Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE ,,Grigore T.
Popa - IAI FACULTATEA DE FARMACIE
DETERMINAREA REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE DIN MIEREA DE ALBINE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Coordonator tiinific, Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu
Doctorand, Popa (Morariu) Ionela Daniela
IAI, 2013
Decizia Rectorului U.M.F. "Grigore. T. Popa" - Iai de numire a Comisiei de Doctorat nr. 5041/19.03.2013 Data susinerii publice a tezei de Doctorat: 11.04.2013
Universitatea de Medicin i Farmacie Grigore T. Popa - Iai, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
CUPRINS
INTRODUCERE..............................................................................................5 Motivaia cercetrii...............................................................................7 Obiective...............................................................................................8 PARTEA GENERAL..................................................................................10 CAPITOLUL I................................................................................................10 ALBINA - MORFOLOGIE, FIZIOLOGIE, PATOLOGIE......................10 I.1. Albina............................................................................................10 I.2. Bolile albinelor.............................................................................13 I.2.1. Bolile contagioase........................................................14 I.2.1.1. Bolile virotice...............................................14 I.2.1.2. Bolile bacteriene...........................................15 I.2.1.3. Boli parazitare...............................................16 I.2.1.4. Boli micotice.................................................18 I.2.2. Bolile necontagioase.....................................................19 I.3. Substane chimioterapice utilizate n apicultur pentru prevenirea i tratarea bolilor albinelor...............................................................................19 I.3.1. Antibiotice....................................................................19 I.3.2. Alte chimioterapice antimicrobiene..............................21 CAPITOLUL II..............................................................................................24 MIEREA DE ALBINE - ASPECTE GENERALE.....................................24 II.1. Istoric...........................................................................................24 II.2. Producerea mierii.........................................................................25 II.3. Tipuri de miere............................................................................27 II.4. Proprietile mierii.......................................................................27 II.4.1. Proprietile senzoriale................................................27 II.4.2.Proprietile fizico-chimice ale mierii..........................30 II.5. Mierea n apiterapie.....................................................................33 II.6. Mierea n circuitul economic.......................................................33 II.7. Legislaia i condiiile de admisibilitate ale mierii de albine................................................................................................................34
CAPITOLUL III............................................................................................38 PREZENA REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE (CHIMIOTERAPICE ANTIMICROBIENE) N MIEREA DE ALBINE...........................................................................................................38 III.1. Surse de poluare a mierii............................................................38 III.1.1. Poluarea datorat unor factori de mediu....................38 III.1.2. Poluarea datorat practicilor apicole..........................38 III.2. Metode de determinare a reziduurilor medicamentoase n miere.................................................................................................................39 III.2.1.Metodele de screening................................................40 III.2.1.1. Clasificarea dup principiul de detecie.............................................................................................................40 III.2.1.2. Clasificarea dup gradul de cuantificare.......................................................................................................40 III.2.2. Metodele confirmatorii..............................................42 III.3. Reziduuri medicamentoase n produse apicole..........................44 PARTEA EXPERIMENTAL.....................................................................52 CAPITOLUL IV.............................................................................................52 ESTIMAREA CONINUTULUI DE SULFONAMIDE N MIEREA DE ALBINE...........................................................................................................52 IV.1. Introducere.................................................................................52 IV.1.1. Corelaii ntre structura chimic i activitatea antimicrobian..................................................................................................53 IV.1.2. Mecanismul de aciune al sulfonamidelor..................................................................................................53 IV.1.3. Proveniena reziduurilor de sulfonamide n miere.................................................................................................................56 IV.2. Obiective....................................................................................57 IV.3. Principiul metodei......................................................................57 IV.3.1.Tehnologia Panelurilor Biocip....................................57 IV.3.2. Biocipul......................................................................57 IV.3.3. Detecia......................................................................58 IV.4. Material i metod......................................................................60 IV.5. Validarea metodei......................................................................63 IV.5.1. Liniaritatea metodei...................................................68
4
IV.5.2. Sensibilitatea metodei /Concentraia inhibitorie (IC50)...............................................................................................................71 IV.5.3. Specificitatea i selectivitatea....................................72 IV.5.4. Precizia i acurateea..................................................73 IV.5.5. Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detectie (CC)................................................................................................................75 IV.5.6. Regsirea (recuperarea).............................................76 IV.6. Probele de miere........................................................................77 IV.7. Rezultate i discuii....................................................................79 IV.8. Concluzii....................................................................................80 CAPITOLUL V..............................................................................................82 ESTIMAREA CONINUTULUI DE NITROFURANI I CLORAMFENICOL N MIEREA DE ALBINE...........................................................................................................82 V.1. Introducere..................................................................................82 V.1.1. Nitrofuranii..................................................................82 V.1.2. Cloramfenicolul...........................................................83 V.2. Obiective.....................................................................................84 V.3. Material i metod.......................................................................84 V.4. Validarea metodei.......................................................................86 V.4.1. Liniaritatea metodei....................................................89 V.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraia inhibitorie (IC50)...............................................................................................................91 V.4.3. Specificitatea i selectivitatea......................................91 V.4.4. Precizia i acurateea...................................................92 V.4.5. Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detectie (CC)................................................................................................................94 V.4.6. Regsirea (recuperarea)...............................................94 V.5. Probele de miere..........................................................................96 V.6. Rezultate i discuii.....................................................................97 V.7. Concluzii...................................................................................100
CAPITOLUL VI...........................................................................................101 ESTIMAREA CONINUTULUI DE CHINOLONE I ANTIBIOTICE N MIEREA DE ALBINE...........................................................................101 VI.1. Introducere...............................................................................101 VI.1.1. Chinolonele..............................................................101 VI.1.2. Cefalosporine (ceftiofur)..........................................102 VI.1.3. Amfenicol (fluorfenicol)..........................................103 VI.1.4. Aminoglicozide (Streptomicina)..............................104 VI.1.5. Macrolide (tilozin).................................................104 VI.1.6. Tetracicline..............................................................105 VI.2. Obiective..................................................................................106 VI. 3. Material i metod...................................................................106 VI.4. Validarea metodei....................................................................108 VI.4.1. Liniaritatea metodei.................................................111 VI.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraia inhibitorie (IC50).............................................................................................................113 VI.4.3. Specificitatea i selectivitatea..................................114 VI.4.4. Precizia i acurateea................................................115 VI.4.5. Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detectie (CC)..............................................................................................................117 VI.4.6. Regsirea (recuperarea)...........................................117 VI.5. Probele de miere......................................................................119 VI.6. Rezultate i discuii..................................................................120 VI.7. Concluzii..................................................................................124 CAPITOLUL VII.........................................................................................125 STUDIU EXPERIMENTAL AL INFLUENEI REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE (SULFONAMIDE) DIN MIERE ASUPRA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI, IMUNOLOGICI I HEMATOLOGICI LA ANIMALE DE LABORATOR.............................................................125 VII.1. Introducere..............................................................................125 VII.2. Obiectivele cercetrii..............................................................130 VII.3. Protocol experimental.............................................................130 VII.4. Evidenierea rspunsului imun la obolani dup administrare de miere coninnd sulfonamide.........................................................................131 VII.4.1. Material i metod..................................................131 VII.4.2. Prelucrarea i interpretarea statistic......................138
6
VII.4.3. Rezultate.................................................................141 VII. 4.3.1. Analiza comparativ a rezultatelor parametrilor analizai......................................................................................141 VII.4.3.2. Analiza corelaiei rezultatelor citokinelor implicate n reacia alergic cu rezultatele IgE i a eozinofilelor...................................................................................................157 VII.4.4. Discuii...................................................................172 VII.4.5. Concluzii.................................................................176 VII. 5. Evaluarea parametrilor biochimici i hematologici la obolani dup administrare de miere coninnd reziduuri de sulfonamide....................................................................................................177 VII.5.1 Material i metod...................................................177 VII.5.2. Rezultate.................................................................184 VII.5.3. Discuii...................................................................201 VII.5.4. Concluzii.................................................................203 CAPITOLUL VIII........................................................................................205 CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE...........................................................205 VIII.1. Concluzii generale.................................................................205 VIII.2. Contribuii originale..............................................................208 VIII.3. Perspective de cercetare........................................................209 BIBLIOGRAFIE..........................................................................................210 AVIZ COMISIA DE ETIC A CERCETRII........................................224 AVIZ LABORATOR...................................................................................225 LISTA INDICATORILOR REALIZAI DIN PROIECT......................226
Teza de doctorat cuprinde: 209 pagini (partea general: 50 pagini, contribuii personale: 159 pagini) 73 tabele 144 figuri 267 referine bibliografice Aviz Comisia de Etica Cercetrii Aviz laborator Lista indicatorilor realizai din proiect 3 Articole tiinifice -1 B+; 2 ISI n acest rezumat se pstreaz numerotarea din tez pentru cuprins, tabele, figuri i referine bibliografice. Cuvinte Cheie: reziduuri medicamentoase, sulfonamide, nitrofurani, chinolone, antibiotice, citokine, miere.
Aceast cercetare a fost sus inut de proiectul POSDRU/88/1.5/S/63117 Burse doctorale pentru doctoranzi competitivi n Aria European a Cercetrii.
8
INTRODUCERE
Mierea este principalul produs apicol, apreciat att pentru nsuirile sale nutritive, ct i pentru efectele sale terapeutice; a fost prima substan dulce folosit n hrana omului, fiind precursoarea zahrului din trestie sau din sfecl. Tendina actual spre consum i necesitatea ndeplinirii tuturor cerinelor de calitate pentru produsele alimentare, n care se ncadreaz mierea i celelalte produse apicole, determin i la noi n ar stabilirea unor standarde de calitate i metode performante de analiz acceptate de Uniunea European (UE). O condiie esenial pe care trebuie s o ndeplineasc alimentele este ca ele s nu conin substane nocive pentru consumatori. Prezena substanelor nocive n alimente i-a preocupat i ngrijorat de muli ani pe specialiti, aceast problem cptnd n ultimele decenii o nou dimensiune datorit polurii crescnde a mediului ambiant, precum i prin folosirea necontrolat a unor substane chimice n scopul optimizrii calitii lor. n ultima perioad, o nou clas de poluani ai alimentelor au intrat n atenia oamenilor de tiin i anume reziduurile de produse farmaceutice. Preparatele farmaceutice administrate animalelor domestice, incluznd antibiotice, hormoni, anestezice, tranchilizante, chimioterapice etc., sunt reinute ca i reziduuri n diferite produse. Mai mult, exist tendina de a nu percepe medicamentele ca un factor poluant, cu toate c exist o mare probabilitate ca acestea s se transfere ca atare sau ca metabolii n produsele alimentare de origine animal (Hughes, Heritage, 2004). Asigurarea integritii lanului alimentar i protejarea sntii consumatorilor devine astfel o necesitate. Standardele de calitate a mierii n UE restricioneaz sever intrarea mierii n oricare din statele europene. Cnd vorbim de calitatea mierii ne referim la respectarea parametrilor de calitate prin aplicarea unei tehnici apicole corecte, dar i la absena reziduurilor medicamentoase.
9
Reglementrile comunitare admit utilizarea mai multor clase de medicamente veterinare (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani, chinolone) pentru tratarea bolilor la albine i nu permit prezena reziduurilor medicamentoase n miere. Reziduurile medicamentoase din alimente trebuie studiate i determinate deoarece prin alimentaie pot deveni un factor de risc pentru sntatea public. Se impune att identificarea principiului activ medicamentos ct i al metaboliilor lor responsabili n unele cazuri de efecte nocive asupra consumatorilor (Bura M et al.,2008). Reglementrile UE cu privire la calitatea produselor apicole relev necesitatea dezvoltrii i implementrii unor metode de determinare rapide, de nalt sensibilitate i specificitate pentru identificarea i dozarea cantitativ a reziduurilor medicamentoase. Dezvoltarea i mbuntirea metodele analitice n vederea monitorizrii nivelurilor de reziduuri din mierea de albine asigur punerea pe pia a produselor alimentare sigure. Lucrarea de fa prezint rezultatele privind determinarea reziduurilor medicamentoase (antibiotice i alte chimioterapice antimicrobiene - sulfonamide, chinolone, nitrofurani) din mierea de albine folosind o metod nou de determinare i anume tehnologia Biocip. Obiective Teza de doctorat are ca scop principal studiul unor metode de determinare rapide, de nalt sensibilitate i specificitate, n vederea identificrii i dozrii cantitative a reziduurilor medicamentoase din mierea de albine. Studiul a fost iniiat n vederea realizrii urmtoarelor obiective: Validarea metodei de determinare simultan a 12 sulfonamide din miere utiliznd tehnologia de analiz cu biocipuri (Biochip Array Technology, BAT) i aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.
10
Validarea metodei de determinare simultan a 4 nitrofurani i a cloramfenicolului utiliznd tehnologia Biocip i aplicarea acesteia la analiza probelor de miere. Validarea metodei de determinare simultan a chinolonelor, cefalosporinelor (ceftiofur), amfenicolilor (florfenicol), aminoglicozidelor (streptomicina), macrolidelor (tilozina), tetraciclinelor utiliznd tehnologia Biocip i aplicarea acesteia la analiza probelor de miere. Evidenierea rspunsului imun la obolani prin determinarea citokinelor, eozinofilelor i a imunoglobulinei E (IgE), dup administrarea de miere coninnd sulfonamide. Studiu experimental al influenei reziduurilor medicamentoase (sulfonamide) din miere asupra unor parametri biochimici i hematologici la animale de laborator (obolani).
Partea general a tezei de doctorat este structurat n 3

