PH y Soluciones Amortiguadoras

- 1 -
Autor: M.Sc. Roberto Rivera Moncada

pH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

Los amortiguadores son importantes en bioqumica porque las estructuras (y como
consecuencia sus funciones) de las biomolculas son estables en rangos relativamente
restringido de valores de pH. Todos los organismos cuyas reacciones bioqumicas
ocurren en medio acuoso funcionan a valores de pH muy estrechos. A nivel molecular,
la mayora de los procesos biolgicos ocurren a pH entre 6 y 9. As, a nivel molecular,
la estructura sectorial de las protenas es muy susceptible a cambios en pH:

H
+
OH
-
OH
-
OH
-
OH
-
OH
-
H
+
H
+
H
+
H
+

A nivel sistmico o individual, cuando el pH ptimo de funcionamiento es alterado, las
consecuencias pueden ser fatales si alcanzan valores extremos.

0 11 14
tiobacilos
1.2-1.5
jugo
gstrico
bacterias
7.35-7.45
normal
8.2
hongos
6.6
alcalosis acidosis
exceso de H
+
dficit de H
+
metablica
respiratoria
metablica
respiratoria
7.6
7.45
7.1
7.3
7.6
7.45
7.1
7.3
puede ser
puede ser
C
D
C
C
C
D
D
D

- 2 -


La acidosis respiratoria ocurre cuando el pH sanguneo baja como resultado de una
disminucin de la respiracin. Si se restringe la respiracin, la [CO
2
] disuelto aumenta haciendo
ms cida la sangre. Esta condicin aparece en casos de asma, neumona, enfisema e inhalacin
de humo. La acidosis metablica ocurre por una disminucin del pH sanguneo por liberacin
de excesivas cantidades de sustancias acdicas en la sangre. Se genera cuando se somete al
cuerpo a una actividad fsica prolongada y extenuante, cuando se es diabtico o cuando se
restringe el consumo de alimentos. La respuesta normal del cuerpo ante esta condicin es
aumentar la frecuencia respiratoria a fin de disminuir la cantidad de dixido de carbono disuelto
en sangre. Si se produce ms CO
2
que el que se puede eliminar, el pH disminuir
significativamente comprometiendo la vida.
La alcalosis respiratoria resulta de una respiracin excesiva que provoca un aumento en el pH
sanguneo. La hiperventilacin hace que mucho CO
2
disuelto sea removido de la sangre, que
disminuya la concentracin de cido carbnico y que, como consecuencia, el pH aumente. A
menudo, la persona hiperventilada se desmaya para desacelerar su respiracin. La alcalosis
metablica es un aumento del pH sanguneo por la liberacin de equivalentes alcalinos en la
sangre o por la prdida de equivalentes cidos. A veces es causada por ingesta de sustancias
alcalinas o por el abuso de diurticos.

Cmo se controla el pH fisiolgico?

A) Eliminando o reteniendo metabolitos

Si hay El pH debe Para lograrlo
ACIDOSIS Subir
pulmn elimina CO
2
rin elimina H
+
rin retiene HCO
3
-
ALCALOSIS Bajar
pulmn retiene CO
2

rin retiene H
+
rin elimina HCO
3
-

B) Activando reacciones que producen protones (en caso de alcalosis) o
consumen protones (en caso de acidosis).

C) Usando amortiguadores biolgicos (vea al final de este material)

CO
2
+
H
2
O HCO
3
-
H
+
H
+
H
+
H
+
+
+
+
+
6.1
7.4
6.2
7.7
7.2
pKa
HPr Pr
-
HHb
Hb
-
H
2
PO
4
-
HPO
4
2-
cido
conjugado
base conjugada
en caso de acidosis
en caso de alcalosis
mmol/l sangre
24
15
7
2

