Floren a Albu Editura Sfntul Ierarh Nicolae ISBN 978-606-577-071-3

MICROSCOPIE GENERAL Examinarea microscopic a produselor alimentare i furajere

GHID DE EXAMINARE Examinarea microscopic este o metod aplicat pentru identificarea, pe baza MICROSCOPIC
caracterelor microscopice caracteristice sau prin compararea cu o mostr de referin, a componentelor normale sau strine din produsele alimentare sau furajere. Aceste produse pot fi materii prime, adjuvani sau produse finite. Prin component strin se nelege orice material diferit de structura normal a produsului, i a crui prezen este condiionat de deficiene de prelucrare, depozitare sau transport a produsului respectiv. In aceast categorie intr materiale de contaminare, rezultate n urma fenomenelor de descompunere (texturi degradate n urma unor aciuni de natur parazitar sau a unor fenomene fizico-chimice, parazii sau fragmente ale acestora, etc.), materiale din mediul de prelucrare (nisip, pamnt, fragmente de sticl, rugin, lemn, plastic, textile, metal, etc.) sau alte corpuri organice sau anorganice (fragmente de insecte, fire de pr, dejecii ale insectelor, pasrilor sau animalelor, oase, pene, cristale, etc.). Examinarea microscopic are ca scop identificarea acestor componente prin comparatie sau pe baza unor caractere identificabile la microscop. Acest mod de examinare este facilitat de efectuarea unor teste suplimentare bazate pe reacii chimice i care pot ajuta la confirmarea identitii structurilor examinate.

Editura Sfntul Ierarh Nicolae ISBN 978-606-577-072-0


Aparatur si echipament de laborator

1.1 Microscopul de laborator Exist o mare varietate de microscoape cu diferite destinaii. Complexitatea i precizia cresc de la microscopul didactic la microscopul universal. Pentru

metodele de examinare microscopic este utilizat microscopul compus echipat cu lumin transmis i cu putere de mrire de pn la 1200 x. n figura 1 sunt prezentate componentele principale ale unui microscop de laborator de complexitate medie.

Fig. 1. Componentele principale ale microscopului de laborator

-2-

n general, microscopul de laborator este alctuit dintr-un suport (talp) pe care este fixat un bra (sau stativ) care susine tubul binocularului, revolverul rotativ n care sunt montate obiectivele, o carcas cu masa port-obiect i condensatorul. Carcasa conine dispozitivele de deplasare fin, micrometric, i de deplasare grosier a obiectivului fa de micropreparat (obiect). Cele dou dispozitive sunt controlate de verniere i pot fi coaxiale sau separate. n funcie de tipul microscopului, deplasarea fa de obiect se poate realiza prin deplasarea vertical a stativului (masa fix) sau a mesei portobiect (stativul fix). Deplasarea orizontal a mesei, pe dou planuri, se realizeaz cu ajutorul unui dispozitiv solidar cu masa portobiect. n talpa microscopului sunt montate, de regul, sursa de lumin i oglinda care direcioneaz lumina la 900 spre condensator (fig. 1). La partea superioar a stativului se gsete un corp de legtur care conine o prism deviatoare. Aceast prism modific traseul fluxului

luminos pentru a face legtura ntre obiectiv i ocular. La corpul de legtur este ataat tubul binocular i un ghidaj prismatic sau cu elemente de rostogolire n care intr revolverul cu obiectivele (fig. 1). Preparatul pentru examinare care mai este denumit i obiect, este aezat de regul, pe o lam portobiect din sticl. Preparatul poate fi examinat direct sau poate fi acoperit cu o lamel din sticl, de indice de refracie (n) i grosime standardizate (d)1. Pentru acurateea examinrii este recomandat numai utilizarea lamelor i lamelelor standardizate.

Valorile standard sunt d= 0,17 mm i ni= 1,524 pentru lamele iar pentru lame d = 1 mm.

-3-

Fig. 2. Schema de principiu a dispozitivului optic al microscopului

1.1.1. Sisteme de iluminare cu cmp luminos (CL) Preparatul microscopic (obiectul) poate fi examinat prin lumin transmis sau diascopic (n care obiectul este examinat prin transparen) sau prin lumin reflectat sau episcopic (n care obiectul este examinat prin lumina reflectat de ctre acesta). Aceste metode de iluminare constituie sistemul de iluminare cu cmp luminos. Dispozitivul de iluminare al microscopului este alctuit n principiu, dintr-o surs de lumin (S), condensatorul (C), diafragma de cmp (DC), oglinda (O) i diafragma de apertur (DA) care se gsete n tubul condensatorului. Schema de principiu a dispozitivului de iluminare al microscopului este prezentat n figura 2. Elementele de focalizare a luminii primite de la sursa de iluminare sunt oglinda (fig. 2) i condensatorul (vezi fig. 1). Condensatorul este constituit dintr-un ansamblu de lentile i poate fi deplasat pe vertical cu ajutorul unui vernier. Lumina care strbate condensatorul poate fi reglat ca diametru al fluxului cu ajutorul unei diafragme reglabile situate la nivelul condensatorului i care este denumit diafragm de apertur. Condensatorul, la unele microscoape, poate fi reglat i prin nclinarea axei verticale, iar de acest lucru se va ine cont la reglarea microscopului.

-4-

1.1.2. Obiective Obiectivele (fig. 1) sunt fixate n revolver cte patru sau cinci (n funcie de tipul constructiv) i au puteri de mrire diferite. Puterea de mrire este notat pe partea exterioar a tubului obiectivului, alturi de apertura numeric

corespunztoare (spre exemplu un obiectiv de imersie are notaia 100 x / 1.25). Conform standardelor DIN/ISO, puterea de mrire a obiectivelor este codificat pe tubul extern al obiectivului, sub forma unui inel de o anumit culoare. Codul culorilor corespunztoare claselor de obiective este prezentat n tabelul 1. Obiectivele pot fi de putere mic sau medie (2-43 x ) sau pot fi obiective de putere mare (50-120 x). Obiectivele care necesit un mediu lichid ntre obiectiv si preparat sunt denumite obiective de imersie iar cele obinuite sunt cunoscute ca obiective uscate (fig. 4). Obiectivele de imersie au un al doilea inel colorat n funcie de tipul mediului lichid care poate fi utilizat (sau recomandat) (vezi fig. 4 i tab. 1).

Fig. 4.

Schema de comparaie ntre obiective uscate i de imersie i

marcajele acestora. Pe suprafaa extern a tubului obiectivului se gsesc marcate indicative

referitoare la tipul obiectivului, lungimea acestuia, distana de lucru sau, la unele tipuri, grosimea lamelei care poate fi utilizat. In tabelul 1 sunt indicate proprietile obiectivelor n funcie de tipul de corecie. Acestea pot fi acromate,

-5-

semi-apocromate sau apocromate, n funcie de gradul de corecie cromatic. Lentilele obiectivelor acioneaz asemntor cu un set de prisme cumulate, astfel c la trecerea luminii spectrul este divizat n culorile componente. Acest fenomen conduce la apariia aberaiilor cromatice i implicit la scderea calitii imaginii. Calitatea imaginii este influenat i de aberaia sferic produs de compun obiectivele lentilele care

Tipul obiectivului

Aberaie sferic

Aberaie cromatic

Pentru corectarea acestor aberaii exist obiective cu combinaii diverse de lentile2 cu grad mrit de dispersie. Cele mai simple sunt obiectivele plan acromate, apoi obiectivele fluorit3 (sau semi-apocromate) i apocromate. Gradul de corecie este notat pe tubul obiectivului, sub form de indicativ (Achro, Apo, Plan, Plan Apo, etc.).

1.1.3. Puterea de rezoluie Performanele unui microscop sunt apreciate pe baza puterii totale de mrire i a capacitii de rezoluie a obiectivelor. Rezoluia este un parametru care indic capacitatea de vizualizare distinct a dou puncte situate la distana invers proporional cu rezoluia. Modul de calcul al rezoluiei are la baz urmtoarea formul :

2 3

Aceste lentile sunt construite din sticl cu compoziie special. Denumirea a fost pstrat de la fluoritul care a fost utilizat iniial ca material constructiv al lentilelor.

-6-

d =

(1 / 2) NA

(1)

Unde :

d = limita rezoluiei = lungimea de unda a luminii transmise NA = apertura numerica

n tabelul 1 sunt prezentate caracteristicile unor obiective mici, medii i mari (uscate i de imersie). Pe tubul extern al unui obiectiv de 10 x , spre exemplu, se va putea vedea notaia 10 x/0.25 (cu inel galben) care indic puterea de mrire i apertura numeric corespunztoare. Din acelai tabel se poate observa distana minim dintre dou puncte separate care pot fi vizualizate (puterea de rezoluie). Odat cu creterea puterii de mrire, scade proporional i distana de lucru dintre obiectiv i lama portobiect. Din formula (1) de calcul a limitei rezoluiei d, se poate observa c rezoluia este invers proporional cu lungimea de und a luminii transmise prin obiectul examinat. In acest fel, devine evident c pentru obinerea unei rezoluii ct mai bune, lungimea de und a luminii transmise trebuie s fie ct mai mic (fig. 5).

Fig. 5. Relaia dintre capacitatea de rezoluie i lungimea de und Lungimea de und a luminii obinut de la becurile microscoapelor se situeaz n jurul valorii de 550 nm. De regul, pentru examinarea la microscop, se utilizeaz un filtru albastru (ex. BG 33-BG 38) aezat n calea fluxului luminos nainte ca lumina s ajung la condensator. Utilizarea unui astfel de filtru ajut

-7-

ochiul observatorului s perceap mai detailat structurile observate la microscop. Exist i alte tipuri de filtre care au scopuri diferite. Astfel, filtrul gri (ex. N 16) atenueaz intensitatea luminii transmise fara a influena temperatura culorii (n exemplul de mai sus codul filtrului indica capacitatea de reducie N 16 = 100/16 = 6.3 %). Filtrul verde (ex. VG 9) mrete contrastul color al imaginii, ceea ce duce la obinerea unor detalii mai bune n special pentru microfotografii sau la examinarea n fluorescen.
Tab. 1 OBIECTIVE PENTRU MICROSCOAPE
Tipul de corecie Putere de mrire (magnificaie) Apertura numeric (NA) Distana de lucru (mm) Codul de culoare al obiectivului Rosu Galben Verde Albastru deschis Albastru cobalt Alb Negru Maron Rosu Galben Verde Albastru deschis Albastru deschis Alb Albastru deschis Alb Rosu Galben Verde Albastru deschis Albastru deschis Albastru cobalt Alb Alb Maron Rosu Galben Verde Codul de culoare suplimentar (imersie) Negru Negru Negru Negru -

Acromat

Plan acromat

Plan fluorit

Plan apocromat

4x 10 x 20 x 40 x 60 x 100 x 0.5 x 1x 2x 4x 10 x 20 x 40 x 50 x (ulei) 100 x (ulei) 40 x 100 x 4x 10 x 20 x 40 x 40 x (ulei) 60 x 100 x 100 x (ulei) 2x 4x 10 x 20 x

0.10 0.25 0.40 0.65 0.80 1.25 0.02 0.04 0.06 0.10 0.25 0.40 0.65 0.90 1.25 0.65 0.90 0.13 0.30 0.50 0.75 1.30 0.85 0.90 1.30 0.10 0.20 0.45 0.75

30.00 6.10 2.10 0.65 0.30 0.18 7.00 3.20 7.50 30.00 10.50 1.30 0.57 0.40 0.17 0.48 0.26 17.10 16.00 2.10 0.72 0.20 0.30 0.30 0.20 8.50 15.70 4.00 1.00

-8-

40 x 40 x (ulei) 60 x 60 x (ulei) 60 x (apa) 100 x (ulei)

0.95 1.00 0.95 1.40 1.20 1.40

0.14 0.16 0.15 0.21 0.22 0.13

Albastru deschis Albastru deschis Albastru cobalt Albastru cobalt Albastru cobalt Alb

Negru Negru Alb Negru

1.1.4. Microscopul cu contrast de faz (CF) Pentru identificarea structurilor componentelor examinate este util

microscopul echipat cu contrast de faz (fig. 6). In principiu, dispozitivul de contrast de faz introduce un inel de faz, n calea fluxului luminos care ajunge la preparat. In acest caz obiectul nu mai este iluminat prin transparen iar obiectul apare iluminat intens pe un fond ntunecat. Principiul contrastului de faz prevede c lumina direct capt un defazaj de 900 , intensitatea luminii directe este micorat aproape comparabil cu intensitatea luminii difractate i lumina difractat interfereaz cu lumina direct a crei intensitate este micorat i deplasat n faz. La microscopul de acest tip,

condensatorul poate fi reglat i ca nclinaie, n aa fel nct lumina ajunge la obiect sub un anumit unghi de inciden. Un aspect deosebit de important pentru acurateea observaiilor la microscop, este reglarea sau centrarea fluxului luminos care trebuie sa ajunga la obiectiv perfect centrat. Aceasta se realizeaza prin ajustarea inclinaiei oglinzii din talpa microscopului cu ajutorul uruburilor de ajustare.