capitole: Capitolul I expune date din literatura de specialitate privind morfologia, fiziologia i patologia albinei. Albinele fac parte din clasa Insectelor, ordinul Hymenoptera, familia Apidae, genul Apis. Albina melifer prezint 3 grupe geografice mari i anume: albina melifer african, albina melifer din orientul apropiat i albina melifer european, care datorit nsuirilor sale superioare s-a rspndit pe tot globul. Sunt prezentate, de asemenea, bolile albinelor, mai ales cele contagioase care spre deosebire de bolile necontagioase, sunt mai periculoase i se trateaz cu chimioterapice antimicrobiene. Bolile contagioase ale albinelor pot fi virotice, bacteriene i micotice.
11
Bolile bacteriene cele mai rspndite sunt Loca americana, Loca europeana, septicemia i paratifoza. Loca americana este de departe cea mai virulent boal de puiet cunoscut la albinele melifere fiind rezultatul infectrii cu bacteria sporulat Paenibacillus larvae subsp. larvae (Ashiralieva, Genersch, 2006). Este foarte contagioas i dac nu este tratat la timp i corespunztor poate conduce la dispariia ntregii colonii, rspndinduse i la alte stupine (Williams, 2000). Loca europeana este mai puin grav dect Loca americana, deoarece majoritatea bacteriilor care contribuie la apariia ei nu sporuleaz, iar sporii speciilor sporogene au o rezisten mai sczut fa de aciunea agenilor fizici sau chimici. Cele mai cunoscute boli parazitare sunt nosemoza, varrooza i senotainioza. Compuii utilizai n tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor sunt: antibiotice i alte chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide, chinolone, nitrofurani). Capitolul II este destinat principalului produs apicol, mierea de albine i debuteaz cu o prezentare succint a importanei i semnificaiei mierii la multe civilizaii antice, ce au nflorit i deczut pe parcursul timpului. Acest capitol continu cu prezentarea modului de producere a mierii, precum i a diferitelor criterii de clasificare ale acesteia. Proprietile mierii sunt prezentate n dou seciuni distincte i anume: proprieti senzoriale i proprieti fizico-chimice. Caracteristicele organoleptice ale mierii sunt determinate de categoria acesteia, de speciile florale din care provine, de compoziia ei chimic, de modul de extracie din faguri, de modul de condiionare, de timpul i condiiile de pstrare. Principalele componente ale mierii de albine sunt zaharurile. Mierea conine cantiti reduse de substane azotoase reprezentate n principal de enzime. Substanele minerale sunt moderat reprezentate n mierea de flori i relativ abundente n cea de man. Mierea conine o
12
gam larg de acizi organici, lipide, pigmeni, enzime, uleiuri eterice, substane cu aciune antimicrobian, vitamine. De coninutul n zaharuri depind n mare msur calitile fizice ale mierii i anume: vscozitatea, higroscopicitatea i capacitatea de cristalizare. Aciunea terapeutic a mierii de albine se exercit att asupra aparatului digestiv (stomac, intestin), ct i asupra ficatului i cilor biliare, ale aparatului cardiovascular, respirator, urinar, sistemului nervos (Andrioiu, 2006; Grigore, 2008). Spre finalul capitolului II sunt atinse cteva aspecte legate de circuitul economic al mierii n Europa i la nivel mondial. Dac n Europa suntem pe locul doi, la nivel mondial, Romnia a urcat n primii 20 productori de miere ai lumii; clasamentul este dominat de China, cu cele 300 mii tone obinute anual. Printre marii productori ai lumii se mai numr ri precum Argentina, Statele Unite ale Americii, Turcia i Ucraina, avnd fiecare producii n jur de 80 mii tone pe an. Un aspect important prezentat n acest capitol l reprezint legislaia i condiiile de admisibilitate ale mierii de albine. n Regulamentul CE 470/2009 de stabilire a procedurilor comunitare pentru limitele de reziduuri medicamentoase din alimentele de origine animal, legislaia european definete prin termenul de reziduuri toate substanele farmacologic active: principii active, excipieni sau produse de degradare, precum i metaboliii acestora, care se regsesc n produsele alimentare obinute de la animalele crora li s-au administrat medicamente de uz veterinar. Controlul i monitorizarea reziduurilor medicamentoase n alimentele de origine animal este reglementat de ctre Uniunea European. Obiectivul principal al legislaiei este de a elabora norme pe baza crora s se detecteze utilizarea ilegal de substane n produsele de origine animal, utilizarea abuziv a medicamentelor de uz veterinar i de a asigura punerea n aplicare a aciunilor adecvate n vederea minimizrii reapariiei tuturor acestor reziduuri n alimentele de origine animal. Termenul de ,,limita maxim de reziduuri (LMR) poate fi definit drept concentraia maxim de reziduu, care rezult din utilizarea
13
unui medicament veterinar, exprimat n g/kg, care este permis de lege sau este recunoscut ca acceptabil n sau pe un aliment. LMR se exprim pe tipul i cantitatea de reziduuri, considerat a fi fr risc toxicologic pentru sntatea uman. Un rol important n determinarea reziduurilor medicamentoase din miere l au sensibilitatea i precizia metodei de detecie. Deoarece sunt analize de urme, este necesar ca tehnica analitic s garanteze o limit de detecie ct mai sczut. Decizia Comisiei 2002/657/CE este decizia de punere n aplicare a Directivei 96/23/CE a Consiliului n ceea ce privete performana metodelor analitice i interpretarea rezultatelor. Aceast decizie prevede criterii de performan i alte cerine pentru metodele de analiz care urmeaz s fie utilizate n testarea probelor de miere, pentru a asigura calitatea i compararea rezultatelor analitice generate de ctre laboratoarele autorizate pentru controlul oficial al reziduurilor. Conform Deciziei Consiliului 2003/181/CE (de modificare a Deciziei 2002/657/CE) este necesar s se prevad stabilirea progresiv a limitelor de performan minime necesare (LPMN) aplicabile metodelor de analiz care trebuie utilizate pentru substanele pentru care nu s-a definit nici o limit autorizat i, n special, pentru substanele a cror utilizare nu este autorizat sau este special interzis n Comunitate n vederea garantrii punerii n aplicare armonizate a Directivei 96/23/CE. Limita de performan minim necesar (LPMN) reprezint coninutul minim de analit ntr-o prob care trebuie cel puin detectat i confirmat (limita minim de detecie a metodei). Pentru majoritatea chimioterapicelor antimicrobiene, LPMN variaz n jurul valorii de 10 g/kg; pentru cloramfenicol aceast limit este de 0,3 g/kg, iar pentru nitrofurani de 1 g/kg (Michaud, 2005). Capitolul III prezint principalele surse de poluare ale produselor apicole care sunt mediul poluant i substanele utilizate de apicultori pentru tratamentul bolilor albinelor.
14
Activitatea albinelor este influenat de toate elementele de mediu (sol, vegetaie, aer i ap) (Pohl, 2009). Bogdanov (2006) subliniaz faptul c pericolul de contaminare a produselor apicole provine ntr-o mai mare msur din practicile apicole, dect din mediul nconjurtor. Apicultorii trebuie s ia msuri pentru prevenirea contaminrii produselor apicole optnd pentru alternative ecologice n controlul bolilor albinelor, prin utilizarea substanelor naturale netoxice n detrimentul celor sintetice. La ora actual, n tratamentul bolilor de albine, apicultorii folosesc frecvent acaricidele pentru combaterea varroozei i chimioterapicele antimicrobiene pentru boala Loca americana i boala Loca europeana (Kleespies, 2000). Prezena reziduurilor de chimioterapice antimicrobiene din miere este corelat cu tratamentele aplicate albinelor n cazul bolii Loca americana i/sau boala Loca europeana, boli infecto-contagioase cauzate de bacteriile Paenibacillus larvae subsp. larvae i respectiv Melissococcus pluton. n tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor, care sunt foarte periculoase deoarece pot distruge complet i rapid stupina, apicultorii utilizeaz sulfamidele i unele antibiotice. Tratamentul medicamentos ar duce numai la o aparent vindecare pentru c bacteria dezvolt spori foarte rezisteni care nu sunt distrui de aceste chimioterapice antimicrobiene i provoac reinfectarea. De aceea, tratamentul trebuie repetat la anumite intervale de timp. Astfel, pericolul reziduurilor n produsele apicole este mare, coloniile rmn purttoare de spori, iar pericolul infecios persist (Ritter, 2000). De asemenea, n acest capitol sunt prezentate metodele de determinare a reziduurilor medicamentoase din miere conform normelor Uniunii Europene incluse n Directiva Consiliului 96/23/CE. Aceste metode se mpart n metode de screening i metode confirmatorii. Metodele de screening cele mai utilizate pentru determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine sunt: testul ELISA, testul Charm II i testul ROSA. n general, rata rezultatelor fals pozitive pentru testul Charm II este destul de ridicat (Re ybroeck, 2003; Beaune et al., 2005).
15
Testul ELISA, utilizat cu succes pentru miere, evideniaz prezena antibioticelor n urma reaciilor imunoenzimatice pentru determinarea anticorpilor i a antigenelor specifici. Metoda ELISA se utilizeaz pentru determinri semicantitative datorit ncrucirii reactivitilor antibioticelor ce aparin aceluiai grup de antibiotice. n prezent, testul ELISA este frecvent nlocuit de testul Charm II (Bogdanov, 2003). Testul Charm II reprezint tot o metod de screening utilizat pentru diferite matrici, cum ar fi carnea i laptele i a fost adaptat i pentru miere. Sunt cunoscute teste Charm II pentru determinarea de chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide, antibiotice: tetracicline, antibiotice betalactamice, macrolide, amfenicoli i aminoglicozide). Un procent cuprins ntre 0-30% dintre probele depistate pozitive n urma testrilor vor fi confirmate prin alte metode, cum ar fi HPLC sau LCMS (Kocher,1996; Edder et al., 1999; Edder, Corvi, 2001). Un dezavantaj al testului Charm II const n faptul c acesta permite detectarea ntregului grup de antibiotice, nu a fiecrui reprezentant individual fiind astfel inferior altor metode cantitative (Bogdanov, 2003; Quintana-Rizzo et al., 2005; Bonvehi, Gutierrez, 2009). Testul ROSA (Rapid One Step Assay) reprezint o alt metod de screening calitativ pentru detectarea reziduurilor medicamentoase din miere. Acesta utilizeaz o band test i un minim de echipament (un incubator), iar rezultatele se pot citi direct. Testul ROSA este utilizat pentru depistarea penicilinei G i a unor compui -lactamici (cefalosporine) din miere. Sensibilitatea pentru penicilin este de 20 g/kg, iar pentru compuii -lactamici analizai este de 20-200 g/kg (Legg et al., 2003). Rezultatele metodelor de screening sunt calitative i semicantitative, iar probele testate pozitiv se vor confirma prin metode analitice de mare sensibilitate (HPLC, LC) n vederea cuantificrii reziduurilor de antibiotice i chimioterapice antimicrobiene. Metoda HPLC este cea mai extins tehnic cromatografic utilizat pentru analiza antibioticelor (Kanfer et al., 1998) n special cea
16
cuplat cu detector UV (Vinas et al., 2004), dar prezint i unele dezavantaje, precum faptul c fiecare clas de antibiotice trebuie testat separat. Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de mas s-a obinut un instrument de analiz performant, capabil s separe, s identifice i s cuantifice componenii din cele mai complexe probe. Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE prevede ca toate metodele bazate pe cromatografie fr utilizarea MS, s fie confirmate prin spectrometrie de mas (Gentili et al., 2005). Metoda LC-MS prezint o siguran de detecie de aproape 100% (Nakazawa et al., 1999). Metoda a fost dezvoltat pentru sulfonamide i tetracicline (tetraciclin, oxitetraciclin i cloroxitetraciclin). Limita de detecie este ntre 0,5 - 10 g/kg, depinznd de substan. Metoda a continuat s se extind i pentru cloramfenicol i streptomicin. Obiectivul principal a fost dezvoltarea metodei LC-MS, capabil s detecteze toate reziduurile de antibiotice din miere (Bogdanov, 2003). n ultima perioad s-au efectuat numeroase studii privind depistarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine utiliznd numeroase metode de determinare cu diferite limite de detecie i cuantificare. Stadiul actual al cunoaterii privind utilizarea acestor metode de determinare pentru probele de miere este prezentat n cadrul acestui capitol al tezei de doctorat.
17
Partea experimental a tezei de doctorat este structurat n 5 capitole care urmresc ndeplinirea sistematic a obiectivelor propuse n cercetarea doctoral. Capitolul IV - ESTIMAREA CONINUTULUI DE SULFONAMIDE N MIEREA DE ALBINE
Scopul cercetrii Cercetarea prezent a avut drept scop validarea unei metode de determinare simultan a 12 sulfonamide din miere utiliznd tehnologia de analiz cu biocipuri (Biochip Array Technology, BAT) n vederea evalurii coninutului acestora n probe de miere disponibile pe piaa comercial din Romnia. Introducere La ora actual, n medicina veterinar, sulfonamidele sunt printre cele mai folosite substane medicamentoase, datorit faptului c au un pre sczut (comparativ cu antibioticele), un spectru antibacterian larg i o eficacitate terapeutic apreciabil n unele boli infecioase. Sulfonamidele sunt folosite n apicultur pentru a trata trei boli ale albinelor i anume, boala Loca americana, boala Loca europeana i nosemoza (Reybroeck et al., 2010). Sulfadimetoxina, sulfametoxazolul, sulfachinoxalina i sulfadiazinele sunt cele mai folosite sulfonamide n medicina veterinar, inclusiv n apicultur. Dac perioada dintre tratamentul albinelor i recoltarea mierii nu este respectat, aceasta poate fi contaminat cu reziduuri din aceste substane. Interesul pentru detectarea acestor reziduuri este de mare actualitate. Avertizri recente ale Uniunii Europene n legtur cu prezena sulfonamidelor n miere au condus la intensificarea supravegherii reziduurilor medicamentoase i necesitatea dezvoltrii de metode sensibile i rapide de screening ale reziduurilor acestor substane n acest produs alimentar deosebit de apreciat de consumatori (Thompson, Noot, 2005).
18
Material i metod Metoda Biocip aplicat se ncadreaz, conform criteriilor de clasificare a metodelor de determinare a reziduurilor din miere, n categoria metodelor de screening. Toate determinrile au fost efectuate pe analizorul Evidence Investigator produs de firma Randox, UK. Acest sistem utilizeaz principiile imunologice de baz: metoda competitiv tip sandwich, bazat pe captur de anticorpi. Metoda de detecie este chemiluminescena. Reactivii sunt livrai de productorul aparatului i includ: Antimicrobial Array I - kit (cod de catalog EV3523, Randox Laboratories, UK). Control: Sulphonamide Multianalit Control (cod de catalog AMC5004, Randox Laboratories, UK). Validarea metodei Metoda de validare i procedura de analiz a produselor apicole s-a realizat n conformitate cu ghidurile de validare pentru metodele analitice ale FDA, ghidurile de validare pentru reziduuri medicamentoase, ghidurilor pentru implementarea Deciziei Comisiei 2002/657/CE, ghidurilor de validarea a metodelor de screening pentru reziduurile de medicamente veterinare i Procedurile Standard de Operare ale Laboratorului S.C.Investigaii Medicale Praxis S.R.L. Iai. Parametrii de validare evaluai au fost urmtorii: calibrarea (liniaritatea); sensibilitatea (IC50); specificitatea i selectivitatea; precizia (intermediar i reproductibilitate) i acurateea; limita de detecie, regsirea (recuperarea) (tabel IV.2 - IV.5). Limita de decizie obinut pentru sulfonamidele determinate s-a ncadrat ntre valorile 0,54 g/kg i 5,14 g/kg. Capabilitatea de detecie obinut pentru sulfonamidele determinate s-a ncadrat ntre valorile 0,79 g/kg i 7,99 g/kg conform tabel IV.3, tabel IV.5 i fig. IV.32.
19
SD SMZ
8 6 4 2
SZ SDM
SCP 0 SMP
SQ
SMT
SM SP SS
ST
Limita de decizie CC (g/kg) Capabilitatea de detecie CC (g/kg)
Fig. IV.32: Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detecie (CC)
20
Tabelul IV.2: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie i acuratee)

