BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Lokasi Penelitian 1. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Perlakuan dengan menggunakan variasi konsentrasi ekstrak daun Botto-botto (Cromolaena odorata L) dalam menghambat pembelahan sel telur bulubabi untuk mengetahui nilai IC50. 2. Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar. B. Pendekatan Penelitian Penelitian ini dilakukan menggunakan pendekatan eksperimental terhadap efek antimitosis dari ekstrak n-Heksan, Etil Asetat, dan Etanol daun Botto-botto (Cromolaena odorata L) dengan beberapa konsentrasi dalam menghambat pembelahan sel telur bulubabi. Setelah itu dihitung nilai IC50-nya. C. Populasi dan Sampel 1. Sampel Sampel yang digunakan pada penelitian ini yaitu daun laruna atau daun Botto-botto (Cromolaena odorata L).

34

35

D. Metode Pengumpulan data Data yang dikumpulkan adalah data primer yang diperoleh dengan menggunakan metode RAL (Rancangan Acak Lengkap). E. Instrumen Penelitian Dalam pelaksanaan penelitian ini, digunakan beberapa alat dan bahan yang dapat menunjang, antara lain: 1. Alat Alat yang digunakan antara lain adalah water bath, rotavapor, blender, cawan porselin, sendok besi, gelas arloji, autoklaf, oven, aerator, corong, gelas ukur, mikroskop, mikropipet, neraca analitik, neraca OHauss, oven, pipet ukur, tabung eppendorf, vortex mixer, wadah maserasi, pompa vacuum, sinter glass, eksikator. 2. Bahan Bahan yang digunakan berupa daun botto-botto (Chromolaena odorata L.), air suling, aluminium foil, air laut, etanol, formalin, etil asetat, n-heksan, KCl, DMSO, kertas saring, serbuk silika, lempeng silika gel. F. Teknik Pengolahan dan Analisis Data Data hasil penelitian akan disajikan dalam bentuk tabel, dimana perhitungan nilai IC50 dilakukan dengan menggunakan metode Tabel Probid Log-Konsentrasi.

36

G. Prosedur Kerja 1. Penyiapan Sampel a. Pengambilan sampel Sampel daun botto-botto (Chromolaena odorata L.) diperoleh di sekitar kampus II Universtitas Islam Negeri Alauddin, daerah Samata, Kabupaten Gowa, Sulawesi Selatan. Pengambilan sampel dilakukan pada pagi hari, pukul 08.00 10.00 wita. Daun yang digunakan adalah seluruh daun yang tidak rusak dan tidak berjamur. b. Pengolahan sampel Daun botto-botto (Chromolaena odorata L.) yang telah diambil, dicuci hingga bersih dengan air mengalir, dikeringkan tanpa terkena sinar matahari langsung. Lalu diserbukkan dengan penggiling hingga menjadi simplisia setengah kasar. c. Ekstraksi sampel Simplisia daun botto-botto (Chromolaena odorata L.) disediakan sebanyak 1.000 g lalu dimasukkan ke dalam wadah maserasi, direndam dengan n-heksan hingga seluruh simplisia terbasahi dan ditambahkan kembali n-heksan hingga batas pelarut 2 cm di atas simplisia. Wadah maserasi ditutup dan disimpan selama 24 jam di tempat terlindung dari sinar matahari sambil diaduk sekali-kali. Selanjutnya disaring, dipisahkan antara ampas dan filtratnya. Ampas diekstraksi kembali dengan penyari yang baru dengan jumlah yang sama. Hal ini terus dilakukan hingga cairan penyari tampak bening. Setelah maserasi dilakukan dengan menggunakan n-heksan, selanjutnya ampas diektraksi kembali

37

menggunakan pelarut etil asetat dan etanol dengan cara yang sama pada pengerjaan saat menggunakan n-heksan. Ekstrak encer yang diperoleh kemudian dikumpulkan dan diuapkan cairan penyarinya dalam rotavapor 40oC sampai diperoleh ekstrak kental. 2. Uji Antimitosis dengan Menggunakan Sel Telur Bulubabi a. Penyiapan sel telur bulubabi Disiapkan alat dan bahan. Kemudian diambil bulubabi lalu disuntikkan dengan KCl 10% sebanyak 3 ml. setelah itu diletakkan bulubabi yang telah diinduksi dengan KCl di atas wadah penampung yang berbeda untuk menampung sel telur dan sperma dari Bulubabi. Kemudian dibuat campuran sel telur dan sperma Bulubabi yang diperoleh yaitu sel telur sebanyak 5 ml dan sperma sebanyak 1 ml. setelah itu diamkan campuran sel telur dan sperma Bulubabi yang telah dibuat di dalam kulkas hingga terjadi fertilisasi. b. Pembuatan konsentrasi sampel dan Pelaksanaan Uji Disiapkan alat dan bahan. Dibuat larutan stok dengan konsentrasi 100.000 dengan cara ditimbang masing-masing ekstrak sebanyak 100 mg keudian dilrutkan dalam 1 ml DMSO. Lalu dibuat pengenceran sampel (ektrak daun Laruna) untuk konsentrasi 1000, 100 dan 10 untuk tiap-tiap ekstrak di dalam tabung eppendorf, tiap konsentrasi dibuat tiga replikasi. Untuk konsentrasi 1000, diambil 10 l sampel dari stok kemudian ditambahkan campuran sel telur dan sperma Bulubabi yang telah difertilisasikan sebanyak 100 l setelah itu ditambahkan air laut bebas protozoa sebanyak 890 l. Untuk konsentrasi 100, diambil 1 l sampel dari stok kemudian