-9-

Fig. 6. Reprezentare schematic a dispozitivului de contrast Centrarea fluxului luminos se realizeaz prin ndeprtarea geamului mat din calea luminii i vizualizarea4 filamentului (la becuri cu incandescen) sau a reelei (la becuri cu halogen sau fluorescente) (fig.7) :

b BHg 50 C- Hg 100

Fig. 7. a) Diferite tipuri de lmpi : A-halogen

b) Imaginea filamentului (bec cu incandescen) Oc 7 x Ob 10 x Pentru centrarea cu dispozitivul CF se regleaz condensatorul pentru

nclinaie n plan vertical. In acest scop se folosete n locul unuia dintre oculare o lunet special cu care se poate vizualiza poziia inelului de faz. Reglarea se face pn la fixarea acestui inel n centrul cmpului vizual.
4

Aceasta reglare se efectueaz cu un ocular de 7 x i un obiectiv de 10 x

- 10 -

1.1.5. Microscopul cu dispozitiv polarizant n anumite situaii, este necesar examinarea cu lumin polarizat. Fa de microscopul obinuit, microscopul polarizant

simplu conine un dispozitiv polarizor situat n faa condensatorului i o lam compensatoare (). Cu ajutorul luminii polarizate se pot observa materiale anisotrope organice sau anorganice, se pot diferenia cristale (fig. 8 A) sau fragmente de sticl (fig. 8 B). Substanele anisotrope se caracterizeaz prin apariia n cmpul de examinare a culorilor de polarizare iar cele isotrope prezint transparen (extincie) complet. De notat c examenul cu lumina polarizat se poate combina cu observarea n contrast de faz.

Fig. 8. A) Cristal n lumin polarizat,

B) Fragment de sticl

- 11 -

1.2 Stereomicroscopul 1.3 Stereomicroscopul este compus, n principiu, din aceleai piese ca i microscopul, cu deosebirea c examenul obiectului se face prin iluminare reflectat. Practic, este o lup de examinare dar care are capacitatea de mrire mult mai mare.

Fig. 9 Stereomicroscopul de tip Wild

- 12 -

Stereomicroscopul poate avea o putere de mrire de la 10 la ~250 x n funcie de aplicaia la care este folosit. Puterea total de mrire se calculeaz n mod identic prin multiplicarea puterii ocularului cu cea a obiectivului. In cazul n care sunt montate obiective suplimentare, puterea de mrire a acestora se multiplic cu puterile ocularului i obiectivului principal. La stereomicroscop, spre deosebire de microscopul compus, piesa care este schimbat este ocularul (10-32 x) n timp ce puterea obiectivului este, n general, fix5 (0.5-5.0 x). Ca i n cazul microscopului, obiectivele stereomicroscoapelor pot fi codificate color6 dup puterea de mrire a acestora. Codurile si specificaiile obiectivelor sunt prezentate n tabelul 2 :
Tab. 2 OBIECTIVE PENTRU STEREOMICROSCOAPE7
Tipul de corecie Putere de mrire (magnificaie) 0.5 x 0.75 x 1x 1.5 x 2x 0.5 x 1x 1.6 x Apertura numeric (NA) 0.045 0.68 0.09 0.14 0.18 0.066 0.13 0.21 Distana de lucru (mm) 155 117 84 50 40 136 54 24 Codul de culoare al obiectivului Rou Galben Alb Verde Albastru -

Plan acromat

Plan apocromat

n figura 9 este reprezentat structura principal a stereomicroscopului de tip Wild. La unele stereomicroscoape este prevzut i posibilitatea iluminrii obiectului prin transparen, situaie n care sursa de lumin este aezat sub masa portobiect, ntr-un sistem asemntor celui de la microscop. n acord cu cele prezentate mai sus referitor la capacitatea de rezoluie, la dispozitivul de iluminare extern se va ataa un filtru albastru care va facilita observarea detaliilor de pe suprafaa obiectului de examinat. Pentru examenul pe placa de sticl este de preferat s se aeze sub plac o hrtie de culoare neagr pentru componente deschise la culoare, sau una de culoare alb n cazul componentelor colorate sau

5 6

Exist stereomicroscoape la care se obin magnificaii n trepte prin rotirea unui cursor. Exist i productori care nu folosesc sistemul de codificare al obiectivelor. 7 Sunt prezentate specificaii pentru obiective obinuite, folosite n laboratoarele biomedicale.

- 13 -

negre8. Iluminarea se face de preferin cu o surs de cel mult 30 W iar sursa poate fi configurat lateral, frontal sau combinat. Rezultate optime se obin la iluminare simultan lateral i frontal (fig. 10) :

Fig. 10. Schema de configurare a surselor de iluminare extern (combinat)

Identificarea microscopic 2.1 Pregtirea examinrii

Este esenial omogenizarea foarte atent a probei de analizat. Examinarea pentru identificare microscopic se realizeaz n cteva etape. ntr-o prima etap are loc separarea fragmentelor pe baza dimensiunii acestora. Aceasta se realizeaz prin separarea mecanic prin filtrare, sitare, flotaie sau selectarea vizual. n cazul n care este necesar mrunirea mecanic a unor granule sau conglomerate, se poate face mojararea manual sau mcinarea n moara electric. n acest caz, trebuie ns inut cont de turaia aplicat pentru a nu fragmenta prea fin componente care pot fi recunoscute macroscopic (se ncepe cu o turaie mic ~1000-2000 r.p.m. timp de 5-10). Fragmentele mai mari sunt apoi examinate la
8

Stereomicroscoapele sunt prevzute cu un disc opac cu dou suprafee (alb/negru) care acoper masa. portobiect

- 14 -

stereomicroscop unde vor fi observate caracterele macroscopice (detalii de suprafa, textur) consisten (se ncearc fragmentarea prin presare), culoarea particulelor, dimensiunile acestora, etc., aspecte care vor fi notate alturi de dimensiunea fraciei analizate (ex. nr. sitei pe care s-a facut separarea).

2.1.1 Sitarea Pentru separarea diferitelor componente prin sitare se folosesc dou tehnici : sitarea uscat i sitarea umed. In primul caz se face sitarea amestecurilor uscate, alctuite din componente de dimensiuni diferite sau a amestecurilor obinute prin mcinare i uscare. In cazul sitrii umede se folosesc site cu diametrul de cel puin 15-20 cm (cu ochiuri de 60, 100, 150 m)9. Sitarea se efectueaz sub curent de ap cald (50-600 C) meninnd sita la ~300 nclinaie. In funcie de natura componentelor separate, este opional adugarea de detergent10, caz n care splarea se efectueaz pn la ndeprtarea complet a spumei rezultate. Reziduul rmas pe sit este uscat i apoi transferat cantitativ cu o soluie alcoolic ntr-un pahar curat. Dup separarea i uscarea reziduului obinut, acesta poate fi supus unei etape de hidroliz acid sau bazic.

2.1.2 Filtrarea Filtrarea este utilizat pentru separarea

suspensiilor fine din soluii sau rezulate prin umectarea reziduului rmas la sitare. Pentru filtrare se folosete hrtie de filtru de porozitate medie, corespunztoare pentru majoritatea aplicaiilor. In
pentru iluminare extern i un disc din sticl mat, semitransparent, pentru iluminare transmis. 9 Vezi Anexa 3. 10 In mod uzual se folosete un detergent anionic.

- 15 -

anumite cazuri, cnd sedimentul este foarte fin iar filtrarea dureaz prea mult, se poate aplica filtrarea sub vid n plnie Hirsch sau n filtru ceramic. In situaiile cnd coninutul de substane grase sau coloizi ngreuneaz filtrarea, se folosete apa fierbinte pentru splarea filtrului11, iar n situaiile cnd amestecul conine substane amidonoase se folosete soluie fierbinte de HCl 1-2%.

2.1.3 Sedimentarea i flotaia Separarea fragmentelor pe baza densitii acestora, se face utiliznd tehnica sedimentului de concentrare. Aceasta const n separarea fragmentelor prin

suspendarea amestecului ntr-un volum de solvent cu densitate mare (cloroform, clorura de metilen, tetracloretan). Pentru separarea sedimentului, proba este

suspendat n solvent ntr-o plnie de separare. Dup omogenizare fragmentele uoare (cu densitate mai mic) vor flota iar fragmentele mai grele vor rmne n sediment. Prin ndeprtarea solventului cu elementele flotante va ramne sedimentul concentrat care va examinat sistematic pentru identificarea

componentelor sale. Partea flotant este examinat dup ndeprtarea solventului prin uscare. n general componentele prii flotante sunt reprezentate de structuri cu densitate mic : esuturi vegetale, fire de pr, esut muscular deshidratat, fragmente de elitre ale unor insecte, etc. Separarea fragmentelor pe baza dimensiunii se poate face att din proba ca atare sau din fraciile de la sedimentarea cu solvent. Aceast separare se efectueaz cu ajutorul sitelor standard cu

dimensiuni diferite ale ochiurilor. Numerotarea sitelor poate fi fcut dup standardul ISO sau standardul USA. n Anexa 3 sunt prezentate

11

In funcie de metoda utilizat se pot folosi i solveni organici care dizolv grsimile i uureaz filtrarea.

- 16 -

deschiderile nominale ale sitelor standard corespunztoare celor 2 standarde de numerotare12. 2.2 Examinarea microscopica13 Dup obinerea fraciilor prin diverse metode de separare, pentru completarea observaiilor, se va face apoi examinarea la stereomicroscop i/sau la microscop. Pentru obinerea unui preparat microscopic obiectul trebuie secionat sau fragmentat la dimensiuni de ~0.1-0.3 mm. Fragmentele astfel obinute pot necesita apoi un tratament chimic pentru clarificarea structurii.

Fig. 11. Sigilarea lamelei peste preparatul microscopic. Agenii de clarificare utilizai au proprieti diferite (vezi Anexa 2- reactivi), cei mai utilizai fiind cloralhidratul, glicerina sau parafina. Aceste substane au n general densitate i vscozitate mare, ceea ce face ca porii i canaliculele s nu poata fi penetrate prin capilaritate, devenind astfel mai vizibile (rmn umplute cu aer i apar negre) fapt care ajut la identificare. Pentru clarificarea texturilor mai dure (ex. cu celuloza, lignina) este necesar un tratament prin hidroliz acid iar n cazul substraturilor proteice, un tratament prin hidroliz bazic. Dup clarificare se execut preparatul ntre lam i lamel i care poate fi apoi examinat la microscop.

12 13

Vezi pagina 37. Aplicatia nu se refera la examenul histologic cu preparat obtinut la microtom

- 17 -

Pentru fixarea14 lamelei atunci cnd se efectueaz examinarea repetat, se poate prepara un amestec15 de ulei de parafina cu parafin solid (1 :1) se nclzete la 700 C pe baie de ap pn la lichefiere i apoi se aplic pe marginile lamelei (vezi figura 11). Pe o lam pot fi delimitate 2 cmpuri la care se pot aplica ageni de clarificare sau colorare diferii (de exemplu un cmp pentru reacia cu iod, etc.) sau unul dintre cmpuri va fi cu un preparat de referin.

2.3 Reacii chimice de confirmare n foarte multe situaii este util colorarea preparatului (vezi Anexa 2 i metodele de lucru). Colorarea16 se face pentru deosebirea matricelor cu proprieti diferite, cum sunt grsimile, cerurile, glucidele complexe, esuturi osoase. Pentru srurile minerale exist o serie de teste chimice ale cror rezultate sunt reacii vizibile sau coloraii specifice ionilor care reacioneaz. Rezultatul unui singur test chimic nu va putea fi considerat aplicabil dect n corelaie cu alte teste i cu caracterele microscopice observate. Pentru maxim acuratee, un reactiv nu va fi aplicat unui grup de fragmente i reaciile vizibile sunt urmrite sub stereomicroscop pentru observare imediat. n acest scop, se pune pe o lam de sticl o picatura de reactiv i apoi sub stereomicroscop se mpinge particula n pictura de reactiv (fig. 12) cu ajutorul unei spatule sau pense. Reacia se noteaz i se compar cu un rezultat cunoscut.

Fig. 12. Efectuarea reactiilor chimice pe lama de examinare

14 15

Exist mai multe tipuri de montani disponibili comercial. Un alt amestec util este combinaia de glicerina gelatina. 16 Sunt excluse aici coloratia vitala sau alte tipuri de colorare utilizate n histopatologie

- 18 -

2.4 Numrtori efectuate la microscop (stereomicroscop)

Numrarea presupune trecerea sistematic peste preparat. n microscopie acest lucru se realizeaza prin utilizarea lamelor care au cmpuri delimitate pentru numrare. Aceste cmpuri au forma de ptrat (sau cmpuri dreptunghiulare) la care se cunoate exact dimensiunea laturilor. Numrarea ncepe de regul de la colurile cmpului i se face o trecere succesiv n zig-zag pentru evitarea numrrii repetate a aceleiai particule (fig. 13) :

Fig. 13. Numrarea prin trecerea succesiv prin fiecare cmp

2.5 Mijloace de msurare Msurarea structurilor, vizualizate la microscop sau la stereomicroscop, este util att pentru caracterizarea acestora, ct i pentru compararea cu preparate de referin. Pentru msurare exist oculare care au prevzut un micrometru de msurare a crui scal gradat este vizualizat prin ocular. Pentru calibrarea acestor micrometre oculare se utilizeaza micrometrele de mas (sau de cmp). Un astfel de micrometru este construit sub forma unei plcue metalice (pentru

stereomicroscop) sau din sticl transparent (pentru microscopul cu lumin

- 19 -

transmis) pe care se gsete o scal de 10 mm gradat la 0.1 mm. Privind prin ocularul cu micrometru se suprapune imaginea micrometrului peste cea a micrometrului de mas. Prin comparare se msoar echivalena n gradaii a

micrometrului ocular (fig. 14). Dac, spre exemplu, s-au numrat 3 gradaii de 0,1 mm de pe micrometrul de mas corespunztoare prin suprapunere la 1 gradaie pe micrometrul ocular, rezult c pentru fiecare gradaie de pe micrometrul ocular corespund 0,3 mm n cmpul vizual.

