AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE HONGOS NATIVOS CON CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA, SOBRE CARBON DE BAJO RANGO DE LA MINA EL CERREJON (LA GUAJIRA

COLOMBIA).

TRABAJO DE GRADO

PILAR VANESA SALAS CORREA

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR TRABAJO DE GRADO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA VALLEDUPAR-CESAR 2010 1

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE HONGOS NATIVOS CON CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA, SOBRE CARBON DE BAJO RANGO DE LA MINA EL CERREJON (LA GUAJIRA COLOMBIA).

TRABAJO DE GRADO

PILAR VANESA SALAS CORREA

NELSON VALERO VALERO Bilogo, M.sc Microbiologa ASESOR TECNICO Y METODOLOGICO

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR TRABAJO DE GRADO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA VALLEDUPAR-CESAR 2010

NOTA DE ACEPTACIN -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

-----------------------------------------------------------Firma del presidente del jurado

-----------------------------------------------------------Firma del jurado

-----------------------------------------------------------Firma del jurado

Valledupar, Mayo 12, 2010

El presente trabajo se llev a cabo dentro del desarrollo del proyecto de investigacin Evaluacin de carbones meteorizados generados en el Cerrejn para su aprovechamiento como materia prima en la elaboracin de enmiendas orgnicas Financiado por Carbones del Cerrejn Limited y Colciencias, mediante convenio RC- 591 -2008 (Colciencias Carbones del Cerrejn- Universidad Popular del Cesar). Investigacin desarrollada por el grupo de investigacin en microbiologa agrcola y ambiental de la Universidad Popular del Cesar.

DEDICATORIA

Al nico ser capaz de entregar tantas bendiciones en una sola vida, Dios. Gracias por ser y mostrarme tu omnipresencia, por llenarme de tus bendiciones y tu proteccin. Por ser mi fuerza y descanso A mi madre Pilar Correa Maldonado y mi hermano quienes me han dado todo su apoyo, confianza y amor, Para ser el motivo de m luchar. A mi padre Horacio Salas Carrasquilla que siempre est a mi lado, aunque ya no lo pueda ver. A mi familia Correa Maldonado, por las enseanzas y apoyo. A estas personas tan especiales en estos 3 ltimos aos que construyen y forman parte en mi vida diaria con su apoyo y su presencia constante: Arleth Caballero, Damin Orozco, Zulay Barrios, Isauro Alemn, Mildrys Martnez incondicionales siempre. A mi compaero de bromas en los laboratorios Yesid Almanza. A Julin Ruiz por su apoyo constante, confianza y cuidado. Por poder contar contigo siempre. Gracias por todo tu cario y proteccin a pesar de las circunstancias adversas. A mis compaeros y amigos de batalla Manuel Pantoja Guerra y Karina Fuentes con quienes compart el trascurrir de mi carrera, a ellos agradezco todos sus consejos, risas, preocupaciones y su amistad sincera. Doy inmensas gracias a pesar de la distancia mi mejor amigo y hermano Luis Carlos Aguilar, con quien forje una amistad inigualable, gracias por estar en los mejores y en los momentos tristes de mi vida, t y tu familia hacen parte de lo que hoy soy y de lo que he logrado. Erick Guevara, mil gracias por tu siempre confianza en m y tu apoyo veinticuatro siete A mi Alma Mater humilde pero llena de superacin: Universidad Popular del Cesar Las gracias no bastarn, solamente mi vida pagar todas las bendiciones

AGRADECIMIENTOS

Carbones del Cerrejn Limited por la financiacin Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnologa e Innovacin Colciencias por la financiacin Grupo de investigacin en microbiologa agrcola y ambiental Universidad Popular del Cesar Laboratorio de microbiologa agrcola y ambiental, Laboratorio de ingeniera ambiental y al profesor Luis Francisco Ramrez por prestar las instalaciones.

A los Profesores Aracely Garca Cuan y Nelson Valero Valero A los investigadores Luz Nidia Rodrguez, Liliana Gmez y Eric Guevara. Al grupo de investigacin en microbiologa Agrcola y Ambiental.

CONTENIDO

pg.

RESUMEN ABSTRAC INTRODUCCIO PLANTEAMIENTO DE INVESTIGACION 2. JUSTIFICACION 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 4. MARCO TEORICO 4.1 GENERALIDADES Y NATURALEZA DEL CARBON 4.1.1 CARBON 4.1.2 CARBON DE BAJO RANGO 4.2 TRANSFORMACION MICROBIANA DEL CARBON DE BAJO RANGO 4.2.1 MECANISMOS DE BIOTRANSFORMACION DEL

13 15 17 19 21 23 23 23 24 24 24 26 28

31

CARBON 5. METODOLOGIA 5.1 MUESTREO 5.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 5.2.1 AISLAMIENTO 5.2.1.1 TECNICA 1: Enriquecimiento en medio de cultivo liquido. 5.2.1.2 TECNICA 2: Inoculacin de diluciones seriadas en agua peptonada directamente de la muestra. 5.2.1.3 TECNICA 3: Inoculacin directa de partculas de las muestras (mtodo impronta) 5.2.2 IDENTIFICACION DE LOS MORFOTIPOS FUNGICOS 5.3 PRUEBA CUALITATIVA DE SOLUBILIZACION DE 45 46 44 34 43 43 43 44 44

CARBON EN MEDIO SOLIDO 5.4 DETERMINACION DE SUSTANCIAS HUMICAS EN 46

MUESTRAS DE CARBON METEORIZADO PROCEDENTE DEL CERREJON 6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 AISLAMIENTO 6.1.1 SELECCIN Y DESCRIPCION DE MORFOTIPOS 48 48 53

FUNGICOS 6.2 SOLUBILIZACION DE CARBON EN MEDIO SOLIDO 6.3 EXTRACCION DE SUSTANCIAS HUMICAS A PARTIR DE CARBON METEORIZADO DEL CERREJON 7. CONCLUSIONES 8. RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFIA ANEXOS 61 63 64 72 54 60

LISTA DE GRAFICOS Y TABLAS pg. TABLA 1. Hongos reportados con capacidad biotransformadora de carbones de bajo rango. TABLA 2. Nmero de morfotipos fngicos aislados por en 48 29

relacin a las tcnicas de aislamiento ensayadas. GRAFICO 1. Nmero de morfotipos fngicos aislados en 49

relacin a las muestras y las tcnicas de aislamiento ensayadas. GRAFICO 2. Porcentaje de morfotipos fngicos aislados relacin a las muestras procesadas. TABLA 3. Actividad biotransformadora y referencias de las 37 cepas obtenidas a partir del aislamiento en Medio agar Carbn. 58 en 51

LISTA DE FIGURAS

pg. Fig. 1 Carbonificacin, diagnesis y metamorfismo Fig. 2 Localizacin mina El Cerrejn, tajo Patilla manto cuarenta de la mina el Cerrejn Fig. 3. Muestra 1. a) Tajo Patilla, b) Manto 40 y c) Muestra de carbn Fig. 4 Muestra 2: Zona de recoleccin de muestra SC00111. Fig. 4b: Acercamiento de la recoleccin de la muestra de suelo conservado. Fig. 5 Muestra 3: Muestra del interior de un tronco. Fig. 6 Muestra 4: rea de suelo deforestado por excavacin. Fig. 7 Muestra 5: rea de suelo de Banco. Fig. 8 Muestra 6: rea de suelo de Rizsfera en proceso de Rehabilitacin Fig. 9 Muestra 7: rea de suelo rehabilitado. Fig. 10Muestra 8: Suelo con rea de botadero Fig. 11 Muestra 9: Patio de almacenamiento de carbn. 11a submuestra SC00621. Y 11b submuestra SC00611 Fig. 12 Muestra10: Muestra de lodo carbonoso. Fig. 13 Muestra 11: Pila de carbn que es lavado. b. Gramneas creciendo sobre lodo carbonoso Fig. 14 Montaje de la tcnica Impronta para el aislamiento de hongos a partir de las muestras Fig. 15 Cultivo por enriquecimiento. Desarrollo de 50 45 42 42 40 40 41 38 38 39 39 37 37 25 36

actinomicetos inhibiendo crecimiento de morfotipos fngicos. Fig. 16 Crecimiento de las cepas aisladas en abundante, 10 MCM: a) 54

b) medio Fig. 17 Utilizacin de las partculas de carbn morfotipo HC23: Cladosporium sp. Fig. 18 Utilizacin de las partculas de carbn morfotipo HC25: Mucor sp. Fig. 19 Utilizacin y Solubilizacin de partculas de carbn, (Cs2 carbon tipo 2, Trat: seco) por morfotipo HC09: Paecilomyces sp. Fig. 20 Solubilizacin de partculas de carbn, (carbn tipo 2, Trat: seco) por morfotipo HC27 (Trichoderma sp.). 56 56 55 55

11

LISTA DE ANEXOS pg. Anexo1: Anlisis prximo, ltimo, mineral y elementos traza de carbn oxidado o de bajo rango extrado de la mina El cerrejn Guajira ANEXO 2: Descripcin de los morfotipos fngicos aislados a partir del crecimiento en Medio selectivo con Carbn. 75 73

12

RESUMEN

En el proceso de minera de carbn a cielo abierto se producen y acumulan altas cantidades de carbones de bajo rango (CBR), una importante caracterstica de estos materiales es su naturaleza orgnica, lo que hace posible que bajo ciertas condiciones puedan ser susceptibles al ataque de ciertos hongos y bacterias, esta caracterstica puede aprovecharse para potenciar la produccin de sustancias orgnicas solubles tiles como acondicionadores en suelos deteriorados. A nivel internacional es bien conocida y documentada la transformacin de carbn mediada por microorganismos, sin embargo a nivel nacional no se ha investigado en este tema. Teniendo en cuenta el anterior contexto, se desarrollo el presente trabajo cuyo propsito central fue la bsqueda y evaluacin del potencial metablico de hongos nativos con capacidad biotransformadora CBR generados en la mina El Cerrejn. El trabajo se desarrollo en 3 etapas: aislamiento de hongos nativos a partir de muestras de suelo influenciados por la presencia de carbn, identificacin y caracterizacin de hongos capaces de crecer en un medio de cultivo con CBR como nica fuente de carbono y finalmente evaluacin de la actividad biotrasformadora de carbn (ABC). Se obtuvieron 137

morfotipos de hongos con ABC a partir de 11 muestras de carbn y suelo influenciado por residuos de carbn, de los cuales 37 gneros de hongos presentaron buen crecimiento en el agar carbn, 3 de estos hongos lograron solubilizar partculas de carbn, con produccin de sustancias lquidas de color marn semejantes a las sustancias hmicas. A partir de lo anterior se seleccionaron las cepas que presentaron mejor utilizacin y solubilizacin del carbn, el morfotipo HC27 correspondiente a

Trichoderma sp., HC09: Paecilomyces sp., y HC19: Penicillium sp. Dentro de este contexto la investigacin logro demostrar que en zonas influenciadas por la extraccin de Carbn, en el rea geografa el Cerrejn, existen hongos nativos con capacidad biotransformadora de

13

carbones de bajo rango, utilizables para procesos de extraccin de sustancias hmicas aplicables al mercado de enmiendas orgnicas. Palabras claves: Carbn de bajo rango, sustancias hmicas,

microorganismos, utilizacin, Solubilizacin.