Parametrii de validare Liniaritate Interval de calibrare (g/kg) Coeficient de corelatie r SZ 0 - 20,00 0,987 SDM 0 - 20,50 0,982 SQ ANALIT SMT 0 - 11,20 0,988 ST 0 - 21,10 0,991 SS 0 - 11,20 0,986
0 - 20,20 0,986
Senibilitate
IC 50 (g/kg)
0,89
1,90
1,60
0,20
0,40
0,60
Aceeai serie
Precizie i acuratee
Serii diferite
21
Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
Conc.(g/kg) CV (%) Conc.(g/kg) CV (%) Conc.(g/kg) CV (%) Conc.(g/kg) CV (%) Conc.(g/kg) CV (%) Conc.(g/kg) CV (%)
57 6 115 7 164 6 84 10 171 12 259 15
51 7 99 6 140 5 51 11 101 8 160 10
50 10 89 9 134 5 54 10 141 10 212 10
51 9 112 7 170 7 61 14 101 7 138 7
59 5 131 9 206 6 51 14 122 12 207 11
47 8 113 5 167 7 36 11 90 9 136 10
Tabelul IV.3: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie i capabilitate de detecie)
Parametrii de validare Recuperarea Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Conc.(g/kg) Recuperare (%) Conc.(g/kg) Recuperare (%) Conc.(g/kg) Recuperare (%) SZ 44 112 113 113 159 106 1,71 0,39 0,64 2,35 2,99 SDM 51 102 96 96 138 92 2,41 0,54 0,89 3,30 4,19 SQ 49 98 86 86 134 89 1,23 0,11 0,18 1,41 1,59 ANALIT SMT 50 100 112 112 169 113 2,29 1,74 2,85 5,14 7,99 ST 57 115 129 129 204 136 0,71 0,24 0,39 1,10 1,49 SS 46 92 112 112 166 111 2,01 0,30 0,49 2,50 2,99
Limita de decizie CC i capabilitate de detecie CC
Conc. medie (g/kg) DS 1,64 x DS CC (g/kg) CC (g/kg)
22
Tabelul IV.4: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie i acuratee)

Parametrii de validare Liniaritate Interval de calibrare (g/kg) Coeficient de corelatie r SP 0 - 19,40 0,993 SM 0 - 2,50 0,985 SMP ANALIT SCP 0 - 19,60 0,993 SMZ 0 - 11,70 0,996 SD 0 - 19,40 0,989
0 - 19,60 0,991
Senibilitate
IC 50 (g/kg)
2,50
0,20
0,80
0,60
0,30
0,60
Aceeai serie
Precizie i acuratee
Serii diferite
23
Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
58 7 100 6 140 7 94 11 192 13 275 8
50 7 112 10 174 5 62 10 80 14 156 17
53 7 129 6 190 6 58 9 112 8 175 9
48 6 102 8 149 5 78 11 124 11 189 11
68 5 149 5 236 6 98 9 158 8 231 9
45 9 101 8 139 7 38 11 64 10 95 10
23
Tabelul IV.5: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie i capabilitate de detecie)
Parametrii de validare Recuperarea Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Conc.(g/kg) Recuperare (%) Conc.(g/kg) Recuperare (%) Conc.(g/kg) Recuperare (%) SP 53 106 97 97 139 93 1,19 0,09 0,15 1,34 1,49 SM 49 99 112 112 173 115 2,17 0,19 0,31 2,48 2,79 SMP 52 105 128 128 190 126 1,89 0,55 0,90 2,79 3,69 ANALIT SCP 47 94 101 101 148 99 3,81 0,48 0,79 4,60 5,39 SMZ 66 132 148 148 234 156 1,41 0,24 0,39 1,80 2,19 SD 44 88 100 100 138 92 0,29 0,15 0,25 0,54 0,79
Limita de decizie CC i capabilitate de detecie CC
24
Analiza cantitativ a celor 12 sulfonamide studiate n diferite probe de miere

n cercetrile efectuate am analizat 11 probe de miere achiziionate din supermarketuri i 5 probe achiziionate de la mai muli productori din diferite regiuni geografice ale Romniei. Prelucrarea probelor Extracia sulfonamidelor din probele de miere se realizeaz astfel: n jur de 1g de prob de miere dizolvat n 9 ml tampon de splare (soluie de lucru) se menine la incubat la 37C timp de 30 minute i se agit pe un roller pentru 10 minute pn la dizolvare. Soluia probei se dilueaz cu o cantitate egal de soluie tampon de splare i se aplic pe suprafaa biocipului. Din acest mod de lucru rezult o diluie a probei de miere de 1:20, de care se va ine cont la calcul. Etape de lucru se execut manual i sunt similare celor de la tehnica ELISA: reactivii i proba sunt adugai pe un biocip pregtit pentru utilizare incubare biocipuri la 37C cu agitare. splare biocipuri pentru a ndeprta de pe suprafaa lor orice component care nu s-a legat. reactivul semnal este adugat pe fiecare biocip nainte s aib loc citirea imaginii n modulul de captare imagine al analizorului Evidence Investigator. lumina emis de fiecare regiune de test este analizat cu ajutorul softului de procesare imagine i cuantificat rapid n uniti de msur RLU (Relative Light Unit) folosind o curb de calibrare; rezultatele sunt calculate automat de un software dedicat. Intensitatea luminoas este invers proporional cu concentraia analitului. Rezultate i discuii Pentru confirmarea rezultatelor obinute prin metoda Biocip, probele de miere au fost testate i prin metoda LC-MS/MS. Analizele au fost efectuate utiliznd sistemul Agilent 1100 LC (Agilent
25
Technologies, SUA) cuplat cu spectrometru de mas 4000 Q TRAP (Applied Biosystems, SUA). Dou din probele analizate au fost pozitive n urma determinrilor prin metoda Biocip, avnd valori mai mari dect 10 g/kg pentru mai multe sulfonamide analizate cu ajutorul Panelului I Antimicrobian. Majoritatea rilor din UE au stabilit limita minim de performan necesar (LMPN) pentru sulfonamide la valoarea de 10 g/kg (Michaud, 2005). Performanele metodei Biocip au fost bune, valorile obinute au fost comparabile cu rezultatele metodei confirmatorii att pentru probele pozitive, ct i pentru probele negative. Probele pozitive confirmate prin metoda LC-MS/MS sunt prezentate n tabel IV.9.
Tabelul IV.9: Valorile obinute pentru probele pozitive prin metoda Biocip i metoda confirmatorie LC-MS/MS
Sulfonamide Sulfadiazina Sulfadimetoxina Sulfakinoxalina Sulfametazina Sulfatiazol Sulfisoxazol Sulfapiridina Sulfamerazina Sulfametoxipiridazina Sulfaclorpiridazina Sulfametizol Sulfadoxina Proba1 Biochip LC-MS/MS Conc. (g/kg) 11.4 7.3 < LOD < LOD < LOD < LOD 24.8 32.6 22.6 18.4 < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD 51.2 58.9 < LOD < LOD Proba 2 Biochip LC-MS/MS Conc. (g/kg) 9.2 8.8 < LOD < LOD < LOD < LOD 17.1 21.3 16.2 11.7 < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD 68.2 72.9 < LOD < LOD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip i confirmate prin metoda LC-MS/MS au evideniat prezena acelorai sulfonamide la valori peste LMPN i anume: sulfadiazina, sulfametazina, sulfatiazol i sulfametizol. Rezultatele obinute n acest studiu sunt comparabile cu cele existente n literatura de specialitate.
26
Concluzii Tehnologia Biocip aplicat a permis msurarea simultan i selectiv a 12 sulfonamide n miere la nivele mult mai mici dect LMR stabilite. Determinarea cantitativ simultan a celor 12 sulfonamide prezint specificitate pentru fiecare analit intit, iar senbilitatea metodei exprimat ca IC50 este 2,5 g/kg. Metoda prezint o precizie foarte bun att n cadrul aceleeai serii analitice, ct i n serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici de 15 % pentru concentraiile de 50, 100 i 150 g/kg. Criteriile de validare ale metodei: specificitate, acuratee, liniaritate, limite de detecie i cuantificare, respect recomandrile Deciziei Comisiei Europene 2002/657/CE i demonstreaz c metoda poate detecta i cuantifica reziduuri din sulfonamidele amintite fr analiza prin spectrometrie de mas sau derivatizarea fluorescent a analiilor.
CAPITOLUL V - ESTIMAREA CONINUTULUI DE NITROFURANI I CLORAMFENICOL N MIEREA DE ALBINE

Scopul cercetrii n acest capitol ne-am propus validarea metodei de determinare a 4 metabolii ai nitrofuranului din mierea de albine i anume 1-aminoimidazolidin-2,4-dion (AHD), 3-amino-5-morfolinometil-2oxazolidinon (AMOZ), 3-amino-2-oxazolidon (AOZ), semicarbazid (SEM) i a cloramfenicolului (CAP) utiliznd tehnologia Biocip i aplicarea acesteia la analiza probelor de miere. Introducere Nitrofuranii au fost utilizai n practica veterinar ca ageni antibacterieni, pentru tratarea infeciilor cauzate de bacterii i protozoare. Dei utilizarea lor a fost interzis pentru prima dat n UE ncepnd cu data de 1 ianuarie 1997 prin anexa IV a Regulamentului
27
2377/90/CE (Leitner et al., 2001), la ora actual se mai folosesc pentru animalele care nu sunt crescute pentru consum. Numeroase publicaii menioneaz c nitrofuranii sunt utilizai n tratarea albinelor pentru producia de miere, dei actualmente, conform Regulamentului nr. 37/2010 al Comisiei UE, nitrofuranii sunt substane interzise pentru toate animalele productoare de hran. Nitrofuranii utilizai n tratamentele albinelor sunt nitrofurantoina, furazolidona, furaltadona i nitrofurazona. Rezultatele unei determinri simultane a reziduurilor din patru nitrofurani (furazolidon, furaltadon, nitrofurantoin, i nitrofurazona), au demonstrat c furazolidonul este principalul chimioterapic antimicrobian administrat n tratarea bolilor bacteriene ale albinelor (Khong et al., 2004). Dezvoltarea unor metode accesibile care s permit detectarea lor este de interes pentru programele de monitorizare i de reglementare a reziduurilor n alimente. Detectarea reziduurilor de nitrofurani este de obicei realizat cu ajutorul lichid cromatografiei n tandem cu spectrometria de mas (LCMS/MS) (Leitner et al., 2001; OKeeffe et al., 2004). Metoda imunochimic a fost propus ca o alternativ pentru a detecta reziduurile de nitrofurani n miere. Cloramfenicolul are aciune bacteriostatic i este eficient n tratamentul bolilor infecioase. Are un spectru de activitate asemntor tetraciclinei, dar utilizarea lui n medicina uman i veterinar este interzis datorit efectelor adverse pe care le are asupra organismului uman (Joshi, 2002). Material i metod Tehnologia Panelurilor Biocip i aparatura pentru determinarea cantitativ simultan a nitrofuranilor i cloramfenicolului din miere au fost prezentate n capitolul IV din partea experimental a tezei de doctorat. Toi reactivii sunt multianalit i sunt furnizai ntr-un kit compact care include:
28
Antimicrobial Array III kit (cod de catalog EV3695, Randox Laboratories, UK). Antimicrobial Array III Control kit (cod AMC5036, Randox Laboratories, UK). Validarea metodei Parametrii de validare evaluai au fost urmtorii: a) Liniaritatea metodei Liniaritatea metodei s-a verificat prin efectuarea unei calibrri n 9 puncte pentru fiecare din cei 4 nitrofurani i pentru cloramfenicol utiliznd calibratorii inclui n kitul Anti Microbial Array III. Softul analizorului utilizeaz pentru calibrare o ecuaie specific pentru metoda de detecie imunoenzimatic competitiv (Findlay, Dillard, 2007): y = D + [(A-D)/1+(x/C)B] unde: x = concentratia analitului (g/kg), y = intensitatea semnalului chemiluminescent exprimat n RLU A, B, C, D - parametri ai metodei competitive i sunt predefinii n softul analizorului: A = intensitatea semnalului chemiluminiscent la concentraia 0 a analitului B = factorul pantei C = punctul de inflexiune al curbei de calibrare D = intensitatea semnalului luminos de rspuns la o concentraie teoretic infinit a analitului. n urma determinrilor s-au obinut coeficieni de corelaie (r) mai mari de 0,98, cel mai mic coeficient s-a obinut n cazul SEM (0,982). Rezultatele obinute dovedesc faptul c a fost ndeplinit condiia de admisibilitate a curbei de calibrare (coeficienii de corelaie admii trebuie s fie > 0.949).
29
b) Sensibilitatea metodei /Concentraia inhibitorie (IC50) Concentraia inhibitorie (IC50) pentru fiecare analit testat s-a calculat lund 50% din valoarea semnalului RLU generat de calibratorul de concentraie zero i extrapolnd valoarea RLU astfel obinut pe axa x a curbei de calibrare pe care sunt exprimate unitile de concentraie n g/kg. Concentraia astfel obinut corespunde concentraiei inhibitorii ce produce 50% inhibiie. Sensibilitatea metodei exprimat sub form de IC50 pentru determinarea cantitativ simultan a celor 4 nitrofurani i a cloramfenicolului a nregistrat valori care au fost 2,32 g/kg i care sunt detaliate n fig. V.8.
2,5 2,32
1,5
IC50 (g/kg)
1 0,74 0,5 0,4 0,09 0 AHD AOZ SEM AMOZ CAP 0,44
Fig. V.8: Valorile sensibilitii metodei pentru nitrofuranii analizai i cloramfenicol
c) Precizia i acurateea Conform legislaiei actuale i ghidurilor de validare pentru metodele de determinare ale reziduurilor medicamentoase din miere, precizia i acurateea se evalueaz att pentru concentraia corespunztoare limitelor LMPN (1 g/kg), ct i pentru concentrai i reprezentnd 50 %, respectiv 150 % din LMPN.
30
Precizia s-a determinat n cadrul aceleiai serii analitice i n serii analitice diferite. Valorile obinute pentru determinarea preciziei i acurateei sunt prezentate n fig. V.9. i n fig.V.10.
31
Fig.V.9: Precizia i acurateea pentru concentraii care reprezint 50 %, 100% i 150% din LMPN n
cadrul aceleiai serii analitice
32
Nivel 1 (0,50 g/kg) n = 20 12 10,15 10 8 6 4 2 0 AOZ AMOZ AHD SEM CAP 0,68 0,64 0,61 0,96 0,44
Conc. (g/kg) CV (%)
Nivel 2 (1 g/kg) n = 20 9 8 8,1 7,46 5,72 7,26 14 12 10 8 6 4 1,16 1,14 1,07 1,25 0,75
Conc. (g/kg) CV (%)
Nivel 3 (1,5 g/kg) n = 20 12,93 9,84 8,33 8,71
8,02
11,78
7,87
8,32 5,86
8,92
7 6 5 4 3 2 1 0 AOZ AMOZ AHD SEM CAP
1,84 2 0 AOZ
1,73
1,81
2,25 1,06
Conc. (g/kg) CV (%)
AMOZ
AHD
SEM
CAP
Fig. V.10: Precizia i acurateea pentru concentraii care reprezint 50 %, 100% i 150% din LMPN n serii analitice diferite
d) Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detecie (CC) Limita de decizie (CC) a fost calculat ca fiind media aritmetic a concentraiei analitului la nivel LMPN plus 1.64 x DS a repetabilitii la = 5% (CC) Capabilitatea de detecie (CC) a fost calculat ca fiind media aritmetic a concetraiei analitului la nivel CC plus 1.64 x DS a repetabilitii la = 5% (CC). Valorile obinute sunt redate n fig. V.11.
AOZ 1,2 1 0,8 0,6 CAP 0,4 0,2 0 AMOZ
SEM
AHD
Limita de decizie CC (g/kg) Capabilitatea de detecie CC (g/kg)
Fig. V.11: Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detecie (CC)
e) Regsirea (recuperarea) Procentul de recuperare s-a calculat pentru 3 nivele de concentraie reprezentnd 50%, 100 % i 150 % din limita minim de performan necesar pentru reziduurile de nitrofurani i cloramfenicol n mierea de albine (LMPN = 1 g/kg). Probele de miere au fost mbogite cu urmtoarele concentraii de nitrofurani i cloramfenicol: 0.5, 1, 1.5 g/kg. Procentele de recuperare au fost calculate efectund raportul dintre concentraia analitului din proba analizat i concentraia teoretic a analitului din soluia standard.
33
Procentele de recuperare obinute sunt prezentate n fig.V.12V.14.