- 3 -


PREPARANDO AMORTIGUADORES

En las reacciones bioqumicas participan muchas biomolculas (carbohidratos, lpidos,
protenas y cidos nucleicos) cuya estructura y funcin se ven afectadas por cambios
bruscos en el pH de la solucin. El uso de amortiguadores permite mantener el pH de la
solucin dentro de un rango que no comprometa la actividad de dichas biomolculas.

base conjugada
no funciona
cido conjugado
no funciona
Base
cido
[cido] = [base]
B-mx
zona amortiguada

La mayora de los buffers usados en bioqumica son pares conjugados de cidos y bases
dbiles. La relacin matemtica ms til para clculos previos es la ecuacin de
Henderson y Hasselbalch:

A
-
HA
pH = pKa + log

Si el pH > pKa, la relacin molar ms conveniente es

A
-
HA
= 10
pH - pKa

Si pKa > pH conviene usar

HA
A
-
= 10
pKa - pH

en donde |HA| es la concentracin del cido conjugado y |A
-
| es la concentracin de la
base conjugada, una vez alcanzado el equilibrio.
- 4 -


El valor ideal o termodinmico es el pKa que se calcula usando actividades. El valor
prctico o pKa
'
se calcula a partir de concentraciones molares y debe corregirse cuando
hay diferencias considerables de fuerza inica () o de temperatura de acuerdo a las
siguientes relaciones matemticas:

pK
a = pKa -
0.509(2n + 1)( )
1/2
( )
1/2
1 +
- 0.1

donde n es el nmero de cargas en el cido conjugado. pK
a se aproxima al pKa si la
fuerza inica se aproxima a cero.

pK
a = pKa + (
pKa/C)
A
(T
ensayo
- T
estndar
)

EJERCICIO 1

Describa la preparacin de 50 ml de MES a pH 7.4 y 0.03 M para usarlo a 42C
partiendo de:
a) Mezcla de MES cido con MES bsico
b) Neutralizacin de MES bsico con HCl concentrado (37% , 1.18 g/ml)
c) Neutralizacin de MES cido con NaOH 0.62 N
d) Calcule la fuerza inica de la solucin.
e) Evale su eficiencia si se usara en una reaccin que produce 1.5 x 10
-4
M de H
+

f) Evale su eficiencia si se usara en una reaccin que consume 3.0 x 10
-2
M de H
+

Caso a

1. Ecuacin qumica involucrada: mezcla de ambas especies hasta lograr el
equilibrio.

MES
+
MES
(HA)
(A
-
)

2. Moles totales (q
total
) del buffer: q
HA
+ q
A
-

q
total
= (V
t
)(|M|
t
) = (0.05 litros)(0.03 mol/l) = 1.5 x 10
-3
mol

3. Correccin del pKa. Debe hacerse por dos razones: a) El buffer ser usado a
una temperatura (42C) diferente a la cual fue estandarizado (20C) y b) MES
- 5 -

sufre alteracin considerable en su equilibrio al cambiar la temperatura del
sistema. Busque datos de temperatura, pKa y otros en la tabla adjunta.

pK'a = pKa + (
A
pKa/C)(T
ens
- T
std
) = 6.15 + (-0.011)(42 - 20) = 5.908

4. Razn molar de las especies conjugadas de MES.
Dado que pH > pKa, conviene calcular la relacin:

Razn molar =
A
-
HA
MES
MES
+
/
=
= 10
7.4 - 5.908
= 10
1.492
= 31.05 / 1

El total de partes en el sistema es 31.05 + 1 = 32.05.