14

ABSTRAC

In the process of extracting coal open pit mines are produced and accumulate high amounts of low rank coals (CBR), an important feature of these materials is their organic nature, which makes it possible that under certain conditions may be susceptible to attack by certain fungi and bacteria, this feature can be used to boost the production of soluble organic substances in soil conditioners useful as damaged. At the international level is well known and documented the transformation of coal by microorganisms, but nationally has not been investigated in this topic. Considering the above context, this paper was developed, whose main objective was the search and evaluation of the metabolic potential of native fungi biotransformed CBR capacity generated in the mine "The Cerrejon. The work took place in 3 stages: isolation of native fungi from soil samples influenced by the presence of carbon, identification and characterization of fungi capable of growing in a culture medium with CBR as the sole source of carbon and finally assessment biotrasformadora activity of carbon (ABC). Through three different techniques of isolation were 137 fungal morphotypes with ABC, from 11 samples of soil influenced by coal and coal waste, of which 37 genera of fungi showed good growth in the Coal Agar, 3 of these fungi were able to solubilize coal particles, producing color liquid substances Maron like humic substances. From the above were selected strains showed better solubilization of coal use and the morphotype HC27: Trichoderma sp., HC09: Paecilomyces sp., And HC19: Penicillium sp. Within this context, research can show that in areas influenced by coal mining in the area the Cerrejn geography, native fungi are capable biotransformations low rank coals, usable
15

and extraction of humic substances amendments applicable to the markets organic.

16

INTRODUCCION

El carbn es un combustible fsil de consistencia slida, su proceso de formacin constituye una fosilizacin incompleta puesto que su estructura es bsicamente materia orgnica. La extraccin de carbn ha sido de gran importancia desde hace muchos siglos, con el inicio de la revolucin industrial su uso se elev al ser utilizado como fuente de energa, dada la disminucin de reservas de petrleo y gas natural, sin embargo, las

aplicaciones sugieren que se puede ir ms all del procesamiento de metales y produccin de qumicos, el uso y desarrollo de mecanismos para transformar el carbn desde su forma nativa hasta productos una va no contaminante y

gaseosos o lquidos, a travs de

econmicamente factible. El diseo de nuevos procesos de conversin, especialmente para carbones que presenten bajo poder calorfico requiere de conocimiento frente a las condiciones orgnicas, las vas por medio de las cuales se puede llevar a cabo la transformacin y las

propiedades del carbn, que dependen del grado de Carbonificacin lo que determinara el uso ms eficiente.

Numerosos estudios han demostrado que los carbones de bajo rango, son un importante material para la obtencin de sustancias hmicas, compuestos de gran importancia para la agricultura utilizados como abonos de origen natural. Las sustancias hmicas juegan un papel primordial en la fijacin de nutrientes en suelos disponibles para las plantas, son responsables por la agregacin de las partculas de suelo, contribuyen notablemente como agentes qumicos en la meteorizacin de rocas, ayudan en la transferencia de micronutrientes del suelo de la planta y como coadyudantes en procesos de fitorremediacion. Diferentes estudios han evaluado el potencial del uso de carbn para la obtencin industrial de estos compuestos, se ha probado el uso de tratamientos qumicos con agentes oxidantes como cido ntrico, perxido de

17

hidrgeno

permanganato

de

potasio.

Alternativamente,

otras

investigaciones han recopilado numerosas experiencias en procesos de transformacin biolgica del carbn mediante la actividad

biotransformadora de

hongos y bacterias, proceso viable debido al

contenido orgnico, presencia de espacios porosos, contenido de elementos importantes para la nutricin y principalmente su origen a partir de material vegetal.

Lo anterior

hace posible que el carbn sea un sustrato

para la

colonizacin y crecimiento por parte de microorganismos cuya capacidad metablica haga posible utilizarlo como fuete de energa y alimento.

18

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACION

El carbn es uno de los recursos ms importantes en la economa del pas, especficamente el Cesar y la Guajira, su extraccin se realiza a gran escala, esta actividad genera grandes cantidades de carbn comercial de alto poder calorfico, sin embargo, al realizarse el proceso de extraccin, se producen y acumulan cantidades significativas de un tipo de carbn con bajo poder calorfico, conocido como carbn de bajo rango. Se estima en Colombia una produccin anual de 49.5 millones de toneladas de carbn, de las cuales se exportan 45.6, es decir 3.9 millones de toneladas de carbn, no se exportan debido a su baja calidad y otros factores (Ministerio de Minas y Energa, INGEOMINAS, 2007). Este carbn es entonces considerado como un subproducto a partir del cual se podran generar usos alternos con valores agregados.

A nivel mundial se han explorado diferentes vas de aprovechamiento de estos materiales, por una parte esta ampliamente documentada la presencia de altos porcentajes de sustancias hmicas en carbn de bajo rango, de tal forma que las sustancias hmicas extradas qumicamente a partir del carbn constituyen gran parte del mercado de abonos y

enmiendas orgnicas para la agricultura y el manejo de suelos deteriorados. (Senesi, 1996; Chassapis, 2008).

Se han demostrado procesos de transformacin biolgica de carbn de bajo rango por medio de diferentes hongos y bacterias que actan sobre el carbn como sustrato y liberan fracciones solubles, entre las que se encuentran sustancias hmicas. Esta aproximacin ha motivado el estudio en torno a conversin del carbn procesos biotecnolgicos en que conlleven a la que

productos de valor agregado

posteriormente puedan ser utilizados en sntesis biotecnolgica . (Martin

19

et al, 2004). Desde comienzos de los aos 80

se ha investigado la

biotransformacin del carbn mediada por hongos y bacterias, se han dilucidado algunos de los mecanismos bioqumicos y factores que

favorecen el proceso. Fakoussa, (1981) fue el primero que reporto la actividad de ciertos microorganismos bituminosos de Alemania, capaces de utilizar carbones

Cohen y Gabriele (1982) demostraron por

primera vez que los hongos basidiomicetes (Polyporus versicolor y Poria montcola) tienen la capacidad de degradar carbn (lignito triturado) en medios mnimos, adicionando lignito como nica fuente de carbono. Aos ms tarde el reporte de hongos con capacidad biotransformadora de carbn aumento, deuteromicetes como Penicillium sp. Asperguillus sp. (Stewart, 1990); Fusarium sp., (Hlker et al. 1995) Neurospora sp., (Patel et al., 1996), Paecilomyces sp. (Ward 1985, Scott et al. 1986),

Trichoderma sp., (Hlker et al. 1997) y zigomycetes como Mucor sp. (Ward 1995).

Teniendo en cuenta el anterior contexto y bajo el marco de la magnitud de la minera del carbn en la regin del Cesar y la Guajira, se plantean interrogantes que direccionan el desarrollo de investigacin bsica en estos aspectos en Colombia. En el presente trabajo de investigacin se aborda la existencia de microorganismos nativos en reas influenciadas por la extraccin carbonfera, los cuales posiblemente presenten

actividad biotransformadora del carbn. Por tal razn es necesario iniciar trabajos bsicos de bioprospeccin para determinar el potencial de uso de la microbiota nativa para el aprovechamiento de carbones de bajo rango. As se plantea la siguiente pregunta de investigacin:

En zonas influenciadas por la extraccin de Carbn, en el rea biogeogrfica del Cerrejn, existen hongos nativos con capacidad biotransformadora de carbones de bajo rango?

20

2. JUSTIFICACIN

En la actualidad la extraccin y uso de carbn mineral representa un importante factor para la economa energtica de muchos pases.

Colombia es un importante productor y exportador de este recurso (Caldern, 2008).

Para la obtencin de carbn mineral en Colombia se utilizan como mecanismos de extraccin la minera de socavones y la remocin de suelo a cielo abierto, este ltimo es mtodo de explotacin utilizado en la mina El Cerrejn en el departamento de La Guajira (Caldern, 2008).

El carbn meteorizado se localiza en los mantos ms superficiales, de tal manera que para extraer el carbn de alto rango que se encuentra a mayor profundidad es necesario remover tambin los mantos superiores, generando as el carbn de bajo rango o meteorizado como subproducto.

A nivel mundial es comn el uso de carbones de bajo rango como materia prima para la obtencin de sustancias hmicas mediante la extraccin con lcali lo cual ha conllevado a una dinmica significativa en la produccin y comercializacin de extractos hmicos para aplicaciones en agricultura (Giannouli et al 2008). A pesar del importante papel de las sustancias hmicas para el manejo sostenible del suelo, sumado al

importante contenido de este tipo de sustancias reportado en la mayora de carbones residuales de bajo rango (hasta un 60%) y la actividad de biosolubilizacin por parte de ciertos microorganismos transformadores de materia orgnica del suelo, no se ha investigado la posibilidad de biotransformacin del carbn en el suelo, mediada por microorganismos con la consecuente liberacin de sustancias hmicas; hecho que puede constituir una estrategia en procesos de rehabilitacin de suelos

21

degradados o el mejoramiento de la fertilidad en aquellos que presenten bajo contenido de materia orgnica.

Por lo anterior y con la intencin de buscar un aprovechamiento biolgico de este tipo de residuos de la minera el carbn en Colombia, se hace necesario y conveniente iniciar estudios bsicos de aislamiento y caracterizacin de microorganismos con capacidad biotransformadora de carbn, generando las bases de futuras investigaciones que lleven a una evaluacin ms selectiva de microorganismos biotransformadores, que puedan ser objeto de desarrollos biotecnolgicos para aplicaciones a nivel de campo, para mejorar el contenido de materia orgnica en suelos

deteriorados por manejo agrcola inadecuado, suelos afectados por la explotacin minera o suelos en proceso de rehabilitacin. Principalmente en la regin del Caribe seco colombiano, donde la mayora de los suelos presentan cierto grado de deterioro y donde adems mayor actividad de la minera del carbn se desarrolla la

22

3. OBJETIVOS:

3.1 GENERAL

Aislar y caracterizar hongos con capacidad transformadora de carbn de bajo rango generado en la mina El Cerrejn Guajira.

