Caracterizao da cintica da reao de hidrlise do pnitrofenil acetato a p-nitrofenol na ausncia e presena da enzima -quimiotripsina, efeito da temperatura e do pH

A. Alves Rodrigues A. I. Alves dos Reis Almeida B. N. Santana Pinto V. Leite

RESUMO: Para estudar a hidrlise do p-nitrofenil acetato (PNPA) a p-nitrofenol (PNP) em presena e ausncia
da enzima -quimotripsina (-CT), foram variados alguns parmetros para determinar as melhores condies da hidrlise, como pH em 7,4 e 10,0 e a temperatura em 25C, 35C 45C e 60C. Para fins comparativos foram feitas anlises com solues de tirosina (Tyr) e triptofano (Trp). Analisou-se a cintica da reao atravs de duas tcnicas; a espectrometria de absoro UV/Vis e fluorescncia. Com os resultados obtidos por essas tcnicas, foi estimada a energia de ativao para o pH 7,4 e 10, a ordem da reao, a velocidade mxima (Vmx) para a reao catalisada e a temperatura de desnaturao da -CT. As temperaturas de desnaturao encontradas foram T = 48,10,428 C para pH 7,4 e T = 48C para pH 10. Para pH 7,4 sem enzima Ea = 62 kJ/M , com enzima Ea = 22 kJ/M; para o pH 10,0 sem enzima Ea = 8,6 kJ/M, com enzima Ea = 28 kJ/M. A reao de primeira ordem.

PALAVRAS CHAVE: -quimiotripsina, PNPA, PNP, Cintica, pH e Temperatura

I. INTRODUO O objetivo da pesquisa realizar um estudo a respeito da hidrlise do PNPA a PNP considerando o efeito da temperatura e do pH. A fim de analisar a eficincia da -CT como catalizador foi feita a reao na presena e ausncia dessa enzima. A hidrlise do PNPA para PNP ocorre quando uma molcula de gua ataca o carbono da carbonila do PNPA, gerando por fim uma molcula de lcool e um cido carboxlico [Figura 1] [1].

Figura 1 Reao de hidrlise de um ster a acido carboxlico Essa reao influenciada pelo pH do meio e pela temperatura. Quando o pH 7 temos mais ons hidrxidos disponveis no meio, de forma que a reao deslocada no sentido dos produtos, logo a velocidade da reao aumenta. Com aumento da temperatura do sistema as molculas adquirem mais energia cintica, o que aumenta o choque entre elas, consequentemente h maior formao de produtos e aumento da velocidade de reao. A -CT uma protena encontrada no intestino bovino, composta por 245 aminocidos [2] e massa molar de 24800 g/mol [3]. Seu pH de funcionamento timo 8. Essa protena capaz de clivar ligaes peptdicas entre aminocidos, onde pelo menos um deles tenha cadeia lateral aromtica. A -CT tambm pode ser empregada para catalisar reaes de hidrlise de p-nitrofenil steres [3]. Por ser uma protena a -CT tem uma estrutura tridimensional que mantida por interaes fracas do tipo ligaes de hidrognio, pontes dissulfeto, interaes hidrofbicas, foras de van der Waals e interaes eletrostticas (pares inicos), as quais podem ser rompidas por agentes desnaturamtes, como o pH, temperatura e estresse mecnico. Com o aumento da temperatura a velocidade de vibrao molecular aumenta e as interaes fracas so rompidas. Alteraes no pH modificam o estado inico das cadeias laterais dos aminocidos o que interfere nas ligaes de hidrognio e nas interaes eletrostticas [4]. Foram empregadas tcnicas de espectrometria de absoro UV/Vis e fluorescncia em nossas anlises. O PNPA e PNP absorvem em diferentes comprimentos de onda na tcnica de espectrometria de absoro UV/Vis, o que possibilita analisar o andamento da hidrlise com a variao da absorvncia em um determinado comprimento de onda. A -CT possui trs aminocidos que so sensveis a tcnica de fluorescncia; a tirosina, o triptofano e a fenilalanina, pois estes possuem grupos aromticos. Assim podemos analisar a desnaturao da -CT consoante temperatura empregada. II. MATERIAIS E METODOS II.1 Aparelhagem Nesse experimento foram utilizados: pipetas volumtricas, pipetador automtico, bqueres, bales volumtricos, balana analtica, cuvette de quartzo, banho termosttico, termmetros, tubos de ensaio, eppendorfs, banho de gelo, espectrofotmetro de absoro UV/Vis, fluormetro, erlenmeyer.