Procentul de recuperare - Nivel 1 (0,50 g/kg) n = 20 192 124 150 100 50 0,62 0 AOZ 0,62 Recuperare (% ) 0,68 AHD 0,96 SEM 0,32 CAP Conc. (g/kg) 136
200 124
64
AMOZ
Fig.V.12: Valorile procentului de recuperare pentr u concentraii care reprezint 50 % din LMPN
Procentul de recuperare - Nivel 2 (1 g/kg) n = 20
140 120 100 80 60 40 20 0 AOZ 1,06
106
111
119
125
75
1,11
Recuperare (% ) 1,19 AHD 1,25 SEM 0,75 CAP Conc. (g/kg)
AMOZ
Fig. V.13: Valorile procentului de recuperare pentru concentraii care reprezint 100 % din LMPN
34
Nivel 3 (1,5 g/kg) n = 20 150 123 150 115 121
100
71
50 1,84 0 1,73 Recuperare (% ) 1,81 2,25 SEM 1,06 CAP Conc. (g/kg)
AOZ AMOZ AHD
Fig.V.14: Valorile procentului de recuperare pentru concentraii care reprezint 150 % din LMPN
Analiza cantitativ a celor 4 metabolii de nitrofuran i a cloramfenicolului n diferite probe de miere

Metoda validat a fost aplicat la determinarea a 11 probe de miere achiziionate din supermarketuri i 5 probe achiziionate de la productori din diferite regiuni geografice ale Romniei n perioada mai - august 2011. Prelucrarea probelor Derivatizarea i extracia nitrofuranilor i cloramfenicolului din probele de miere s-a realizat astfel: mase de prob n jur de 1g de prob de miere dizolvate n 4 ml ap distilat se incubeaz la 37C timp de 30 minute i se agit pe un agitator pentru 10 minute pn la dizolvare. peste soluia probei se adaug mai nti 0,5 ml soluie HCl 1M i apoi 100 l soluie 10mM 4-nitrobenzaldehid. Se omogenizeaz amestecul, se agit pe un agitator pentru 10 minute i apoi se incubeaz timp de 16 24 ore la 37C.
35
dup incubare, n fiecare prob se adaug 5 ml soluie fosfat dipotasic (0.1M K2HPO43H2O). Se corecteaz pH-ul soluiei obinute la valoarea de 7,4 cu soluie NaOH 1M. peste aceast soluie se adaug acetat de etil (15 ml acetat de etil la 5ml proba miere derivatizat). Dup agitare cu ajutorul agitatorului Vortex timp de 2 minute, urmeaz omogenizarea timp de 10 minute i centrifugarea probei 10 min la 4500 rcf. din supernatant se transfer n microtuburi cte 6 ml din fiecare prob. Microtuburile cu probe se evapor pentru 30 min la 60C i presiune 15 psi. reziduul obinut dup evaporare se reia cu 375 l diluant pentru probe (AM III DIL SPE) i se agit cu ajutorul agitatorului Vortex timp de 2 minute. Etape de lucru se execut manual i sunt similare celor de la tehnica ELISA: Rezultate i discuii Confirmarea rezultatelor obinute prin metoda Biocip pentru probele de miere analizate s-a realizat prin metoda LC-MS/MS, utiliznd sistemul Agilent 1100 LC (Agilent Technologies, SUA) cuplat cu spectrometru de mas 4000 Q TRAP (Applied Biosystems, SUA). Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip i confirmate prin metoda LC-MS/MS au evideniat prezena acelorai reziduuri medicamentoase la valori peste LMPN. n proba 3 s-au determinat concentraii de nitrofurani (SEM i AOZ) peste valoarea de 1 g/kg (LMPN), valorile obinute prin metoda Biocip fiind comparabile cu cele obinute prin metoda LC-MS/MS (tabel V.4).
36
Tabelul V.4: Concentraiile celor 4 nitrofurani i cloramfenicol determinate prin metoda Biocip i LC-MS/MS
Proba Metoda AOZ Proba 1 Biocip LC-MS/MS Proba 2 Biocip LC-MS/MS Proba 3 Biocip LC-MS/MS Proba 4 Biocip LC-MS/MS Proba 5 Biocip LC-MS/MS Proba 6 Biocip LC-MS/MS Proba 7 Biocip LC-MS/MS Proba 8 Biocip LC-MS/MS Proba 9 Biocip LC-MS/MS Proba 10 Biocip LC-MS/MS Proba 11 Biocip LC-MS/MS Proba 12 Biocip LC-MS/MS 0,50 0,17 0,76 0,41 1,24 1,11 0,68 0,08 0,35 0,12 0,44 0,43 0,41 0,09 0,28 0,22 0,27 0,07 1,07 0,72 0,43 0,44 0,76 0,42 Concentraie analit (g/kg) AMOZ 0,74 0,12 0,75 0,42 2,88 1,46 0,53 0,34 0,65 0,18 0,88 0,65 0,54 0,16 0,78 0,98 0,99 0,76 0,99 0,77 0,43 0,76 0,65 0,48 AHD 0,46 0,32 0,78 0,13 4,16 2,34 0,55 0,11 0,73 0,65 0,67 0,60 0,65 0,45 0,89 0,99 0,54 0,76 1,14 0,76 0,54 0,76 0,42 0,53 SEM 0,75 0,19 0,66 0,28 7,21 6,54 0,54 0,38 0,44 0,22 0,57 0,52 0,72 0,43 0,34 0,21 0,88 0,72 0,88 0,72 0,88 0,72 0,63 0,26 CAP 0,79 0,88 0,84 0,33 3,07 2,34 0,23 0,07 0,76 0,61 0,49 0,29 0,77 0,43 0,44 0,94 0,11 0,32 0,11 0,32 0,11 0,32 0,85 0,12
37
Proba
Metoda AOZ
Concentraie analit (g/kg) AMOZ 0,74 0,81 0,89 0,16 0,79 0,76 0,89 0,32 AHD 0,89 0,19 0,54 0,26 0,54 0,46 0,54 0,32 SEM 0,34 0,21 0,88 0,42 0,88 0,62 0,88 0,21 CAP 0,44 0,14 0,11 0,02 0,11 0,53 0,11 0,26
Proba 13
Biocip LC-MS/MS
0,43 0,87 0,89 0,80 0,89 0,80 0,89 0,48
Proba 14
Biocip LC-MS/MS
Proba 15
Biocip LC-MS/MS
Proba 16
Biocip LC-MS/MS
Rezultatele obinute n acest studiu sunt comparabile cu cele existente n literatura de specialitate. Concluzii Tehnologia Biocip a permis msurarea simultan i selectiv a 4 metabolii de nitrofurani i a cloramfenicolului n miere la nivele mult mai mici dect LMPN admise. Metoda aplicat se caracterizeaz prin specificitate pentru fiecare analit intit i prin sensibilitate exprimat ca IC50, care a nregistrat valori 2,32 g/kg. Metoda prezint o precizie foarte bun att n cadrul aceleeai serii analitice, ct i n serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici de 15 % pentru concentraiile de 0,5, 1 i 1,5 g/kg. Limita de decizie (CC) obinut pentru determinarea metaboliilor a 4 nitrofurani i cloramfenicolului s-a ncadrat ntre valorile 0,37 g/kg i 1,05 g/kg. Capabilitatea de detecie (CC) a nregistrat valori care s-au ncadrat n intervalul 0,42 - 1,14 g/kg. Coeficientul de recuperare obinut s-a situat n domeniul 64 192 % fa de concentraia iniial.
38
CAPITOLUL VI - ESTIMAREA CONINUTULUI DE CHINOLONE I ANTIBIOTICE N MIEREA DE ALBINE Scopul cercetrii Studiul din acest capitol a avut drept scop validarea unei metode de determinare simultan a chinolonelor (QNL), cefalosporinelor (ceftiofur - CEFT), amfenicolilor (tiamfenicol - TAF), aminoglicozidelor (streptomicina - STR), macrolidelor (tilozina - TYL), tetraciclinelor (TCN) utiliznd tehnologia Biocip i aplicarea acesteia la analiza probelor de miere. Introducere Chinolonele constituie o clas de ageni antimicrobieni sintetici eficieni n tratamentul multor boli infecioase provocate de bacterii att n medicina uman, ct i n cea veterinar. Majoritatea utilizrilor de uz veterinar al acestor chimioterapice antimicrobiene este sub form de fluorochinolone. Dei la ora actual datele tiinifice privind eficacitatea fluorochinolonelor n apicultur sunt reduse, utilizarea acestora ca profilaxie a bolilor albinelor, n special n Asia, a luat amploare n ultimii ani. Aceast utilizarea a fost confirmat de detectarea reziduurilor de chinolone n mierea din acea zona (Savoy Perroud, 2009). Utilizarea pe scar larg a chinolonelor n medicina veterinar reprezint un pericol potenial pentru sntatea uman; acestea fi prezente sub form de reziduuri n produsele alimentare (Wegener, 1999), care poate determina reacii alergice sau fenomene de rezisten la antibiotice la om. Ceftiofurul face parte din cefalosporinele de generaia a treia, dezvoltate exclusiv pentru uz veterinar. Este bactericid in vitro prin inhibarea sintezei peretelui celular al germenilor. n ultimii ani, ceftiofurul a fost folosit n apicultur pentru tratarea infeciilor bacteriene dei nu este recomandat n timpul produciei mierii, totui poate fi detectat n miere (Moats, Buckley, 1998).
39
Tiamfenicolul i fluorfenicolul sunt antibiotice cu spectrul larg, foarte asemntoare ca structur i mod de a aciona cu cele ale cloramfenicolului. Streptomicina se utilizeaz n apicultur mpotriva bolii Loca americana i Loca europena n mai multe ri, n special n America Central i de Sud. n ciuda faptului c tratamentele cu streptomicin nu sunt permise n cele mai multe ri (UE, SUA) datorit toxicitii crescute, utilizarea acesteia este adesea sugerat n diferite forumuri apicole i n manualele de apicultur (Mutinelli, 2003). n China, streptomicina i cloramfenicolul au fost antibiotice preferate pentru a controla un mare focar de boal Loca americana n 1997 (Ortelli et al., 2004). Macrolidele sunt chimioterapice antibacteriene larg rspndinte n practica medical i veterinar. Din grupa macrolidelor mai face parte tilozin care este utilizat la nivel global n apicultur i a crei eficacitate a fost dovedit de ctre autori diferii (Hitchcock et al., 1970; Moffett et al., 1970; Peng et al., 1996; Pettis, Feldlaufer, 2005). Tetraciclinele sunt chimioterapice antimicrobiene cu spectru larg bacteriostatic, cu o lung istorie n medicina veterinar. Oxitetraciclina, de obicei sub form de clorhidrat, este utilizat n apicultur de la nceputul anilor cincizeci n tratamentul bolilor bacteriene de puiet, cum ar fi Loca americana (Hopingarner, Nelson, 1987; Spivak, 2000) i Loca europeana (Oldroyd et al., 1989.; Waite et al, 2003;. Thompson et al., 2005). Material i metod Tehnologia Biocip a permis determinarea simultan, cantitativ att a compuilor printe din cele 6 clase de chimioterapice antimicrobiene ct i a principalilor metabolii ai acestora. Toate determinrile au fost efectuate pe analizorul Evidence Investigator produs de firma Randox, UK. Toi reactivii sunt multianalit i sunt furnizai de productorul aparatului ntr-un kit compact care include: Anti Microbial Array II (EV3524) produs de Randox Laboratories, UK
40
Control: Multianalit Control (cod de catalog AMC5004, Randox Laboratories, UK). Validarea metodei Validarea metodei de determinare cantitativ simultan a celor 6 tipuri de chimioterapice antimicrobiene luate n studiu utiliznd tehnologia Biocip reprezint un protocol care ntrunete concomintent cerinele deciziei 2002/657/CE i posibilitile unui laborator oficial cu numr mare de probe de testat. Parametrii de validare evaluai au fost urmtorii: calibrarea (liniaritatea); sensibilitatea (IC50); specificitatea i selectivitatea; precizia (intermediar i reproductibilitate) i acurateea; limita de detecie; regsirea (recuperarea). Valorile parametrilor de validare sunt inserate n tabel VI.1 i tabel VI.2. Limita de decizie obinut pentru clasele de antibiotice determinate s-a ncadrat ntre valorile 1,25 g/kg i 5,5 g/kg. Capabilitatea de detecie obinut pentru aceleai chimioterapice s-a ncadrat ntre valorile 2,05 g/kg i 8,81 g/kg. Valorile obinute sunt redate n tabel VI.2 i fig. VI.16.
41
CEFT 10 8 TYL 6 4 2 0 QNL
TAF
STR
TCN Limita de decizie CC (g/kg) Capabilitatea de detecie CC (g/kg)
Fig. VI.16: Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detecie (CC)
42
Tabelul VI.1: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie i acuratee)

Parametrii de validare Liniaritate Interval de calibrare (g/kg) Coeficient de corelatie r CEFT 0-7 0,986 QNL 0 - 11,5 0,982 STR ANALIT TCN 0-4 0,994 TAF 0-5 0,998 TYL 0-5 0,991
0 - 76 0,987
Senibilitate
IC 50 (g/kg)
0,25
0,52
1,30
1,70
0,50
0,55
Nivel 1 Aceeai serie Precizie i acuratee Nivel 2 Nivel 3 Nivel 1 Serii diferite Nivel 2 Nivel 3
1,25 6,8 2,50 5,80 5,00 5,00 0,49 6,80 1,05 5,80 1,97 5,00
0,63 4,30 1,25 6,60 2,50 6,80 0,93 4,30 1,80 6,60 3,29 6,80
3,91 4,60 7,81 3,40 15,63 4,60 5,03 4,60 8,51 3,40 18,88 4,60
1,48 6,90 2,22 7,60 3,33 5,70 0,99 6,90 1,43 7,60 2,25 5,70
0,31 3,40 0,63 4,50 1,25 6,80 0,38 3,40 0,59 4,50 1,17 6,80
0,31 5,00 0,63 4,00 1,25 4,00 0,33 5,00 0,66 4,00 1,28 4,00
43
Tabelul VI.2: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie i capabilitate de detecie)
Parametrii de validare Nivel 1 Recuperarea Nivel 2 Nivel 3 Conc.(g/kg) Recuperare (%) Conc.(g/kg) Recuperare (%) Conc.(g/kg) Recuperare (%) CEFT 0,56 112 0,87 87 1,54 77 0,49 2,44 4,01 4,50 8,51 QNL 0,62 123 1,00 100 1,74 87 0,93 1,52 2,50 3,43 5,93 STR 0,57 113 0,91 91 2,00 100 5,03 0,28 0,47 5,50 5,97 ANALIT TCN 0,63 125 0,84 84 1,68 84 0,99 2,38 3,91 4,90 8,81 TAF 0,60 119 1,00 100 1,98 99 0,38 0,53 0,87 1,25 2,05 TYL 0,60 119 1,05 105 1,86 93 0,33 0,65 1,07 1,40 2,47
Universitatea de Medicin i Farmacie Grigore T. Popa - Iai, Facultatea de Farmacie Popa T. Popa Grigore Farmacie Grigore i Farmacie Medicin demierea de Medicin Facultatea Universitatea - Iai, Iai, Facultatea T. Farmacie de de Farmacie i Universitatea de albine din medicamentoase Daniela reziduurilor (Morariu) Ionela Popa Determinarea de mierea de din mierea medicamentoase din Daniela reziduurilor medicamentoase Ionela Daniela (Morariu) Ionela Popa (Morariu) - Determinarea Determinarea reziduurilor Popa albine albine
1Limita de decizie CC i capabilitate de detecie CC
44
Analiza cantitativ a chinolonelor i a diferitelor tipuri de antibiotice n probe de miere