5. Fraccin molar de cada componente (x
especie
). Este dato permite calcular los
moles, la molaridad y el porcentaje de cada componente:

x
MES
= 31.05 / 32.05 = 0.9688
x
MES
+
= 1 / 32.05 = 0.0312

6. Moles de cada componente (q
especie
). Es la fraccin molar de cada componente
multiplicada por los moles totales del buffer.

q
MES =
x
MES
x q
total
= (0.9688)(1.5 x 10
-3
mol) = 1.45 x 10
-3
mol

q
MES
+
= (0.0312)( 1.5 x 10
-3
mol) = 4.68 x 10
-5
mol

7. Molaridad de cada componente. Es la fraccin molar de cada componente
multiplicada por la molaridad total del buffer. Se calcula slo si se evaluar la
capacidad amortiguadora y/o la fuerza inica de la solucin.

|MES| = (0.9688)(0.03 M) = 2.91 x 10
-2
mol/l

|MES
+
| = 0.0312 (0.03 M) = 9.36 x 10
-4
mol/l

8. Cantidades a medir de cada componente.

a. MES = (1.45 x 10
-3
mol)(195.2 g/mol) = 0.2830 g

b. MES
+
= (4.68 x 10
-5
mol)(231.7 g/mol) = 0.0108 g

9. Descripcin. Mezclar 0.2830 g de MES bsico con 0.0108 g de MES cido en
un frasco volumtrico de 50.00 ml. Con adiciones parciales de agua desionizada
y agitaciones para homogeneizar, aforar hasta la marca. Si el pH-metro no
- 6 -

muestra 7.4 ajuste a este valor adicionando cuidadosamente solucin diluida de
NaOH o de HCl, segn se requiera.

Caso b

1. Ecuacin qumica involucrada. Es una neutralizacin de MES bsico con HCl
concentrado:

MES + HCl MES
+
+ Cl
-
(A
-
) (HA)

Se repiten los clculos realizados en los numerales del 2 al 7 del caso a.

8. Cantidades a medir.
a. MES = (q
total
)(195.2 g/mol) = 0.2928 g.
Nota: Siempre que se prepare un buffer por neutralizacin, la especie
que sirve de punto de partida, (MES en este caso), requiere moles
totales.

b. HCl = q
MES
+
= 4.68 x 10
-5
mol (36.45 g/mol)(100 g/37 g)(1 ml/1.18 g)
= 3.91 x10
-3
ml = 3.91 . (1 ml = 1000 )

9. Descripcin. Mezclar 0.2928 g de MES bsico con 3.91 de HCl concentrado.
Con adiciones parciales de agua desionizada y agitaciones para homogeneizar,
aforar hasta la marca. Si el pH-metro no muestra 7.4 ajuste a este valor
adicionando cuidadosamente solucin diluida de NaOH o de HCl, segn se
requiera.

Caso c

Desarrolle los pasos 1, 8 y 9 basndose en los datos generados en los casos anteriores.

Caso d

1.- La fuerza inica (). Se calcula de acuerdo a la siguiente ecuacin en donde
C es la concentracin molar de cada especie con carga elctrica y Z es la
carga elctrica del ion respectivo. Recurdese que slo las especies cargadas
elctricamente aportan a la fuerza inica.
- 7 -


E
=
CZ
2
1/2
= MES
+
1/2 x (+1)
2
= 1/2 9.36 x 10
-4
x
1
=
4.68 x 10
-4
mol/l

Caso e

Cuando la reaccin produce protones (pH
inicio
> pH
final
) se utiliza la capacidad
amortiguadora en la direccin cida (|
a
|
H
+
) para evaluar si el buffer amortigua o
no.

|
o
= = =
HA
HA
A
-
A
-
9
10 +
9
(2.91 x 10
-2
)(9.36 x 10
-4
)
10 (9.36 x 10
-4
) +
(2.91 x 10
-2
)
6.36 x 10
-3
mol/l

= =
Eficiencia relativa
|
o
H
+
producidos
=
6.36 x 10
-3
mol/l
1.5 x 10
-4
mol/l
42.4
*

(*) Dado que la eficiencia relativa es mayor que 2, el buffer es excelente pero est
muy concentrado para esta reaccin que produce protones (en la direccin cida).
Lo recomendable es diluirlo hasta 42.4/2 21.1 veces la concentracin actual. La
concentracin recomendada sera (0.03 mol/l)/(21.1) = 1.42 x 10
-3
mol/l.