II.2 REAGENTES Nesse experimento foram utilizados: tampo fosfato 10mM a pH = 7,4 com 0,15M NaCl, tampo fosfato 10mM a pH = 10 com 0,15M NaCl, tampo etanol 95:5 (% v/v) pH = 7,4, tampo etanol 95:5 (% v/v) pH=10, p-nitrofenol 1mM em gua:etanol 95:5, p-nitrofenil acetato 10mM em etanol, soluo de tirosina, soluo de triptofano e soluo de -CT.

II.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A partir da soluo de PNP inicial, preparou-se cinco solues de 5 mL cada, utilizando como solvente o tampo etanol a pH 7,4, com as seguintes concentraes: 110-5M, 2.510-5M, 510-5M, 7.510-5M e 110-4M. Foram tambm preparadas as mesmas solues, porm o solvente era o tampo etanol a pH 10. Utilizando um espectrofotmetro de absoro UV/Vis, foi feita uma varredura de 250nm a 500nm da soluo mais concentrada para cada um dos pHs, foi observado para ambos que a maior absorvncia ocorria quando = 401nm. Esse valor de foi fixado e ento foi medido a absorvncia das cinco solues em pH 7,4 e para as cinco solues em pH 10, dessa forma foram obtidas curvas de calibrao do PNP. Para analisar a hidrlise do PNPA a PNPA sem enzima, utilizou-se a soluo de PNPA inicial para preparar 2mL de solues de PNPA em tampo etanol pH 7,4 e tampo etanol pH 10 com as seguintes concentraes: 1,2103M, 0,610-3M. As solues e o tampo foram mantidas no banho de gelo, a fim de evitar que a hidrlise comeasse a ocorrer. Essas solues foram diludas vinte vezes em tampo arrefecido e foi retirado 1 mL dessas e colocado em um eppendorf no banho de gelo. Os erlenmeyers contendo o restante das solues foram colocados em banhos trmicos com diferentes temperaturas (25C, 35C e 45C). A tempos predeterminados retirou-se 1 mL de cada soluo e colocou-se em eppendorfs numerados no gelo. Esses foram submetidos a anlise do espectrofotmetro de absoro UV/Vis para determinar suas absorvncias. Alm disso, preparou-se 5mL de solues de -quimiotripsina, tirosina e triptofano com concentrao de 10 M cada, a soluo de -quimiotripsina foi guardada no gelo. O procedimento foi feito em duas temperaturas diferentes, para isso, tanto as solues de aminocidos como a soluo de enzima foram dividas em duas fraes iguais, sendo uma delas colocada num banho a 25C e a outra parcela a 60C. Em seguida foram feitas os espectros de absoro para determinar o mx de todas as solues, como a absorvncia foi superior a 0,1 para as solues de -quimiotripsina, essas foram diludas. Todas as solues foram utilizadas para fazer os espectros de fluorescncia, fixando-se o mx encontrado. Avaliou-se tambm a estabilidade da enzima atravs de uma rampa de temperatura. Procedeu-se de modo que as mesmas solues de aminocidos e enzima utilizadas anteriormente foram submetidas ao Fluormetro. Com base no mx encontrado na fluorescncia, fixou-se o par ex/ em no fluormetro, variou-se a temperatura de 25C a 60C com a velocidade de 1C/min e em seguida foi feito o arrefecimento at 25C com a mesma velocidade. Por fim analisou-se o efeito da -quimiotripsina na hidrlise do PNPA a PNP. A partir da soluo inicial de PNPA preparou-se solues em etanol com cinco concentraes: 2.5x10-4 M, 6x10-4 M, 1,2x10-3 M, 2,5x10-3 M, 5x10-3 M. A seguir foi preparado 10mL de uma soluo de -quimiotripsina a 200 M em tampo, todas as solues foram colocadas em banho de gelo. Uma amostra de tampo foi levada ao banho termosttico para cada temperatura utilizada no experimento; 25C, 35C e 45C. Em cada cuvette foi colocado 2,74mL de tampo, 100 L de -quimiotripsina 200 M e aps agitar por inverso se adicionou 150 L da soluo de p-nitrofenil acetato em etanol, colocou-se primeiro a soluo de PNPA mais diluda e posteriormente repetiu-se para as outras solues, incluindo a soluo inicial de PNPA com concentrao 1x10-2 M. II.4 MTODOS Para as anlises foi levado em conta a Lei de Beer- Lambert