Metoda validat a fost aplicat pe 43 de probe de miere de diferite sortimente n vederea determinrii reziduurilor de chinolone i antibiotice. Prelucrarea probelor Eantioane de miere analizate prin metoda LC-MS/MS i identificate ca fiind fr reziduuri de medicamente au fost utilizate ca i probe blanc sau controale negative n cadrul protocolului de validare. Optimizarea procedurii de extracie Datorit faptului c mierea este o matrice complex ce conine zaharuri, dar i alte substane precum pigmeni sau compui fenolici, care trebuie eliminai nainte de nceperea determinrilor de reziduuri medicamentose, am inclus o etap de extracie n cadrul protocolului de testare, innd cont de proprietile diferite ale antibioticelor incluse n studiu. S-a luat n considerare necesitatea de a dezvolta o metod comun pentru extracia simultan a mai multor clase de antibiotice. Prelucrarea probelor poate fi fcut n dou moduri: Metoda diluiei rapide: cntrirea a 1 g de miere; adugarea a 9 ml de soluie tampon de reacie (37oC); omogenizare, diluie i filtrare; aplicarea probei pe suprafaa de microtitrare (biocip). Metoda extraciei: cntrirea a 1 g de miere; adugarea a 9 ml de soluie tampon de reacie (37oC); vortexare i adugare de acetat de etil; vortexare, omogenizare, centrifugare; eluare i evaporare pn la uscare a stratului organic superior; resuspensie n soluie tampon de reacie i vortexare;
45
aplicarea probei pe suprafaa de microtitrare (biocip). Etape de lucru se execut manual i sunt similare celor de la tehnica ELISA. Rezultate i discuii Dup testarea celor 43 probe de miere, n 9 probe au fost identificate reziduuri de chinolone, ceftiofur, tiamfenicol, streptomicin, tilozin i tetracicline. Att probele pozitive ct i cele negative au fost confirmate prin metoda LC-MS/MS. Dup cum se observ din datele prezentate n tabel VI.9, valorile de concentraie obinute cu ajutorul metodei Biocip sunt comparabile cu cele obinute prin metoda LCMS/MS. Doar pentru o singur prob au fost identificate reziduuri de tilozin cu ajutorul Panelului Antimicrobian II, ceee ce nu s-a confirmat prin metoda LC-MS/MS. Astfel, putem afirma c pentru tilozin, n probe de miere, metoda Biocip a permis detectarea cu precizie a unei valori mici de concentraie, ns aceast concentraie de 1.9 g/kg nu a fost detectat de metoda LC-MS/MS. Acest rezultat ar putea de asemenea s indice faptul c sensibilitatea metodei Biocip este mult mai nalt dect cea a metodei LC-MS/MS. Rezultatele comparative pentru cele 9 probe de miere pozitive pentru reziduurile de antibiotice analizate sunt prezentate n tabelul VI.9. Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip i confirmate prin metoda LC-MS/MS au evideniat prezena acelorai antibiotice la valori peste LMPN i anume: ciprofloxacin, norfloxacin, streptomicin, tilozin i clortetraciclin. Cele 9 probe pozitive de miere provin de la apicultori particulari din diferite regiuni geografice din Romnia.
46
Tabelul VI.9. Concentraiile celor 6 clase de antibiotice n probele de miere determinate prin metoda Biocip i confirmate prin metoda LC-MS/MS
Proba Proba 1 Proba 2 Metoda Biocip LCMS/MS Biocip LCMS/MS QNL (g/kg) < LOD < LOD 10.4 Ciprofloxacin 5g/kg, Norfloxacin 7g/kg 54.9 Ciprofloxacin 41g/kg, Norfloxacin 10g/kg 12.7 Ciprofloxacin 4g/kg, Norfloxacin 2g/kg 11.4 Ciprofloxacin 7 g/kg, Norfloxacin 3g/kg < LOD < LOD 9.4 Ciprofloxacin 6g/kg, Norfloxacin 4g/kg 24.6 Ciprofloxacin 3g/kg, Norfloxacin 15g/kg < LOD < LOD CEFT (g/kg) < LOD < LOD < LOD < LOD TAF (g/kg) < LOD < LOD < LOD < LOD STR (g/kg) < LOD < LOD 29 22 TYL (g/kg) 3.4 6 < LOD < LOD TCN (g/kg) < LOD < LOD < LOD < LOD
Proba 3
Biocip LCMS/MS
< LOD < LOD
< LOD < LOD
34.9 28
< LOD < LOD
< LOD < LOD
Proba 4
Biocip LCMS/MS
< LOD < LOD
< LOD < LOD
< LOD < LOD
< LOD < LOD
10.7 Clortetraciclin 8g/kg < LOD < LOD
Proba 5
Biocip LCMS/MS
< LOD < LOD
< LOD < LOD
26.6 19
< LOD < LOD
Proba 6 Proba 7
Biocip LCMS/MS Biocip LCMS/MS
< LOD < LOD < LOD < LOD
17.8 18 < LOD < LOD
Proba 8
Biocip LCMS/MS
< LOD < LOD
< LOD < LOD
13.4 11
< LOD < LOD
< LOD < LOD
Proba 9
Biocip LCMS/MS
< LOD < LOD
< LOD < LOD
< LOD < LOD
1.9
< LOD
< LOD < LOD
47
Rezultatele obinute n acest studiu sunt comparabile cu cele existente n literatura de specialitate. Vidal et al. (2009) au dezvoltat recent o metod pentru detectarea simultan a 16 antibiotice (macrolide, tetracicline, chinolone i sulfonamide). Majoritatea probelor de miere au fost achiziionate din supermarketuri, iar cinci dintre ele au fost colectate de la diferii apicultori particulari din Granada i Almera. Rezultatele studiului au relevant un coninut de 8,6 g/kg n una din probele comercializate, n timp ce o prob provenit de la un apicultor particular a prezentat urme de sarafloxacin i reziduuri de tilozin, sulfadimidin i sulfaclorpiridazin (Vidal et al., 2009). Concluzii Sub aspectul performanei analitice, metoda Biocip prezint o precizie excelent att n cadrul aceleeai serii analitice, ct i n serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici de 15 % pentru concentraiile de 0,5, 1 i 1,50 g/kg. Limita de decizie (CC) obinut pentru cele 6 clase de chimioterapice antimicrobiene determinate s-a ncadrat ntre valorile 1,25 g/kg i 5,5 g/kg. Capabilitatea de detecie (CC) a nregistrat valori situate n intervalul 2,05 - 8,81 g/kg. Coeficientul de recuperare obinut s-a situat n domeniul 77 125 % fa de concentraia iniial. Performanele metodei Biocip au fost corespunztoare, rezultatele obinute au fost comparabile cu valorile de concentraie determinate prin metoda confirmatorie, att pentru probele pozitive ct i pentru probele negative. Panelul Antimicrobian II reprezint un sistem foarte eficient pentru detectarea i cuantificarea simultan multianalit pentru 6 clase diferite de chimioterapice antimicrobiene n probe de miere. Compararea rezultatelor obinute prin metoda Biocip i LC-MS/MS a evideniat c metoda biosenzor propus, prezint adecvare la scopul propus, i anume determinarea concentraiei fiecrui analit n parte, n cadrul programelor europene de supraveghere a siguranei alimentelor.
48
CAPITOLUL VII - STUDIU EXPERIMENTAL AL INFLUENEI REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE (SULFONAMIDE) DIN MIERE ASUPRA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI, IMUNOLOGICI I HEMATOLOGICI LA ANIMALE DE LABORATOR
Scopul cercetrii Obiectivele cercetrilor incluse n acest capitol au urmrit studierea influenei unor reziduuri medicamentoase (sulfonamide) din mierea de albine asupra obolanilor, rasa Wistar prin: evaluarea modificrilor valorilor plasmatice ale parametrilor implicai n reaciile de hipersensibilitate de tip alergic prin analizarea variaiei valorilor serice ale citokinelor: interleukina IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, factorul de cretere al endoteliului vascular (VEGF), interferon gamma (IFN), factor de necroz tumoral alfa (TNF), IL1, IL-1, MCP-1, factorul de cretere epidermic (EGF), nainte i dup administrarea de miere de albine coninnd un amestec de sulfonamide (20 g din fiecare sulfonamid: sulfadiazina, sulfametazina, sulfatiazol i sulfametizol, sulfadimetoxina) evaluarea unor parametri biochimici (uree, creatinin, acid uric, bilirubin total, bilirubin direct, aspartat aminotransferaza AST, alanin aminotransferaza - ALT, triiodotironina - T3, tiroxina - T4) i hematologici (hematocrit - Hct, hemoglobina - Hb, numrtoare globule roii - RBC, concentraia medie a hemoglobinei dintr-un volum dat de eritrocite - MCHC, volum eritrocitar mediu - MCV) dup administrare de miere coninnd sulfonamide. Introducere Chimioterapicele antimicrobiene sunt eficiente mpotriva bolilor albinelor, ns reziduurile medicamentoase pot s persiste o perioad mai mare de timp n esuturi (uneori chiar i o lun), iar consumul de miere care conine astfel de reziduuri reprezint un potenial risc pentru sntatea omului. Literatura include date privind toxicitatea acestor compui.
49
Intensitatea aciunii, durata de aciune i toxicitatea sulfonamidelor deriv din capacitatea organismului de a le transforma n sulfonilamid, activitatea antibacterian datorndu-se structurii sulfanilamidice. Prezena grupei metoxi pe radicalii heterociclici determin o ntrziere a eliminrii din organism i o aciune prelungit (Castrejon, 2010). Se consider c sulfonamidele au o toxicitate medie care include tulburri gastrointestinale (grea, vom, diaree), reacii de hipersensibilitate (alergice) care constau n erupii cutanate, eozinofilie, rareori oc anafilactic; la persoanele cu deficit genetic de glucozo-6fosfat dehidrogenaz a enterocitelor poate aprea anemia hemolitic. Sulfamidele au aciune competitiv cu bilirubina pentru situsurile de legare ale acesteia i de aceea nu trebuie administrate n ultimul trimestru de sarcin i la nou-nscut. Bilirubina nelegat se poate depozita n ganglionii bazali ai creierului i n subtalamus, determinnd encefalopatie toxic (icter nuclear Kernicterus) (Naisbitt et al., 2001; Verdel et al., 2006 ). n urma biotestelor efectuate la roztoare s-a raportat c sulfametazinul produce tumori cu diferite localizri; de asemenea au fost prezentate dovezi privind toxicitatea sulfonamidelor asupra glandei tiroide (Finkelman, 2007). Unele sulfonamide inhib prin mecanism competitiv lactoperoxidaza i tiroid peroxidaza, mediatori n sinteza hormonilor tiroidieni, putnd conduce la hipertiroidism. n plus sulfonamidele pot da uneori febra medicamentoas, boala serului i lupus eritematos sistemic (hipersensibilitate de tip III mediat de imunoglobulinele G), toxicitate hepatic (inclusiv necroza). Sulfonamidele pot da reacii alergice severe, incluznd toxicitate hepatic i hematologic, pe lng toxicitatea dermatologic. i reaciile de fotosensibilizare sunt relativ frecvente la sulfonamide. Aproximativ 3% din populaie este afectat de reacii alergice la sulfonamide. Citotoxicitatea compuilor hidroxilaminici asupra limfocitelor umane a fost demonstrat prin studii in vitro (Contreras, 2003). Aceti compui produc ocazional un numr de reacii alergice (hipersensibilitate), de la rash-uri tegumentare minore (inclusiv reacii maculopapulare i reacii
50
de tip pruriginos care apar tipic dup o sptmn de tratament), pn la reacii severe sau care pun uneori n pericol viaa pacienilor cum ar fi: eritemul multiform, sindromul Stens-Johnson i necroliza epidermic toxic. Reaciile de hipersensibilitate la niveluri terapeutice de sulfonamide, au fost intens studiate n schimb nu s-au raportat cazuri de alergie la sulfonamide datorit ingestiei de alimente contaminate cu reziduuri medicamentoase, ns manifestrile specifice ar fi greu de recunoscut la doze att de mici. Deoarece n publicaiile din literatura de specialitate sunt disponibile doar date limitate am decis efectuarea unei evaluri mai complete pentru acest aspect. Biomarkerii care evideniaz reacile de hipersensibilitate sunt citokinele, imunoglobulinele E, limfocitele i histamina.
Evidenierea rspunsului imun la obolani dup administrare de miere coninnd sulfonamide