Fig. 14. Ajustarea micrometrului ocular cu micrometrul de mas Pentru microscop, o modalitate simpl de calibrare a micrometrului ocular este utilizarea unei camere de numrare, care poate fi gsit n majoritatea laboratoarelor medicale. Camerele de numrare sunt prevzute cu o reea de precizie, la care se cunosc exact dimensiunile orizontale ale ochiurilor reelei ( de la 0,05 la 0,25 mm) i adncimea (de la 0,1 la 1 mm) ceea ce asigur

posibilitatea de numrare pe unitatea de volum. Cele mai cunoscute camere de numrare sunt hemocitometrele utilizate pentru numrarea celulelor sanguine. Hemocitometrele sunt utilizate, n general, pentru msurarea i numrarea de particule cu dimensiuni mai mici de 50-100 m. In figura de mai jos sunt prezentate reelele de la trei modele de camere de numrare utilizate pentru

- 20 -

numrarea i msurarea celulelor, bacteriilor, granulelor de polen, sau a altor particule de mici dimensiuni.

Fig. 15. Aspectul i dimensiunile reelelor la diferite tipuri de hemocitometre

Ocularele de microscop specializate pot fi cu micrometru simplu sau cu reea. Micrometrul ocular, la majoritatea modelelor, const dintr-o scal de 10 mm subdivizat n 8, 10 sau 100 diviziuni. Micrometrele specializate pentru msurarea particulelor sau fibrelor pot avea marcaje ajuttoare pentru msurtori bidimensionale. In lipsa micrometrelor se poate utiliza dimensiunea relativ a cmpului vizual observat de utilizator, innd cont de puterea de mrire a obiectivului ales. Cu un obiectiv de 10 x i un ocular de 10 x ( total 100 x) diametrul cmpului vizual este de

aproximativ 1600 m (fig. 16). n cazul n care vom trece la un alt obiectiv se poate face un calcul rapid : spre exemplu la un obiectiv de 40 x (400 x) se va calcula 100/400 x 1600 = 400 m. n acest caz diametrul cmpului vizual va fi de ~400 m.

- 21 -

Fig. 16. Diametrul aproximativ al cmpului vizual la microscop. Msurarea poate fi efectuat i pe vertical (n adncime) pentru aprecierea grosimii sau nlimii structurii examinate. n acest caz trebuie ns ca partea cea mai nalt i partea cea mai joas a preparatului s poat fi bine focalizate. Diferena de nlime se apreciaz pe baza gradaiilor de pe viza fin ( ~ 3 m) (vezi fig. 16). Pentru msurarea exact (real) trebuie cunoscut i indicele de refracie al obiectului, folosind formula de mai jos : n0 d (real) = d ni unde : d (real) = grosimea real a obiectului d= diferena de focalizare (gradaia de pe viza fin) n0= indicele de refracie al obiectului ni = indicele de refracie al mediului dintre lama portobiect i obiectiv (aer= 1) (2)

Fig. 16. Elementele de msurare pe orizontal i n adncime (la dou modele de microscop).

- 22 -

n mod particular, structuri de mai mari dimensiuni pot fi msurate i cu ajutorul vernierelor gradate ( 0,01-0,02 mm) care sunt dispuse pe cele dou axe ale mesei port obiect (fig. 16). Pentru stabilirea reperului vizual n cmpul microscopic trebuie folosit un ocular cu scal. Prin deplasarea reperului fa de obiectul examinat, se stabilesc puncte pe vernierele gradate ale mesei port-obiect, obinnd astfel valori de msurare.

2.5.1 Msurarea microfotografic n cazul microscoapelor la care se pot realiza imagini digitale ale preparatelor, exist posibilitatea efecturii de msurtori cu ajutorul programelor dedicate acestui scop. Atunci cnd se utilizeaz imaginile digitale trebuie s se in cont de puterea de mrire a ocularului i respectiv a obiectivului dar mai ales de valoarea de zoom optic sau digital utilizat. De preferat este s se utilizeze capturi de imagine direct, fr a utiliza capacitatea de mrire a camerei. In figura 17 este

exemplificat modul de obinere al imaginii digitale utilizate pentru msurare. Microscoapele la care se ataeaz camere foto digitale sunt prevzute cu un un al treilea tub ocular configurat pentru acest scop. Exist diverse programe pentru captura i prelucrarea microfotografiilor. Pentru obinerea imaginilor utile este esenial stabilirea raportului contrast/luminozitate iar n cazul n care imaginile trebuie s fie color este necesar un obiectiv de tip apocromat (vezi tab. 1).

Fig. 17. A imagine corect ; B -imagine la care s-a utilizat puterea de mrire a obiectivului camerei de luat vederi.

- 23 -

2.6. Etapele examinrii simple la microscop

Pentru utilizarea mai facila a microscopului, sunt recomandai urmatorii pasi de execuie :
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. ALEGEREA OCULARULUI ( 7 x 10 x 16 x ) ALEGEREA OBIECTIVULUI ( se ncepe cu un obiectiv mic - obiectiv de 10 x ) FIXAREA LAMEI CU PREPARAT PE MASA PORT-OBIECT FIXAREA CONDENSORULUI LA PUTERE MAXIMA SE DESCHIDE DIAFRAGMA DE CAMP LA PRIVIND IN BINOCULAR SE APROPIE OBIECTIVUL CU VIZA GROSIERA IMAGINEA APARUTA SE CLARIFICA CU VIZA FINA SE DESCHIDE DIAFRAGMA DE CAMP LA 1/1 (COMPLET) SE REGLEAZA INTENSITATEA LUMINII DIN CONDENSOR (VERTICAL)

10. SE SCHIMB OBIECTIVELE PE RND LA 20 x, 40 x 11. IMAGINEA SE CLARIFIC CU VIZA FIN

- 24 -

GHID DE IDENTIFICARE MICROSCOPIC

3.1 Identificarea seminelor de buruieni i plante toxice 3.1.1. Cereale i semine furajere ntregi Seminele de buruieni i plante toxice constituie impuriti botanice care pot constitui un risc pentru producia i sntatea animalelor, atunci cnd se gsesc n dieta acestora. Dup standardele de stat17, impuritile sunt catalogate ca i corpuri strine care sunt clasificate n corpuri inerte (pmnt, praf, paie, pleav, etc.) i amestec de alte semine de cultur i semine de diferite buruieni, etc. Corpurile strine se determin cantitativ, trecnd proba printr-un sistem de cel puin 4 site cu ochiurile de 3.0-2.0-1.00,5 mm n diametru, cantitile obtinute prin sitare se cntresc i se exprim procentual, ca total corpuri strine i separat pe tipuri i mrimi.

Proba luat n analiz depinde de mrimea seminelor (grunelor): pentru cele mari (porumb, mazre, soia, etc.), proba va fi de 100-200 g, pentru cele mijlocii (orz, ovz, secar, etc.) de 50 g, iar pentru cele mici (mei, in, etc.) de 10-25 g. Pentru a determina semintele (gruntele) atacate de duntori, se asaz proba pe o coala de hrtie, examinnd integritatea lor (cu ochiul liber sau cu stereomicroscopul); cu aceast ocazie se constat si
17

Vezi Anexa 5 Standarde pentru seminte.

- 25 -

prezenta insectelor (si fragmente ale acestora) sau a diferitelor larve in prob.

Cereale atacate de duntori In general, se admit urmtoarele proporii de corpuri strine (%), pe clase de puritate, n functie de tipul seminelor :
Ovaz Clasa de puritate Corpuri inerte Al t e seminte Corpuri inerte Orz Alte seminte Porumb Corpuri inerte Alte seminte Secara Corp uri inerte Alt e seminte

2 23

II

1-3

24

24

2-5

12

2-3

1-2

III

Article I.

Seminele speciilor de plante toxice sau duntoare nu sunt acceptate dect

- 26 -

n limitele maxime indicate in Anexa DC 32/2002/EC. Semintele de buruieni se vor indica procentual, dupa felul lor (se indic specia) ca si proportia de semine seci, sistave, sparte, etc., care aparin culturii de provenien a probei. Acestea din urm au caracter limitativ ca impurit i vegetale (organice).

3.1.2. Uruieli si amestecuri mcinate

n general, uruielile au aceleasi nsuiri ca si grunele (seminele) din care provin, dar uneori survin cauze care le depreciaz, de exemplu, n timpul uruirii pot ptrunde n ele corpuri strine (praf, corpuri metalice, etc.), pot fi pstrate in conditii necorespunzatoare, sau chiar pot fi falsificate prin adugare de produse calitativ inferioare18. Corpurile strine (%) indic puritatea probei. Corpurile metalice pot fi separate i cu ajutorul electromagnetilor. In general, suspendarea probei mcinate ntr-un solvent (cloroform, tetracloretan) cu densitate mare conduce la separarea sedimentului concentrat constituit in principal din partea grea a probei care contine corpurile straine minerale, metalice i esuturile vegetale lignificate. Seminele de buruieni, de plante toxice, sporii de mucegai (scleroti, etc.) se identific prin examinarea direct, la stereomicroscop, a probei asezat pe un fond alb.

18

Spre exemplu, adaosul de tarte sau coji mcinate.

- 27 -

Mod de lucru general Domeniu de aplicare

Aceasta procedur se poate utiliza acolo unde detectarea si identificarea semintelor, fragmentelor acestora si a altor componente vegetale din amestecuri furajere, se efectueaza prin examen macro/microscopic pe baza caracterelor tipice. Echipament si accesorii (Vezi Anexa 1). Reactivi (vezi Anexa 2). A. Pregtirea probei Este necesar, n prealabil, o foarte bun omogenizare a probei. Se iau cel putin 500 g de prob care se omogenizeaz cu ajutorul omogenizatorului-divizor.

Din cantitatea omogenizat, o fractie de 5-10 g se ntinde n strat subire pe o foaie de hrtie si se examineaz cu ochiul liber (de preferin in lumin natural). Pentru o examinare mai atent, se poate utiliza o lup de birou. n cazul dispersiei de componente foarte diferite (corpuri strine foarte mari) se efectueaz sitarea probei pe site cu ochiuri cu de la 3-0,1 mm. Fragmentele mari (vizibile cu ochiul liber), de forme sau culori diferite se selecteaz cu penseta pentru examinarea ulterioara la stereomicroscop19. Fraciile de pe site se cntaresc (0.001g) si se noteaz alturi de numrul sitei corespondente (diametrul ochiurilor) pentru a putea fi exprimate

19

Aparatura este listata in Anexa 1.

- 28 -

procentual. n lipsa omogenizatorului20, se iau 200 g proba care se ntinde n strat uniform de cel mult 1 cm nlime, pe o coal de hrtie alb. Proba se uniformizeaz cu ajutorul unei rigle sau spatule i se formateaz n form de ptrat. Cu ajutorul riglei se mparte n 16 ptrele aproximativ egale. Se aleg 8 ptrate n sah care se separ de restul grmezii si se amestec. Se repet operaiunea pn la obinerea unei probe de aproximativ 200 g.

B. Examinare general Proba omogenizat se ntinde n strat subire21 pe o tvi i se examineaz cu ajutorul lupei. Seminele identificate sunt apoi examinate la stereomicroscop unde se noteaz dimensiunile, culoarea, forma i aspectul capsulei. La foarte multe specii ornamentaia capsulei permite identificarea. Este util secionarea seminei longitudinal/transversal cu ajutorul unui bisturiu sau lame i separarea stratului aleuronic ataat capsulei. Examinarea la microscop22 a capsulei poate da indicaii asupra speciei in funcie de forma i dispunerea celulelor n straturi. Pentru fragmentele de semine, o mic poriune de prob (sau fracia de pe sit) se amestec cu puin ap i se examineaz la stereomicroscop in lumin normal.
20 21

Sau in prezenta corpurilor straine mari. Stratul nu trebuie sa fie mai gros dect inaltimea a trei seminte suprapuse.

- 29 -

Aceasta examinare poate da informaii generale despre compoziia amestecului. De multe ori se pot identifica astfel fragmente de esuturi vegetale, semine ntregi mai mici, fragmente lemnoase, etc. n cazul unor componente care necesit identificare, se face la stereomicroscop caracterizarea general prin notarea dimensiunilor, culorii, texturii i a consistenei. Este esenial cunoaterea caracterelor seminelor plantelor de cultur pentru a putea face diferenierea ntre acestea i seminele nedorite.