A= lc
Onde A = absorvncia, = coeficiente de absortividade molar (L. mol-1. cm-1), c = concentrao (mol.L-1) e l = caminho ptico = 1 cm Foi empregada a ferramenta Solver do Microsoft Excel 2010 para criar linhas de ajuste para as seguintes equaes: Equao cintica para reaes de primeira ordem

[PNP]= (1- exp(-kt)) x [PNPA]0

Equao cintica para reaes de segunda ordem

[
Equao de Michaelis-Meten:

]=[

A]

[ [

A] A]

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

=
Equao de Arrhenius:

l
III. RESULTADOS

=l A

Ao fazer a curva de calibrao do PNP foi possvel obter o valor da absortividade molar que dada pela inclinao da reta. Todos os resultados obtidos esto expostos na tabela abaixo.

Amostra a pH 7,4 1 2 3 4 mdio

Absortividade molar () 12565 16322 15196 16322 157591770 5 6 7 ---

Amostra a pH 10

Absortividade molar () 19216 18107 18036 --18107662

mdio

Tabela I: Absortividades molares a pH 7,4 e pH 10 O Grfico I apresenta a curva de calibrao feita para amostra 3, o valor de obtido pelo coeficiente angular da reta. As outras amostras foram submetidas ao mesmo tratamento.

Curva de calibrao PNP

amostra 3
1 Absorvncia 0,8 0,6 0,4 0,2 0,391 0,175 2,00E-05 4,00E-05 6,00E-05 0,781 y = 15196x + 0,0184 R = 9,99E-01 Absorvncia Linear (Absorvncia)

0 0,00E+00

Concentrao mol/L

Grfico I: Curva de Calibrao do PNP para a amostra 3

A partir da Lei de Beer-Lambert obtiveram-se as concentraes de PNP formado ao logo do tempo de hidrlise e criou-se um grfico. Para descobrir a ordem da reao utilizou-se um modelo de equao de primeira ordem, a ferramenta Solver do Excel ajustou a equao ao grfico ao variar o valor da constante de velocidade (k). Atravs desse ajuste obteve-se um valor para a constante de velocidade de primeira ordem e tambm a soma dos quadrados das distncias entre os pontos experimentais e os de ajuste. No Grfico II e no Grfico III as concentraes experimentais foram encontradas considerando = 151961770 L.mol-1.cm-1 na equao de Beer-Lambert.

Velocidade da hidrlise do PNPA

4,00E-05 3,50E-05 3,00E-05 [PNP] (M) 2,50E-05 2,00E-05 1,50E-05 1,00E-05 5,00E-06 0,00E+00 0,00 3.000,00 6.000,00 9.000,00 12.000,00 Tempo (s)

Experimental Ajuste de 1 ordem

Grfico II: Velocidade de hidrlise do PNP para amostra 3 e ajuste de 1 ordem

Amostra 1 2 3 4 5 6 7

pH 7,4 7,4 7,4 7,4 10 10 10

K1 1,62E-05 5,08E-05 8,67E-05 7,60E-05 1,81E-02 1,88E-02 1,45E-02

Tabela II: Constantes de velocidade para ajuste de 1 ordem Utilizando novamente o Solver fez-se tambm o ajuste para uma reao de 2 ordem, que pode ser visto no grfico abaixo.