3.2 ESPECIFICOS

Desarrollar tcnicas de aislamiento microbiano, que permitan la recuperacin de hongos nativos con capacidad transformadora de carbn de bajo rango.

Identificar hongos aislados a partir de carbn de bajo rango y muestras ambientales de suelo adyacente a mantos carbonferos y suelos con material vegetal en descomposicin.

Realizar ensayos cualitativos respecto a la transformacin de carbn de bajo rango, mediada por los hongos aislados.

23

4. MARCO TEORICO

4.1 GENERALIDADES Y NATURALEZA DEL CARBON:

4.1.1 CARBON

El carbn es un combustible fsil de consistencia slida y de color oscuro, su formacin data de la era carbonfera (entre 280 y 345 millones de aos aproximadamente), su proceso de formacin constituye una fosilizacin incompleta; su estructura es bsicamente materia orgnica. (World Coal Institute, 2005).

El carbn se form a partir de material vegetal maderable que se encontraba junto a cuerpos de agua o zonas litorales. En la evolucin del planeta se presentaron cataclismos y fenmenos naturales, que incidieron en el cubrimiento de esta gran cantidad de material vegetal por procesos de formacin geolgica. Despus de estos eventos, se gener el proceso de carbonificacin, dando origen a dos grandes etapas: la diagnesis, en la que tiene lugar la descomposicin de la materia orgnica por las bacterias, hasta formar la turba, el segundo proceso es metamorfismo, en el que se contina la carbonificacin por la accin del calor y la presin. La diagnesis consta de una primera etapa de descomposicin aerobia posteriormente una etapa de descomposicin anaerobia, en esta etapa se genera gran cantidad de cidos hmicos que fueron acumulndose, de esta forma se formo la turba, a su vez fue nuevamente cubierta por

sedimentos (arcilla y limo), en conjunto con el aumento de la temperatura, la presin y un largo proceso de evolucin geolgica se formaron los tipos de carbn que hoy se conocen. (World Coal Institute, 2005).

24

Fig. 1. Carbonificacin. Diagnesis y Metamorfismo. Fuente: Menndez, 2006

La extraccin de carbn ha sido de gran importancia desde hace muchos siglos, sin embargo, con el inicio de la revolucin industrial su uso se elev al ser utilizado como fuente de energa. En la actualidad las reservas de carbn se encuentran distribuidas en setenta pases con yacimientos aprovechables, sus principales usos estn destinados a la produccin energtica en centrales termoelctricas, seguida de su

utilizacin como potencial calorfico en calderas y en la industria de fundicin del hierro y del acero, otra pequea cantidad es usada en industrias varias. Algunas investigaciones sugieren que se puede ir ms all de este uso actual, su aprovechamiento depende del desarrollo de tcnicas para transformar el carbn desde su forma compleja hasta

productos gaseosos o lquidos, de manera que se puedan utilizar a travs de una va no contaminante y econmica. (Bumpus 1998; Hofrichter et al, 2000; Zagal et al, 2002; Contreras 2004; Hongli et al, 2006).

25

El carbn est clasificado dentro de unos rangos dependiendo de su porcentaje de carbono compacto, porcentaje de humedad y poder calorfico. De esta manera se encuentran los tipos de carbn con mayor poder calorfico: antracita, bituminosos (contienen elevado porcentaje de carbono, menos del 8% de materias voltiles y bajo contenido de

humedad.); y los carbones de menor poder calorfico, que poseen potencias calorficas bajas y elevado contenido de humedad (30-45%) y cenizas: (lignito, turba, leonardita). (World Coal Institute, 2006).

4.1.2 CARBN DE BAJO RANGO (CBR)

Los carbones de bajo rango, son aquellos cuyo poder calorfico bruto, en base hmeda sea menor a 6.390 Kcal/Kg., denominados sub bituminosos y los lignitos, son tpicamente ms blandos, fcilmente desmenuzables, opacos y con apariencia de tierra; se caracterizan por tener altos niveles de humedad y bajo contenido de carbono, y por consiguiente, poca energa. Los carbones de alto rango son tpicamente ms duros y resistentes. (Franco, 2004).

En consecuencia de lo anterior los carbones de bajo rango son considerados residuos de los procesos de extraccin carbonfera, pero gracias a la naturaleza orgnica y fsica, constituyen una fuente rica en sustancias hmicas. (Pea, 2005).

Las sustancias hmicas son utilizadas como abonos de origen natural, contribuyen al aumento de la capacidad de intercambio de iones del suelo; constituye parte fundamental del complejo absorbente regulador de la nutricin de la planta, asimismo a la conversin de formas no asimilables; (Chen et al 1990) juegan un papel primordial en la fijacin de nutrientes en suelos, disponibles para las plantas (Piccolo et al 1999), contribuyen notablemente como agentes qumicos en la meteorizacin de

26

rocas (Tejada et al 2007), ayudan en la transferencia de micronutrientes del suelo de la planta, aumenta la retencin de agua, aumenta las tasas de germinacin de las semillas y los porcentajes, como coadyuvantes en procesos de fitorremediacin de suelos contaminados y estimulan el desarrollo de poblaciones microbianas en los suelos.( Nutranetics, 2000; Yuan 2004; Sim Siong et al 2007).

Pocas experiencias en el estudio de la obtencin de sustancias hmicas a travs de carbones sub-bituminosos u oxidados, han resultado exitosas debido al costo del proceso y la variabilidad en los porcentajes que se logran extraer, (generalmente bajas cantidades), alrededor del 20% de material hmico extractable; por esta razn se ha probado el uso de

tratamientos qumicos como perxido de hidrogeno hidrgeno (H2O2) y permanganato de potasio (KMnO4), cuyos resultados no son promisorios, alternativamente se ha evaluado cido ntrico, lo cual ha mejorado el porcentaje de sustancias hmicas que se pueden extraer, sin embargo sigue siendo un tratamiento costoso. (Sim Siong et al, 2007)

El diseo de nuevos procesos de conversin, esencialmente para carbn de bajo poder calorfico, requiere un conocimiento de las alternativas experimentales por las cuales se puede llevar a cabo la transformacin del carbn para la obtencin de sustancias hmicas, las cuales mediante parmetros correctos de aplicacin pueden actuar como enmiendas orgnicas para el mejoramiento de las caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas del suelo. (NutraNetics Inc. 2000).

27

4.2 TRANSFORMACION MICROBIANA DEL CARBON DE BAJO RANGO

Existe una gran diversidad microbiana con caractersticas fisiolgicas que permiten el uso del carbn como fuentes energticas, dentro de los que sobresalen algunos hongos que producen un conjunto de enzimas extracelulares capaces de metabolizar la lignina, de la misma forma permiten degradar un diverso numero de compuestos orgnicos de composicin similar. (Montero et al, 2004), por ejemplo se han aislado microorganismos a partir de hidrocarburos, DDT (Carrillo et al, 2004), aplicando esta sustancia como nica fuente de carbono, obteniendo un limitado nmero de microorganismos capaces de degradar dicho compuesto, (Rivera et al, 2000).

La conversin biolgica del carbn de bajo rango por accin de microorganismos ha ganando recientemente la atencin cientfica y un inters sustancial por los procesos biolgicos que resultan en la

biosolubilizacin. El origen a partir de material vegetal del CBR, contenido de elementos importantes para la nutricin microbiana, elementos como nitrgeno, azufre, hierro, carbono, oxigeno e hidrogeno y elementos trazas, el contenido orgnico y acuoso, hacen que el carbn sea un sustrato para la colonizacin y crecimiento de microorganismos, cuyos procesos biolgicos puedan utilizarlo como fuente de energa. (Holker et al, 2002; Yin et al 2009;)

Existan

pocos estudios en la transformacin de carbones sub-

bituminosos, mediada por microorganismos (Hofrichter et al, 2000). Fakoussa (1981) fue el primero que reporto microorganismos capaces de utilizar carbones bituminosos de Alemania como nico recurso de carbono y energa, el mismo en 1990 evalu levaduras y mohos enriquecidas con carbn tipo hulla como fuente de carbono, observando

28

un crecimiento exponencial lento y la fijacin de la hulla en las hifas jvenes del hongo (Bumpus 1998; Fakoussa et al, 1999; Hofrichter et al, 2000; ), Cohen y Gabriela (1982) encontraron dos hongos: Trametes versicolor y Poria monticola, capaces de solubilizar cantidades

sustanciales de carbn lignito la estructura del lignito y la lignina poseen algunas semejanzas y se sugera que la solubilizacin observada del lignito era responsabilidad del sistema enzimtico de estos hongos,

reportados como degradadores de lignina. (Cohen y Gabriele, 1982; Pyne, 1987; Bumpus, 1998). Posteriormente se han reportado nuevos hongos y bacterias capaces de solubilizar carbones seleccionados, Stewart et al, (1990), reportaron dos gneros de hongos Cuninghamella sp. Y Penicillium sp. con actividad pretratados en placas de agar. sobre carbones sub-bituminosos

Existen varios microorganismos que generalmente no son asociados con la capacidad de degradar lignina, (Tabla 1) pero si capaces de solubilizar carbones de bajo rango como el lignito, por ejemplo: Aspergillus sp., Penicillium sp. y Candida sp. Mucor sp. Paecilomyces sp., Alternaria sp., Phoma sp. fueron aislados de lignito, expuesto y no a pretratamientos qumicos. (Scott et al, 1986; Stewart et al, 1990).