Protocol experimental Studiul s-a desfurat pe 2 loturi de obolani care au consumat miere coninnd amestec de sulfonamide (100 g/kg amestec de 5 sulfonamide - 20 g din fiecare sulfonamid: sulfadiazina, sulfametazina, sulfatiazol i sulfametizol, sulfadimetoxina); concentraiile citokinelor obinute au fost comparate cu valorile obinute pentru lotul martor. Fiecare lot a inclus 15 obolani, pentru ca semnificaia statistic s fie acceptabil, iar lotul martor a fost format din 10 obolani. Pentru acest studiu s-au selecionat femele de obolani rasa Wistar cu greutate de 180 - 220 g. obolanii au fost mpriti n 3 loturi: l - lot de control administrare prin gavaj gastric de hran standard i 2 ml miere de albine, lotul 2 - obolani crora li s-au administrat prin gavaj gastric timp de 5 zile, miere cu amestec de sulfonamide i lotul 3 - obolani crora li s-au administrat prin gavaj gastric 2 ml de miere mbogit cu 100 g/kg amestec de sulfonamide, timp de 14 zile consecutiv.
51
Studiul a fost realizat n conformitate cu aprobarea emis de ctre Comitetul de Etic a Cercetrii al Universitii de Medicin i Farmacie "Grigore T. Popa "- Iai. Material i metod Determinrile cantitative ale citokinelor, s-au efectuat pe analizorul Evidence Investigator (Randox Laboratories, UK), determinrile cantitative ale imunoglobulinei E (IgE) s-au efectuat pe aparatul Stat Fax 303 Plus (Awareness Technology, SUA), iar eozinofilele s-au determinat pe analizorul automat de hematologie, model Sysmex XT 1800i (Sysmex Europe Gmbh, Germania). Reactivi: Rectivi pentru determinarea simultan a 12 citokine: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, IFN, TNF, IL-1, IL-1, MCP-1, EGF sunt furnizai ntr-un kit compact care cuprinde: Kit High Sensitivity Cytokine Array I (cod EV3623, productor Randox Laboratories, UK) Control : Multianalit Control (Randox Laboratories, UK) utilizat pentru verificarea preciziei i acurateii metodei Reactivi pentru determinrile de IgE: kit ELISA (Clin Pro Internaional, SUA), cod EH-518 Reactivi pentru determinarea hemoleucogramei sunt reactivi dedicai pentru analizorul automat de hematologie Sysmex XT 1800i. Prelucrarea i interpretarea statistic Datele obinute au fost prelucrate statistic n vederea eliminrii variaiilor biologice i a erorilor de determinare i totodat pentru validarea rezultatelor studiului. S-a efectuat n acest scop descrierea statistic a eantioanelor de probe pentru obinerea descriptorilor de interes (medie, median, eroare standard a mediei - ES, deviaie standard, varian, amplitudine, coeficient Skewness, coeficient Kurtosis). Prelucrarea i reprezentarea grafic a datelor s-a realizat utiliznd module de lucru ale softurilor MedCalc i Microsoft Office 2007.
52
Testele statistice aplicate: pentru probele cu valori normal distribuite au fost t-Student pentru probe independente cu variane egale i t-Student pentru probe independente cu variane inegale, iar pentru cele a cror distribuie nu a putut fi normalizat - testul Mann-Whitney. Pentru a verifica normalitatea distribuiei datelor s-au utilizat testele DAgostino-Pearson i Kolmogorov-Smirnov. Rezultate
A. Analiza comparativ a rezultatelor parametrilor analizai

Rezultatele obinute pentru determinarea citokinelor, IgE i eozinofilelor n urma administrrii de miere coninnd reziduuri de sulfonamide la obolani Wistar sunt redate n tabel VII..4. Media valorilor obinute pentru citokine, IgE i eozinofile n cadrul loturilor analizate este prezentat n fig.VII.9 - VII.10.
53
B 18 16
IL-4 14 (pg/mL)
16,14 14,19
12 10 8
Deviatia standard a mediei
12 10 9,28 8,37
IL-10 8 (pg/mL)
6 4
6 4 2 0
5,39 2,85
2 0 Lot 1 Lot 2 Lot 3
Fig.VII.9: Variaia valorilor interleukinelor Th-1 derivate (A), Th-2 derivate (B) i APC derivate (C)
54
Fig. VII.10: Variaia valorilor factorilor de cretere (A), a valorilor IgE (B) i eozinofilelor (C)
Tabelul VII.4: Tabelul sinoptic al rezultatelor determinrilor de citokine, IgE i eozinofile

Parametru determinat Interleukine Th-1 derivate (pg/ml) Interleukine Th-2 derivate (pg/ml) Interleukine APC derivate (pg/ml) IL-2 IFN- IL-4 IL-10 IL-1 IL-1 IL-6 IL-8 TNF- VEGF MCP1 EGF Lot 1 (n = 10) 4,96 0,73 4,07 0,45 5,39 0,73 2,85 0,28 3,22 0,47 4,68 1,24 5,23 0,50 4,58 0,67 3,04 0,24 2,91 0,36 137,1 1,26 4,76 0,63 2,05 0,34 2,42 0,42 Media DS Lot 2 (n = 15) 6,57 0,72 6,80 0,85 14,19 2,35 9,28 2,92 3,17 0,35 3,84 1,29 9,85 2,50 9,34 2,07 4,66 0,48 8,53 1,91 150,51 4,03 6,72 0,81 14,43 2,52 7,18 0,90 Lot 3 (n = 15) 6,75 0,73 6,71 0,78 16,14 2,87 8,37 2,13 2,57 0,21 5.99 2.07 8,16 1,39 8,56 2,07 4,93 0,54 8,59 1,91 148,31 3,62 6,85 1,00 16,03 3,08 8,33 0,96
Factori de cretere (pg/ml) IgE (UI/ml) Eozinofile (%)
B. Analiza corelaiei rezultatelor citokinelor implicate n reacia alergic cu rezultatele IgE i a eozinofilelor. Valorile fiecrui lot examinat au fost considerate ca fiind diferite semnificativ statistic fa de celelalte pentru un anumit parametru atunci cnd probabilitatea de eroare a fost mai mic de 0,05 (p < 0,05). Pentru compararea variabilelor cantitative s-a folosit indicele de corelaie Pearson (r). Procentul n care valorile variabilelor analizate sunt realmente corelate este indicat de coeficientul de corelare Pearson (R2 ). Analiza parametrilor luai n studiu pentru fiecare lot i corelaia ntre valorile lor cu ajutorul indicelui de corelaie Pearson este ilustrat n tabel VII.19- VII.20.
55
Tabelul VII.19: Analiza corelaiei citokinelor cu IgE

Interleukine Th-1 derivate IL-2 (pg/ml) Lot 1 r P R2 0,2434 0,4981 0,0592 0,0586 0,8357 0.0034 0,5887 0,0210* 0,3466 IFN- (pg/ml) -0,1098 0,7627 0,0121 -0,3220 0,2418 0,1037 0,6019 0,0176 0,3622 Interleukine Th-2 derivate IL-4 (pg/ml) -0,3065 0,3891 0,0939 0,8579 < 0,0001*** 0,7360 0,7537 0,0012** 0,5681 IL -10 (pg/ml) -0,0486 0,8939 0,0024 0,5250 0,0445* 0,2756 0,3130 0,2560 0,0980 IL-1 (pg/ml) 0,0492 0,8926 0,0024 -0,0299 0,9158 0,0009 0,5582 0,0306* 0,3115 Interleukine APC derivate IL-1 (pg/ml) 0,1340 0,7121 0,0180 0,1240 0,6597 0,0154 0,4170 0,1220 0,1739 TNF- (pg/ml) 0,2860 0,4231 0,0818 0,5319 0,0413* 0,2829 0,3160 0,2512 0,0999 Factori de cretere IL-6 (pg/ml) -0,1928 0,5935 0,0372 -0,00357 0,9899 0,1274 x 10-6 0,3137 0,2548 0,0984 IL-8 (pg/ml) -0,3676 0,2960 0,1351 0,1639 0,5594 0,0269 0,2180 0,4350 0,0475 VEGF (pg/ml) -0,3950 0,2586 0,1560 0,1500 0,5936 0,0225 -0,1235 0,6610 0,0153 MCP1 (pg/ml) -0,2191 0,5431 0,0480 -0,1570 0,5763 0,0246 0,3933 0,1469 0,1547 EGF (pg/ml) -0,2606 0,4670 0,0679 -0,1875 0,5034 0,0352 0,1560 0,5788 0,0243
56
Lot 2
r P R2 r P R2
Lot 3
p < 0.05 semnificativ(*), p 0,01 distinct semnificativ (**), p 0,001 foarte semnificativ (***)
Tabelul VII.20: Analiza corelaiei citokinelor cu eozinofilele

