentro de perspectivas realsticas, o teste de pirognio em coelhos, apesar de delegado apenas a situaes s quais no aplicvel a metodologia alternativa, deve ser mantido. Ter sempre a seu favor a situao privilegiada do envolvimento de toda a reao fisiolgica do animal, constituindose no apenas em teste de pureza para substncias pirognicas, mas tambm em teste de segurana para os produtos injetveis, lquidos para infuso e perfuso, materiais cirrgicos e descartveis em geral (EUROPEAN PHARMACOPEIA, 1997).

LAL Limulus Amebocyte Lysate

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6.5.1. Fundamento do Mtodo

Apesar de algumas modificaes, o fundamento do mtodo permanece o mesmo desde sua oficializao. Alteraes mais consistentes esto relacionadas com o nmero de animais, a chance de reteste antes da deciso final de rejeio, melhorias nas condies analticas para conduo do teste e outros, procurando minimizar a variao biolgica e com isto aumentando a segurana do ensaio. um ensaio limite, com a chance de aprovar ou rejeitar uma amostra, mediante informaes obtidas de um grupo de coelhos, e que devem atender a um nvel padro de estado febril. Cada grupo de animais recebe a injeo intravenosa da amostra e observado durante um perodo, geralmente de 3 horas (FARMACOPIA BRASILEIRA, 1998). Diferentes mtodos oficiais farmacopeicos so semelhantes entre si, visto que consideram o nmero de animais com elevao trmica acima de um valor limite, normalmente estipulado para igual ou maior que 0,6 C, ou a somatria de elevao trmica individual de todos os animais testados. Portanto, a elevao trmica de pelo menos 0,6 C considerada como decorrncia da inoculao de dose pirognica de material estranho. Sendo assim, quanto maior o nmero de animais, tanto mais segura ser a deciso, por diminuir a variabilidade do reagente biolgico. Porm, h que considerar os pontos referentes praticidade e custos do ensaio (CRISTLIA, 2005). Quando se analisa critrios de interpretao necessria se faz conceituao exata sobre a elevao trmica individual dos coelhos. As farmacopias definem este valor como sendo a diferena entre a temperatura mxima aps a injeo e a de controle, devendo ser valor positivo, e nos casos negativos considera-se zero.

6.5.2. Modelo Animal

Entre os mamferos experimentados como substrato biolgico para a deteco de substncia pirognicas, o coelho foi considerado animal de escolha por diversas razes. Evidentemente que quando se pensa em utilizar a resposta hipertermizante como parmetro deste ensaio, ser de se esperar que o sistema termoregulador da espcie animal tenha as

43 mesmas caractersticas do ser humano. Alm da semelhana qualitativa ser necessria, tambm, a constatao da magnitude da resposta frente ao material pirognico injetado (PEARSON, 1985). No que diz respeito sensibilidade das espcies, as informaes iniciais so de que existe equivalncia, desde que os coelhos sejam adultos. Por tais razes surgiu a limitao do peso corporal mnimo, geralmente de 1,5 kg, embora a primeira metodologia tivesse estipulado 1,0 kg. Este fato no est relacionado com a sensibilidade, mas com a praticidade analtica. Se para injetveis de grande volume a dose recomendada de 10,0 mL/kg, a injeo de volumes maiores que 30,0 mL consome tempo maior que 4 minutos, necessitando de um tempo muito grande para a inoculao de 3 a 5 animais. Por isto, algumas raas de porte menor como a holandesa, Himalaia e polaca so preferidas. Apesar de no atender a este requisito, utilizam-se raas albinas, com orelha bem desenvolvida, como a neozelandesa (PEARSON, 1985). Cuidados devem ser tomados com a colnia de coelhos que esteja recebendo, constantemente, doses sub-pirognicas de endotoxinas, e gradativamente tornando-se refratria a nveis de contaminao realmente pirognicos. Em casos de dvida deste tipo ser aconselhvel a constatao da reatividade, pelo menos de alguns deles, mediante injeo de padro de endotoxina, de resposta conhecida. Ou, quando possvel pela incluso em cada grupo, de ao menos um animal no anteriormente utilizado em teste, a carter rotineiro (PEARSON, 1985). As condies ecolgicas do biotrio de coelhos devem respeitar as exigncias quanto faixa de neutralidade trmica da espcie, com variao inferior a 3 C, com instalaes que permitam renovao de ar, alm de barreiras acsticas, bem como para insetos e roedores estranhos. No caso de se dispor de biotrio de manuteno, importante a quarentena, para posterior introduo de animais externos colnia para os testes. Toda vidraria empregada para o preparo das amostras, bem como para injeo intravenosa das amostras deve ser despirogenizada previamente, por tratamento trmico. As monografias recomendam 30 minutos a 250 C ou 1 hora a 200 C. Outra opo consiste em trabalhar com material apirognico descartvel, ao invs do convencional (CRISTLIA, 2005). Em vista das informaes muitas vezes conflitantes, o importante que os animais empregados em teste sejam sadios, e que apresentem facilidade de condicionamento para o