TABLA 1. HONGOS REPORTADOS CON CAPACIDAD BIOTRANSFORMADORA DE CARBONES DE BAJO RANGO Tipo De Carbn Microorganismo Referencias Carbn tipo lignito Trametes versicolor Cohen & Gabrielle Dakota del Norte (1982) Torzilli & Isbister (1994) Carbn tipo lignito Candida sp. Scott et al, (1986) Dakota del Norte Aspergillus sp. Paecilomyces sp. Penicillium waksmanii ML20 Sporothrix sp. Trametes versicolor 29

Carbn tipo lignito Mississippi

Aspergillus sp. Candida sp. Penicillium waksmanii ML20 Trametes versicolor Cunninghamella sp. sub- Penicillium sp. Cunninghamella sp. sub- Penicillium sp. Cunninghamella sp. Phanerochaete chrysosporium

Scott et al, (1986)

Carbn tipo lignito Carbon bituminosos Pennsylvania Carbon bituminosos Carbones subbitumuminosos Nigerian Carbn tipo lignito Alemania Carbon tipo lignito Alemania Carbones subbituminosos y lignitos Alemania Carbones subbituminosos y lignitos Carbn tipo lignito

Stewart et al, (1990) Stewart et al, (1990)

Stewart et al, (1990)

Achi (1993)

Alternaria sp. Trichoderma viride Aspergillus terreus Paecilomyces spp. Mucor lausannesis Fusarium oxysporum Trichoderma artroviride Penicillium decumbens

Hofrichter et al, (1997) Reiss, (1992) Ward (1985)

Hlker et al, (1997, 1995, 1999) Hongli et al, (2005)

Carbn tipo lignito

Carbn tipo lignito Carbn tipo lignito

Trichoderma sp., Cladosporium sp., Penicillium sp. Paecilomyces inflatus Paecilomyces lilacinus Phoma sp. Alternaria sp.

Pokorny et al, (2005) Tao et al, (2009) Kluczek et al, (2005) Rezacova et al, (2006)

30

4.2.1 MECANISMOS DE BIOTRANSFORMACIN DEL CARBN

Los mecanismos por los cuales los microorganismos transforman el carbn de bajo rango han sido objeto de atencin considerable. Informes iniciales concluyen que los principales mecanismos de transformacin biolgica del carbn estn asociados a procesos enzimticos, no enzimticos, la accin de alcalina y agentes quelantes estos dos ltimos actividad en la mayora de bacterias y actinomicetos. (Cohen et al, 1987, Pyne et al, 1987; Steinbchel 2001)

Actualmente se conocen 2 mecanismos importantes que implican la transformacin del carbn de bajo rango: la solubilizacin y la depolimerizacin. La solubilizacin del carbn es un proceso que conlleva a la formacin de un lquido de color oscuro, a partir de carbn en estado slido, es un proceso que disuelve el carbn preferiblemente a valores de pH (7- 10) y se ha sugerido que se debe a la formacin de microbiana de sustancias alcalinas, agentes quelantes o surfactantes liberados al medio extracelular (Willmann, 1997; Iffet et al, 2006). Se ha comprobado que ciertas enzimas hidroliticas pueden desencadenar procesos de

solubilizacin, mediados principalmente por peroxidasas, lacasas, fenoloxidasa y Mn peroxidasa. (Wondrack 1989), se ha demostrado que diversos hongos degradadores de lignina, principalmente los

basidiomicetos, producen estas enzimas extracelulares que participan en el proceso de solubilizacin de carbn de bajo rango. (Pyne et al 1987; Bumpus, 1988; Wise, 1990; Steinbchel 2001). (Wondrack, 1989).

Generalmente, la solubilizacin del carbn no resulta en una disminucin sustancial del peso molecular de las sustancias hmicas del carbn, evidenciado en la no presencia de monmeros en los productos de la solubilizacin; por lo contrario, se ha observado que puede estar

31

acompaada con reacciones de polimerizacin como el mecanismo de disminucin del peso molecular del carbn. (Bumpus, 1998).

Agentes quelante como el ion de oxalato rompen los enlaces inicos entre las macromolculas del carbn de bajo rango, tornndolas solubles al agua. Hongos como Aspergillus sp. Y Penicillium sp. Son gneros que secretan iones de oxalato, por lo cual muestran actividad solubilizadora de carbn (Bumpus 1998; Cohen et al, 1990; Fredrickson et al, 1990). Los biosurfactantes son surfactantes producidos extracelularmente o como parte de la membrana celular de bacterias y hongos. Se ha observado que la produccin de biosurfactantes est relacionada con la

solubilizacin de carbn (Yuan et al, 2006). La solubilizacin del carbn mediada por sustancias alcalinas ionizan los grupos funcionales cidos del carbn de bajo rango, generando la solubilizacin. (Ralph et al, 1997).

La solubilizacin microbiana del carbn se encuentra condicionada al rango del carbn y el grado de oxidacin. Se ha demostrado que

carbones como el lignito y la leonardita son ms susceptibles a la solubilizacin que carbones de alto rango como el subbituminoso y bituminoso, debido a que a medida que aumenta el rango del carbn disminuye el contenido de oxigeno dificultando la accin microbiana sobre el carbn. (Wise, 1990).

Otros estudios han demostrado que tras la solubilizacin ocurre una reduccin en el tamao molecular de los compuestos solubilizados, a este fenmeno se ha descrito como depolimerizacin aplicndolo tanto al

carbn como a las macromolculas derivadas (cidos hmicos), se ha comprobado que este es un proceso exclusivamente enzimtico que por el contrario de la solubilizacin ocurre a valores bajos de pH( 3-6) y da como resultado el clivaje de los enlaces de las macromolculas,

permitiendo la formacin de sustancias de colores amarillentos (similares

32

a cidos flvicos) con bajo peso molecular (Bumpus, 1998; Hofrichter, 2000).

La intervencin de enzimas en los procesos de depolimerizacin fueron reportados inicialmente por Wondrak (1989), informo que la lignino peroxidasa de Phanerochaete chrysosporium inhibe la capacidad para mediar una sustancial desaparicin de macromolculas inicialmente

solubilizadas del carbn slido, (Bumpus, 1998). Ms recientemente Ralph et al, (1999) reporto dos hongos Tremellosus merulis y Tephropora erenniporia, polimerizadores de la macromolcula de carbn, por accin de las enzimas Mn peroxidasa y lacasa. (Willmann, 1997; Iffet et al, 2006)

Existe otro fenmeno llamado utilizacin, por el cual microorganismos (bacterias hongos filamentosos y levaduras) presentan la capacidad para crecer sobre el carbn utilizndolo como sustrato, aprovechando

compuestos biodisponibles ya sea liberados espontneamente desde las partculas de carbn o tomados mediante procesos oxidativos, para su crecimiento; en algunos casos la utilizacin del carbn generalmente esta acompaada por procesos de solubilizacin. (Hofrichter, 2000). Esta

capacidad se ha observado en hongos como Trametes versicolor y Poria monticola (Ralph et al, 1997)

Adems de procesos hongos

de solubilizacin y depolimerizacin, algunos

tiene la capacidad de tomar los productos solubles y generando en el medio

metabolizarlos en el interior de las clulas

extracelular una prdida en la cantidad de material solubilizado, en este caso el proceso de es llamado biodegradacin. (Ralph, 1997)

33

5. METODOLOGIA

Para la obtencin de microorganismos biotransformadores de carbn meteorizado, se recolectaron muestras de carbn, suelos adyacentes a mantos carbonferos y suelos con material vegetal en descomposicin y diferentes muestras ambientales caracterizadas por presentar alta generado en diferentes

influencia y aportes de material carbonoso

procesos, como lavado, almacenamiento, extraccin y transporte de carbn, de la mina El Cerrejn.

Para el aislamiento de hongos en general Se probaron 3 tcnicas: 1) Enriquecimiento previo en medio de cultivo lquido (contenido: extracto de levadura (2g/l), extracto de malta (3g/l), glucosa (1.5g/l) , medio mnimo de nutrientes inorgnicos y carbn (1g/l)), inoculacin en medio carbn modificado (MCM), 2) inoculacin de diluciones seriadas en agua peptonada directamente de la muestra, sin previo enriquecimiento y 3) Inoculacin directa de partculas de suelo o carbn (mtodo de impronta) en la superficie MCM. Se probaron dos medios de cultivo selectivos con el carbn de bajo rango procedente del Cerrejn como nica fuente de carbono: 1) medio mnimo de nutrientes inorgnicos de composicin:

((NH4) SO4: 0.5g/L; KH2 PO4: 10g/L; MgSO 4:7H2O: 0.2g/L; CaCl2:0.1g/L). (Rivera et al, 2000) con Carbn mineral, para este medio se probaron concentraciones de carbn en polvo al 1% y 5%. 2) medio agar lignito de composicin: 1% p/Vol. agar-agar, 7% p/Vol. lignito pulverizado, agua destilada, el carbn pulverizado fue disuelto con el agar fundido. (Cohen et al, 1982). Para todos los medios se ajusto el pH a 5.5 con acido

clorhdrico 0.1M. Se realizaron ensayos preliminares de las diferentes tcnicas y medios de cultivo y se seleccion la tcnica y el medio que permiti recuperar mayor diversidad de morfotipos de colonias fngicas para el proceso definitivo de aislamiento de hongos a partir de las muestras de suelo y carbn.

34

Los hongos aislados en los medios selectivos con carbn como nica fuente de carbono (MCM) fueron sometidos a pruebas de solubilizacin de 2 tipos de partculas de carbn (CT1- CT2), las partculas fueron

sometidas a 3 tipos de tratamiento (esterilizacin en seco, esterilizacin en hmedo y tratamiento qumico con cido ntrico al 0.8M).

Fueron identificados mediante el uso de claves taxonmicas de

Barnett;

a partir de los cultivos puros se examinaron caractersticas microscpicas y macroscpicas. Para el anlisis macroscpico se tuvo en cuenta textura, borde, color, topografa y pigmentacin en el reverso. Para el examen microscpico de las caractersticas estructurales del hongo se realizaron montajes en azul de lactofenol y observacin en el microscopio compuesto y teniendo en cuanta el tipo de hifa y el tipo de estructura reproductiva (Franco 2005; Gonzales 2005).

5.1 MUESTREO El muestreo se realiz en la mina El Cerrejn situado en la pennsula de la Guajira parte nororiental de Colombia, con una extensin de 69.000 hectreas, en uno de los cinco frentes de extraccin de carbn de la mina denominado Tajo Patilla localizado a 110545.54 latitud norte y 724066.55 longitud oeste en el departamento de la Guajira (Figura 2). El relieve de esta zona ica es plano y ondulado y un poco menos rido, que el extremo norte de la pennsula, de altas temperaturas tropicales que oscilan entre 27 y 30C, alteradas por los vientos marinos que llegan del norte del Caribe. (Caldern, A. 2008).