Velocidade de hidrlise de PNPA

4,00E-05 [PNP] (M) 3,00E-05 2,00E-05 1,00E-05 0,00E+00 0 5000 10000 15000 Tempo (s) Ajuste de 2 ordem Experimental

Grfico III: Velocidade de hidrlise do PNPA para a amostra 3 e ajuste de 2 ordem Como a soma dos quadrados das distncias entre os pontos experimentais e de ajuste para a reao de 1 ordem menor do que para a de 2 ordem, conclui-se que a reao de hidrlise de PNPA a PNP uma reao de 1 ordem. Obteve-se os espectros de fluorescncia para a tirosina, o triptofano e a -quimiotripsina as temperaturas de 25C e 60C para os valores de pH 7,4 e 10. Para uma melhor comparao dos resultados juntou-se os espectros a pH 7,4 no Grfico IV. Para pH 10 os resultados obtidos foram semelhantes aos do pH 7,4.

Espectros de Fluorescncia a 25C e 60C pH = 7,4

200 Intensidade (a.u.) 150 100 50 0 250 290 330 370 410 450 490 Comprimento de onda (nm) a-CT - 2uM - 25C Trp - 10uM - 25C Trp - 10uM - 60C a-CT - 1,4uM - 60C Tyr - 10uM - 25C Tyr - 10uM- 60C

Grfico IV: Espectros de Fluorescncia da enzima e dos aminocidos a 25C e 60C A tabela III expressa os valores de mx encontrados atravs da fluorescncia.

Solues mx a 25C mx a 60C

-CT 337

Triptofano Tirosina 357 304

355

357

304

Tabela III: Resultados obtidos a partir dos espectros de fluorescncia Com base nos mx obtidos, foram feitas rampas de temperaturas usando fluorescncia para as diferentes solues.

Rampa de Temperatura -CT 2uM e Trp 10uM pH 7,4

160 140 120 100 80 60 40 20 0 20 30 40 Temperatura 50 60 Intensidade (.au.)

Trp (25C - 60C) Trp (60C - 25C) a-CT (25 - 60C) a-CT (60C - 25C)

Grfico V: Rampa de Temperatura da -CT e do Trp de 25 a 60C e de 60 a 25C Com base nos pontos obtidos no grfico acima para a -CT, foi possvel estimar a temperatura de desnaturao e a frao desnaturada utilizando a funo distribuio normal como forma de ajuste. Este resultado pode ser visualizado no Grfico VI.

Temperatura de desnaturao -CT 2uM

e frao desnaturada pH 7,4
70 60 Intensidade (a.u.) 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (C) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Experimental Ajuste Frao desnaturada

Grfico VI: Temperatura de desnaturao e frao desnaturada para a amostra 8

Temperatura de desnaturao -CT 1uM

e frao desnaturada pH 7,4
50 Intensidade (a.u.) 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (C) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Ajuste Experimental Frao desnaturada

Grfico VII: Temperatura de desnaturao e frao desnaturada para a amostra 9

Temperatura de desnaturao -CT 1,3uM

e frao desnaturada pH 10
80 70 Intensidade (a.u.) 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (C) 0,2 0 0,8 0,6 0,4 Ajuste Experimental Frao desnaturada 1,2 1

Grfico VIII: Temperatura de desnaturao e frao desnaturada para a amostra 10

Amostras pH [-CT] Molar Temperatura de desnaturao (C) % da forma desnaturada a temperatura de desnaturao (C)

8 7,4 2,0x10-6 47,76 48,38

9 7,4 1,0x10-6 50,45 52,72

10 10 1,3x10-6 48,00 50,88

% desnaturada a 25C % desnaturada a 35C % desnaturada a 45C

0,00 0,12 22,58

0,00 0,00 7,41

0,00 0,05 22,49

Tabela IV: Dados obtidos atravs das rampas de temperatura Foi feito o estudo da velocidade da hidrlise do PNPA na presena da enzima. Preparou-se solues com seis concentraes diferentes de PNPA para cada pH a temperaturas predeterminadas e ento foi adicionada a enzima. A reao foi acompanhada atravs de espectrometria de absoro UV/Vis. Com os resultados obtidos, foram construdos grficos de [PNPA] por tempo para as diferentes solues, foram considerados os primeiros pontos como pode ser visto abaixo.