Caso f

Cuando la reaccin consume protones (pH
inicio
< pH
final
) se utiliza la capacidad
amortiguadora en la direccin bsica (|
b
|
OH
-
) para evaluar si el buffer amortigua
o no.

=
=
=
=
=
HA
HA
A
-
A
-
9
10 +
9
(2.91 x 10
-2
)(9.36 x 10
-4
)
10
(9.36 x 10
-4
) + (2.91 x 10
-2
)
8.42 x 10
-4
mol/l
Eficiencia relativa
H
+
consumidos
=
3.0 x 10
-2
mol/l
0.028
*
|
b
|
b
8.42 x 10
-4
mol/l

(*) Dado que la eficiencia relativa es menor que 2, el buffer no funcionar porque
est muy diluido para esta reaccin que consume protones (en la direccin bsica).
Lo recomendable es concentrarla hasta 2/0.028 71.4 veces la concentracin actual.
La concentracin recomendada sera (0.03 mol/l) (71.4) = 2.14 mol/l.

- 8 -


Tarea

Utilice una hoja electrnica de Excel para:
a) Resolver el problema 1 recin presentado.

b) Calcular la a y b de este amortiguador de MES para pH desde 5.00 hasta
7.50 (con incrementos de 0.05 unidades de pH). Use como concentracin
total la de mayor eficiencia relativa normal. Elabore un grfico de dispersin
de
cida
vs pH. Analice el grfico por secciones y emita las conclusiones
necesarias.

LOS AMORTIGUADORES BIOLGICOS (AB)

El pH dentro y fuera de las clulas se mantiene en valores muy restringidos gracias a
varios mecanismos, entre ellos:
1. La eliminacin y/o retencin de equivalentes cido-bsicos va pulmn y/o
rin.
2. Activacin/desactivacin de procesos bioqumicos que conducen a la produccin
y/o consumo de protones (H
+
).
3. La intervencin de amortiguadores biolgicos que donan o neutralizan protones
cuando el medio as lo requiere.

A nivel molecular, la mayora de los procesos bioqumicos ocurren a pH entre 6 y 9.
Los AB son muy utilizados en bioqumica, biotecnologa, biologa celular y molecular y
en muchas tcnicas analticas como cromatografa, electroforesis, espectrofotometra,
espectroscopia, polarimetra y diluciones radio isotpica.

FOSFATOS: Opera en el fluido celular de todas las clulas con un rango til de pH
entre 6.2 y 8.2. Su pKa en condiciones fisiolgicas es 7.21. En el fluido celular las
reacciones se dan a pH entre 6.9 y 7.4.

H
2
PO
4
-
HPO
4
2-
+
H
+

CARBONATOS: Sistema abierto que opera en el plasma sanguneo con un pKa de 6.1.
Los componentes de este sistema pueden eliminarse o retenerse a travs del pulmn
(CO
2(g)
) o del rin (H
+
y HCO
3
-
). A pH 7.4, la concentracin total de carbonatos es
2.52 x 10
-2
, la [HCO
3
-
] es 0.024 molar y la [CO
2(ac)
] es 0.0012 M. La [CO
2(ac)
] = k x P
en donde k es 3.01 X 10
-5
(en M/mmHg) y P es la presin parcial del CO
2
(en mmHg)
disuelto en sangre. A pH fisiolgico, la RM de [HCO
3
-
] / [CO
2(ac)
] es de 19.95/1 20/1.