44 teste. Os animais permanecem presos em contendores, nos quais a imobilizao se faz pela regio cervical, permitindo que cada um assuma posio sentada e cmoda, pois, a imobilizao total dos mesmos poderia induzir hipotermia ou mesmo hipertemia. A conteno dos animais surgiu em decorrncia da massificao dos testes bem como da automatizao no registro de temperatura retal, mediante insero de par termoeltrico no reto do animal (PINTO et al., 2000). So sugeridos valores de oscilao trmica individual de 0,3 C, sendo que animais que normalmente apresentam variao maior entre duas determinaes consecutivas podem dar falso-positivo. O valor mdio das determinaes, para cada um, com disperso de 0,2 C ser o limite de oscilao trmica fisiolgica. Este limite ser referncia para o dia do teste, pois, nesta ocasio temperatura de controle de cada animal dever estar compreendida entre estes valores (PINTO et al., 2000).

6.5.3. Amostra
Sob o ponto de vista de controle de qualidade, todos os injetveis, bem como os equipamentos de transfuso, infuso e todos os dispositivos implantveis ou descartveis empregados na terapia parenteral devem oferecer segurana ao paciente, sob o ponto de vista de contaminantes pirognicos. Este aspecto engloba, alm da contaminao tipo endotxica, todo e qualquer contaminante estranho, capaz de ser detectado, pelo menos com o teste animal. Logo, tanto injetveis de grande e de pequeno volume devem ser testados. Recentemente, produtos em forma de aerossol, para uso respiratrio, esto sendo testados, podendo ser englobados na mesma exigncia (BPF, 1990). Sabe-se, entretanto, que o potencial de periculosidade maior quando se trata de injetveis de grande volume, ou mesmo de pequeno volume, com uso exclusivo por via intravenosa. A diferena conceitual entre ambos varia conforme o pas, sendo para alguns a partir de 15,0 mL, enquanto que para outros de 50,0 mL. Produtos que contm frmacos que atuam sobre o sistema termo-regulador, inibindo o estado febril, no permitem detectar a presena de contaminantes termognicos. Se a reao biolgica fosse apenas neste aspecto no haveria problemas, mas devido a outras reaes txicas desencadeadas por pirognio, h que estar atento para a segurana do usurio, tambm nesses produtos (LACASA & VEGA, 1989).

45 Outros produtos incompatveis com a metodologia animal so aqueles que contm hipnticos, anestsicos, gluconato de clcio, alguns antibiticos como anfotericina e vancomicina, entre outros. Incluem-se tambm radiofrmacos que naturalmente provocam aumento na temperatura corporal. Nestes casos, o teste em diluentes ser importante. Da mesma forma, em radiofrmacos de meia vida muito curta, o teste poder ser realizado no produto aps o prazo de validade, a fim de obter informaes de carter preventivo para novos lotes a serem fabricados (CRISTLIA, 2005).