Velocidade inicial hidrlise PNPA 1,25E05 M

pH 7,4 35C com enzima
8,00E-06 [PNPA](M) 6,00E-06 4,00E-06 2,00E-06 0,00E+00 0 20 Tempo (s) 40 60 y = -5,89E-08x + 6,98E-06 R = 9,98E-01

Experimental Linear (Experimental)

Grfico IX: Velocidade inicial para a hidrlise de PNPA com enzima a temperatura 35C Todos os grficos obtidos apresentaram o mesmo comportamento, mas com velocidades iniciais diferentes, como se pode perceber na Tabela V.

Amostra 1 pH7,4 25C Amostra 2 H 7,4 35C Amostra 3 pH 7,4 45C Amostra 4 pH 7,4 45C Amostra 5 pH 10 25C Amostra 6 pH 10 35C Amostra 7 pH 10 45C [PNPA] Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) 1,25E-05 5,71E-08 4,14E-08 5,78E-08 7,86E-08 8,53E-08 8,84E-08 1,03E-07 3,00E-05 7,00E-08 5,43E-08 7,97E-08 1,08E-07 7,23E-08 1,50E-07 1,52E-07 6,00E-05 8,25E-08 6,13E-08 1,29E-07 1,31E-07 1,28E-07 6,44E-08 2,21E-07 1,25E-04 8,24E-08 --2,00E-07 1,99E-07 1,64E-07 1,52E-07 2,84E-07 2,50E-04 9,28E-08 --1,95E-07 1,24E-07 1,81E-07 2,20E-07 3,88E-07 5,00E-04 8,54E-08 6,77E-08 1,98E-07 1,34E-07 2,19E-07 2,28E-07 4,05E-07
Tabela V: Velocidades iniciais obtidas a diferentes condies de temperatura e pH para seis concentraes de PNPA. A velocidade inicial corresponde ao valor negativo da inclinao da reta. Utilizando a equao de MichaelisMenten e os grficos de velocidade inicial em funo da [PNPA] foi possvel determinar as constantes k2 e KM.

pH 7,4 35oC
2,00E-07 Velocidade (mol/s) 1,50E-07 1,00E-07 5,00E-08 0,00E+00 0,00E+00 1,00E-04 2,00E-04 3,00E-04 4,00E-04 5,00E-04 6,00E-04 [PNPA] (M)

k2 e KM

Ajuste Experimental

Grfico X: Grfico obtido atravs da equao de MichaelisMenten para k2 e KM Os grficos para as demais amostras so semelhantes ao anterior, porm os valores de k2 e KM so diferentes. Foi tambm possvel obter a velocidade mxima das reaes utilizando a equao de Michaelis-Menten novamente.

1,50E+07 1,20E+07 1 / V (s/mol) 9,00E+06 6,00E+06 3,00E+06 0,00E+00 0,00E+00

Vmax pH 7,4 35o C

y = 1,00E+02x + 5,00E+06 R = 1,00E+00

Experimental Linear (Experimental)

2,00E+04

4,00E+04

6,00E+04 (mol-1)

8,00E+04

1,00E+05

1 / [PNPA]

Grfico XI: Grfico obtido atravs da equao de MichaelisMenten para Vmx A Tabela VI mostra todos resultados de k2 , KM e Vmx

Amostra

Temperatura (C)

pH

K2

KM

Vmx

11 12 13 14

25 35 45 45

7,4 7,4 7,4 7,4

1,35E-02 1,03E-02 3,00E-02 2,34E-02

7,49E-06 8,17E-06 2,00E-05 1,08E-05

9,01E-08 6,86E-08 2,00E-07 1,56E-07

15 16 17

25 35 45

10 10 10

3,36E-02 3,44E-02 6,85E-02

4,31E-05 3,91E-05 6,07E-05

2,24E-07 2,28E-07 4,46E-07

Tabela VI: Valores de k2, KM e Vmx para diferentes valores de pH e temperatura Utilizando os valores de k1 para a reao sem enzima e k2 para a reao com enzima, foi possvel descobrir as energias de ativao para pH 7,4 e pH 10. Para tal utilizamos a equao de Arrhenius.