HCO
3
-
H
+
+
[H
2
CO
3
]
CO
2(ac)
CO
2(g)

Cada vez que por metabolismo degradativo se producen protones, stos son
neutralizados por el bicarbonato y el CO
2
producido en exceso es eliminado hasta que
su valor es igual a [HCO
3
-
]
eq
/RM. Si por metabolismo se liberara 0.006 M de H
+
en
sangre, al intervenir el sistema de carbonatos, el pH resultante sera 6.5 (si el sistema
fuera cerrado) o 7.4 (si el sistema es abierto).
- 9 -


PROTENAS: Los sistemas proteicos son los amortiguadores ms efectivos porque su
pKa est cercano a 7.4 como resultante del aporte de varios pKas asociados a
aminocidos ionizables como Asp, Glu, Lis, His y Arg. El aporte ms significativo se
atribuye al equilibrio de residuos de histidina (His) con un pKa de 6.0

H
N
NH
H
H
N
NH
H
+
+

La protena ms estudiada como sistema amortiguador es la hemoglobina en sus
diferentes formas (Hb, HHb
+
, HHbO
2
+
y HbO
2
). La forma Hb recoge protones en la
periferia del cuerpo en base al pH del medio por donde circula. Entre ms bajo el pH,
ms protones recoge y mayor porcin de HHb
+
llega al pulmn. En el pulmn, debido
a la alta presin de oxgeno presente, la HHb
+
se oxigena convirtindose en HHbO
2
+
,
estructura altamente inestable que rpidamente se estabiliza eliminando el protn y
convirtindose en HbO
2
. En la periferia, la baja presin de oxgeno obliga a la HbO
2
a
ceder el O
2
(transformndose en Hb) para la oxidacin de nutrientes hasta HCO
3
-
y H
+
.
El HCO
3
-
contina en circulacin pero el H
+
es recogido por Hb y soltado en el
pulmn por la HHbO
2
+
. En el pulmn, el H
+
es neutralizado por el HCO
3
-
circulante y
eliminado como CO
2(g)
. Ver esquema:

- 10 -

Hb
HHb
+
HHbO
2
+
HbO
2
O
2
H
+
O
2
Nutrientes
CO
2(ac)
HCO
3
-
+ H
+
+ HCO
3
-
CO
2(ac)
CO
2(g)
pKa
1
pKa
2
protn
recogido por Hb
circula hasta el
pulmn para
neutralizar el H
+
puede eliminarse
por el pulmn
puede eliminarse
por el rin
pKa
1
= 7.71 - 8.18
pKa
2
= 6.17 - 6.68

La hemoglobina que ingresa al pulmn responde al equilibrio de Hb y HHb
+
, mientras
que la saliente del pulmn hacia la periferia es un equilibrio de HHbO
2
+
y HbO
2
. Cul
es el porcentaje de estos metabolitos al entrar y salir del pulmn en una persona con pH
fisiolgico normal de 7.42, en estado de coma acidtico con pH 6.9 o con alcalosis
descompensada con pH 7.8?

GUIA DE EJERCICIOS 1
(Use Excel para resolver los ejercicios marcados con *)

1. Calcule el pH de la solucin resultante al mezclar 100 ml de NaOH 0.1 M con:
a. 150 ml de cido ascrbico 0.2 M b. 200 ml de cido ascrbico 0.1 M
c. 0.654 g de glicina neutra d. 200 mmol de MES
e. 100 ml de PIPES 0.15 M

2. Describa la preparacin de:

a. 100 ml de fosfato 0.1M pH 6.7 partiendo de H
3
PO
4
1M + NaOH slido.
b. *25 ml de fosfato 0.4M pH 11.2 partiendo de Na
3
PO
4
y HCl
concentrado.
c. 10 ml de glicinato 0.3M pH 2.4 partiendo de glicina y HCl 1N.

3. *Se prepar un buffer de MOPS disolviendo 5.7 mmol de MOPS cido, 4.2
mmol de MOPS base y 8.765 g de NaCl. Se afor hasta 100 ml con ddH
2
O.
De inmediato se hizo una dilucin de 1:25. Para la solucin final, calcule:

- 11 -

a. La molaridad del buffer b. El pH
c. La fuerza inica total. d. Si la en el organismo es 0.154 M,
convendra administrar este buffer a un paciente para equilibrarle un
desbalance cido-base. ?