6.5.4. Coelho
O manuseio dos animais durante o teste fundamental para que estmulos adversos no acarretem, principalmente, a hipersensibilidade. No dia do teste deve-se suspender o fornecimento da alimentao, ou pelo menos durante o teste, mas o acesso gua pode ser livre, embora geralmente isto no seja efetuado em funo das restries encontradas nas instalaes. Quando o animal devolvido gaiola, durante o tempo de observao, este pode tomar gua livremente. A preferncia para no fornecimento da dieta desde a noite anterior ou pela manh, nos casos de utilizar os animais pela manh ou pela tarde, respectivamente, est relacionada com questes de ordem prtica, pois, nos casos de manter o par termoeltrico no reto, este pode ser expulso juntamente com a eliminao das fezes (KOROLKOVAS, 1988). Quanto ao horrio para execuo do teste, se de manh, tarde ou noite, no existem pesquisas neste sentido, ficando a escolha do perodo ideal, na dependncia da demanda e organizao interna de cada laboratrio. Cada animal, respeitado o perodo de descanso, deve ser pesado, colocado em contendor seguindo-se a introduo do par termoeltrico. Procede-se ento a seleo dos coelhos, que consiste em determinar a temperatura corporal, de 40 a 90 minutos antes da injeo. Conforme a monografia, este valor resulta de uma nica tomada de temperatura, ou representado pela mdia de 3 determinaes, a cada 30 minutos. Por sua vez, a diferena entre duas determinaes consecutivas, no mesmo animal, no deve exceder de 0,2 C. Outra exigncia que a disperso da temperatura de controle, entre os animais de cada grupo, no deve ser maior que 1,0 C, embora sejam valores compreendidos entre 38,0 e 39,8 C. Outras monografias exigem, simplesmente, que a

46 temperatura de controle seja inferior a 39,8 C. Se a tomada de temperatura for contnua, com registros grficos durante o tempo que antecede a injeo da amostra, este recurso dar um referencial muito mais seguro do que a determinao nica ou mltipla (CRISTLIA, 2005). A soluo-teste deve ser injetada na veia marginal da orelha e registrar a temperatura corporal durante pelo menos 3 horas. As determinaes, no caso descontnuo, ao menos 3, a intervalos de uma hora aps a inoculao da amostra, ou em maior nmero, a intervalos de tempo menor. O ideal ser o registro grfico contnuo, cujo perfil da curva oferecer melhores condies para a deciso final. Interpretam-se os dados experimentais, em confronto com a monografia adotada, possibilitando a disposio final como apirognico, pirognico ou duvidoso (CRISTLIA, 2005).

6.6.

DETERMINAO DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

POR MTODO IN VITRO

Desde 1885, observou-se que o sangue do Limulus polyphemus, o caranguejo em forma de ferradura de cavalo, formava um cogulo em gel slido quando removido do animal. Vrios aspectos da coagulao foram estudados, com particular referncia aos amebcitos, a nica clula circulante encontrada no sangue do Limulus. Subseqentemente, tomou-se conhecimento que bactrias marinhas, Gram negativas, provocavam uma doena fulminante nos caranguejos, caracterizada por extensiva coagulao intravascular e morte. Um derivado termoestvel destas bactrias era responsvel por esta coagulao (PEARSON, 1985). Em 1964, Levin e Bang apresentaram estudos que permitiram as seguintes concluses: os amebcitos eram necessrios para a reao, e sua lise acelerava a reao; quantidades de endotoxina eram inativadas na reao. Inicialmente, foi desenvolvido um ensaio sensvel para endotoxinas no plasma humano usando o material lisado do amebcito do Limulus (PEARSON, 1985).

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6.6.1. Mecanismo de Reao

Aps Levin e Bang (apud PEARSON, 1985) demonstrarem que a atividade de coagulao da hemolinfa do Limulus residia no amebcito, trabalho de Young (apud PEARSON, 1985) e colaboradores estabeleceram a natureza enzimtica da reao induzida pela endotoxina. Eles concluram que a reao dependente da ativao de enzima de alta massa molar pela endotoxina, que por sua vez gelifica protenas coagulveis de baixa massa molar. Esta reao crtica na definio de um ponto final no teste LAL. A enzima de coagulao, de elevada massa molar, foi isolada a partir de lisado ativado pela endotoxina. Estudos posteriores demonstraram que a ativao depende tambm de Ca2+, e outros ons bivalentes. A protena coagulante de baixa massa molar, estudada por Solum, foi denominada de coagulognio. Incluindo coagulognio enzima de coagulao ativada obtida do sangue de Tuchypleus tridentatus, outra espcie de caranguejo em forma de ferradura de cavalo, era produzido um gel protico. As caractersticas das seqncias de aminocidos levam a crer que coagulognio e fibrinognio derivem de um ancestral comum, sendo o primeiro um prottipo do fibrinognio dos primatas (PEARSON, 1985).