Teste chimice orientative23

Prezena seminelor toxice se poate stabili i prin probe de culoare orientative: o prob mcinat (sau uruial) se introduce intr-un balon Erlenmeyer, iar peste ea se introduce un amestec de 100 parti alcool etilic (70) si 5 parti acid clorhidric; amestecul se fierbe, se agit si se lasa apoi n repaus pentru sedimentare ; culoarea lichidului se va modifica dupa felul semintelor de plante toxice continute; dac proba nu contine seminte toxice, lichidul de deasupra este incolor sau slab glbui, dac contine cornul secarii, lichidul are culoarea crnii, dac conine seminte de Agrostema githago, sau de Lolium temulentum, lichidul de extracie are culoarea oranj. Se mai poate efectua i examenul de flotaie cu cloroform, n care semintele se stratific diferit, dup greutatea lor. Pentru aceasta, se introduce o cantitate de 2-5 g proba ntr-o eprubet, se trateaz cu cloroform, se agit eprubeta, apoi se las pentru sedimentare; neghina ( Agrostema githago), fiind grea, cade la fundul eprubetei sub form de particule de culoare neagr; cornul secrii ( Claviceps spp.) rmne la suprafat, tot sub form de particule de culoare neagr; alte seminte se situeaza la nivele diferite, avind culori diferite, astfel c pot fi separate si identificate.
22 23

Cu coloratie sau pentru examen in lumina polarizata. Vezi Anexa 3.

- 30 -

Pentru a determina nisipul, praful sau alte particule de origine mineral, se trateaz proba, ntr-o eprubet, cu solutie de clorura de zinc, apoi se agit. Corpurile inerte vor cadea la fundul eprubetei, iar particulele organice rmn la suprafata ; dupa decantare se separ depozitul de nisip, se usuca, se cntreste si se exprim procentual. Nisipul se mai poate determina astfel : se ia o.proba de circa 20 g uruieli, se introduc ntr-un pahar nalt si ngust, se trateaz cu ap, pna la nltimea de 3/4 din pahar; se agita apoi continutul cu o baghet de sticl si dup decantare se ndeprteaz cu atentie apa tulbure; se repet operatia de splare pn se obtin ape limpezi, reziduul mineral se usuca, se cntreste si se exprim procentual. n cazul particulelor de mici dimensiuni sau a celor rezultate din fragmentarea unei piese mai mari se fac preparate pe lama pentru examenul la microscop. In acest caz dimensiunea particulelor trebuie sa fie ajustata la mai putin de 0.1-0.3 mm. Examenul la microscopul compus se face n lumin normal (filtru albastru) si cu dispozitivul de contrast. Textura observat (celule, formaiuni structurale, etc.) se poate caracteriza suplimentar prin teste chimice efectuate pe preparat. Pentru identificarea amidonului, pe lama de examinare la microscop se aeaz la una dintre margini (la nivelul mbinrii cu lamela) o pictur de soluie de iod(5) si se examineaz din nou preparatul. Granulele de amidon vor fi colorate in albastrualbastru inchis, celuloza din fragmente in galben iar proteinele in galben maroniu. Identificarea amidonului, spre exemplu, intr-o prob mcinat de semine de oleaginoase24, indic prezena altor semine. Toate detaliile observate sunt notate. n acelasi mod se face testul cu solutie de KOH(10). Tratamentul alcalin produce gelatinizarea granulelor de amidon, dizolv proteinele i saponific grsimile. n acelai timp accentueaz coloraia roietic produs de taninul din esuturi i clarific preparatul. Dac acest tratament nu este suficient pentru clarificarea preparatului, se utilizeaz tratamentul cu agent de clarificare I (3) pentru 2-3 ore sau o cantitate redus de prob se amestec cu agentul de clarificare II (4) se nclzete
24

Semintele de oleaginoase nu contin amidon.

- 31 -

uor pe lam i apoi se examineaz. Pentru separarea substanelor celulozice, se macereaz proba cu amestec de clorat de potasiu-acid azotic
(11)

i se nclzete

timp de 20-30. Celuloza brut se deosebete de substanele de infiltrare (lignina, suberina) prin adugare de soluie proaspt preparat de iod
(13)

unei fracii de

prob umezit in prealabil. Substratul celulozic se va colora n albastru iar substanele de infiltrare in galben. Substantele grase, rinile, uleiurile, cerurile din componena celulelor vegetale, vor fi colorate n rou prin tratarea probei cu soluie de Sudan IV(14) si 23 picturi de soluie de cloral-hidrat(4) urmat de o uoar nclzire. Un test

suplimentar const in tratarea separat a probei cu eter de petrol i cu alcool etilic. Eterul dizolv grasimile, cerurile sau rinile. Alcoolul dizolva, de regula, uleiurile esentiale si rasinile dar are efect redus asupra grasimilor si cerurilor. Pentru

evidentierea taninurilor sau a tesuturilor impregnate cu tanin, se efectueaza testul cu acetat de fier(12) sau clorura ferica(12). In ambele cazuri culorile dezvoltate sunt verde sau albastru.

Examenul n fluorescen Pentru examenul n fluorescen se utilizeaz stereomicroscopul i microscopul compus. Tehnica de iluminare a preparatului poart numele de epifluorescen i se rezum la observarea culorii fluorescente dup excitarea preparatului cu o lumin ultraviolet incident. Utilizarea tehnicii de examinare in fluorescen poate fi foarte util pentru stabilirea originii esuturilor examinate sau identificarea tipurilor de semine. Foarte multe structuri ale esuturilor vegetale, n special cele de depozitare, prezint fenomenul de autofluorescent la tratamentul cu reactiv Schiff25. Este foarte important alegerea corecta a colorantilor utilizati tinnd cont de structurile care vor fi evidentiate. Astfel, pentru colorarea proteinelor sunt utilizate safranina, eozina, fucsina acida, acridin orange, acriflavina, pentru colorarea lipidelor se utilizeaza Rosu si Albastrul de Nil, Sudan,
25

Col. PAS -Vezi anexa cu reactivi.

- 32 -

verde luminos, iar pentru colorarea amidonului Rosu de Congo, acidul periodic, solutia Lugol, etc. Culorile obtinute la colorarea acestor structuri trebuie sa fie bine cunoscute pentru a putea face caracterizarea corect a preparatului.

Porumb- sectiune endosperm colorata PAS-Verde luminos (CL26, 200 x)

Detalii -structura endospermului (in stanga) are colorate granulele de amidon (fuchsia) intr-o matrice proteica (verde inchis) in timp ce embrionul (dreapta) contine majoritatea lipidelor miezului si foarte putine proteine

26

CL= examen in cmp luminos

- 33 -

Ovz - seciune endosperm colorat Rou de Congo (FL27, 200 x)

Detalii -se remarc autofluorescena compuilor fenolici n stratul aleuronic (dreapta-albastru) si coloraia roie a endospermului datorat -glucanilor (stnga)

Ovz - seciune endosperm colorata acriflavina-HCl (FL, 200 x)

Detalii -acidul fitic care se gsete predominant n stratul aleuronic genereaz coloraia roieportocalie (stnga)

27

FL =examen in fluorescenta

- 34 -

Orz - seciune endosperm colorat PAS-albastru Evans (CL, 400 x)

Detalii -granulele de amidon din endosperm sunt colorate n rou-nchis iar pereii celulari sunt colorai n albastru

- 35 -

Caractere morfologice identificabile

n cazul seminelor ntregi, nedecorticate, este esenial compararea caracterelor morfologice generale. Aceste caractere sunt: dimensiunea (lungime, latime, diametru), forma seminei, aspectul i tipul ornamentatiilor28 de pe suprafaa cuticulei. Dup stabilirea atent a acestor caractere se poate face compararea cu mostre sau imagini ale preparatelor de comparaie29.

Dac se lucreaz cu fragmente de semine trebuie stabilit gradual dac este vorba de un esut vegetal30 i nu de un artefact, apoi se face i examinarea la microscop. Pentru examinarea la microscop este util examinarea n lumina polarizat sau, ca alternativ, efectuarea unei coloraii. Cele mai multe informaii sunt obinute de la fragmentele de cuticul, respectiv din epiderm, mezocarp i stratul aleuronic. Distribuia i forma celulelor care constituie aceste straturi ofer

28 29

La unele specii datorita ornamentatiilor caracteristice identificarea poate fi facuta direct. Ghid de identificare a semintelor de buruieni (CD-R). 30 Vezi si testele chimice

- 36 -

mai multe informaii dect examinarea structurilor, de cele mai multe ori amorfe, ale endospermului sau cotiledonului.

Structura seminei la monocotiledonate - n dreapta imagine la microscop a endospermului i a embrionului (200 x , CL, PAS - Verde luminos)

- 37 -

Structura seminei la dicotiledonate in dreapta seciune transversal a seminei la stereomicroscop (12,5 x)

Bob de orz aspectul in seciune transversal si detaliu al endospermului i stratului epidermic (col. PAS)

- 38 -

Bob de orez aspectul n seciune transversal i detaliu al endospermului i stratului epidermic (col. PAS)

Bob de gru aspectul in seciune transversal i detaliu al endospermului i stratului epidermic (col. PAS)

- 39 -

Bob de ovz aspectul n seciune transversal i detaliu al endospermului i stratului epidermic (col. PAS)

- 40 -

Examen n lumin polarizat (100 x)-cuticula (familia Euphorbiaceae) Stnga Ricinus communis dreapta Jatropha curcas

Examen n lumin polarizat (200 x)-cuticul (i strat aleuronic) Stnga Crotalaria spp. dreapta Camelina sativa

Examen in lumina polarizata (100 x)-cuticula (fam. Brassicaceae)

- 41 -

Stnga Brassica juncea dreapta Brassica nigra

Examen microscopic -cuticula si strat aleuronic Stnga lolium temulentum (200 x) dreapta Lolium remotum (100 x)

Examen in lumina polarizata (400 x)-Claviceps purpurea (Periteciu cu asce)

- 42 -

Speciile de buruieni si plante toxice (impuritati botanice) din Anexa DC 2002/32/EC1

1. Ricinul (Ricinus communis L.) Ricinul este o plant originara din India i face parte din familia Euphorbiaceae. Are o mare variabilitate de areal si aspect, astfel c poate fi gsit sub form de arbore, de 10-12 m nltime n zone tropicale sau de 3-5 m n rile

mediteraneene, n timp ce n zonele nordice, unde este cultivat mai mult ca plant de ornament, are aspect de arbust. Fructele sunt trilobate, cu suprafata tepoas, de culoare verde sau rosie. In fiecare lob se dezvolta o samnta mare cu suprafata cu aspect marmorat. Ricinul
1

Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7 May 2002 on undesirable substances in animal feed (E.C.O.J. n L 140 of 30/5/2002,

- 43 -

este cultivat si in scop comercial pentru uleiul nevolatil (90% acid ricinoleic) extras prin extractie cu solventi din seminte sau prin presare. Producia de semine de ricin n scopuri industriale (1,05 Mt) este preponderent n

India i China i mai important puin in

Brazilia. Uleiul2 de ricin este folosit de foarte mult timp ca purgativ dar are si multe alte utilizri comerciale, cum sunt fabricarea maselor plastice, textile, vopsele sau cosmetice. Ricinul are toxicitate ridicata din cauza continutului n ricin, o glicoprotein hidrosolubil foarte concentrat in endospermul semintelor3 dar prezenta in cantitati mai mici si in celelalte portiuni ale plantei. Este considerat unul dintre cele mai puternice toxice naturale 4. Exist o mare variabilitate n privina sensibilittii la toxin.

2 3

Uleiul ca atare nu este foarte toxic, semintele macinate intregi contin toxina. Insotita de un alcaloid (ricinina). 4 Actioneaza prin inactivarea ribozomilor .

- 44 -

Cabalinele prezint cea mai mare sensibilitate, cu doza letal (p.o5) de 0.1 g/kg mc, apoi celelalte specii de ferm cu doza letal de 1-2 g/kg mc (p.o) cu exceptia caprinelor la care aceast doz ajunge la 5,5 g/kg mc. Toate animalele de ferm si cele de companie, sunt vulnerabile. Seminele sunt toxice numai dac nveliul extern (cuticula) este ndeprtat. Seminele nghiite intacte trec prin tubul digestiv, n general, fr incidente. Simptomele pot apare chiar i dup 18-24 ore de la ingerare. Acestea debuteaz cu stare depresiv, uoar hipertermie, dup care predomin tulburrile gastrointestinale, voma, diaree profuz, colica abdominal. Animalele afectate manifest apoi convulsii, colaps circulator si apoi moartea la aproximativ 36 ore de la consum. Mecanismele principale sunt iritatia gastrointestinala, anafilaxia i socul.