Energia de ativao a pH 7,4

3,12E-03 3,18E-03 3,24E-03 3,30E-03 3,36E-03 3,42E-03 0,00E+00 -1,00E+00 Ln K2 -2,00E+00 -3,00E+00 -4,00E+00 -5,00E+00 1 / Temperatura (K-1) y = -2,65E+03x + 4,73E+00 R = 4,70E-01 Experimental Linear (Experimental)

Grfico XII: Energia de ativao Descobriu-se que para a reao sem enzima Ea = 61527,09 kJ/M para pH 7,4 e Ea = 8647,05 kJ/M para pH 10. Para a reao com enzima Ea = 22033,35 kJ/M para pH 7,4 e Ea = 27853,48 kJ/M para pH 10.

IV. DISCUSSO A absortividade molar das solues em pH 7,4 e pH 10 foram diferentes. Isso deve-se ao fato que a valores de pH elevado o grupo hidroxila do PNP pode liberar um prton e ionizar o PNP, dando-lhe uma carga negativa que aumenta a absortividade. Para a reao sem enzima os valores de k1 em pH 10 so cerca de 1000 vezes maiores do que para pH 7,4. Tal fato ocorre devido a maior quantidade de OH- a pH 10, que chega a ser 800 vezes maior do que em pH 7,4. A reao de hidrlise do PNPA a PNP dependente do pH, logo como o pH maior a velocidade da reao aumenta. De acordo com o Grfico IV, quanto maior a temperatura menor a intensidade da fluorescncia independentemente do pH. Isso se deve ao fato de que a temperaturas mais elevadas as molculas podem perder energia de forma no radiativa. Alm disso, fica claro que a temperatura de 60C o mx da -CT se aproxima ao do triptofano. A -CT possui em sua cadeia polipeptdica resduos de triptofano, que aps a desnaturao so expostos e alteram o mx, uma vez que o principal responsvel pela fluorescncia dentre os aminocidos aromticos que compem a enzima. Assim a alterao do mx um indicativo da desnaturao da protena. Analisando o Grfico V, observou-se que independentemente do pH a -CT desnaturada com o aumento da temperatura e no h renaturao ao retornar a temperatura inicial. Um indicativo desse fato que a rampa de arrefecimento da -CT se assemelha a rampa do triptofano. Pelos Grficos VI, VII e VIII foi possvel obter as temperaturas e fraes de desnaturao da enzima, no h influncia significativa do pH na temperatura de desnaturao. Segundo a literatura [5], era esperado que com o aumento do pH a temperatura de desnaturao fosse menor, devido a ionizao da cadeia lateral da tirosina que desestabiliza a estrutura da enzima, porm esse fato no foi observado no experimento. O que pode ser justificado pelo fato da enzima ter um pH timo de funcionamento bsico e que a ionizao da cadeia lateral da tirosina mais significativa para valores de pH 10,1 que corresponde ao pKa da tirosina. Para as reaes com enzima, foi verificado que a Vmx aumenta ao elevar o pH. Entretanto, em pH 10 a velocidade global da reao maior quando no h enzima. Isso se reflete tambm nas energias de ativao. A pH 10 h grande quantidade de OH- no meio, de forma que a enzima acaba protegendo o PNPA do ataque da

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hidroxila, pois a velocidade com que a enzima atua no PNPA muito menor do que a velocidade com que ocorre o ataque da hidroxila.

V. CONCLUSO Percebeu-se que a reao sem enzima de 1 ordem. Concluiu-se que o pH no influencia significativamente na temperatura de desnaturao da enzima, e que at a temperatura de 45oC ainda h grande quantidade de enzima na forma nativa, o que possibilita que a reao possa ser catalisada at esse valor de temperatura. A -CT um catalizador eficiente para hidrlise de PNPA em pH 7,4, entretanto a utilizao dessa enzima em pH 10 no interessante.

VI. AGRADECIMENTOS Agradecemos a Deus pela pacincia e graa para realizar este trabalho. Agradecemos aos integrantes dos grupos que disponibilizaram seus dados para nossa pesquisa. Agradecemos a CAPES pela oportunidade de intercmbio. Agradecemos a Universidade de Coimbra e a professora Maria Joo pelo auxlio na pesquisa.

VII. BIBLIOGRAFIA
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