6.6.2. Ponto Final de Gelificao

O mais simples e amplamente usado dos procedimentos para deteco de endotoxinas baseia-se na gelificao. Volumes iguais de reagente de lisado e soluo-teste (0,1 mL de cada) so transferidos aos tubos-teste de vidro despirogenizado de 10 x 75 mm. A mistura ento suavemente homogeneizada e a seguir incumbada em banho de gua a 37 C por uma hora, durante a qual os tubos no devem ser manuseados, a fim de no interferir na gelificao. O ponto final da reao facilmente constatado pela remoo cuidadosa e individual dos tubos e sua inverso a 180 C. Se houver a presena de gel que se mantm slido durante a inverso, a amostra considerada positiva para endotoxinas. Quando conduzido desta forma, atravs da transformao do sistema sol em gel, o ensaio se constitui em teste limite, levando em considerao a sensibilidade do LAL empregado. Apresenta sensibilidade na faixa de 0,25 a 0,015 UE/mL (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000).

48 O ensaio pode ser usado para definir o nvel de endotoxina de uma soluo particular do produto. Diversas diluies 1:2 em duplicata so preparadas e o ponto final determinado. O nvel de endotoxina calculado multiplicando a recproca da mais alta diluio da soluo com ponto final positivo pela sensibilidade do LAL. Exemplificando, se a sensibilidade do reagente for de 0,010 ng/mL e a diluio do ponto final for 1:16, ento a concentrao de endotoxina ser de 0,16 ng/mL. Este critrio particularmente til na monitorao em processo, de materiais e da gua. Permanece o mtodo de escolha para testes em nmero reduzido ou no freqentes, para que turvem ou com expectativa de resultado negativo (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000).

6.7. OUTROS MTODOS

Outras tcnicas tm tambm sido propostas, como ensaio da microdiluio, ensaio de LAL radiomarcado e fluorescente, todos provocando menor impacto, ao mesmo at o momento. A automao tem sido bastante estudada, permitindo ensaios de maior reprodutibilidade e rapidez. Interessante a aplicao de sistema semi-automtico cintico, (o teste emprega placas, leitor tipo Elisa e Software especfico) que determina alteraes seqenciais na densidade ptica a intervalos de tempo de um minuto, permitindo o ensaio de 176 preparaes de amostras no perodo convencional de uma hora. So comercialmente disponveis preparaes de reagente para esta tcnica assim como equipamento, aumentando a sensibilidade de 60 a 250 vezes com relao ao mtodo da formao de gel. O software automaticamente produz uma relao logartmica entre o onset time de cada padro e a concentrao de endotoxina correspondente (PINTO et al., 2000). Tambm mtodos distintos empregando LAL permitem a determinao de endotoxinas, como por exemplo, a espectrometria de massa e radioimunoensaio. Com a conscientizao cada vez maior das indstrias farmacuticas sobre as Boas Prticas de Fabricao de produtos injetveis, est se prevenindo a contaminao indevida do produto por substncias termognicas. Evidentemente que dentro deste esprito consideram-se, principal e diretamente, as fontes de contaminao microbiana. Por estas razes, diversos estudos tentaram obter uma correlao entre pirogenicidade do produto terminado e o nvel

49 de contaminao vivel do produto no instante imediatamente anterior esterilizao, porm com resultados conflitantes (PINTO et al., 2000). Outro fator importante que deve ser levado em considerao, procurando evitar a contaminao por pirognio, o tempo de manipulao e a fase de esterilizao do produto, a fim de evitar altas contagens de microrganismos viveis, que iro acarretar concentraes pirognicas, em funo da termoestabilidade da endotoxina. Logo, outra preocupao deve estar voltada para a qualidade das matrias-primas, em particular aquela que esteja em maior proporo, muitas vezes a gua. Neste caso, referindo-se gua para injees, muito mais fcil obt-la apirognica do que tentar a descontaminao do produto (CRISTLIA, 2005). Em vista dos fatos discutidos, o produtor de medicamentos deve estar atento aos problemas que podem decorrer da qualidade inadequada dos mesmos, procurando por venda aqueles comprovadamente eficazes e seguros ao paciente. Por outro lado, grande foi a evoluo observada durante os ltimos anos no mbito bioanalitico, de forma a permitir metodologia in vitro que, exceto em raras excees, aplicvel inclusive a produtos terminado (PINTO et al., 2000).