2. Purghera (Jatropha curcas L.) Jatropha curcas este o plant din familia Euphorbiaceae, ca i ricinul, cunoscut pentru potentialul toxic. Este originara din America centrala dar este cultivata pe scara larga in tarile tropicale. Crete sub form de arbust sau arbore de 5-6 m naltime. Fructele uscate complet se desfac in trei valvule dintre care cel putin doua contin cte o singura samanta alungita, de culoare neagra. Planta, inclusiv semintele, este utilizata pe scara larga pentru diferite

Administrare orala (per os)

- 45 -

scopuri casnice si in medicina traditionala. Utilizarea comerciala a uleiului prezinta un interes mai scazut, desi proprietatile sunt similare celui de palmier. Semintele contin ca principiu activ, curcina, care este o glicoproteina similara ricinului si are un mod de actiune asemanator. La om

simptomatologia consecutiva ingerarii semintelor este asemanatoare celei asociate iritatiei

gastrointestinale. Debutul este brusc cu dureri abdominale puternice, senzatii de arsura la circa 30 minute dupa ingerare, urmate de diaree (uneori hemoragica) si deshidratare accentuata. In unele cazuri apar si tulburari cardiovasculare si ale sistemului nervos central. Se consider c 2 seminte pot avea un puternic efect purgativ in timp ce 4-5 seminte pot produce moartea subiectului. Intoxicatiile produse la animale sunt cunoscute n practica veterinara in zonele unde creste planta. Studiile efectuate asupra toxicitatii orale ale J. curcas au aratat ca exista diferente de sensibilitate ntre speciile de rumegatoare. Vacile care au primit 0.25-1 g/kg furaj au murit in interval de 19 ore de la administrare, in timp ce caprele care au primit aceeasi doza au murit in intreval de 7-21 zile. Nu a fost stabilita o relatie directa cu capacitatea citotoxica in aceste cazuri sau posibilitatea de metabolizare a substantei active, continuta de seminte, in metaboliti mai mult sau mai putin toxici. Furajarea pasarilor cu seminte fierte de J. curcas produce ntrziere in crestere, pierdere in greutate, modificari metabolice (cresterea

nivelului de creatinina serica) si mortalitate proportionala cu cresterea procentului de seminte n diet. 3. Croton (Croton tiglium) Este o planta din familia Euphorbiaceae, cu un areal larg, din India pn n Noua Guinee, nordul Indoneziei si China. Poate fi gasita sub forma de arbust sau arbore de peste 12 m. Fructele au forma triangulat (trilobata) si contin 3 seminte. Este mai putin toxica dect genurile descrise mai sus.

- 46 -

Substanta toxica majoritara din compozitie este reprezentata de crotin6 cu un mod de actiune asemanator cu cel al ricinului. Simptomatologia este determinata de actiunea iritanta gastrointestinala si purgativa. Uleiul de croton este produs comercial n cantitti reduse, n special in India, sursa principala de seminte comercializate fiind regasita n nordul Indiei.

Planta are si unele proprietati terapeutice folosite n medicina traditionala. In Europa poate fi gsita ca plant ornamental.

Nume generic pentru un grup de glicoproteine cu toxicitate variabila.

- 47 -

4. Crotalaria spp7. (Crotalaria spectabilis, Crotalaria giant) Denumita i buruiana plesnitoare8, este o plant anual, peren, de 1,5-2 m, cu fructe asemntoare cu mazrea, cu multe semine care, atunci cnd sunt uscate, produc zgomotul de unde i denumirea plantei. La nceputul secolului trecut, mai multe specii9 de

Crotalaria au fost duse din Africa n SUA pentru a fi utilizate pentru controlul eroziunii solului, ca ngrasamnt vegetal, ca sursa de azot, etc10. Aceasta activitate a fost discontinu dar n acest mod plantele au fost diseminate pe teritoriul trii, iar semintele care patrund in culturile de cereale pot produce intoxicatii animalelor de ferma. Dintre acestea, cel mai puternic afectate sunt psrile. Crotalaria spp. nu creste in Europa dect ca rezultat al cultivarii. Posibilitatea de a contamina soia (respectiv fina de soia) importata din SUA in Europa este motivul includerii acestui gen in anexa Directivei.

7 8

Laur porcesc (pop.) In engleza rattlebox sau rattleweed (rattle=suntor, zanganit) 9 De fapt peste 600 de specii dintre care au fost identificate 6-7 specii cu potential toxic pentru animale. 10 In India sunt folosite in medicina traditionala pentru tratarea scabiei

- 48 -

Dintre speciile existente, Crotalaria giant striata si Crotalaria spectabilis au un potential toxic mai ridicat. Plantele si semintele sunt toxice in egal msur prin continutul de monocrotalin11, un alcaloid hepatotoxic prezent n ntreaga plant. Consumul de C. spectabilis de catre ginile outoare duce la scaderea rapida a ouatului si cresterea mortalitatii

Clinic, intoxicaia se manifest prin micri dezordonate i dezorientare. La examenul necropsic se constat rupturi hepatice (sau hemoragii de suprafa n stadiile incipiente), hemoragie intern i acumulare de lichid n cavitatea abdominal12. In cazul hrnirii experimentale cu semine mcinate s-au putut
11 12

Este alcaloidul (pirozilidinic) majoritar alaturi de fulvina si crispatina In unele cazuri apare ciroza hepatica.

- 49 -

observa efecte adverse la un coninut de 0.01-0.1 % n diet, n timp ce la un continut de 0.3 % apare mortalitate. Procente in diet mai mici de 0.05 % reduc sever ouatul i procentul de eclozionare. 5. Camelina sativa (L.) Crantz (in fals, lubit) Camelina este o plant din familia Brassicaceae, cultivata in Europa nc din epoca bronzului pentru uleiul extras din seminte si ca sursa de fibra vegetala. A fost cultivata pe scara larga dar productia comerciala a fost nlocuit cu introducerea uleiului de rapita. Uleiul are proprietati asemanatoare cu ale uleiului de in13 si are un continut mai scazut de glucozinolat14 dect speciile de Brassica. Acest din urma aspect favorizeaza chiar utilizarea semintelor (faina) in hrana animalelor15. Nu este foarte clar motivul pentru care aceasta planta, tinnd cont de cele de mai sus, a fost inclusa in anexa Directivei. Unul din motive ar putea fi faptul c atunci cnd inul (Linum usitatissimum) era cultivat pe scar larg in Europa, aceast plant era o buruiana comun att n culturile de in ct si in cele de cereale. In consecint, Camelina sativa a fost considerat nedorit in amestecurile de cereale si probabil acesta este unul dintre motivele includerii in anex.

13 14

Contine acid linolenic 30-40%, acid eicosenic 15% si acid erucic <4% compozitie asemanatoare celui de in Referitor la speciile alimentare. 15 In afara glucozinolatilor (care se gasesc in mai multe specii de Brassica) nu contine alte substante cu potential toxic pentru animale.

- 50 -

6. Semintele de mustar16 Familia de plante cunoscute sub numele generic de mustar cuprinde mai multe specii si subspecii17 ale acestora. In aceasta grupa sunt incluse rapita 18 (canola) si mustarul dar acestea sunt denumiri comerciale si nu stiintifice. Familia mustarului este de fapt Brassicaceae19 (Cruciferae) si este una dintre cele mai bogate, cu peste 40 de genuri si peste 200 de specii salbatice si cultivate. Taxonomia speciilor listate in anexa a fost revizuit, astfel c n prezent, nu exist distinctie ntre diversele subspecii de Brassica juncea. In consecinta, subspeciile denumite Indian, brun, chinezesc sunt considerate simple varietati de Brassica juncea iar mustarul sareptian apare ca un termen a crui existent este legat doar de contextul directivei. 6.1. Brassica juncea (L.) (mustar indian, chinezesc sau brun)

16 17

In directiva : mustard seeds Unele dintre acestea sunt considerate varietati in cadrul speciei. 18 Brassica rapa.( sin. B. campestris) si Brassica napus 19 Genul reprezentativ este Brassica spp.(spre exemplu mustarul salbatic Sinapis arvensis face parte din aceeasi familie)

- 51 -

Este o plant peren de 1-1,5 m provenit din incrucisarea Brassica nigra cu Brassica rapa. Locul de origine este considerat sud-vestul Indiei si Asia unde distributia naturala a celor doua specii s-a suprapus. Inainte de 1940 B. juncea a fost considerata inferioara B. nigra pentru obtinerea mustarului dar din 1940 a fost importata din China o noua varietate20 de B. juncea care a devenit larg cultivata21.

Continutul de substante toxice este reprezentat, ca important, de sinigrina (2propenil-glucozinolat) care dup hidroliza enzimatic (mirozinaza) se transform n alil-izotiocianat22. Sinigrina se regseste n ntreaga plant cu variaii de continut in timpul diferitelor faze de vegetatie si culminnd cu acumularea in seminte pe timpul formrii si maturrii acestora.

Coninutul mediu de alil-izotiocianat din B. juncea este de 0,9 % (0,25-1.4 %). In urma hidrolizei enzimatice rezult i alti compui volatili (metil, butil, benzil) dar
20 21

Cu seminte galbene Spre deosebire de B. nigra, aceasta putea fi recoltata mecanizat. 22 Lichid volatil cunoscut ca ulei de mustar

- 52 -

n concentratii foarte mici. Alil-izotiocianatul este foarte iritant si are efect rubefiant si vezicant asupra tesuturilor. In experientele pe celule ovariene (linie celulara de hamster chinezesc) s-a demonstrat un efect citotoxic de 1000 de ori mai mare23 dect glucozinolatul. Izotiocianatii produc hipotiroidism24 la animalele de experienta iar sinigrina induce aberatii cromozomiale in vitro. In exeperientele de furajare, efectuate pe oi, cu concentratii de 10 mmol/ zi, administrate in furaje granulate la discretie, s-a constatat reducerea consumului dietei si cresterea nivelului de -glutamil-transpeptidaz, ceea ce indic leziuni hepatice. 6.2. Brassica nigra (mustar negru) Este o plant cu crestere rapida, atingnd dimensiuni de pn la 4 m care produce seminte de culoare brun nchis pn la negru (~1 mm ). Originea speciei nu este cunoscut exact dar se presupune c provine dintr-un nucleu mediteranean. Este larg rspndit n sudul si centrul Europei si este o buruian frecvent att n culturi ct si n locuri virane. O treime din masa semintelor de mustar negru este constituit din ulei al crui continut mediu de acid erucic este de 40%.

Ca si celelalte specii, contine sinigrin si implicit alil-izotiocianat ca principii toxice. In afara sinigrinei contine si o proteina termostabila cu rol de factor antitriptic.
23 24

Are activitate citotoxica semnificativa la mai putin de 1 g/ mL Gusa endemica sau hipotiroidismul se manifesta prin hipertrofia tiroidei.

- 53 -

6.3. Brassica carinata (mustar etiopian) Este un hibrid natural rezultat din B. nigra si B. oleracea25, originar din Etiopia unde este cunoscut ca sursa verde si pentru uleiul obtinut din seminte. Este o plant foarte rezistenta la seceta si temperaturi nalte. Ca si celelate specii descrise anterior, semintele au un continut important de glucozinolat. Planta a reprezentat la un moment dat o sursa de ulei de uz nealimentar, n Europa si Canada. Uleiul din semintele de B. carinata are un continut ridicat (~50 %) de acid erucic. 7. Madhuca26 (Madhuca longifolia (L.) Machr.) Madhuca longifolia este un arbore cu coroana larg si foarte dens, cultivat n zone cu clima cald pentru uleiul continut de semintele sale. Din punct de vedere taxonomic, nu se mai face distinctie, conform anexei din directiva, ntre Madhuca longifolia si Madhuca indica, astfel c, acum, acestea sunt considerate sinonime. Uleiul din seminte, care este un ingredient uzual n grasimile hidrogenate utilizate n India, contine acid oleic (46.3 %) si acid linoleic (17.9 %) ca si acizi grasi nesaturati alturi de acid palmitic (17.8 %) si acid stearic (14.0 %) dintre cei saturati. Semintele degresate contin 29.4 % proteina si 9.8 % saponine27. La acest nivel de

concentratie, saponinele sunt componenta toxic actionnd iritant asupra mucoasei digestive si prin hemoliz. Detoxifierea prin tratament termic reduce foarte mult digestibilitatea, nefiind o metod practic. In schimb, prin macinare si extractie cu solventi (2-propanol) se reduce foarte mult concentratia de saponine iar fina astfel

25 26

B. oleracea exista 3 varietati : varza, conopida si gulia. Alte denumiri : Mahua, mowrah, bassia. 27 Termenul este derivat de la Saponaria officinalis plant utilizata din vechime pentru calittile sale de spun. Saponinele sunt glicozizi care se gsesc n multe alte plante (Agrostema githago, Helleborus niger, Aesculus hippocastanum, Asparagus officinalis, etc.)

- 54 -

rezultat constituie o valoroas surs proteic28. Includearea turtelor neprocesate n proportie de 20 %29 n hrana vacilor lactante nu afecteaz consumul hranei, digestibilitatea, productia de lapte, compozitia acestuia.

Fina de seminte neprocesate este de asemenea bine tolerat de ctre vacile lactante. Nu exist suficiente date despre furajarea cu seminte netratate sau fina acestora, a altor specii de ferm n afara rumegtoarelor. In orice caz, prezenta saponinelor toxice este nedorit si ca atare si prezenta semintelor de Madhuca longifolia nu trebuie sa depseasca nivelele de tolerant ale rumegtoarelor. 8. Prunus armeniaca (cais, zarzr) si Prunus dulcis var. Amara (migdal)30

28 29

Pentru alimente si furaje. Din total substanta uscata 30 Inclusiv Prunus virginiana

- 55 -

Familia Rosaceae include multi copaci fructiferi inclusiv caisul si migdalul, la a cror smburi face referire anexa. Plantele din aceasta familie contin n frunze, seminte si radacini, glicozide cianogenice, dintre care, amigdalina 31 este cel mai frecvent si mai important din punct de vedere cantitativ. Amigdalina are o

toxicitate proprie destul de redus. Aceasta se manifest numai cnd smburii fructelor sunt zdrobiti pentru ca s fie posibil activitatea enzimelor care hidrolizeaza amigdalina. In prima faz a hidrolizei, care este efectuat de o -glicozidaz specific, rezult prunasina32 iar apoi prin

intermediul altei -glicozidaze specific prunasinei, rezult mandelonitril si glucoz. Mandelonitrilul (aglicon) este mai apoi metabolizat cu o liaz specific la 4-hidroxi-benzaldehid si HCN33. Nu s-a putut nc stabili un nivel sigur pentru cantitatea de glicozide cianogenice34 ingerat, n mare parte datorit lipsei de informatii toxicologice, cu exceptia HCN pentru care exist mai multe studii efectuate si informatii. In principal, HCN conduce la scderea nivelului de utilizare a oxigenului tisular, provocnd anoxia histotoxic 35. Toate mamiferele sunt sensibile la intoxicatia cu HCN, doza minim letal fiind de ~ 2 mg/kg mc 36. In general rumegatoarele sunt mai sensibile dect monogastricele.