4 Describa la preparacin de 50 ml de un amortiguador de HEPES 0.05M, pH
7.42 partiendo de HEPES cido (238.31 g/mol) y NaOH 0.1N. El amortiguador
ser usado a 42C para una reaccin cuyo pH final es 7.38.

a. Evale su eficiencia
b. Explique si amerita hacer cambios en su preparacin.

4. El plasma sanguneo contiene 0.0252M de carbonatos totales. Calcule:

a.- La relacin porcentual de HCO
3
-
a CO
2
disuelto
b.- pH final si 0.01 M de H
+
se adicionan al medio y el CO
2
formado:
i. no se libera
ii. s se libera
c.- Concentracin de CO
2
liberado para equilibrar el pH.

6. *10 ml de sangre arterial (pH 7.42) de un paciente fueron acidificados
producindose 5.91 ml de CO
2
(corregidos a TPN). Calcule:

a. Concentracin total de carbonatos en esta muestra de sangre
b. Concentracin de HCO
3
-
y de CO
2
disuelto.
c. Presin parcial de CO
2
en mm de Hg.

7. *Usando la ecuacin de Henderson-Hasselbalch, construya un grfico de
dispersin que relacione:

a. |A
-
|/|HA| vrs pH para un sistema de carbonatos para una [C] =
fisiolgica. Use valores de pH entre 5.5 y 8.5 con
incrementos de 0.1 unidades de pH.

b. |log(|A
-
|/|HA|| vrs pH y encuentre el valor de pKa para el
carbonato como intercepto en x.

- 12 -


ALGUNOS AMORTIGUADORES DE USO COMUN EN BIOQUIMICA
(Valores de pKa estandarizados a 20 C)

COMPUESTO PM pKa_1 pKa_2 pKa_3 RANGO pKa/C
ACES 182.2 6.9 6.2-7.4 -0.02
ADA 190.17 6.6 6.0-7.4 -0.011
AMP 9.8 9-10.5
AMPSO 9 8.3-9.8
ASCORBICO 176.12 4.1
BARBITURICO 128.09 3.98
BES 213.25 7.15 5.4-7.8 -0.027
BICINA 163.18 8.35 7.6-8.9 -0.018
BISTRIS 209.24 6.46 5.7-6.2
BISTRIS PROPANO 6.8 9 6.3-9.7
CAPS 221.32 10.4 9.8-11.1 0.032
CAPSO 9.6 8.8-9.3
CARBONICO 62 6.1 -0.009
CHES 9.3 8.5-10 -0.011
CHOLAMINE 156.69 7.1
CITRICO 192.12 3.06 4.54 5.4 -0.0016
DIPSO 7.6 7-8.4
EDTA 292.24 2.6 6.3 10.6
ENDCA 183.62 7
EPPS 252.23 8 7.2-8.8
FOSFORICO 98 2.12 7.21 12.32 -0.0028
FUMARICO 116.07 3.03 4.47
GLICEROFOSFATO 172.08 1.47 6.19
GLICINA 75.07 2.34 9.6 -0.026
GLICINAMIDA 74.04 8.4 -0.029
HEPES 238.31 7.55 6.8-8.4 -0.014
HEPPSO 7.8 7.2-8.6 -0.011
HISTIDINA 155.16 9.17
LACTICO 90.08 3.86
MALONICO 146.02 2.85
MES 195.2 6.15 5.5-6.7 -0.011
MONOTRIS 165.18 7.83
MOPS 209.27 7.2 6.5-7.9 -0.011
PIPES 302.37 6.8 -0.0085
PIRIDINA 79.1 5.23
SALICILICO 138.12 2.98
TAPS 243.3 8.4 7.7-9.2 0.018
TARTARICO 150.09 3.02 4.54
TEA 7.8 7.4-8.3
TES 229.28 7.5 6.8-8.3 -0.02
TRICINA 180.18 8.15 7.5-8.9 -0.021
TRIS 121.14 8.1 -0.031

CAPSO: Acido 3(ciclohexilamino)-2-hidroxi-1-propanosulfnico
En NEGRITA y cursiva: de uso biolgico

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