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7. CONCLUSO

Pelo exposto pode-se observar que os problemas mais importantes do controle de qualidade de medicamentos so a identificao, pureza, estabilidade, legitimidade, dosagem, absoro e o aparecimento de novas substancias ativas. O controle de medicamentos, no , sem duvida alguma, um processo estacionrio; evolui sempre, de acordo com os problemas que vo surgindo. A analise microbiolgica de medicamentos um fator fundamental dentro da industria, pois com ela, os produtos comercializados estaro sempre isentos de microrganismos patognicos. Somente devero ser liberados ao mercado, os medicamentos que atendam aos limites mximos de microrganismos permitidos, sendo estes no prejudiciais. Segundo CORREIA (2003) a qualidade microbiana dos produtos farmacuticos afetada no apenas pelos tipos e grandeza de microrganismos introduzidos durante a fabricao, estocagem e uso, mas tambm depende da interao dos mesmos com a formulao. Muitos fatores fsico-qumicos so fundamentais, assim como o sistema conservante pode atuar minimizando os contaminantes a nveis no detectveis durante a estocagem do produto. Como os microrganismos apresentam absoluta exigncia quanto presena de gua, a atividade de gua exerce efeito fundamental, embora tambm formulas slidas possam se deteriorar em decorrncia de contaminantes. H bem pouco tempo, o controle de qualidade de medicamentos tinha a funo de avaliar a qualidade das matrias-primas e dos produtos terminados, como visto nos estudos de SANTORO (1988). Atualmente, tem funo mais ampla na industria, isto , orienta, discute, sugere e normaliza todos os problemas referentes produo farmacutica. Dentre os objetivos do controle de qualidade est a obteno de medicamentos cada vez melhores, mais eficazes e seguros, menos txicos e mais estveis. Assim, deve-se ter sempre em mente que um controle da qualidade microbiolgica efetivo e atuante extremamente necessrio dentro de uma indstria, sempre priorizando a preveno. As anlises e os mtodos citados neste trabalho apenas exemplificam alguns dos procedimentos analticos de um controle de qualidade microbiolgica de

51 medicamentos, sendo, portanto, de grande importncia utilizao destes mtodos padronizados e sua realizao feita por profissionais treinados e com experincia nesta rea.

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8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ABIFARMA, Controle de Qualidade e Boas Normas de Fabricao, 1a edio. 1978.

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54

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56

9. ANEXO:

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Estgio Supervisionado - 2005

Curso de Cincias Biolgicas Aluno: Daniela Cristina Cezaretto Entidade/Empresa/Instituio onde realizou os estgio: Cristlia Produtos Qumicos e Farmacuticos Ltda Responsvel/Orientador do estgio: Farm. Jos Carlos Stevanatto Filho Perodo (mm/aaaa): 04 a 07 de 2005 Tempo total do estgio (horas): 368 horas Relato das atividades desenvolvidas: Durante o perodo do estgio acompanhei todas as etapas da fabricao de medicamentos, desde a chegada da matria prima, produo, acabamento e controle de qualidade qumico-fsico e microbiolgico. A maior parte do tempo de estgio, fiquei no laboratrio de microbiologia, onde acompanhei todos os testes que so realizados neste setor. Os teste nos quais tive maior contato foram os testes de anlise microbiana de medicamentos no estreis, medicamentos estreis e teste de pirognio. Todos estes so descritos detalhadamente na minha monografia. Acompanhei tambm o tratamento e anlise da gua que usada pela indstria, e os testes que so realizados para a anlise que so: pesquisa de patgenos e teste de coliformes fecais. Participei de auditorias internas, auto-inspeo e fiscalizao da industria pela ANVISA que o rgo responsvel pela aplicao correta das Boas Prticas de Fabricao.