31 32

D-mandelonitril- gentobiozid (agliconul este mandelonitrilul) D-mandelonitril-D-glucozid 33 Migdalele pot contine peste 250 mg HCN/100 g seminte. 34 Aceste substante (inclusiv acidul cianhidric) se gasesc de altfel si in multe nutreturi care compun obisnuit dieta animalelor de ferma (anumite furaje verzi, leguminoase, sorg, etc.). In acest sens, in anexa este mentionat un nivel permis de concentratie pentru HCN in anumite materii prime si nutreturile combinate. 35 Anoxia rezult din inactivarea citocromoxidazei de ctre HCN, care se combin cu Fe3+/Fe2+ din enzim. 36 Unitate de mas corporal.

- 56 -

Subprodusele industriale de la prepararea fructelor uscate, conservate, producerea de gemuri, erau utilizate pentru adaus n hrana animalelor. Cresctorii, nutritionistii si productorii de nutreturi combinate cunosc riscurile utilizrii de astfel de subproduse la care, s-a renuntat n prezent. 9. Fagus silvatica37 (ghind si jir)38 In aceast categorie sunt incluse fructele si semintele arborilor de pdure cum sunt fagul (Fagus silvatica) sau stejarul (Quercus robur) utilizate pentru hrana traditional a porcilor. Aceste produse erau folosite prin administrare n ratie sau psunare direct, n sistem de crestere traditional, pentru porcii la ngrasat, pentru psri sau cprioare.

Resturile rmase dup extragerea uleiului din ghind erau utilizate pentru fabricarea de turte pentru furajarea animalelor. Semne de intoxicatie au fost raportate atunci cnd s-au utilizat turte cu un continut ridicat de coji, administrate la discretie.

37

In anexa directivei apare doar Fagus silvatica dar pentru ca se mentioneaza ghinda si jirul mpreun, am facut referire si la Quercus robur (stejar). 38 In anexa sunt mentionate fructele ntregi (nedecorticate)

- 57 -

Cauza real a intoxicatiilor nu este cunoscut dar se presupune a fi datorat prezentei saponinelor. In mod special, caii sunt mai sensibili, dar majoritatea cazurilor semnalate au implicat rumegtoare. In amestecurile furajere se verific existenta fructelor nedecorticate. 10. Lolium temulentum L. (raigras, zzanie) Intoxicatia cu aceasta specie este cunoscut la animale 39 nc din secolul XIX prin contaminarea finii. Extractele de seminte administrate experimental pe cale oral si intraperitoneal la soareci produc sindrom de depresie gradual a sistemului nervos central, cu com si moarte prin sincop respiratorie. Semintele de Lolium temulentum contin lolina40 (alcaloid pirolizidinic), 6-metil lolina si lolinina41.

39 40

Se cunosc cazuri si la om In 1985 a fost identificata temulina care s-a dovedit mai trziu un artefact de izolare. 41 Studiile de toxicitate individual asupra alcaloizilor au demonstrat o slab toxicitate iar efectele asupra SNC se obtin prin efect cumulat al mai multor alcaloizi.

- 58 -

Partea aerian a plantei contine lolina si un alcaloid cu nucleu fenantrenic, perlolina. Originea alcaloizilor a fost un timp necunoscut dar acum se stie c lolina (alcaloid insecticid) este invariabil produs n simbioz 42 cu fungi din genul Neotyphodium. Astfel, a fost demonstrat c Neotyphodium uncinatum produce, n mediu minimal si n absenta plantei, lolina, N-acetil-norlolina si N-formil-lolina si c acesti alcaloizi nu sunt sintetizati ca rspuns al plantei la infestare 43. 11. Lolium remotum Schrenk Introducerea acestei specii n anexa se datoreaz unui sindrom de psunat, predominant neurologic, care apare n sudul si vestul Australiei. Acesta debuteaz ca urmare a consumului de cantitti mari de seminte cu gale 44 de L. remotum infestat cu un nematod (Anquina agrostis) si o specie de bacterie Clavibacter toxicus45. Amestecul de toxine cuprinde 8 glicolipide a cror actiune se manifest si exeprimental, la miei, cu simptome clinice si leziuni ale creierului. Dozele mai mici, care nu produc intoxicatia, au efect asupra productiei oilor, n special asupra dezvoltrii lnii. L. remotum n absenta semintelor infestate nu prezint pericol pentru animale iar relevanta in Europa a sindromului australian este nedemonstrat. 12. Datura stramonium (ciumfaie) Aceast specie este cunoscut de foarte mult timp pentru propriettile sale toxice46,47. Principalele substante active din compozitia plantei sunt alcaloizi tropanici: atropina, hiosciamina si scopolamina48. Continutul maxim de alcaloizi se regseste n tulpin si frunzele plantei (majoritar hiosciamina) si mai putin n seminte. Actiunea
42 43

Valabil pentru genurile Lolium spp. si Festuca spp. Un exemplu similar este cazul Festuca spp. in cazul infestrii cu Acremonium coenophialum 44 Noduli infestanti formati pe suprafata semintelor 45 Initial a fost descris ca o tulpina de Corynebacterium. 46 Una dintre denumirile traditionale americane face referire la moartea unor soldati britanici in sec XVII intoxicati cu D. stramonium. 47 Si datorita proprietatilor halucinogene (sunt mentionate si cazuri de delir datorate consumului de miere toxic provenit din specii de Rhododendron, Datura stramonium i Hyoscyamus niger ) 48 Se gasesc si n Atropa belladonna si Hyoscyamus niger.

- 59 -

toxic este datorat antagonismului competitiv cu acetilcolina la nivelul receptorilor muscarinici centrali si periferici. Receptorii periferali sunt la nivelul glandelor exocrine, muschilor netezi si cardiac. In urma intoxicatiei se produc paralizii iar consecutiv efectului asupra sistemului nervos central (ca amine tertiare) rezult sindromul anticolinergic central, manifestat cu psihoz acut si delir. Aceste substante se absorb rapid prin mucoasa gastric si intestinal. Timpul de njumttire al atropinei este de ~ 4 ore, prin metabolizarea hepatic (hidroliz) se reduce jumtate din cantitatea initial iar restul este eliminat nemodificat prin urin. Intoxicatia prin psunare direct este mai rar ntlnit la animale pentru c din cauza gustului neplcut, rareori animalele consum suficient material vegetal ca s produc intoxicatia. La rumegtoare mari se manifest prin excitabilitate nervoas, tremor si dezorientare. La rumegtoarele mici (oaie si capra) pe lng simptomele de la rumegtoarele mari, se mai constat instabilitatea trenului posterior si cderi bruste.

Cele mai multe cazuri de intoxicatie se produc prin administrarea de fn sau alte furaje cultivate pentru masa verde, care contin D. stramonium.

- 60 -

Ocazional a fost detectat ca si contaminant n soia 49 din recolte provenite din America de Sud. 13. Claviceps purpurea (ergot50, cornul secarei) Genul Claviceps51 cuprinde specii de fungi foarte specializati care paraziteaz partea floral a unor pioase. Pe timpul parazitrii, ovarul52 florii este nlocuit cu o structur fungal numita sfacel din care n timp se dezvolt sclerotul53. In timpul dezvoltrii acestuia, sporii, denumiti conidii, sunt amestecati cu un lichid de secretie siropos, cu continut ridicat de zaharuri, asemanator cu mierea, care atrage insectele si poate realiza n acest fel diseminarea sporilor. Majoritatea speciilor de Claviceps paraziteaz specific o specie de plant cu exceptia C. purpurea care se poate dezvolta pe mai mult de 200 specii de plante. Sclerotii multor specii de Claviceps contin alcaloizi toxici pentru om si animale. Unele substante sunt utilizate si in scop farmaceutic54 (ergotamina, ergometrina) datorit efectelor exercitate asupra vaselor sanguine, asupra musculaturii netede, etc. Este larg

rspndit n lume, n special n zonele temperate unde sclerotii se pot dezvolta mai bine55. Impactul economic asupra culturilor este de mai mic important. Dintre toate speciile cel mai bine cunoscut este C. purpurea cu denumirea comun de
49 50

Se mai poate ntlni Datura ferox L. care are acelasi continut toxic. Ergot este un termen general utilizat pentru toate speciile de Claviceps. 51 Claviceps purpurea, Claviceps africana, Claviceps sorghi, etc. 52 Ovarul se afla situat la partea inferioara a pistilului (pistilul are doua componente :stigmatul si ovarul) 53 Sclerotul este un tesut fungic dur si compact (dimensiunile sale sunt de cteva ori mai mari dect samnta gazd (dimensiunea sclerotului este diferentiata in functie de dimensiunile semintelor).. 54 Inaintea obtinerii de culturi pure in scopuri industriale, ergotul a fost cultivat pe secar (Secale cereale) 55 Sclerotii nu se dezvolt bine in zone cu clima foarte cald (nu germineaza).

- 61 -

ergot (cornul secarei). Limita tolerat n culturile de cereale variaz de la 0.3 % pentru secar, la 0.1 % n gru sau ovz. Concentratii mai mari influenteaz calitatea recoltelor. Sclerotii de C. purpurea au aspect alungit, drept sau curbat, de 1-4 ori dimensiunea semintei gazd, cilindrici pe sectiune si cu capete rotunjite. Culoarea tipic la exterior este neagr, cu variatii de la rosu-nchis la negru. In interiorul sclerotului culoarea peretilor este de la alb la gri cu aspect rugos. Pe suprafat se pot observa conidii uscate de culoare gri deschis. Conidiile sunt ovale, hialine si au dimensiuni de 4-6 x 2-3 m.

- 62 -

- 63 -

- 64 -

14. Seminte de buruieni, fructe nemcinate si nedecorticate Aceast categorie, care poate cuprinde multe specii de plante, este inclus n anexa directivei si ofer o anumit flexibilitate n cuprinsul listei impurittilor botanice, dar este deschis unor interpretri. Asa cum am mentionat anterior, spre exemplu, n cazul saponinelor56 sau acidului cianhidric57, chiar unele ingrediente obisnuite ale nutreturilor contin astfel de substante iar n alt ordine de idei, toate plantele vasculare contin glicozide. In consecint, n aceast categorie general se pot include buruieni si plante toxice care sunt specifice florei locale 58. In acest scop, trebuie ntocmit o list de plante care se pot regsi n mod obisnuit printre furajele verzi si semintele de cultur si care pot constitui un factor toxic sau un factor limitativ pentru sntatea si nutritia animalelor. Aceast list trebuie s fie la dispozitia fiecrui laborator oficial care execut analiza botanic sau decelarea impurittilor botanice microscopic identificabile. La punctele 1-13 sunt descrise o serie de specii, cu continut toxic, specii dintre care unele exotice. Pe plan local exist ns si unele buruieni, unele nocive, altele nedorite (necomestibile) ca impuritti n culturi sau furaje verzi si care vor fi incluse la acest punct. Plantele necomestibile sunt cele cu tulpini lignificate, cu diametru de peste 5 mm, aspre, cu ghimpi, cu ariste, etc., cum sunt: Xanthium spinosum, Cyrsium
56 57

Vezi si pct. 7 Madhuca longifolia si notele de subsol Vezi si pct. 8 Prunus armeniaca si notele de subsol 58 In afara impuritatilor listate in anexa directivei exista si alte plante (intregi sau seminte ale acestora) specifice tarii, care sunt considerate nedorite in standardele de calitate interne.

- 65 -

arvense, Sonchus oleraceus, Rumex sp., Salvia sp., Lepidium sp., Equisetum sp., ca si cele care provoac leziuni sau ulceratii, cum sunt Bromus tectorum, Setaria verticillata, Holcus lanatus, Stipa pennata, Stipa capillata, etc. Aceste genuri si specii trebuie identificate si cuantificate ca plante ntregi sau portiuni ale acestora n furajele verzi sau uscate. Ocazional, se pot gsi si semintele acestora n cereale59. Unele plante influenteaz negativ calitatea

productiei animalelor, prin modificarea gustului si mirosului normal, cum sunt Arthemisia absinthium, Matricaria chamomilla, Alliaria officinallis, Lepidium draba, pentru lapte sau Allium ursinum pentru carne. Plantele nocive contin substante toxice (alcaloizi, toxalbumine, etc.) care pot provoca uneori chiar moartea animalelor. Unele dintre acestea contin substanta activ n tulpini, frunze si flori, cum sunt Veratrum album si V. nigrum, Datura stramonium, Hyosciamus niger, Solanum nigrum, Xanthium strumarium, Cicuta virosa, Colchycum autumnale, Euphorbia sp., etc. iar altele au fructe si seminte otrvitoare, cum sunt Lolium themulentum, Papaver rhoeas, Agrostemma githago, Delphinium consolida, etc.