35

Fig 2. Lugar: Localizacin mina El Cerrejn, tajo Patilla manto cuarenta de la mina el Cerrejn

De cada sitio de muestreo se tom una muestra integrada de 3 Kg. conformada por tres submuestras de1Kg, tomadas entre los 5 y 20 cm de profundidad, a una distancia de 20 metros entre s, llas muestras colectadas fueron tomadas con una pala metlica de jardinera previamente esterilizada, las 3 submuestras fueron mezcladas

conformando una muestra integrada, almacenadas en bolsas plsticas de cierre hermtico, rotuladas y transportadas en una nevera de icopor con hielo, hasta el laboratorio de microbiologa agrcola y ambiental de la Universidad Popular del Cesar, donde fueron almacenadas a temperatura de refrigeracin (0 - 5C) para su posterior procesamiento.

A continuacin se describen en detalle las once muestras colectadas:

36

Muestra 1 (Carbn) Cdigo de muestra: SC000 Muestra colectada en el frente de extraccin de carbn llamado Tajo Patilla, en el manto 40 (Fig. 3a -3b) que corresponde a una capa de carbn de bajo rango o carbn meteorizado (Fig. 3c).

Fig. 3a: Lugar: Tajo Patilla.

Fig. 3b: Detalle del manto 40.

Fig. 3c: Muestra de carbn.

Muestra 2 (Suelo conservado) Cdigo de muestra: SC00111 Muestra correspondiente al horizonte O de un suelo conservado adyacente al frente de extraccin Tajo patilla, con vegetacin nativa de bosque seco tropical de aproximadamente 2 hectreas (ha) (Fig. 4a), de color caf oscuro con presencia de material orgnico de origen vegetal y actividad evidente de mesofauna. (Fig. 4b) Fig. 4a Fig. 4b

Fig. 4a: Zona de recoleccin de muestra SC00111. Fig. 4b: Acercamiento de la recoleccin de la muestra de suelo conservado. 37

Muestra 3 (rea interior tronco) Cdigo de muestra: SC00112 Muestra correspondiente al interior de un tronco en descomposicin. (Fig. 5) No se evidencia la presencia de races, textura esponjosa, de color caf claro caracterstico del humus.

Fig. 5: Muestra del interior de un tronco

Muestra 4: (rea de suelo deforestado para excavacin) Cdigo de muestra: SC00121 Muestra integral correspondiente al suelo en el borde del rea conservada, de aproximadamente 2 ha, bajo el efecto de la

mecanizacin. Color caf oscuro. Con caractersticas de horizonte O. (Fig. 6)

Fig. 6: rea de suelo deforestado por excavacin

38

Muestra 5: (suelo de Banco) Cdigo de muestra: SC00201 Muestra integrada correspondiente al horizonte O de un suelo de Banco intervenido sin vegetacin y de uso agrcola hace 20 aos atrs, con aproximadamente 20 ha, material de color caf oscuro, con presencia de races, algo de mesofauna y relativamente hmedo. (Fig. 7)

Fig. 7: rea de suelo de Banco

Muestra 6: (rea de suelo de Rizsfera en proceso de rehabilitacin) Cdigo de muestra SC00301 Muestra de Rizsfera de Bledo (Amaranthus blitoides), verdolaga (Portulaca oleracea) y gramnea (Pogonatherum paniceum), de color caf claro amarillento, compacta, con presencia de pocas races, sin materia orgnica y poca o nula mesofauna, en zona de rehabilitacin de 1 ao. (Fig. 8)

Fig. 8: rea de suelo de Rizsfera en proceso de rehabilitacin

39

Muestra7: (suelo rehabilitado) Cdigo de muestra: SC00401 Suelo de bosque rehabilitado de hace 15aos, extensin de 40 ha, con presencia de restos de materia orgnica seca en descomposicin y vegetacin. (Fig. 9)

Fig. 9: rea de suelo rehabilitado.

Muestra 8: (suelo influenciado por carbn en rea de botadero de material estril) Cdigo de muestra: SC00501 Suelo hmedo con rea de botadero estril, pero sin rehabilitacin, solo regeneracin natural 10 a 15 aos. Color caf amarillento. Se observan fragmentos de materia orgnica vegetal, con flora dominante de gramnea. Superficie de 15 ha y una profundidad de la muestra de 15 cm. (Fig. 10)

Fig. 10: Suelo con rea de botadero

40

Muestra 9: (Material estril con partculas de carbn) Cdigo de muestra: SC00611+SC00621

Muestra colectada en un talud donde esta dispuesto un material mineral compuesto por rocas pulverizadas y fragmentos slidos de diferente tamao denominado Estril, extrado en el proceso de excavacin y

acumulado para ser utilizado como base para la rehabilitacin posterior del suelo. Se encuentra localizado frente a un patio de almacenamiento de carbn (Fig. 11) recibiendo constantemente partculas de carbn de diferente tamao; se ha desarrollado un sustrato sobre el cual pueden crecer plantas de pasto Buffel (Cenchrus ciliaris). Se tomaron submuestras del material localizado en el lmite entre el

patio de almacenamiento de carbn y el talud de suelo en rehabilitacin (SC00621) (Fig. 11a) y submuestras suelo adyacente y rizsfera de

plantas del Pasto Buffel (Cenchrus ciliaris) que est creciendo (SC00611) (Fig. 11b). Las muestras fueron mezcladas para obtener una muestra homognea (SCOO611- 621).

Fig. 11a

Fig. 11b

Fig. 11: Patio de almacenamiento de carbn. 11a submuestra SC00621. Y 11b submuestra SC00611.

41

Muestra 10 (Lodo carbonoso) Cdigo de muestra: SC00701 Corresponde a fango de color negro, denso, textura plstica y

anaerobio. Este lodo se forma mediante el proceso de sedimentacin de materiales suspendidos en el agua residual utilizada en un patio de lavado de carbn, con apariencia de Humedal. Sobre este material se desarrollan poblaciones de plantas gramneas enea (Typha latifolia) y Pasto Buffel (Cenchrus ciliaris).

Fig. 12: Muestra de lodo carbonoso.

Muestra

11

(Rizsfera

de

gramneas

Enea

(Typha

latifolia)

desarrolladas sobre lodo carbonoso) Cdigo de muestra: SC00702+ SC00703

Muestra recolectada de rea de sedimentos procedente de lavado de carbn, un semihumedal con predominio de plantas gramneas Enea (Typha latifolia), con textura de plastilina, de aproximadamente 15 ha. Se tomaron porciones de races y sustrato adherido fuertemente a las races.

42

Fig. 13a: Pila de carbn que es lavado y hacia el frente los sedimentos depositados por el agua residual proveniente del lado y sobre ellos creciendo 5.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS parches de gramneas (Typha latifolia ). Fig. 13b: Gramneas creciendo sobre lodo carbonoso

5.2.1 AISLAMIENTO

Para el aislamiento de hongos se probaron 3 tcnicas: 1. Enriquecimiento previo en medio de cultivo lquido, 2. inoculacin de diluciones seriadas en agua peptonada directamente de la muestra, sin previo

enriquecimiento y 3. Inoculacin directa de partculas de suelo o carbn (mtodo de impronta) en la superficie MCM.

5.2.1.1 Tcnica 1: Enriquecimiento en medio de cultivo lquido En frascos con 100ml de medio cultivo lquido enriquecido se sembr 1 g de cada muestra, ms un control (100 ml del medio de cultivo liquido sin inoculo). Estos cultivos se mantuvieron en agitacin a 300 r.p.m. por 8 das a 25C. (Observacin diaria durante y despus de los ocho das hasta observar crecimiento micelial). Posteriormente se realizaron diluciones 10-5 y 10-6, adicionando 0.1ml de las diluciones en MCM solido

43

al

5%. Incubacin a 25C por ocho das (hasta observar colonias

fngicas). 5.2.1.2 Tcnica 2: Inoculacin de diluciones seriadas en agua peptonada, directamente de la muestra

Por la tcnica de diluciones seriadas se procesaron 11 observndose crecimiento de colonias fngicas.

muestras:

Se tom 0.1 g de las muestras, para la realizacin de una serie de diluciones hasta 10-6 (agua peptonada al 1%), adicionando 0.1ml de las diluciones 10-2 10-4, 10-6, por ser las ms representativas en los ensayos preliminares, con tres replicas en medio especifico Agar MCM al 1% y 5%. Se incub a 25C por 8 das (Observacin diaria, durante y despus de los ocho das hasta observar crecimiento fngico. 5.2.1.3Tcnica 3: Inoculacin directa de partculas de las muestras (mtodo de impronta).

Con la ayuda de una pinza estril se tomaron pequeas partculas de las 11 muestras y se inocularon en cajas de Agar MCM al 1% y 5% (Fig. 14). Se incubaron a 28C por ocho das ms los controles negativos de cada Agar (1-5% de carbn sin inoculo). (Observacin diaria durante y despus de los ocho das hasta observar crecimiento fngico)

44

Identificacin Carbn 1% Prueba de transformacin de carbn Carbn 5%

Fig. 14: Montaje de la tcnica Impronta para el aislamiento de hongos a partir de las muestras.

5.2.2 IDENTIFICACION DE LOS MORFOTIPOS FUNGICOS De las tres tcnicas de aislamiento utilizadas se seleccionaron las colonias ms representativas, teniendo en cuanta su crecimiento (escaso, moderado, abundante) de las muestras ambientales procesadas. Las colonias seleccionadas fueron repicadas hasta obtener cultivos axenicos en medio Saboreaud Dextrosa Agar. A partir de los cultivos puros se examinaron caractersticas microscpicas y macroscpicas, teniendo en cuenta textura, borde, color, topografa y pigmentacin en el reverso Y para el examen microscpico de las caractersticas estructurales del hongo se realizaron montajes en azul de lactofenol para hongos miceliares, teniendo en cuanta el tipo de hifa y el tipo de estructura reproductiva y para hongos levaduriformes tincin de GRAM. (Franco 2005; Gonzales, 2005). 45

5.3 PRUEBA CUALITATIVA DE SOLUBILIZACION DE CARBN EN MEDIO SOLIDO

En Agar extracto de malta se inocularon esporas o micelio de los hongos seleccionados del aislamiento, se incubaron a temperatura de 28C por ocho das. Pasados los ocho das, y observado un crecimiento de la colonia por toda la caja, con ayuda de una pinza estril se colocaron sobre la superficie partculas de carbn (CT1-CT2), tamizadas a travs de un tamiz 2.36mm de dimetro de poro, las partculas fueron sometidas a tres pretratamientos: 1) Esterilizacin a vapor (121C/15lb por 15 minutos), con el fin de hidratar las partculas de carbn. (Pyne et al, 1987). 2) Esterilizacin en seco (a 100C por 2 horas), conservando su estado natural. 3) Pretratamiento con un compuesto qumico (cido ntrico 0.8M) por 10 minutos y posterior lavado con agua destilada estril, hasta obtener en el agua producto del lavado un pH 7.0 (Modificaciones wise 2001). Como control se colocaron partculas de carbn (1 y 2) con los 3 pretratamientos en una placa de Agar malta sin crecimiento fngico. Las cepas con las partculas de carbn pretratadas y el control se incubaron a 28C por 15 das, observando cada tres das la presencia de gotas de color caf oscuro, que evidencian el proceso de solubilizacin transformando el carbn de estado slido a lquido.