Interleukine Th-1 derivate IL-2 (pg/ml) Lot 1 r P R2 Lot 2 r P R2 0,3426 0,3325 0,1174 -0,0184 0,9482 IFN- (pg/ml) -0,1593 0,6601 0,0254 0,0025 0,9928 0,0645 x 10Interleukine Th-2 derivate IL-4 (pg/ml) -0,4433 0,1994 0,1966 0,6865 0,0047** IL -10 (pg/ml) -0,4420 0,2009 0,1954 0,4610 0,0837 IL-1 (pg/ml) 0,2597 0,4687 0,0674 -0,1119 0,6913 Interleukine APC derivate IL-1 (pg/ml) 0,0545 0,8811 0,0030 0,2600 0,3493 TNF- (pg/ml) -0,0303 0,9338 0,0009 0,2401 0,3888 0,0576 0,4650 0,0807 0,2162 Factori de cretere IL-6 (pg/ml) -0,4268 0,2187 0,1821 IL-8 (pg/ml) -0,2998 0,4001 0,0898 0,1183 0,6747 0,0140 0,2630 0,3436 0,0692 VEGF (pg/ml) 0,0909 0,8028 0,0083 0,2640 0,3417 0,0697 -0,0895 0,7512 0,0080 MCP1 (pg/ml) -0,3271 0,3563 0,1070 -0,0340 0,9043 0,0012 0,3627 0,1840 0,1315 EGF (pg/ml) -0,5131 0,1293 0,2633 -0,1516 0,5897 0,0230 0,0948 0,7368 0,0090
0,0179 0,9495 0,3204 x 0,0003 0,4713 0,2125 0,0125 0,0676 4 10-3 0,5280 0,3553 0,5857 0,2930 0,6600 0,4630 0,1905 Lot 3 r P 0,1937 0,2892 0,0822 0,4964 0,0431* 0,0218* 0,0074** R2 0,2788 0,1263 0,3431 0,0858 0,4356 0,2144 0,0363 p < 0.05 semnificativ(*), p 0,01 distinct semnificativ (**), p 0,001 foarte semnificativ (***)
57
57
Discuii Reaciile de hipersensibilitate/ntrziat tip IV, mediate de citokine eliberate de celulele T sensibilizate, activeaz cascada reaciilor sistemului imunitar implicat n producerea leziunilor tisulare (Castrejon et al., 2010). n urma msurrii concentraiilor citokinelor serice APC derivate la loturile de obolanii studiate putem concluziona c citokine au prezentat valori serice semnificativ crescute ale IL-1, IL-1, IL-6, IL-8, TNF- n cadrul loturilor 2 i 3 comparativ cu lotul martor, concentraiile medii fiind corelate cu perioada de timp pe care s-a desfaurat administrarea de miere cu sulfonamide. Rezultatele obinute concord cu mecanismele imunologice i datele prezentate n literatur, n cadrul studiilor privitoare la reaciile de hipersensibilitate la sulfonamide. Astfel, interleukinele IL-1, IL-1, IL-6, IL-8, TNF- sunt produse de ctre celulele dendritice mature numite, grupate sub denumirea de interleukine APC (antigen-presenting cell) derivate, ele avnd un rol crucial n iniierea rspunsului imun de ctre limfocitele T. (Sallusto, Lanzavecchia, 1994). Concluzii n urma msurrii concentraiilor citokinelor serice la loturile de obolanii studiate putem concluziona c citokinele analizate prezint profil dublu pro-inflamator i anti-inflamator i difer de cele ale obolanilor din lotul martor. Dousprezece componente diferite, att pro- ct i anti-inflamatorii, au fost analizate: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL10, VEGF, IFN, TNF, IL-1, IL-1, MCP-1 i FEG. Evaluarea modificrilor profilului de citokine dup administrarea de miere coninnd sulfonamide a condus la rezultate care evideniaz faptul c la obolanii care au consumat miere coninnd sulfonamide nivelurile de citokine IL-4 i IL-10, mpreun cu IgE i eozinofilele plasmatice au crescut de 5-30 ori. Prin contrast, nu s-au observat concentraii semnificativ crescute ale citokinelor proinflamatorii, cum ar fi TNF, IL-1 sau IL-1. Concentraiile citokinelor studiate, care sunt indici de hipersensibilitate, sunt crescute n snge i se coreleaz cu prezena de eozinofilie la obolani, dup ingestia de
58
miere coninnd sulfonamide. Celelalte tipuri de citokine au fost uor crescute, cu nivele de concentraie care, n studiul de fa nu par a fi corelate cu biomarkerii indicatori de hipersensibilitate. Valorile obinute pentru citokinele IL-4 i IL-10, mpreun cu IgE i eozinofilele indic un rspuns maxim dup o expunere timp de 14 zile, diferenele fiind semnificative statistic comparativ cu lotul martor. Determinarea citokinelor plasmatice este un instrument util n studiul reaciilor de hipersensibilitate de tip ntrziat la obolani.
Evaluarea parametrilor biochimici i hematologici la obolani dup administrare de miere coninnd reziduuri de sulfonamide
Protocol experimental Studiul s-a desfurat pe 1 lot de obolani care a consumat miere coninnd amestec de sulfonamide (100 g/kg amestec de 5 sulfonamide - 20 g din fiecare sulfonamid: sulfadiazina, sulfametazina, sulfatiazol i sulfametizol, sulfadimetoxina), iar concentraiile obinute pentru parametri biochimici, hematologici i imunologici au fost comparate cu valorile obinute pentru lotul martor. Fiecare lot a inclus 5 obolani, numr minim necesar pentru ca semnificaia statistic a studiului s fie acceptabil. Material i metod Determinrile cantitative ale parametrilor biochimici (uree, creatinin, acid uric, bilirubin total, bilirubin direct, AST, ALT) vizai de experimentul realizat s-au efectuat pe analizorul automat Rx Imola (Randox Laboratories, UK), parametrii imunologici (T3, T4) s-au efectuat pe aparatul Stat Fax 303 Plus (Awareness Technology, SUA), iar parametri hematologici s-au efectuat pe analizorul automat de hematologie, model Sysmex XT 1800i (Sysmex Europe Gmbh, Germania).
59
Reactivi: Rectivi pentru determinri biochimice sunt produi de firma Randox Laboratories, UK i sunt reactivi dedicai pentru analizorul automat Rx Imola: Kit pentru determinarea cantitativ a ureei n ser, plasm i urin prin metoda cinetic enzimatic, cod UR3825 Kit pentru determinarea cantitativ a creatininei n ser, plasm i urin prin metoda colorimetric, cod CR3814 Kit pentru determinarea cantitativ a acidului uric n ser, plasm i urin prin metoda enzimatic colorimetric, cod UA3824 Kit pentru determinarea cantitativ a bilirubinei totale n ser sau plasm prin metoda colorimetric, cod BR3859 Kit pentru determinarea cantitativ a bilirubinei directe n ser sau plasm prin metoda colorimetric, cod BR3807 Kit pentru determinarea cantitativ a activitii aspartataminotransferazei n ser sau plasm prin metoda UV (IFCC) Kit pentru determinarea cantitativ a activitii alaninaminotransferazei n ser sau plasm prin metoda UV (IFCC) Reactivi pentru determinrile imunologice: Kit pentru determinarea T3 (triiodotironina), cod EH-500, productor Clin Pro Internaional, SUA. Kit pentru determinarea T4 (tetraiodotironina sau tiroxina), cod EH-501, productor Clin Pro Internaional, SUA. Reactivi pentru determinarea eozinofilelor (hemoleucograma) sunt reactivi dedicai pentru analizorul automat de hematologie Sysmex XT 1800i. Rezultate Rezultatele obinute pentru parametri biochimici, imunologici i hematologici n urma administrrii de miere coninnd reziduuri de sulfonamide la obolani Wistar sunt redate n tabel VII.26
60
Tabelul VII.26: Tabelul sinoptic pentru valorile obinute pentru parametri biochimici i hematologici dup administrare de miere cu reziduuri de sulfonamide la obolani
Parametru determinat Creatinin (mg/dl) Uree (mg/dl) Acid uric (mg/dl) Bilirubina total (mg/dl) Bilirubina direct (mg/dl) AST (U/l) ALT (U/l) T4 (g/dl) T3 (ng/dl) Hct (%) VEM (MCV) (fL) RBC (milioane/mm3) Hb (g/dl) CHEM (MCHC) (g/dl) Media DS Lot 1 (n = 5) 0,45 0,05 17,04 3,80 1,71 0,29 0,62 0,04 0,08 0,017 60,71 8,66 72,75 4,14 4,50 0,30 0,70 0,14 47,80 3,69 81,60 6,13 9,72 1,14 16,10 0,92 38,.60 2,79 Lot 2 (n = 5) 0,72 0,03 18,36 0,87 2,40 0,42 1,27 0,09 0,32 0,070 109,57 7,36 128.23 5,99 3,32 0,21 0,34 0,03 52,70 6,64 98,50 5,49 5,14 0,38 14,50 1,16 34,50 2,20
Concluzii Rezultatele obinute evideniaz variaii moderate n cadrul loturilor luate n studiu. Concentraiile serice ale alanin aminotransferazei i ale aspartat aminotransferazei au crescut n urma administrrii de miere cu sulfonamide, comparativ cu valorile determinate la lotul martor. Aceste rezultate sunt n concordan cu date din literatura de specialitate, conform crora aciunea toxic a sulfonamidelor, chiar administrate n cantiti foarte mici, se manifest prin perturbarea parametrilor hepatici la animalele de laborator (Hess et al., 1999). Astfel, activitatea ALT i activitatea AST au nregistrat creteri semnificative statistic (p < 0,0001) la obolanii care au primit miere cu sulfonamide, comparativ cu lotul de control, evideniind astfel modificarea permeabilitii membranei hepatocitului.
61
Valorile concentraiei bilirubinei directe variaz asemntor cu cele ale bilirubinei totale, astfel, pentru lotul care a consumat miere cu sulfonamide, valorile bilirubinei directe au fost de 0,32 mg/dl 0,07 fa de 0,08 mg/dl 0,017 nregistrate pentru lotul martor. Cercetrile noastre au nregistrat o cretere nesemnificativ statistic a uremiei, la 18,36 0,87 mg/dl pentru lotul tratat cu sulfonamide, comparativ cu lotul de referin pentru care concentraia medie a ureei a fost 17,04 3,80. Efectul administrrii de miere cu sulfonamide la obolani asupra funciei renale s-a concretizat n creterea semnificativ a valorilor concentraiilor acidului uric i creatininei n cadrul lotului test comparativ cu lotul martor. n literatura de specialitate nu exist date suficiente cu privire la modificarea parametrilor biochimici determinai n prezentul studiu ca urmare a toxicitii datorate administrrii de miere cu sulfonamide. Rezultatele obinute pentru valorile triiodotironinei (T3) sugereaz confirmarea ipotezei conform creia sulfonamidele interfer n sinteza hormonilor tiroidieni. Valorile plasmatice ale tiroxinei (T4) au sczut foarte semnificativ la animalele care au consumat miere cu sulfonamide, comparativ cu lotul martor. Rezultatele sunt concordante cu cele obinute de Cribb et al.(1996).
CAPITOLUL VIII - CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE Concluzii generale
n urma rezultatelor obinute la validarea metodei Biocip pentru cele 3 Paneluri Antimicrobiene, dar i la determinrile cantitative efectuate pe diferite probe de miere, putem concluziona urmtoarele:
62
metoda biosenzor propus este adecvat scopului i anume pentru determinarea concentraiei fiecrui analit n parte, n cadrul programelor de supraveghere a siguranei alimentelor. metoda Biocip utilizat prezint avantajul c nu necesit extracia analitului din matricea biologic cu solven organici. tehnica multiplexarii permite detecia simultan, dintr-o singur prob, minimaliznd astfel variaiile biologice, variaiile analitice i de stabilitate. Detectarea se realizeaz prin chemiluminiscen indus enzimatic, iar fiecare biocip conine opiunea de controale incluse. aceast tehnic de multiplexare are de asemenea largi implicaii att asupra cantitii de prob ct i asupra vitezei de testare, permind posibilitatea obinerii unui numr mare de rezultate (540 determinri) ntr-un timp scurt. determinarea reziduurilor medicamentoase prin metoda Biocip nu necesit operaii adiionale (derivatizare), echipamente i accesorii suplimentare, prin urmare este mai puin laborioas, i implic costuri mai mici comparativ cu metodele cromatografice. volumul de reactiv utilizat pentru un test este mai mic dect la oricare alt sistem. Un volum total de reacie de 350 l este necesar pentru toate testele dintr-un panel antimicrobian. Acest avantaj al metodei Biocip presupune un spaiu de stocare redus i producerea unor cantiti mai mici de deeuri biologice periculoase. toi reactivii utilizai pentru sistemul Evidence Investigator au coduri de bare fcnd sistemul foarte uor de folosit i facilitnd eficientizarea timpului de lucru i a costurilor. Obiectivele cercetrilor din aceast tez au inclus i studiul influenei reziduurilor sulfonamidelor din mierea de albine asupra obolanilor Wistar prin evaluarea modificrilor valorilor plasmatice ale parametrilor implicai n reaciile de hipersensibilitate de tip alergic prin analizarea variaiei valorilor serice ale citokinelor: interleukina IL-2, IL4, IL-6, IL-8, IL-10, factorul de cretere al endoteliului vascular
63
(VEGF), interferon gamma (IFN), factor de necroz tumoral alfa (TNF), IL-1, IL-1, MCP-1, factorul de cretere epidermic (EGF), nainte i dup administrarea de miere de albine coninnd un amestec de sulfonamide (20 g din fiecare sulfonamid: sulfadiazina, sulfametazina, sulfatiazol i sulfametoxazol, sulfadimetoxina). n urma msurrii concentraiilor citokinelor serice APC derivate la loturile de obolanii incluse n experiment putem concluziona c citokinele au prezentat valori serice semnificativ crescute pentru IL-1, IL-1, IL-6, IL-8, TNF- n cadrul loturilor 2 i 3 comparativ cu lotul martor, concentraiile medii fiind corelate cu perioada de timp n care s-a desfaurat administrarea de miere coninnd sulfonamide. Rezultatele obinute concord cu mecanismele imunologice i datele prezentate n literatur, n cadrul studiilor privitoare la reaciile de hipersensibilitate la sulfonamide. Dup administrarea de miere cu sulfonamide, parametrii biochimici, hematologici i imunologici (hormonii tiroidieni) la lotul cruia i s-a administrat miere coninnd sulfonamide, comparativ cu lotul de control, au nregistrat modificri dup cum urmeaz: 1. Evoluia valorilor alanil aminotransferazei, evideniaz creteri semnificative ale activitii acesteia (p < 0,0001), sugernd permeabilizarea membranei hepatocitului i migrarea sa n spaiul intercelular. Dinamica valorilor determinate pentru AST sugereaz c ar avea loc migrarea AST din citoplasma hepatocitelor n spaiul intercelular datorit creterii permeabilitii membranare. Aceast permeabilizare a membranei hepatocitului poate fi consecina lezrii consecutive legrii sulfonamidelor sau a unor metabolii ai acestora de proteinele membranare. Bilirubina total a nregistrat o cretere de 48,81%. Rezultatele obinute n urma determinrii concentraiilor plasmatice ale bilirubinei totale i bilirubinei directe confirm afectarea sever a funciei hepato biliare n urma administrrii timp de 14 zile, prin gavaj gastric, a mierii coninnd sulfonamide. Parametrii de investigare a funciei renale au nregistrat concentraii crescute la lotul testat, ca urmare a toxicitii datorate administrrii de miere coninnd sulfonamide. Astfel, s-au
64
nregistrat creteri ale creatininei, ureei i acidului uric n procente de 60 %, 7,74%, respectiv 40,35%. 2. Parametrii hematologici au nregistrat variaii semnificative. Modificrile indicilor hematologici n sensul reducerii semnificative a numrului de eritrocite, a cantitii de hemoglobin i a valorii hematocritului au evideniat instalarea unei anemii eritrocitare la lotul testat. 3. Investigarea funciei tiroidiene prin determinarea T3 i T4 i urmrirea raportului acestora a evideniat scderea foarte semnificativ a valorilor plasmatice ale tiroxinei la animalele care au consumat miere coninnd sulfonamide, comparativ cu lotul martor.
Contribuii originale
Sintetiznd activitatea de cercetare din studiile efectuate n cadrul acestei teze de doctorat se remarc urmtoarele elemente de originalitate: validarea unei metode de analiz cantitativ a reziduurilor medicamentoase (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani i chinolone) din mierea de albine prin metoda Biocip, metod care se distinge att prin precizie i acuratee, liniaritate, limit de decizie i capabilitate de detecie, randament de recuperare, ct i prin simplitatea i uurina metodologiei de lucru, prin costuri reduse pentru aparatur i reactivi, comparativ cu metodele gaz cromatografice sau lichid cromatografice utilizate n prezent; tehnologia Biocip simplific metodologia de confirmare a prezenei reziduurilor medicamentoase prin posibilitatea de cuantificare i identificare individual a substanelor antimicrobiene utilizate n tratamentul bolilor la albine i care se regsesc ca reziduuri n miere; determinarea coninutului n reziduuri medicamentoase al mierii de albine disponibil pe piaa romneasc utiliznd metoda Biocip evit obinerea unor rezultate fals pozitive; tehnologia Biocip permite identificarea individual a citokinelor, biomarkeri care evideniaz reaciile de hipersensibilitate;
65
realizarea unui model experimental pe animale de laborator care a avut ca obiectiv major identificarea reaciilor de hipersensibilitate cu manifestri alergice la doze foarte mici datorate ingestiei de miere coninnd sulfonamide, precum i repercusiunile generate de aceste reziduuri medicamentoase la nivel biochimic, imunologic i hematologic. n literatura de specialitate sunt disponibile doar date limitate referitoare la dozarea citokinelor plasmatice, un instrument util n studiul reaciilor de hipersensibilitate de tip ntrziat la obolani.
Perspective de cercetare
Rezultatele obinute n cadrul prezentei teze de doctorat ofer posibilitatea orientrii ctre noi direcii de cercetare: continuarea determinrilor cantitative ale reziduurilor medicamentoase n alte produse apicole (polen, lptior de matc, propolis); extinderea cercetrilor din mierea de albine prin validarea metodei Biocip pentru nc 3 sulfonamide i anume: sulfametoxazol (SMX), sulfamonometoxin(SMM) i trimetoprim (TMP) incluse n Panelul Antimicrobian I Plus; extinderea determinrilor cantitative de citokine i la IL-5 i IL-13 care sunt indici de hipersensibilitate i care nu au fost evaluate n acest experiment i corelarea rezultatelor din ambele studii; evaluarea modificrilor parametrilor biochimici, hematologici i a stresului oxidativ n cadrul studierii toxicitii reziduurilor metaboliilor de nitrofurani la obolani ca urmare a administrrii prin gavaj gastric de miere de albine coninnd aceste reziduuri; revizuirea legislaiei privind sigurana alimentului, prin introducerea unor limite maxime admisibile viznd prezena reziduurilor medicamentoase n mierea de albine i n alte produse apicole. Se cunoate faptul c depistarea reziduurilor n miere n urma controalelor ntreprinse de organismele autorizate, poate duce la sanciuni financiare pentru productorii acesteia, la retrageri de pe pia a loturilor corespunztoare i la declanarea unor alerte de siguran.
66
Bibliografie selectiv
Andrioiu V. Mierea. In cap.VI Produse apicole, Apiterapia n planningul familial, tez de disertaie, Arad, 2006; 162-166. Ashiralieva A, Genersch E. Reclassification, genotypes and virulence of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American foulbrood in honeybees - a review. Apidolologie 2006; 37: 411 420. Beaune P, Diserens JM, Reybroeck W. Proficiency Testing of Charm II Tests for Residue Control of honey. Proceedings of the 39th Apimondia International Agricultural Congress, Dublin, Ireland, August 21-26, 2005: 33-34.
Bogdanov S. Contaminants of bee products, Apidologie 2006; 37, 1-18.
Bogdanov S. Current state of analytical methods for the detection of residues in bee products. Apiacta 2003; 38, 399-409 Bonveh JS and Coll FV. Flavour index and aroma profiles of fresh and processed honeys. J Sci Food Agr 2003; 83, 275. Bura M, Ptruic S, Bura VA. Tehnologia apicol. Timioara: Editura Waldpress, 2008, 235-249. Castrejon JL, Lavergne SN, El-Sheikh A et al. Metabolic and chemical origins of cross-reactive immunological reactions to arylamine benzenesulfonamides: T-cell responses to hydroxylamine and nitroso derivatives. Chem Res Toxicol 2010; 23:184-92. Contreras JP, Ly NR, Gold DR, et al. Allergen-induced cytokine production, atopic disease, IgE, and wheeze in children. J Allergy Clin Immun 2003; 112:10721077. Cribb AE, Lee BL, Trepanier LA, Spielberg SP. Adverse reactions to sulphonamide and sulphonamide-trimethoprim antimicrobials: clinical syndromes and pathogenesis. Adverse Drug React Toxicol Rev 1996; 15: 9-50. Decizia 2002/657/CE din 12 august 2002 de aplicare a Directivei 96/23/CE a Consiliului n ceea ce privete performana metodelor analitice i interpretarea rezultatelor. JOUE 2002, L 221:8.
67
Decizia 2003/181/CE din 13 martie 2003 de modificare n ceea ce privete stabilirea limitelor de performan minime necesare (LMPN) pentru anumite reziduuri n alimente de origine animal. JOUE 2003, L 71:17. Directiva 96/23/CE a Consiliului din 29 aprilie 1996 privind msurile de control care se aplic anumitor substane i reziduurilor acestora existente n animalele vii i n produsele obinute de la acestea i de abrogare a Directivelor 85/358/CEE i 86/469/CEE i a Deciziilor 89/187/CEE i 91/664/CEE. JOUE 1996, L 125:10. Edder P, Cominoli A, Corvi C. Determination of streptomycin residues in food by solid phase extraction and liquid with post-column derivation and fluorometric detection. J Chromatogr A 1999; 830: 345-351. Edder P, Corvi C. Utilisation du Charm II pour le depistage des residus dantibiotique dans les dendees alimentairea dorigine animale. Mitt Lebensm Hyg 2001; 92: 218-228. Findlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. AAPS J 2007, 9 (29) : E260-E267. Finkelman FD. Anaphylaxis: lessons from mouse models. J Allergy Clin Immun 2007; 120:506-15. Gentili A, Perret D, Marchese S. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for performing confirmatory analysis of veterinary drugs in animal-food products, Trend Anal Chem 2005; 24(7):704-733
Grigore G. Fitoterapia i apiterapia. Boli tratate cu plante medicinale i produse apicole, Bucureti, Ed. tefan, 2008, 98-115.
Hess DA, Sisson ME, Suria H et al. Cytotoxicity of sulfonamide reactive metabolites: apoptosis and selective toxicity of CD81 cells by the hydroxylamine of sulfamethoxazole. Faseb J 1999; 13(13): 1688-98. Hitchcock JD, Moffett JO, Lackett JJ, Elliott JR. Tylosin for control of American foulbrood disease in honey bees. J. Econ. Entomol. 1970; 63: 204-207.
68
Hopingarner R, Nelson K. 1987. American foulbrood cleanup rate using three terramycin treatments. Am Bee J 1987; 128:120-121. Hughes P, Heritage J. Antibiotic growthpromoters in food animals. FAO Anim Pr 2004; 160: 129-52. Joshi S. HPLC separation of antibiotics present in formulated and unformulated samples. J Pharmaceut Biomed 2002; 28:795-809. Kanfer I, Skinner M, Walker RB. Analysis of macrolide antibiotics. J Chromatogr A 1998; 812:255-286 Khong SP, Gremaud E, Richoz J et al. Analysis of matrix-bound nitrofuran residues in worldwide-originated honeys by isotope dilution high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Agr Food Chem 2004; 52(17): 5309-5315. Kleespies RG, Radtke J, Bienefeld K. Virus -like particles found in the ectoparasitic bee mite Varroa jacobsoni Oudemans. J Invertebr Pathol 2000; 15, 87-90. Kocher U. Nachweis von Streptomycin-Ruckstanden in Honig mittels Charm II- Test und Absicherung der Befunde durch HPLC mit Nachsaulenderivatisierung und Fluorescenzdetektion. Lebensmittelchemie 1996; 50:115-117. Legg, DR, Baumgartner A, Salter R, Wheeler A. ROSA (Rapid One Step Assay) for antibiotics in honey. Apiacta 2003; 38, 207-217. Michaaud V. Antibiotic residues in honey - the FEEDM view, Apiacta 2005; 40, 52-54. Moats WA, Buckley SA. Determination of free metabolites of ceftiofur in animal tissues with an automated liquid chromatographic cleanup. J AOAC Int 1998; 81(4): 709-13. Moffett JO, Wilson WT, Parker RL. The effect of Penicel, tetracycline and erythromycin on adult bees, brood-rearing, and honey production. Am Bee J 1958;98: 22-24. Mutinelli F. Practical Application of Antibacterial drugs for the Control of Honey Bee Diseases. Apiacta 2003; 38:149-155. Naisbitt DJ, Gordon SF, Pirmohamed M, et al. Antigenicity and immunogenicity of sulphamethoxazole: demonstration of
69
metabolism-dependent haptenation and T-cell proliferation in vivo. British J Pharmacol 2001; 133:295-305. Nakazawa H, Ino S, Kato K, Watanabe T et al. Simultaneous determination of residual tetracyclines in food by highperformance liquid chromatography with atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry. J Chromatogr B 1999; 732(1):55-64. O'Keeffe M, Conneely A, Cooper KM et al. Nitrofuran antibiotic residues in pork: The FoodBRAND retail survey. Anal Chim Acta 2004; 520:125-131. Oldroyd BP, Goodman RD, Hornitzky MAZ, Chandler D. 1989. The effect on American foulbrood of standard oxytetracycline hydrochloride treatments for the control of European foulbrood of honeybees (Apis mellifera). Aust J Agr Res 1989; 40(3): 691697. Ortelli D, Edder P, Corvi C. Analysis of Chloramphenicol Residues in Honey by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Chromatographia 2004; 59:61-64. Peng CYS, Mussen E, Fong A et al. Laboratory and field studies on the effects of the antibiotic tylosin on honey bee Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) development and prevention of American foulbrood disease. J Invertebr Pathol 1996; 67(1): 6571. Pettis J, Feldlaufer M. Efficacy of tylosin and lincomycin in controlling American foulbrood in honey bee colonies. J Apic Res 2005; 44(3): 106-108.
Pohl P. Determination of metal content in honey by atomic absorption and emission spectrometries. Trend Anal Chem 2009; 28(1):117-128.
Quintana-Rizzo J, Salter RS, Saul SJ. Solid phase extraction procedures for validation of Charm II sulfonamide, streptomycin and chloramphenicol positives and detection of tylosin in honey. Apiacta 2005; 40:55-62. Regulamentul (CE) Nr. 470/2009 al Parlamentului European i al Consiliului din 6 mai 2009 de stabilire a procedurilor
70
comunitare n vederea stabilirii limitelor de reziduuri ale substanelor farmacologic active din alimentele de origine animal, de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 2377/90 al Consiliului i de modificare a Directivei 2001/82/CE a Parlamentului European i a Consiliului i a Regulamentului (CE) nr. 726/2004 al Parlamentului European i al Consiliului. JOUE 2009, L 152:11-22. Regulamentul (UE) nr. 37/2010 al Comisiei din 22 decembrie 2009 privind substanele active din punct de vedere farmacologic i clasificarea lor n funcie de limitele reziduale maxime din produsele alimentare de origine animal. JOUE 2011, L 15:1. Reybroeck W, Jacobs FJ, De Brabander HF, Daeseleire E. Transfer of sulfamethazine from contaminated beeswax to honey. J Agr Food Chem 2010; 58:72587265. Reybroeck W. Residues of antibiotics and sulphonamides in honey on the Belgian Market. Apiacta 2003; 38: 23-30. Ritter W, 2000, Bolile albinelor, Bucureti: Ed. M.A.S.T., 2000, 117145. Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 1994; 179:1109-18. Savoy Perroud MC, Le-Breton MH, Graveleau L, Diserens JM . Validation of an ELISA kit for the detection of fluoroquinolones in honey. Poster at 41st Apimondia Congress 2009, France, Montpellier, September 15-20. Spivak M. Preventive antibiotic treatments for honey bees. Am. Bee J. 2000; 140: 867-868. Thompson HM, Waite RJ, Wilkins S et al. Effects of European foulbrood treatment regime on oxytetracycline levels in honey extracted from treated honeybee (Apis mellifera) colonies and toxicity to brood. Food Addit Contam 2005; 22: 573-578. Thompson TS, Noot DK. Determination of sulfonamides in honey by
71
lichid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chim Acta 2005; 551:168-176. Verdel BM, Souverein PC, Egberts ACG, Leufkens HG. Diference in Risk of Allergic Reaction of Sulfonamide Drugs based on Chemical Structure. Ann Pharmacother 2006; 40:1040-6. Vidal JL, Aguilera-Luiz MM, Romero-Gonzalez R, Garrido-Frenich A. Multiclass Analysis of Antibiotic Residues in Honey by Ultraperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J Agr Food Chem 2009; 57(5): 17601767. Vinas P, Balsalobre N, Lopez-Erroz C, Hernandez-Cordoba M. Liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection for the analysis of tetracycline residues in honey. J Chromatogr A 2004; 1022, 125-129. Waite RJ, Brown MA, Thompson HM, Brew MH. 2003. Controlling European foulbrood with the shook swarm method and oxytetracycline in the UK. Bee World 2003; 82: 130-138. Wegener HC, Aarestrup FM, Gerner-Smidt P, Bager F. Transfer of antibiotic resistant bacteria from animals to man. Acta Vet Scand Suppl 1999; 92:5157. Williams DL. A veterinary approach to the European honey-bee (Apis mellifera). Rev Vet J 2000; 160:61-73.
72
ARTICOLE PUBLICATE IN EXTENSO Popa (Morariu) ID, chiriac EC, Mtiu S, Cuciureanu R. Method validation for simultaneous determination of 12 sulfonamides in honey using Biochip Array Technology. Rev. Farmacia 2012; 60(1):143-154. (Jurnal ISI, factor de impact :0.850). http://www.revistafarmacia.ro/201201/issue12012art16.html Popa (Morariu) ID, chiriac EC, Ungureanu D, Cuciureanu R. Immune response in rats following administration of honey with sulfonamides residues. Rev Romana Med Lab 2012; (1/4):63-72. (Jurnal ISI, factor de impact 2010: 0,113). http://rrml.ro/articole/articol.php?year=2012&vol=1&poz=8 Popa (Morariu) ID, chiriac EC, Cuciureanu R. Multi-analytic detection of antibiotic residues in honey using a multiplexing Biochip Assay. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi 2012; 116(1):324-329. (Jurnal indexat n baze de date internaionale - B+). http://www.revmedchir.ro/uploads/1/5/7/2/15722076/50_popa.pdf
PARTICIPAREA LA CONFERINE NAIONALE Popa (Morariu) ID, chiriac EC, Ungureanu D, Cuciureanu R. Evidenierea rspunsului imun la obolani dup administrarea de miere coninnd sulfonamide, prezentare oral, Sesiunea tiinific (videoconferin) n cadrul activitii din proiect ''Organizarea de sesiuni tiinifice ale doctoranzilor (simpozioane)'', Videoconferin Iai-Timioara, 11 decembrie 2012. Morariu D.I., Schiriac C.E., Cuciureanu R. Validarea metodei de determinare a 12 sulfonamide din miere utiliznd Tehnologia Biochip, prezentare oral, Simpozionul Naional: Contribuii ale
73
tinerilor cercettori la dezvoltarea cercetrii n domeniul medicofarmaceutic, Iai, 7-9 noiembrie 2012. Ionela Daniela Popa (Morariu) , I. Chirila, Elena Corina chiriac , Rodica Cuciureanu. Evaluation of oxidative stress and serum biochemical parameters in rats following administration of honey with nitrofurans, poster, A 5-a Conferin a Doctoranzilor i a 2-a Conferin a Postdoctoranzilor n Medicin i i Farmacie, Tg Mure, 46 iulie 2012. Popa (Morariu) Ionela Daniela, chiriac Elena Corina, Cuciureanu Rodica. Determinarea profilului de citokine la obolani n urma administrrii de miere de albine mbogit cu sulfonamide, poster, 50 de ani de nvmnt universitar farmaceutic la Iai, ediia a V-a, 6-8 octombrie 2011. Popa (Morariu) ID, Hristodorescu C, Schiriac EC, Matiut S, Cuciureanu R. Simultaneous detection of four nitrofuran metabolites in honey using biochip array technology, prezentare oral, Simpozionul Doctoranzilor din cadru proiectului POSDRU cu titlul: Burse doctorale pentru doctoranzi competitive n Aria European a Cercetrii POSDRU/88/1.5/63117, Timioara, 8 septembrie 2011. Morariu D.I., Schiriac C.E., Cuciureanu R. Simultaneous detection and quantification for drug residues in honey.New possibilities, poster, Congresul Naional de Farmacie, ediia a XIV-a, Tg.Mure, 13-16 octombrie 2010. Popa (Morariu), I. D., Schiriac, C.E.,Cuciureanu, R. Method validation for simultaneous multianalit detection of drug residues in honey using Biochip Array Technology, poster, European Strategy for Phd Programs din cadru proiectului POSDRU cu titlul: Burse doctorale pentru doctoranzi competitive n Aria European a Cercetrii POSDRU/88/1.5/63117, Timioara, 20-22 septembrie 2010.
74
PARTICIPAREA LA CONFERINE INTERNAIONALE Ionela Daniela Popa (Morariu), Elena Corina Schiriac, Rodica Cuciureanu. Method validation for simultaneous multianalyt detection of quinolones, ceftiofur, thiamphenicol, streptomycin, tylosin and tetracyclines in honey using Biochip Array Technology, poster, The 15th Panhellenic Pharmaceutical Congress, Atena-Grecia, 13-15 mai 2011. Popa (Morariu), I. D. , Chirila, I., chiriac, E. C., Cuciureanu, R. Toxic effect of drug residues on the serum biochemical parameters of rats following administration of honey with sulfonamides, poster, DKMT Euroregional Conference on Environment and Health, 18 -19 mai 2012, Szeged-Ungaria. Popa(Morariu), I.D.; Rodrguez, Y; Berrada, H; Maes, J; Cuciureanu, R; Font, G. Evaluacin de la presencia de micotoxinas en polen mediante cromatografa gaseosa acoplada a espectrometra de masas en tandem, prezentare oral, Aetox Congres, Valencia, Spania, 29 iunie 2012.
75

Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE ,,Grigore T.

Popa - IAI FACULTATEA DE FARMACIE

DETERMINAREA REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE DIN MIEREA DE ALBINE

Coordonator tiinific, Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu

Doctorand, Popa (Morariu) Ionela Daniela

Partea general a tezei de doctorat este structurat n 3

Limita de decizie CC (g/kg) Capabilitatea de detecie CC (g/kg)

Fig. IV.32: Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detecie (CC)

Tabelul IV.2: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie i acuratee)

57 6 115 7 164 6 84 10 171 12 259 15

51 7 99 6 140 5 51 11 101 8 160 10

50 10 89 9 134 5 54 10 141 10 212 10

51 9 112 7 170 7 61 14 101 7 138 7

59 5 131 9 206 6 51 14 122 12 207 11

47 8 113 5 167 7 36 11 90 9 136 10

Limita de decizie CC i capabilitate de detecie CC

Conc. medie (g/kg) DS 1,64 x DS CC (g/kg) CC (g/kg)

Tabelul IV.4: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie i acuratee)

Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

58 7 100 6 140 7 94 11 192 13 275 8

50 7 112 10 174 5 62 10 80 14 156 17

53 7 129 6 190 6 58 9 112 8 175 9

48 6 102 8 149 5 78 11 124 11 189 11

68 5 149 5 236 6 98 9 158 8 231 9

Limita de decizie CC i capabilitate de detecie CC

Conc. medie (g/kg) DS 1,64 x DS CC (g/kg) CC (g/kg)

Analiza cantitativ a celor 12 sulfonamide studiate n diferite probe de miere

CAPITOLUL V - ESTIMAREA CONINUTULUI DE NITROFURANI I CLORAMFENICOL N MIEREA DE ALBINE

Fig. V.8: Valorile sensibilitii metodei pentru nitrofuranii analizai i cloramfenicol

Nivel 3 (1,5 g/kg) n = 20 12,93 9,84 8,33 8,71

7 6 5 4 3 2 1 0 AOZ AMOZ AHD SEM CAP

Limita de decizie CC (g/kg) Capabilitatea de detecie CC (g/kg)

Fig. V.11: Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detecie (CC)

Procentele de recuperare obinute sunt prezentate n fig.V.12V.14.

140 120 100 80 60 40 20 0 AOZ 1,06

Recuperare (% ) 1,19 AHD 1,25 SEM 0,75 CAP Conc. (g/kg)

Nivel 3 (1,5 g/kg) n = 20 150 123 150 115 121

AOZ AMOZ AHD

Analiza cantitativ a celor 4 metabolii de nitrofuran i a cloramfenicolului n diferite probe de miere

0,43 0,87 0,89 0,80 0,89 0,80 0,89 0,48

CEFT 10 8 TYL 6 4 2 0 QNL

TCN Limita de decizie CC (g/kg) Capabilitatea de detecie CC (g/kg)

Fig. VI.16: Limita de decizie (CC) i capabilitatea de detecie (CC)

Tabelul VI.1: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie i acuratee)

1Limita de decizie CC i capabilitate de detecie CC

Conc. medie (g/kg) DS 1,64 x DS CC (g/kg) CC (g/kg)

Analiza cantitativ a chinolonelor i a diferitelor tipuri de antibiotice n probe de miere

< LOD < LOD

< LOD < LOD

< LOD < LOD

< LOD < LOD

< LOD < LOD

< LOD < LOD

< LOD < LOD

< LOD < LOD

10.7 Clortetraciclin 8g/kg < LOD < LOD

< LOD < LOD

< LOD < LOD

< LOD < LOD

Biocip LCMS/MS Biocip LCMS/MS

< LOD < LOD < LOD < LOD

< LOD < LOD < LOD < LOD

17.8 18 < LOD < LOD

< LOD < LOD < LOD < LOD