59

De regul sunt specii care se gsesc n fnete si nu n culturile de cereale.

- 66 -

ANEXA 1.1

TESTE SUPLIMENTARE PENTRU TESUTURI VEGETALE

Test Agent de clarificare I i II

(3,4)

Reactie vizibila Prin incalzire uoara este clarificat structura matricei Prin flotaie porii rman umplui cu aer

Rezultat posibil Difereniere tesut vegetal/osos Structuri reticulare cu spaii mari, seciuni medulare, etc.

Observatii

Parafina (ulei) (16)

Este util pentru retele sau canale capilare

Testul cu iod/iodura(5)

1. coloraia matricei albastru violet 2. coloraia matricei galben 3. coloraie galben-portocaliu/maron

Amidon Celuloza Proteine Celuloza Substane de infiltrare lignina, suberin Lignina Granulele de amidon sunt gelatinizate Favorizeaz examinarea altor structuri Natura proteinelor nu se poate preciza

Hidroliza cu clorat/acid azotic(11) i testul cu iod(13) Testul cu floroglucinol(20) Hidroliza cu KOH

(10)

1. Coloraie albastr 2. Coloraie galben Coloraie rosie 1. Gelatinizarea substructurilor

2. Preparatul se clarific i capat coloraie rosietic Testul cu actat sau clorura ferica(12) Coloratie cu Sudan IV(14) Coloraie verde / albastr

Taninuri din substrat

Taninuri din substrat

Coloraie rosie

Substante grase, raini, ceruri, uleiuri

- 67 -

3.2

ESUTURI ANIMALE i MINERALE DIN FURAJE

Domeniu de aplicare Acest ghid se va utiliza acolo unde este necesara identificarea i diferenierea componentelor minerale i animale (fragmente de oase, cristale de sare, fosfai, carbonai, etc.) din amestecuri furajere, prin examen microscopic pe baza caracterelor tipice sau testelor de confirmare. Echipament i accesorii (Vezi Anexa 1) . Reactivi (vezi Anexa 2) A. Pregatirea probelor Este necesara o buna omogenizare a probei globale inainte de examinare. Se cantresc cca. 10 g ( 0.001 g) de furaj ntr-un pahar Berzelius de 100 ml i se completeaza la 1/3 cu CHCl3(1). Se amesteca coninutul cu o bagheta i se las n repaus 1 minut. Fracia flotabila (care poate conine fragmente de esuturi, fibre musculare, pr, pene, etc.) se separ cu o spatul de pe suprafaa lichidului intr-o placa Petri ( = 9 cm) i se evapora solventul pe o baie de apa. In funcie de aspectul probei se poate filtra i apoi se concentreaza solventul. Dupa uscare se siteaza reziduul pe site de dimensiuni adecvate dimensiunilor particulelor (0,4, 0,6, 0,8, 1,0). Dupa separarea fraciei flotabile, sedimentul concentrat (care contine fragmente de oase, minerale sau fragmente vegetale lignificate) este reluat cu CHCl3 i trecut cantitativ pe o hartie de filtru uscata i tarata n prealabil. Hartia de filtru cu reziduul se usuc la aer i apoi la etuva la 103 20 C timp de - 1 or. Dupa acest interval se rcete n exsicator i se cantrete (( 0.001 g). Prin diferena fat de tara hartiei goale se determina masa reziduului. B. Examinare B.1. Particule organice Fraciile individuale de pe site se examineaza la stereomicroscop (25 x -50 x) cu iluminare frontal sau lateral la unghi de cca. 450 cu filtru albastru. Suportul

- 68 -

de examinare poate fi sticla mata sau hartie albastr. Se noteaza aspectul particulelor, forma, culoarea, consistenta, rezistenta la presiune. Pentru comparare se recomand folosirea mostrelor de referina. Fragmentele mici din reziduul trecut prin site, se examineaz i la microscop (100 x -400 x) cu condensatorul reglat la putere mica i cu filtru albastru. Pe lama de examinare, cu un strat foarte fin de reziduu se adauga 2 picaturi de agent de clarificare (I)
(3)

i se examineaza sistematic (vezi anexa 2.1). Se adaug apoi pe

lama 1 picatura sol. iod (5) i se reexamineaz : - particulele de amidon sunt colorate n albastru-pal pana la negru, - drojdiile sau alte celule proteice sunt colorate pn la maro inchis. Daca este necesar se poate inclzi o mica cantitate din reziduu cu cca. 5 ml agent de clarificare (II)(4) . Dupa rcire se pun 1-2 picaturi pe o lama microscopica, se acopera cu lamela i se examineaz la microscop. B.2. Particule minerale Din preparatul obinut la pct. A se colecteaz fracia care sedimenteaza (care conine particulele minerale), se indeparteaz solventul prin uscare i se trece sedimentul uscat pe site de dimensiuni diferite (pct. A). Se face examinarea la stereomicroscop (50 x). In general oasele de animale, pete, solzi de pete i fragmente de cochilii sunt identificabile. Formaiunile anorganice (minerale) pot fi recunoscute pe baza formelor acestora.. De exemplu, cristalele de sare sunt de regula cubice i pot fi colorate, calcitul (CaCO3) are forma romboedric, ( vezi anexa 2.2). Deoarece forma cristalelor nu este intotdeauna identificabil (stare amorfa) se efectueaz i teste chimice de recunoastere. C. Teste de confirmare60 Particulele de origine necunoscut (neidentificabile vizual) se aeaza cu o penset pe o placa Petri i se sparg cu atenie prin presarea usoar pe o suprafa plan. Lucrnd sub stereomicroscop, se separ fragmentele la 1-2 cm distana intre
60

n funcie de natura particulelor pot fi efectuate teste adiionale de recunoatere

- 69 -

ele. Lnga fiecare fragment se aeaz o pictur de reactiv iar apoi se mpinge cu penseta fragmentul n mijlocul picturii, urmrind modificrile (vezi anexa ) care au loc la contactul cu reactivul. De preferina, sub placa se aeaza o foaie de culoare neagra pentru o mai buna vizibilitate. Lumina este preferabil s fie natural sau se utilizeaz filtrul albastru, n cazul iluminrii laterale. Testul preliminar trebuie efectuat cu AgNO3
(6)

care poate indica prezena clorurilor i a fosfailor i

face diferena de structurile osoase. Este preferabil ca testele cu soluii de acizi s fie efectuate ca variant suplimentar. D. Calcul i evaluare In cazul n care estimarea cantitativ este necesar se va proceda conform acestui punct. Estimarea cantitativ se poate face global (% de oase i minerale) sau pe grupe de componente ( ex. % de particule minerale sau % de particule osoase) :

R x 100 (a) Reziduu de . ( %) = M

unde : R = masa fraciei (g) de reziduu din sedimentul concentrat M = masa probei (g)

- 70 -

ANEXA 2.1
TESTE DE CONFIRMARE PENTRU MINERALE2
2. Particulele nu se dizolva (dar se dizolva n Test Testul cu AgNO3 KOH/KClO3
(10,11) (6) cu

Oxalat de calciu Rezultat posibil Crbune cochilii probabil sare sau (clorura) calcinate fosfat dicalcic Observatii

HCl)

Reactie vizibila

1. Particule rezistente la aciunea Cristalele devin albe i au reactivilor tendina de expansiune 2. Cristalele capat culoarea galben i apar excrescene aciculare galbene

3. Se formeaz ace de culoare alb, solubile 4. Particulele devin incet negre Testul cu HCl (2)

sulfai de Mn sau Mg fragmente de oase

1. Efervescena puternic 2. Lipsa efervescenei sau de mica intensitate

CaCO3 se efectueaza testele

urmtoare Testul cu molibdat

(7)

1. Formare de cristale galbene la mica distana de particul

fosfat tricalcic, orice os sau roca fosfatic 61

Testul Millon (8)

1. Particulele dezintegrate floteaz i devin de culoare roz-rosietica 2. Particulele dezintegrate floteaz i devin de culoare roz-rosietic i se decoloreaz n cca. 5 min. 3. Particulele se umfl dar ramn n partea inferioar 4. Particulele se dizolva incet

proteine

fosfai din os

roc fosfatica defluorinat

roc fosfatic prezena calciului.

Testul cu H2SO4 (9)

1. Se formeaza cristale aciculare, lungi la adugare de acid sulfuric la soluia acid (HCl) a particulei

Testul CH COOH
(17)

cu

1. Particulele se dizolva cu efervescena

CaCO3

61

( toti fosfaii reactioneaz dar fosfaii mono- i dicalcici se evideniaz cu AgNO3)

- 71 -

ANEXA 2.2

MODELE CRISTALINE

CaCO3 (Calcit)

CaCO3 (Aragonit)

NaCl

Oxalat de calciu

Fosfat monocalcic

Fosfat tricalcic

MgSO4

CaSO4

- 72 -

3.3

ESUTURI ANIMALE DIN FURAJE

Domeniu de aplicare Aceast metod se va utiliza acolo unde detectarea constituenilor de origine animal (definii ca produse de la procesarea carcaselor sau prilor acestora, de la mamifere, pasri sau peti) din furaje, se efectueaza prin examen microscopic. Constituenii de origine animal sunt identificai pe baza caracterelor microscopice tipice ( ex. fibre musculare, pri de oase sau cartilaje, fire de pr, snge, coaja de ou, oase de pete ,etc.). In cazul n care se cere i o apreciere cantitativ a acestor constitueni, se vor urma instruciunile de la subcapitolul Calcul al acestui material. Sensibilitate In funcie de natura constituenilor (< 0.1 %) Echipament i accesorii (Vezi Anexa 1) . Reactivi (vezi Anexa 2) A. Pregtirea probei Este necesar o foarte bun omogenizare a probei globale. Aglomerarile sau granulele se mojareaz usor sau se mrunesc n moar cu cuit la turaie mic (1500-2000 r.p.m.) timp de ~10 sec. In funcie de natura materialului ( numai dac este necesar se mruneste) se iau cel putin 10 g de prob care se impart n dou fracii, una de cel puin 5 g pentru partea filtrat (pe site) i una de cel p utin 5 g pentru sedimentul concentrat. Colorarea i clarificarea cu reactivi este

recomandat pentru identificare (vezi anexa 3.1) B. Examinare: Identificarea constituenilor de natur animal n filtrat O cantitate de min. 5-10 g din prob este trecuta prin site ( 0,1-2 mm) n cel puin dou fracii. Fracia cu dimensiuni >0.5 mm (sau o parte reprezentativa din fracie) se intinde n strat subire pe un suport adecvat i se cauta componenii de origine

- 73 -

animal la stereomicroscop cu diferite puteri de mrire (cel mult 50 x). In stratul(urile) cu <0.5 mm se caut componenii de origine animal la microscopul compus cu obiective diferite . Preparatul se execut prin fragmentarea i clarificarea particulei selectate iar examinarea se face intre lam i lamela. Clarificarea se face iniial cu parafin lichid sau glicerin iar daca nu este suficient pentru identificarea structurilor, clarificarea se efectueaza cu soluie de cloralhidrat (3-4). Identificarea constituenilor din sediment concentrat Se iau cel puin 2 g (cntarite cu precizie 0.001 g) din proba se introduc ntr-un flacon sau intr-o plnie de separare i se adauga 15 ml de CHCl3. Dupa omogenizare, se agit coninutul de mai multe ori i apoi se las n repaus (cel puin 1 i nu mai mult de 2-3) pentru depunerea sedimentului. Se decanteaz supernatantul i sedimentul este uscat la etuva i cntarit repetat pna la masa constant (0.001g). Cntarirea este necesara numai n cazul n care se face o apreciere cantitativ. Sedimentul se examineaza n intregime sau cota parte pentru fragmente de oase, la stereomicroscop i la microscop . C. Calcul i evaluare n cazul n care estimarea cantitativ este necesar, se va proceda conform acestui punct. Calculul poate fi fcut doar dac constituenii conin fragmente de oase. Fragmentele de oase de la animale terestre homeoterme (mamifere i pasri) pot fi deosebite de oasele de pete prin examen microscopic, pe baza vizualizrii lacunelor tipice. Proporia de constitueni de origine animal se poate calcula innd cont de : -proporia estimat (masa %) de fragmente osoase din sediment, i -proporia (masa %) de oase n constituenii de origine animal identificai. Estimarea se face pe baz a cel putin trei (daca este posibil) pna la cinci cmpuri pentru un strat. In nutreurile combinate, de regula, sedimentul nu conine numai fragmente de oase, dar i alte componente cu greutate specifica mare, de exemplu minerale, nisip, fragmente vegetale lignificate sau alte componente asemntoare. Calculul procentual al fragmentelor de oase

- 74 -

Sx c (b) Fragmente de oase % = (animale terestre) W

Sx d (c) Fragmente de oase i solzi % = (pete) W

(S =masa sedimentului [mg], c62= factor de corecie [%] pentru estimarea procentului de oase animale n sediment, d= factor de corectie [%] pentru estimarea procentului de oase de pete i solzi n sediment, W=masa probei prelucrata pentru sedimentare {mg). Estimarea valorii pentru constitueni de origine animal Proporia de oase n produsele animale este variabil. In cazul finii de oase procentul este de 50-60% iar n cazul finii de carne de 20-30%; la fina de pete procentul de oase i solzi este variabil n funcie de specie, n general de 10 -20%. Daca se cunoaste specia de la care provine produsul, se poate calcula coninutul estimat: Coninut estimat de constitueni de la animale terestre (%) Sxc = (i) Wxf Coninut estimat de constitueni de pete (%) Sxd = x 100 x 100