5.4 DETERMINACIN DE SUSTANCIAS HMICAS EN MUESTRAS DE CARBN METEORIZADO PROCEDENTE DEL CERREJN

Para proceder a realizar los ensayos de biotransformacin del carbn por parte de los microorganismos asilados, es conveniente comprobar la presencia de sustancias hmicas solubles en el carbn que se desea utilizar para los ensayos, con este propsito se realiz la extraccin de sustancias hmicas, tomando como base el procedimiento de la

Internacional Humic Substances Society, se probaron dos extractantes

46

(KOH y NaOH) en diferentes concentraciones (0,1M, 0,5M y 1M), se probaron diferentes relaciones entre el volumen de extractantes y cantidad de carbn, tiempos de extraccin y temperaturas .

47

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 AISLAMIENTO A partir de las siembras por las tres tcnicas de aislamiento y las 11 muestras procesadas se aislaron 137 morfotipos fngicos, 42 morfotipos procedentes de la tcnica por enriquecimiento, 80 morfotipos procedentes de la tcnica diluciones seriadas y 15 morfotipos a partir de la tcnica impronta.

En la tabla 2 se detalla el nmero de morfotipos aislados para cada muestra, teniendo en cuenta la tcnica de aislamiento utilizada. Muestra SC000 SC00111 SC00112 SC00121 SC00201 SC00301 SC00401 SC00501 SC00611+621 SC00701 SC00702+703 Tcnica de aislamiento Enriquecimiento Diluciones 7 12 6 15 2 12 3 4 2 3 4 5 4 10 5 3 1 7 5 5 3 4

Impronta 3 4 1 0 2 0 0 2 1 0 2

Total 22 25 15 7 7 9 14 10 9 10 9

Tabla 2: Numero de morfotipos fngicos aislados por en relacin a las tcnicas de aislamiento ensayadas

48

NUMERO DE MORFOTIPOS FUNFICOS CON RELACION A AISLAMIENTO LAS MUESTRAS Y LA TECNICA UTILIZADA 16 14 12 10 8 6 4 2 0

NUMERO DE MORFOTIPOS FUNGICOS VS TECNICAS DE

MORFOTIPOS FUNGICOS

Muestras

Tec. Preenriquecimiento Tec. Diluciones seriadas Tec. Impronta

Grafico1: Numero de morfotipos fngicos aislados en relacin a las muestras y tcnicas de aislamiento ensayadas

En el grafico 1 se observa que entre

las tcnicas empleadas la tcnica de

(preenriquecimiento, diluciones seriadas e impronta)

diluciones seriadas fue ms eficiente, para aislar morfotipos fngicos con actividad biotransformadora de carbn. Esto se relaciona con las

condiciones nutricionales del medio adicionado a los frascos y la agitacin constante de los mismos en la tcnica preenriquecimiento al aumentar el desarrollo de actinomicetos, que inhibieron el crecimiento de los hongos, observado en las placas de Agar Carbn inoculadas con alcuotas del cultivo (Fig. 15). Es ampliamente conocido que los actinomicetos producen una gran diversidad de metabolitos antifuncos (matanlicos, clorofrmicos), que inhiben el (Tanaca et al, 1996). crecimiento de morfotipos fngicos.

Al realizar la siembra por la tcnica diluciones seriadas la cual permite reducir la carga microbiana de una muestra, permiti el aislamiento de 49

morfotipos

fngicos

separados,

reduciendo

el

crecimiento

de

actinomicetos en el medio, esto relaciona el mayor aislamiento de morfotipos de hongos.

El bajo nmero de morfotipos aislados por la tcnica de impronta puede relacionarse a la falta de enriquecimiento antes de su siembra en placa y a la competencia que se genera en su mayora por hongos filamentosos, que crecen en la superficie de la caja e inhiben el crecimiento de otros gneros, adems esta tcnica es para micelio activo, as que las esporas no se expresan lo que si ocurre cuando se trabaja con diluciones.

Fig. 15: Cultivo por preenriquecimiento. Desarrollo de actinomicetos inhibiendo crecimiento de morfotipos fngicos.

50

PORCENTAJE DE MORFOTIPOS FUNGICOS AISLADOS VS MUESTRAS PROCESADAS

SC000 SC00111 SC00112 SC00121

SC00201
SC00611+621

SC00301
SC00701 7% 7% 7% 7% 10%

SC00401
SC00702+703 16%

SC00501

18%

7% 5%

5% 11%

Grafico2: Porcentaje de morfotipos fngicos aislados en relacin a las muestras procesadas.

Los 137 morfotipos fngicos aislados corroboran lo planteado por Lieske en 1982; al describir una amplia gama de microorganismos en zonas mineras. En el grafico 2 se observan los porcentajes correspondientes al nmero de morfotipos aislados por muestra, de las cuales las que mayor numero de morfotipos fngicos aportaron corresponden a las muestras: SC000 (muestra de carbn), de la cual se obtuvo morfotipos fngicos correspondientes al 16%; SC00111 22

(suelo

conservado), 25 morfotipos fngicos correspondientes al 18%; SC00112 (interior de un tronco), 15 morfotipos fngicos correspondientes al 11% y SC00401 (suelo rehabilitado), 14 morfotipos fngicos correspondientes al 10%.

En la muestra de suelo rehabilitado (SC00401) y suelo conservado (SC00111), con vegetacin y materia orgnica, es natural la presencia de microorganismos. La obtencin de mayor cantidad de morfotipos fngicos en las muestras anteriores se puede explicar por varios factores. La

presencia de plantas en las zonas de muestreo crea una relacin microorganismo y planta al est ser la principal fuente de sustratos energtico al suelo, del que los microorganismos su aprovechan cuando 51

se encuentran en reas prximas a las races (Acua et al, 2006). En segundo lugar la descomposicin y mineralizacin de materia orgnica por microorganismos, que de una u otra forma se incorpora al suelo dando lugar a reserva de nutrientes para el desarrollo de vida vegetal y metabolismo microbiano. (Bautista et al, 2004).En relacin a lo anterior, factores fsico como la temperatura, contenido de humedad y zonas con influencia de los procesos de extraccin mineras pueden favorecer el desarrollo de microorganismos con actividad transformadora de carbn.

En la muestra procedente del interior de un tronco (SC00112), de acuerdo a su descripcin presenta caractersticas semejantes a humus, adems del contenido lignolitico del tronco. Esto se puede relacionar con el nmero de morfotipos aportados por esta muestra, teniendo en cuenta que el humus es el producto de procesos de transformacin de la materia orgnica con la accin de una intensa actividad microbiana. El rea donde se encontraba el tronco, existe presencia de vegetacin, representada por el crecimiento de plantas superiores, lo que favorece el crecimiento de microorganismos, adems los procesos relacionados con la degradacin de la lignina, permitieron el desarrollo de morfotipos fngicos que lograran utilizar su capacidad al degradar lignina, para utilizar el carbn como fuente de energa.

La muestra correspondiente a Carbn de bajo rango (SC000), aporto morfotipos fngicos, relacionado a su origen a partir de material vegetal, contenido de elementos importantes para la nutricin, y elementos trazas, el espacio poroso y contenido acuoso, hacen que el carbn sea un

sustrato para la colonizacin y crecimiento de microorganismos altamente adaptados a las condiciones del carbn, cuyos procesos biolgicos

pueden utilizarlo como fuente de energa. (Holker et al, 2002; Yin et al, 2009)

52

Las muestras a partir de las cuales se aislo el mayor porcentaje de morfotipos de hongos contienen reservas orgnicas, material vegetal, propiedades fsicas como humedad y elementos nutricionales mas disponible de acuerdo a las caractersticas visibles para su descripcin (en comparacin con las muestras restantes), a partir de los cuales poblaciones fngicas afectadas directa o indirectamente por la actividad minera, obtienen nutrientes y condiciones necesarias para activar su metabolismo, en procesos de transformacin del carbn de bajo rango, adems los hongos representan el 70% de la poblacin microbiana y constituyen el segundo de los dos grandes grupos de microorganismos del suelo (Will, 1992).

6.1 SELECCIN Y DESCRIPCION DE MORFOTIPOS FUNGICOS De las 137 colonias obtenidas a partir de las muestras de carbn y

ambientales fueron seleccionadas 37 cepas, de acuerdo a su crecimiento en MCM (abundante y medio), incluyeron gneros: Asperguillus sp,

Mucor sp, Cladosporium sp, Trichoderma sp, Paecilomyces sp y levaduras evidenciaron porcentajes ms altos de crecimiento y utilizacin de carbn como fuente carbono para desarrollar su metabolismo enzimtico, reiterando lo descrito por Fakoussa (1981; 1988; 1990), al reportar hongos filamentosos y levaduras capaces de utilizar carbn tipo hulla.

53

a b

Fig. 16: Crecimiento de las cepas aisladas en medio.

MCM: a) abundante, b)

Las caractersticas macroscpicas observadas en los morfotipos fngicos aislados consisten en colonias con crecimiento micelial abundante, de texturas pulverulenta, algodonosa y aterciopelada y topografa aplanada, verrucosa, umbonada, con color del micelio amarillas, blancas, verdes y grises. (Ver anexo 2).

6.2 SOLUBILIZACION DE CARBON EN MEDIO SOLIDO De las 37 cepas seleccionadas por presentar crecimiento en MCM

utilizando el carbn como fuente nica de carbono y energa; 24 morfotipos de hongo transformaron el carbn mediante el mecanismo de utilizacin (Fig. 17a y b; Fig. 18a y b); y solo 3 morfotipos fngicos solubilizaron las partculas de carbn, evidenciado por la presencia de exudados color caf en las zonas de crecimiento del hongo sobre las partculas de carbn. (Fig. 19a y b; Fig.20a y b).