38

ditambahkan campuran sel telur dan sperma Bulubabi yang telah difertilisasikan sebanyak 100 l setelah itu ditambahkan air laut bebas protozoa sebanyak 899 l. Untuk konsentrasi 10, diambil 10 l stok kemudian diencerkan dengan air laut bebas protozoa sebanyak 90 l, kemudian dari stok kedua diambil 1 l kemudian ditambahkan campuran sel telur dan sperma Bulubabi sebanyak 100 l setelah itu ditambakan air laut bebas protozoa sebanyak 899 l. Dibuat kontrol air laut yaitu campuran air laut bebas protozoa sebanyak 900 l dengan campuran sel telur dan sperma Bulubabi yang telah difertilisasikan sebanyak 100 l, dibuat tiga replikasi. Dibuat kontrol DMSO yaitu campuran DMSO sebanyak 1 l ditambahkan campuran sel telur dan sperma Bulubabi yang telah difertilisasikan sebanyak 100 l, dan ditambahkan dengan air laut bebas protozoa sebanyak 899 l, dibuat tiga replikasi. Kemudian diamkan semua sampel uji yang telah disiapkan pada tempat yang sejuk dengan suhu 15-20 C selama 2 jam. Kemudian ditambahkan Formalin pada masingmasing tabung eppendorf yang berisi sel bulubabi. setelah itu Diamati sampel uji tiap-tiap konsentrasi di bawah mikroskop dan dihitung sel yang tidak membelah. 3. Fraksinasi Komponen Kimia a. Persiapan Kolom Kromatografi Cair Vakum Sinter glass kromatografi cair vakum dibersihkan kemudian dipasang tegak lurus. Adsorben (silika gel 60 PF254) dimasukkan dalam sinter glass kemudian ditambahkan cairan pengelusi n-heksan, selanjutnya pompa vakum dijalankan hingga adsorben (silika gel) rapat.

39

b. Pemisahan Komponen Kimia Ekstrak yang memiliki efek antimitosis paling besar ditimbang sebanyak 3 g. Kemudian ditimbang silika gel sebanyak 20 g. Ditambahkan sedikit silika gel dari penimbangan tadi dan etanol kemudian diaduk hingga homogen, didiamkan hingga kering. Setelah kering dimasukkan ke dalam sinter glass dan bagian atasnya ditutup dengan kertas saring. Ekstrak yang memiliki efek antimitosis paling besar difraksinasi

menggunakan kromatografi kolom cair vakum (KCV) memakai fase diam silika gel 60 PF254 dan fase gerak dengan gradien kepolaran berdasarkan profil KLT yang diperoleh. Masing-masing fraksinasi diuji toksisitasnya dengan metode antimitosis. 4. Identifikasi Senyawa Bioaktif Fraksi dengan IC50 paling rendah ditotolkan pada lempeng KLT kemudian dielusi dengan eluen yang sesuai dengan profil KLT yang diperoleh, kromatogramnya disemprot dengan menggunakan pereaksi penampak noda sebagai berikut : a. Pereaksi H2SO4 10%: kromatogram dipanaskan pada 105C selama 5 menit dan diamati. Kebanyakan senyawa organik memberikan warna kuning, coklat, hitam. b. Pereaksi Dragendorf: akan dihasilkan warna jingga dengan latar belakang kuning untuk senyawa golongan alkaloida. c. Pereaksi FeCl3 5%: akan dihasilkan warna hitam-biru atau hijau untuk senyawa golongan fenol. d. Pereaksi Liebermann-Burchard: kromatogram terlebih dipanaskan, kemudian diamati di lampu UV 366. Munculnya noda berflouresensi merah menunjukkan

40

adanya triterpen, sedangkan munculnya warna hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid. e. Pereaksi AlCl3 5%: diamati di lampu UV, akan dihasilkan noda berfluoresensi kuning untuk senyawa golongan flavonoid. f. Pereaksi KOH etanolik: diamati di lampu UV