- 75 -

(ii)

Wxf

(S =masa sedimentului [mg], c63= factor de corecie [%] pentru estimarea procentului de oase animale n sediment, d 64= factor de corecie [%] pentru estimarea procentului de oase de pete i solzi n sediment, f = factorul de corecie pentru proporia de oase din constituenii de origine animal din prob, W=masa probei prelucrat pentru sedimentare [mg]). Exprimarea rezultatelor : Pot exista urmatoarele situaii : La capacitatea de identificare la microscop, nu exist constitueni de origine animal (asa cum sunt definii la pct. n proba analizat La capacitatea de identificare la microscop, exist constitueni de origine animal n proba analizat. In acest caz , raportul examinarii poate fi specificat astfel: In funcie de experiena analistului : -Exista constitueni de origine animal. Continuul de fragmente de oase (pete/animale terestre) -In cazul fragmentelor de oase de la animale terestre, eventual specificat de la pasri sau mamifere, este estimat un ordin de mrire de .%, egal cu .% constitueni animali cnd se calculeaza n baza a .% oase n constitueni animali utiliznd factorul de corecie f, -sau, au fost gasii constitueni de origine animal n cantitai msurabile. Pentru situaiile cnd oasele animalelor terestre au fost identificate, raportul trebuie sa conin date suplimentare, astfel : -Posibilitatea ca urmtorii constitueni s fie derivai de la mamifere, nu poate fi exclus; Aceasta clauza nu este necesar daca fragmentele de oase de la animale terestre au fost identificate ca aparinnd pasri lor sau mamiferelor.
63

Factor de corecie estimat de ctre analist n sediment Factor de corecie estimat de ctre analist n sediment

64

- 76 -

Recomandri Se recomand ca, n cazul constituenilor voluminoi i n cantitate mare, sedimentul obinut la filtrare s fie mprit n doua fracii (de exemplu utilizarea unei site cu ochiuri de 250 m [ 0.3]). Fraciunea cu constitueni voluminoi poate fi examinat ca preparat cu ulei de parafin iar fraciunea cu particule fine trebuie examinat la microscop. Sedimentul concentrat, dac este necesar, poate fi divizat mai departe utiliznd un agent de concentrare cu densitate mai mare sau poate fi examinat prin splari succesive cu ap i cloroform (sau clorur de metilen). n funcie de experienta analistului, identificarea originii poate fi fcut utiliznd un preparat specific histologic, prin care se face compararea cu preparatul probei. ANEXA 3.1
TESTE SUPLIMENTARE PENTRU TESUTURI ANIMALE65

Test Agent de clarificare I i II (3,4) Parafina (ulei) (16) Testul Bradford(15)

Reactie vizibila Prin incalzire usoar este clarificata structura matricei

Rezultat posibil Difereniere esut vegetal/osos

Observatii

Prin flotaie porii raman umplui cu aer Reactiv specific pentru proteine coloraie albastr

Structura osoasa

Structuri proteice (esut muscular/osos)

Testul cu iod/iodura(5)

1. coloraia matricei albastru violet 2. coloraia matricei galben 3. coloraie galbenportocaliu/maron Coloraie roz la inclzire usoar

Amidon

Celuloza Proteine Componente osoase

Testul Millon(8) Testul pt. cistina(18)

Coloraie neagra/maronie la inclzire usoar

Constitueni cu cistina pr, fanere

65

A se compara i cu Anexele 1.1 , 2.1, i 2.2 pe timpul lucrului

- 77 -

ANEXA 1
APARATURA SI MATERIALE PENTRU MICROSCOPIE Stereomicroscop cu iluminare ( 15-20 W) laterala/frontal i transmis cu filtre pentru vizualizare albastru (pentru culoarea natural), verde (pentru fluorescen), alb mat (antireflexie). Oculare necesare : 10 x (cu rigla de msurare), 16 x, 32 x. Obiective stereo: 1 x i 1,6 x. Microscop compus, binocular inclinat , lumina transmis (30-100 W), condensor

reglabil, dispozitiv contrast. Oculare necesare : 7 x, 10 x. Obiective apocromatice : 6 x, 10 x, 20 x, 40 x i pentru imersie 90-100 x. Balana analitic ( 0,001 g) Site circulare inoxidabile cu diametrul ochiurilor de la 5 mm 0,1 mm i vas de captare. Moara electric de laborator cu cuit ( turaie utila de la 1000 la 5000 rpm) Mojar cu pistil pentru omogenizarea probelor cu solveni Placi Petri de = 90-150 mm Lame de sticla standard pentru microscopie i lamele Placi de plastic transparent (55 x 100 mm) pe care se traseaza cu un vrf ascuit linii paralele (4,5 mm) la distana de 2 mm. Spatula i microspatule Pensete dreapta i curba cu vrfuri ascuite i plate, bisturiu sau cutter Micropipete ( volum util 5-200 L) Pipete cu volum util de 1, 5, 10 mL Centrifuga de laborator ( 6 x 10 mL) 1000-7000 rpm Lampa UV -365 nm (15-30 W) Lampa de examinare (150 W mat). Sticlrie de laborator : eprubete, pahare Berzelius ( 100, 300, 800 mL), pahare Ehrlenmeyer (100, 300 mL cu slif i dop), plnii de separare (100-500 mL), plnii de filtrare. Hrtie de filtru (porozitate medie i mica) Watman nr. 40-42.

78

ANEXA 2
REACTIVI66 PENTRU MICROSCOPIE 1) CHCl3 67 p.a. 2) HCl diluat (1:1) : 1 parte HCl + 1 parte ap 3) Agent de clarificare (I) : amestec de 10 g cloralhidrat/ 10 ml apa/ 10 ml glicerina 4) Agent de clarificare (II) : amestec de 160 g cloralhidrat n 100 ml apa + 10 ml HCl 5) Iod solutie: 0,75 g KI + 0,1 g I2 n 30 ml ap la care se adaug 0,5 ml HCl (1:1) 6) AgNO3 soluie 10 % n ap 7) Molibdat de amoniu soluie : 10 g molibdat + 100 ml HNO3 se completeaz la 1000 ml. 8) Reactiv Millon (conine azotat mercuric) 9) H2SO4 diluat (1:1) : 1 parte H2SO4 + 1 parte apa 10) KOH soluie 5 % 11) KClO3 : se amestec 0,5 g KClO3 cu HNO3 (diluat 1:1) 12) Fe(CH3COO)3 sau FeCl3 soluie 1 % n ap (se prepar extempore) 13) Iod soluie : ZnCl2 100 g se amestec cu 60 ml ap n flacon cu dop la care se adaug 20 g KI i 0.5 g I2. Se adaug cateva cristale de I2 n amestec pentru saturare i se las n repaus 14) Sudan IV soluie alcoolic aprox . 0.09 % 15) Reactiv Bradford (utilizat pentru detectarea proteinelor) 16) Parafina (ulei) 17) CH3COOH diluat (1:1) : 1 parte CH3COOH + 1 parte apa 18) Reactiv pentru cistin ( 2 g acetat de plumb + 10 g NaOH se dizolva n 100 ml apa) 19) Rodamina 6G soluie alcoolic 0,5 % 20) Floroglucinol soluie : se amestec 8 g floroglucinol cu 20 ml HCl concentrat i se completeaz la 100 ml cu alcool etilic. 21) Medii utilizate pentru obiectivele de imersie (recomandate glicerina i uleiul de cedru)

Mediu lichid Glicerina Ulei de cedru Anisol Monobrom-naftalena

66 67

nd 1.47158 1.51525 1.5163 1.65820

Apertura 1.35 1.40 1.40 1.60

In funcie de natura componentelor identificate se pot folosi i ali reactivi care pot servi la identificarea matricei. Se poate utiliza i tetracloretan (d= 1,62)

- 79 -

ANEXA 3
STANDARD ISO 12.5 mm a 68 11.2 mm 8.5 mm 8.0 mm 6.7 mm 6.3 mm 5.6 mm 4.75 mm 4.00 mm 3.35 mm 2.80 mm 2.38 mm 2.00 mm 1.70 mm 1.40 mm 1.18 mm 1.00 mm 850 m 710 m 600 m 500 m 425 m 355m 300 m 250 m 212 m 180 m 150 m 125 m 106 m 90 m 75 m 63 m 53 m STANDARD USA in.a 7 /16 in 3 /8 in 3 /16 in 0.265 in. in.a Nr 3 Nr 4 Nr 5 Nr 6 Nr 7 Nr 8 Nr 10 Nr 12 Nr 14 Nr 16 Nr 18 Nr 20 Nr 25 Nr 30 Nr 35 Nr 40 Nr 45 Nr 50 Nr 60 Nr 70 Nr 80 Nr 100 Nr 120 Nr 140 Nr 170 Nr 200 Nr 230 Nr 270 DESCHIDERE NOMINALA (inch) 0.500 0.438 0.375 0.312 0.265 0.250 0.223 0.187 0.157 0.132 0.111 0.0937 0.0787 0.0661 0.0555 0.0469 0.0394 0.0331 0.0278 0.0234 0.0197 0.0165 0.0139 0.0117 0.0098 0.0083 0.0070 0.0059 0.0049 0.0041 0.0035 0.0029 0.0025 0.0021 DIAMETRU NOMINAL AL FIRELOR SITEI (mm) 2.67 2.45 2.27 2.07 1.87 1.82 1.68 1.54 1.37 1.23 1.10 1.00 0.900 0.810 0.725 0.650 0.580 0.510 0.450 0.390 0.340 0.290 0.247 0.215 0.180 0.152 0.131 0.110 0.091 0.076 0.064 0.053 0.044 0.037

68

Aceste dimensiuni nu sunt standardizate dar sunt incluse pentru c sunt utilizate frecvent

- 80 -

BIBLIOGRAFIE

1. *** Council Directive 1999/29/EC of 22 April 1999 on the undesirable substances and products in animal nutrition (E.C.O.J. n L 115 of 04/05/1999,) 2. *** Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7 May 2002 on undesirable substances in animal feed (E.C.O.J. n L 140 of 30/5/2002, p. 10). 3. Abdel-Fattah, M., Rizk, A.M. and Hussiney H.A. 1991. Chemistry and toxicity of Lolium species. In: Poisonous Plant Contamination of Edible Plants (eds. Rizk A.F.M. and Hussiney H.A.), pp. 95-106. CRC Press Inc, Baton Rouge, USA. 4. Adeyemi, O.A., Balogun, M.O. and Fasina, 2001. Response of finishing broilers to graded levels of boiled Jatropha seeds , Ind. J. Anim. Sci. 71, 800-803. 5. Ahmed, O.M.M. and Adam, S.E.I. 1979. Effects of Jatropha curcas on calves. Vet. Pathol. 16, 476-482. 6. Astwood E.B., Greer, M.A, Ettlinger, M.G. (1949): J. Biol. Chem. 181, 121. 7. Basu, A.K., Ghosh, A. and Dutta, J. 1973. Fatty acid composition of mustard (Brassica nigra) seed oil by gas-liquid chromatography. J Chromatogr.86, 232233. 8. Berkov, S. and Philipov, S. 2002. Alkaloid production in diploid and autotetraploid plants of Datura stramonium. Pharm. Biol. 40, 617-621. 9. Blankenship, J.D., Spiering, M.J., Wilkinson, H.H., Fannin, F.F., Bush, L.P.si Schardl, C.L., 2001. Production of loline alkaloids by the grass endophyte, Neotyphodium uncinatum, in defined media. Phytochem. 58, 395-401. 10. Budin, J.T., Breene,W.M. and Putnam, D.H. 1995. Some compositional properties of camelina (Camelina sativa L. Crantz) seeds and oils. J. Am. Oil Chem. Soc. 72, 309-315.

- 81 -

11. El Dirdiri N.I., Wasfi I.A., Adam S.E.I.. Toxicity of Datura stramonium to sheep and goats. Vet. Hum. Toxicol. 23, 242-246, (1981) 12. Fenwick, G., Heaney, R. and Mullin, W. 1983. Glucosinolates and their breakdown products in food and food plants. CRC, Crit.Rev. Food Sci. Nutr. 18, 123-201. 13. Gao, Z.C., Jiang,Y.X., Li, J.F., Hou, S.S., Li, J. and Liu, X.M. 1989. Performance of growing-fattening pigs fed with glandless cottonseed meal. Chinese oeJ.Anim. Sci. 25 , 13-16. 14. Rangkadilok, N., Nicolas, M.E., Bennett, R.N., Premier, R.R., Eagling, D.R. and Taylor, P.W.J. 2002. Developmental changes of sinigrin and glucoraphanin in three Brassica species (Brassica nigra, Brassica juncea and Brassica oleracea var. italica). Scientia Horticulturae, 96, 11-26. 15. Dini Luciana , Food microscopy/microstructure, Dipartimento di Scienze, Universita de Lecce, 2000. 16. B. Herman and J. J. Lemasters (eds.), Optical Microscopy: Emerging Methods and Applications. Academic Press, New York, 1993,

- 82 -