54

Partcula de carbn (2.36 mm)

Fig. 17: Utilizacin de las partculas de carbn morfotipo HC23: Cladosporium sp.

Fig. 18: Utilizacin de las partculas de carbn morfotipo HC25: Mucor sp.

Sobre los mecanismos de transformacin del carbn evaluado a las 37 cepas aisladas, (utilizacin y solubilizacin), los resultados asimilan con cepas biotransformadoras reportadas en experiencias anteriores, de las cuales se identificaron morfotipos como: Aspergillus sp. Penicillium sp. y Mucor sp. Con la capacidad para crecer sobre el carbn utilizndolo como sustrato para la obtencin de molculas orgnicas para su crecimiento, reportados por cientficos como: Scott et al, (1986), primero en reportar los gneros de hongos, por la observacin del crecimiento micelial en las partculas de carbn; Stewart et al, (1990) observacin de 55

colonizacin de carbn sometido previamente a temperatura de 180C/7dias usando microscopia electrnica; gneros como Mucor sp. reportados por Fischer et al, (1997) identificando su crecimiento micelial sobre carbn lignito.

Cs2

Cs2

Cs1

Fig. 19: Utilizacin y Solubilizacin de partculas de carbn, (Cs2 carbon tipo 2, Trat: seco) por morfotipo HC09: Paecilomyces sp. Presencia de exudados color caf.

Fig. 20: Solubilizacin de partculas de carbn, (carbn tipo 2, Trat: seco) por morfotipo HC27 (Trichoderma sp.), presencia de exudados color caf.

56

Entre las cepas aisladas tres gneros diferentes HC: 27 Trichoderma sp., HC 09: Paecilomyces sp., HC: 19 Penicillium sp., subsiguiente a sus

procesos de crecimiento y utilizacin del carbn formaron gotas de color oscuro a partir de las partculas de carbn pretratadas, caracterstico del proceso de solubilizacin, reportado en estudios con especies de estos gneros Trichoderma artroviride (Ward (1985), Scott et al. (1986)) , Paecilomyces spp. (Polman et al, (1994)) Y Penicillium citrinum (Hlker et al, (1997, 1999)), como solubilizadores de las partculas de carbn, mediante la formacin microbiana de sustancias alcalinas, agentes

quelantes o surfactantes que son liberados al medio extracelular.

A diferencia de morfotipos ya referenciados en estudios anteriores el presente trabajo permiti determinar nuevos gneros de hongos con un potencial en cuanto al crecimiento y utilizacin de carbn en medio solido, las cepas correspondientes a los cdigos HC29, HC31, HC39, HC43; adems 3 morfotipos basidiomicetes HC18, HC28, HC30, aislados presentaron un abundante crecimiento en Agar MCM y utilizaron las partculas de carbn como sustrato para la obtencin de molculas orgnicas para su crecimiento.

La formacin de gotas de color oscuro se observ solamente en la muestra de carbn tipo 2 expuesta a esterilizacin en seco, esto puede estar relacionado con la textura del carbn ms blanda y fcilmente desmoronadle, lo que hace posible inferir, que el carbn tipo 1 presenta mayor grado de carbonificacin, por lo que su estructura qumica es ms compleja dificultando el crecimiento fngico. Resis (1992) pudo observar la solubilizacin ms eficiente por parte de microorganismos en carbones geolgicamente ms jvenes (lignito).

La tabla 3 relaciona los gneros fngicos aislados, la actividad transformadora de carbn de bajo rango y estudios previos que dan soporte. 57

Tabla 3. Actividad biotransformadora y referencias de las 37 cepas obtenidas a partir del aislamiento en Medio Agar Carbn
Genero Actividad Referencias de hallazgos en estudios previos

Aspergillus sp. (morfotipos HC 01, HC32; HC35; HC37; HC41) A. flavus (morfotipos HC06; HC08). A. terreus (morfotipos HC13.) Penicillium sp. (morfotipos HC03; HC15; Hc19; HC36; HC44)

Cladosporium sp.(morfotipos HC11; HC23)

Scott et al, (1986); primero en reportar el gnero de hongo, por la observacin del crecimiento micelial en las partculas de carbn. Dutton et al (1993) presencia de iones de oxalato excretados por Penicillium sp. Y Aspergillus sp. CU; Scott et al, (1986); primero en HC19 reportar el gnero de hongo, por la CUS observacin del crecimiento micelial en las partculas de carbn. Stewart et al, (1990) observacin de: colonizacin de carbn sometido previamente a temperatura de 180C/7dias usando microscopia electrnica; oxidacin del 10% de carbn mediante anlisis gravimtrico Dutton et al, (1993) presencia de iones de oxalato excretados por Penicillium sp. Y Aspergillus sp. Laborda et al, (1997 - 1999) Determinaron la actividad de las enzimas oxidativas e hidroliticas de Trichoderma sp. Y Penicillium sp. (Fenoloxidasas, peroxidasas, esterasas) en la biotransformacin de la hulla. Polman et al (1994) evalu el crecimiento y metabolismo de Penicillium citrinum, determinando la capacidad de modificar carbones, produciendo compuestos de menor pero molecular que el carbn original, causando una reduccin del 52% de azufre. CU: Aislamiento de dos especies HC05; cepa fngicas Cladosporium oxysporium HC 23; and C. tenuissimum a partir de las carbn lignito recin excavado, cepas identificadas mediante PCR. HC05 58

CU

11 solo C Trichoderma sp. CU: (morfotipos HC07; HC27) Cepa HC07; CUS: Cepa HC27

Laborda et al, (1997 - 1999) Determinaron la actividad de las enzimas oxidativas e hidroliticas de Trichoderma sp. Y Penicillium sp. (Fenoloxidasas, peroxidasas, esterasas) en la biotransformacin de la hulla. Hlker et al (19971999) determino la actividad alcalina y quelante alta, adems dos clases de actividad enzimtica: hidrolitica de solubilizacin del carbn y lignolitica de la degradacin de los cidos hmicos por parte de T. atroviride Kluczek et al, (2005) reporto la identificacin de Paecilomyces infltus, detectando la activida de enzimas lacasas, indicadas por la modificacin de las estructuras del carbn expuesto. Cohen et al, (1982-1986-1987) reportaron 2 hogos Poria montcola y Trametes versicolor, Solubilizacin de carbn lignito por accin de un complejo enzimtico. (Enzimas extracelulares). Pyne et al, (1987). Wondrak et al, (1989) Actividad enzimtica (lignina peroxidasa ) para mediar la dispersin de la macromolcula de carbn sub-bituminoso y lignito monitoreado por cromatografa Cohen y Gabrielle (1990) evaluaron gneros de levaduras en medios enriquecidos con polvo de hulla. Fischer et a,l (1997) identificacin del crecimiento micelial de Mucor sp. sobre carbn lignito. Los 7 morfotipos de hongos en cuanto a su crecimiento en Agar Carbn fue ptimo, pero al evaluar

Paecilomyces sp. CU: (morfotipos HC09;HC24) Cepa HC24; CUS: Cepa HC09 Basidiomicetes (HC18; CU HC28;HC30)

Levaduriformes (HC34;HC39)

Mucor sp.(HC25; HC26)

CU

Morfotipos: HC4; HC14; C HC20; HC34; HC38; HC42, HC43

59

el mecanismo de solubilizacin, los morfotipos no utilizaron las partculas de carbn.

6.3 EXTRACCIN DE SUSTANCIA HMICAS A PARTIR DE CARBN METEORIZADO DEL CERREJN:

Las mejores condiciones para la extraccin se obtuvieron con NaOH 0,5M en una relacin 1/10 (peso de carbn/volumen de extractantes) con un tiempo de extraccin de 4 horas a 95C alcanzando un rendimiento del 23%. As se comprueba que el carbn con el que se trabajo

efectivamente contena sustancias que pueden ser solubilizadas.

60

7. CONCLUSIONES Se lograron aislar y caracterizar a partir del protocolo de aislamiento y las muestras recolectadas de reas influenciadas por la extraccin minera de EL CERREJON Guajira- Colombia, 3 morfotipos de hongos con capacidad solubilizadora de carbn de bajo rango, correspondientes a Paecilomyces sp., Trichoderma sp., y Penicillium sp. A partir de las 11 muestras ambientales obtenidas de las zonas con influencia de la mina El Cerrejn se aislaron 137 morfotipos fngicos , las muestras con predominio de materia orgnica, desarrollo de cubierta

vegetal, aportaron mayor nmero de morfotipos fngicos. De las tcnicas de aislamiento utilizadas, la tcnica diluciones seriadas fue ms efectiva aportando 80 morfotipos fngicos. A travs del crecimiento en Medio Carbn se lograron seleccionar 37 morfotipos fngicos con crecimiento abundante y medio, lo que indica que presentan capacidad de utilizar el carbn como fuente de carbono y energa. logrando identificar gneros: Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp., Trichoderma sp., Paecilomyces sp., Cladosporium sp., morfotipos levaduriformes y Basidiomicete. Los morfotipos correspondientes a: HC09 Paecilomyces sp., HC19 Penicillium sp., HC27 Trichoderma sp., lograron solubilizar la partcula de carbn, evidenciado en la presencia de gotas de color caf en las zonas del crecimiento fngico en contacto con el carbn. De las prueba de solubilizacin de carbn de bajo rango la muestra de carbn tipo 1 presento mayor resistencia al ataque fngico, relacionado con la textura (ms dura en relacin a la muestra de carbn tipo 2), mayor grado de carbonificacin y estructura qumica ms compleja.

61

 24 morfotipos fngicos lograron utilizar el carbn como sustrato para la obtencin de molculas orgnicas para su crecimiento.

62

8. RECOMENDACIONES

Para la obtencin de mayor diversidad de morfotipos fngicos es importante utilizar tcnicas de aislamiento por preenriquecimiento y diluciones seriadas, para muestras ambientales influenciadas por la actividad minera.

Al evaluar la solubilizacin de carbn de bajo rango en solido utilizar partculas con rangos de tamao diferentes, evaluando las condiciones que favorecen la transformacin de las partculas de carbn y realizar un lavado eficiente de las partculas de carbn pretratadas con acido ntrico.

Realizar investigaciones posteriores para determinar la capacidad de transformacin del carbn de bajo rango mediante procesos diferentes a la solubilizacin determinando la capacidad de produccin de sustancias hmicas.

63

BIBLIOGRAFIA

1. Becerril, J. M., Especies nativas de suelo contaminados por metales: Aspectos ecofisiologicos y su uso en fitorremediacion. Ecosistemas revista cientfica y tcnica de ecologa y medio ambiente. 2007-2.

2. Bumpus J. Regulation of coal polymer degradation by fungi. Departamento de qumica, Universidad de Northern lowa. 1998. p 7- 11.

3. Burbano, O. H. La materia Orgnica: Origen, propiedades y su relacin con la calidad/salud del suelo. Memorias, Noveno congreso colombiano de la ciencia del suelo. p. 161-186. Paipa Colombia. 1998. 4. Cabrera, A. Produccin, caracterizacin y pruebas agronmicas de cidos hmicos producidos con carbones Colombianos. Industrias Tecsl Ltda. Santa fe de Bogot. Colombia. 1998. 5. Caldern, A. Presidencia carbones Colombianos del Cerrejn S.A. Proexport Colombia. 2008. 6. Carrillo, E. Aislamiento, identificacin y evaluacin de un cultivo mixto de microorganismos con capacidad de degradar DDT. Revista Internacional de Contaminacin Ambiental. Departamento de ingeniera y metalurgia, Universidad De Sonora. Sonora Mexico. p. 69-75, 2002. 7. Campbell, J. A., Fredrickson, J. K., Stewart, D. L., Pyne, J. W., Wilson, B. W., Bean, R. M., and Cohen, M. S., Application of model compounds to the study of microbial degradation, Abstracts of the ACS Meeting, New Orleans, Aug. 30Sept. 4, 1987. 64

8. Cohen, M. S., and Gabriele, P. D., Degradation of coal by the fungi Polyporous versicolor and Poria monticola, Appl. Environ. Microbiol, p 44, 23 (1982). 9. Cohen, M. S., Aronson, H., and Gray, E. T., Jr., Degradation of lignite coal by Polyporus versicolor: initial characterization of products, in Proceedings of the Direct Liquefaction Contractor's Review Meeting, U.S. Department of Energy, Washington, D.C., 1986, p. IV48. 10. Cohen, M. S., Liquefaction of coal by Polyporus versicolor, in Proceedings of the Biological Treatment of Coals Conference, Idaho National Engineering Laboratory and U.S. Department of Energy, Washington, D.C., 1987. 11. Chung, K. E., and Goldberg, I. B., Chemical structural differences between two low-rank coals, in Proceedings of the EPRI 11th Annual Conference on Clean Liquid and Solid Fuels, Electric Power Research Institute, Palo Alto, Calif., 2, 83121, 1988 12. Daz M. Aislamiento de hongos resistentes a metales pesados a partir de desechos mineros y su capacidad de remocin de metales y flor en solucin. Centro de investigaciones y de estudio de postgrado. Facultad de ciencias qumicas. San Luis potos, mexico. 2000. 13. Elbeyli, I., Palantoken, A., Piskin, S., Kuzu, H. y Peksel, A. Liquefaction/Solubilization of Low-Rank Turkish Coals by White-Rot Fungus (Phanaerochete chrysosporium). Energy Sources, 2006. p 28 :1063-1073. 14. Faison, B. D., and Kuster, T. A., Localization of ligninase protein in Phanerochaete chrysosporium, 65 in Proceedings of the 8th

Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals (C. D. Scott, ed.), Wiley, New York, 1986, p. 261. 15. Fakoussa R. y Frost, P. In vivo-decolorization of coal-derived humic acids by laccase-excreting fungus Trametes versicolor. Appl Microbiol Biotechnol, 1999. p 52: 60-65, 16. Fakoussa, R. M., Coal as a substrate for microorganisms: investigation with microbial conversion of national coals, Ph.D. thesis, Freidrich-Wilhelm Universitt, Bonn, 1981. 17. Gokcay, C., Kolankaya, N. y Dilek, F. Microbial solubilization of lignites. Turquia. 2001, p 80:1421-1433.

18. Gonzales, G. Mtodos bsicos en el laboratorio de micologa, Identificacin de hongos filamentosos. Departamento de

microbiologa, Facultad de Medicina. Universidad Autonoma de Nueva len. Mxico D.F. 2005. 19. Grinhut, T., Hadar, Y. y Chen, Y. Degradation and transformation of humic substances by saprotrophic fungi: processes and

mechanisms. Fungal Biology Reviews, Israel, 2007. p 2I: 179-189. 20. Hofrichter, M., Fritsche, W. Depolymerization of low-rank coal by extracellular fungal enzyme systems. II. The ligninolytic enzymes of coal-humic-acid-depolimerizing fungus Nematoloma frowardii b19. Appl Microbiol Biotechnol, 1997. p 419-424. 21. Hofrichter, M., Fritsche, W., Bublitz F. II solubilization of low-rank coal by filamentous fungi. Alemania, 1997. p 55-64. 22. Hofrichter M., Fakoussa R., Microbial degradation and modification of coal. Departamento de qumica y microbiologa, Universidad de Helsinki. Finlandia. 2000. p 393- 407. 66

23. Holker. U., Schmiers H., Grobe S., Winkelhofer M., Polsakiewicz M., Ludwig S., Dohse J., Hofer M. Solubilization of low-rank coal by Trichoderma atroviride: evidence for the involvement of hydrolitic and oxidative enzymes by usig 212. 24. Laborda, F., Fernandez, M., Luna, N y Monistrol, Lf. Study of the mechanisms by which mircoorganisms solublilize and/or liquefy Spanish coals. Fuel Processing Technology, 1997. p 35 -107. 25. Machnikowska, H., Pawelec, A. and Podgorska, A. Microbial degradation of low rank coals. Fuel Processing Technology 2002. p 77 78:1723.
14

C- labelled lignite. 2002. p 207-

26. Martn C., Linares L.

Tratamientos Biolgicos De Suelos

Contaminados: Contaminacin Por Hidrocarburos. Aplicaciones De Hongos En Tratamientos De De Biorrecuperacin. 2004. Revista De

Iberoamericana

Micologa.

Departamento

Microbiologa Molecular-CIB-CSIC. p 103-120.

27. Ministerio de Minas y Energa. Instituto Colombiano de Geologa y Minera. El carbn colombiano recursos, reservas y calidad. p 5-7. Santaf de Bogot D.C., Colombia. 28. NutraNetics, Inc. Humic Acid Structure and Properties. Nutranetics ProBio Systems. Junio 2000.

http://www.phelpstek.com/resources/pdfs/humic_acid.pdf

29. Oboirien B., Burton S., Cowan D., Harrison S. The effect of the partuculate phase on coal biosolubilisation mediated by

Trichoderma Atroviride in a slurry bioreactor. 2008. p 123-130. 67

30. Polman J., Stoner D., Delezene K. Bioconversion of coal, lignin, and dimethoxybenzyl alcohol by Penicillium citrinum. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 1994. Vol. 13 Number 5, p 292-299 31. Pyne F., Stewart, D., Fredrickson, J. y Wilson, B. Solubilization of leonardite by an Extracellular fraction from Coriolus versicolor. 1987. Vol. 53, n 12, p 2844-2848.

32. Pokorn R., Olejkov P., Balog M., Zifck P., Holker U., Janssen M., Bend J. Characterization of microorganisms isolated from lignite excavated from the Zhorie coal mine (southwestern Slovakia). Eslovaquia, 2005. p 932- 943. 33. Ralph, J. y Catcheside, D. Transformations of low rank coal by Phanerochaete chrysosporium and other wood-rot Processing Technology. 1997. p 79-93. fungi. Fuel

34. Reiss, J. Studies on the solubilization of German coal by fungi. Appl Microbiol Biotechnol., Alemania. 1992. P 37(6): 830-832. 35. Rivera M., Ferrera R., Volke V., Rodriguez R., Fernandez L. Adaptacin Y Seleccin De Microorganismos Autctonos En Medios De Cultivos Enriquecidos Con Petrleo Crudo. Publicado En Terra, Instituto Mexicano Del Petrleo. Mxico D.F. 2002. p 423-434. 36. Scott, C. D., and Strandberg, G. W., Microbial coal liquefaction, in Proceedings of the Direct Liquefaction Contractor's Review Meeting, U.S. Department of Energy, Washington, D. C., 1986, p. IV65.

68

37. Silva M., Caryn J., Burton S., Cowan D. degradation of low Rank coal by Trichoderma atroviride ES11. Society for industrial microbiology. 2007 p 625-631.

38. Strandberg, G. y Lewis, S. Microbial Solubilization of Coal. United States of America. 1990. 39. Tao, X., Pan, L., Shi, K., Chen-H., Yin, S. y Luo, Z. Biosolubilization of Chinese lignite I: extra-cellular protein analysis. Mining Science and Technology, 2009. p19: 358-362. 40. Ward, B., Lignite-degrading fungi isolated from a weathered outcrop, Syst. Appl. Microbiol., 1985. Vol. 6, N 2 Pag. 236 - 238. 41. Ward, B., Coal solubilizing fungi, in Proceedings of the EPRI First Annual Workshop on Biologic Processing of Coal, Electric Power Research Institute, Palo Alto, California. 1998. p. 1316. 42. Wengel M., Polman J. Degradation of organic matter from black shales and charcoal by the wood-rotting fungus Schizophyllum commune and release of DOC and heavy metals in the aqueous phase. 2006. p 383393. 43. Willmann G., Fakoussa R. Extracellular oxidative enzymes of coal attacking fungi. Alemania. 1997 p 27- 41.

44. Willmann, G. y Fakoussa, R. Biological bleaching of water-soluble coal macromolecules by a basidiomycete strain. Appl Microbiol Biotechnol. 1997. p 95-101. 45. Wilson, B. W., Bean, R. M., Franz, J. A., Thomas, B. L., Cohen, M. S., Aronson, H., and Gray, E. T., Jr., Microbial conversion of low-

69

rank coal: characterization of biodegraded product, Energy Fuels. 1987. 46. Wilson, B. W., Pyne, J. A., Bean, R. M., Fredrickson, J. A., Stewart, D. L., Sass, E., Burnside, M., and Cohen, M. S., Microbial beneficiation of low-rank coals, in Proceedings of the EPRI 11th Annual Conference on Clean Liquid and Solid Fuels, Electric Power Research Institute, Palo Alto, California, 1988. 47. Wise, D. Bioprocessing and Biotreatment of Coal. CRC Press, New York, 1990. Primera edicin, p1-23

48. Yuan, H., Yang, J. y Chen, W. Production of alkaline materials, surfactants and enzymes by Penicillium. Science Direct, 2006. p 85(10-11): 1378-1382.

70

71

72