Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

C A P. 6. T E H N I C I d e I N G I N E R I E G E N E T I C l a D R O J D I I
Drojdiile prezint numeroase avantaje care le recomand ca model experimental n ingineria genetica i biotehnologie. n primul rnd, levurile prezint un timp scurt de multiplicare i apariie a unei noi generaii, de aproximativ 2 ore, ceea ce permite obinerea a mii de colonii de drojdii , n numai 2 zile, prin cultivare pe plci Petri, pe un mediu relativ simplu. n al doilea rnd, genomul de S. cerevisiae are dimensiuni relativ reduse (1,4 x 107 pb) fa de cel mamalian (3,5 x 109 pb), ceea ce simplific analizele genetice i moleculare. n al treilea rnd, drojdiile reprezint un material optim pentru analizele genetice deoarece pot fi meninute att n stadiu haploid ct i n stadiu diploid. Astfel, mutaiile genetice recesive pot fi relativ uor obinute i exprimate n celulele haploide, iar complementaia genetic poate fi realizat prin simpla mperechere a dou mutante haploide. Ingineria genetic la drojdii, ca de altfel i la alte organisme, cuprinde 2 tehnologii: tehnologia ADN recombinant - inginerie genetic molecular i fuziunea de protoplati inginerie genetic celular. Primele experimente de inginerie genetic molecular (transformare genetic) cu drojdii au fost realizate de Hinnen i Beggs (1978) care au demonstrat posibilitatea clonrii i exprimrii genelor heterologe n celula de Saccharomyces cerevisiae. Pn n prezent au fost construii numeroi vectori att pentru tulpinile de drojdii de laborator, avnd o aplicabilitate mai mult teoretic, ct i pentru tulpinile de drojdii industriale n scopul ameliorrii productivitii acestora.

Vectori, markeri genetici si procedee de transformare genetica

Vectorii utilizabili la drojdii pot fi clasificai n funcie de posibilitatea de clonare i / sau exprimare a genelor heterologe n: vectori de clonare care permit numai clonarea fragmentelor de ADN heterolog; vectori de exprimare care permit exprimarea prin transcrierea ADN heterolog clonat datorit prezenei unor promotori foarte puternici constitutivi, inductibli sau hibrizi; vectori de secreie care permit secreia produilor genelor clonate datorit prezenei unor peptide semnal, reprezentate, de regul, prin peptida semnal a precursorului factorilor de mperechere a sau i cea a factorului killer. Toate aceste tipuri de vectori prezint, n comun, ca baz de construcie, un fragment dintr-un vector pentru celule bacteriene (pBR322, pUC118/119, pUC18/19, pBluescript SK/KS +/-). Acest fragment asigur o origine de replicare pentru amplificarea vectorului n celula bacterian, o gen de selecie a transformanilor n populaia bacterian (gena pentru rezisten la ampicilin este cel mai des ntlnit) i, n unele cazuri, origini de replicare caracteristice fagilor filamentoi care permit obinerea de ADN monocatenar i casete care fac posibil transcrierea in vitro a fragmentului clonat (pentru vectori bazai pe fagimidul pBluescript SK/KS +/-). Toi vectorii utilizabili n drojdii prezint i markerii genetici selectabili n celula de drojdie. Acestea sunt gene ce codific enzime implicate n cile metabolice ale unor amionoacizi sau nucleotide (Tab.1). Primul marker genetic de acest tip a fost gena LEU 2 care codific pentru izopropilmalat dehidrogenaza i care este capabil s complementeze mutaia leuB de la Escherichia coli, mutaie care se exprim prin deficien n aceeai enzim a celulelor bacteriene.
Tab.1 Markeri selectabili utilizai pentru drojdii Gena HIS3 LEU2 LYS2 TRP1 URA3 Enzima imidazol glicerofosfat dehidrogenaza -izopropilmalat dehidrogenaza -aminoadipat reductaza N -5fosforibozil-antranilat izomeraza Orotidin-5-fosfat decarboxilaza Selectia histidina leucina lizina triptofan uracil

Principalele clase de vectori de clonare: n funcie de stabilitate i modul de transmitere n descenden n celulele de levuri, se pot defini dou clase majore de vectori de clonare (Fig.6. 1): - vectori integrativi; - vectori cu replicare autonom.

Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

LEU2

pBR322

ADN de drojdie

Vector integrativ (YIp)

pBR322

LEU2

pBR322

LEU2

pBR322

LEU2

CEN ARS
ADN de drojdie

ARS
ADN de drojdie

Fragment din plasmida 2 m

ADN de drojdie

Vector replicativ (YRp)

Vector centromeric (YCp)

Vector episomal (YEp)

Fig. 6. 1. Principalele clase de vectori de clonare pentru drojdii.

pBR322 - secven provenit din plasmidul pBR322; conine gene pentru rezisten la antibiotice (ampicilin i/sau tetraciclin) i oriColE1 (pentru replicare autonom n celula bacterian); LEU2 - gena pentru prototrofie la leucin; ADN drojdie - secven din genomul de drojdie; ARS - secvena ARS cromosomal sau din plasmida 2 m (pentru replicare autonom n drojdii); CEN secven centromeric dintr-un cromosom de drojdie; secven extins din plasmida 2 m care conine secvena ARS, REP1, REP2, REP3 (STB ) i, de cele mai multe ori, FLP.

Vectori de clonare A. Vectorii integrativi (YIp = Yeast Integrating plasmids) conin markeri selectabili pentru drojdii, dar nu prezint secvene care s permit replicarea autonom a vectorilor n celula de drojdie. Transformarea celulei de drojdie are loc n urma unui proces de integrare al plasmidei n genomul drojdiei prin recombinare omoloag ntre o secven din cadrul plasmidei i regiunea corespunztoare de la nivelul unuia dintre cromozomii drojdiei. Eficiena transformrii cu vectorii YIp este de numai 1 10 transformanig ADN. n Fig. 6. 2 este reprezentat un vector din aceasta clas - YIp 5. Vectorul prezint: - genele de rezisten la ampicilin i tetraciclin (ApR, TcR) care permit selecia transformanilor (ampicilin rezisteni- tetraciclin sensibili); - originea replicrii din plasmidul ColE1 (oriColE1) confer capacitate de replicare autonom n celula bacterian; - tulpinile de drojdie receptor sunt auxotrofe pentru uracil (ura3). Transformarea celulelor de drojdie are loc prin integrarea vectorului la nivelul secvenei URA3 la locusul de omologie din cromosomul de drojdie, celulele transformate revenind la starea de prototrofie pentru uracil.

ApR ApR

TcR TcR

YIp YIp 5 5

5.5 5.5kb kb

oriColE1 oriColE1 URA3 URA3

Fig. 6. 2. Vectorul integrativ YIp 5

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

B. Vectorii cu replicare autonom: - replicativi (YRp = Yeast Replicating plasmids) - centromerici (YCp = Yeast Centromeric plasmids) - episomali (YEp = Yeast Episomal plasmids) - lineari (YLp = Yeast Linear plasmids) conin markeri selectabili n celula de drojdie i, spre deosebire de vectorii integrativi, pe lng secvenele care le permit replicarea autonom n celula bacterian mai prezint i secvene ce confer capacitatea de replicare autonom n celula de drojdie de unde i denumirea de vectori navet sau shuttle. Vectorii replicativi (YRp) prezeni n numar de 1 10 copii/celul, conin secvena ARS (autonomously replicating sequence) de la nivelul plasmidei 2 m sau dintr-un cromosom de drojdie, se replic autonom fa de ADN-ul cromosomial al drojdiilor, numai o dat pe parcursul unui ciclu celular. Acest tip de vectori prezint un grad destul de mare de instabilitate mitotica i meiotica astfel nct vor fi prezeni n numai aproximativ 5% - 10% dintre descendeni dup circa 10 generaii. Eficiena transformrii cu vectori YRp este de 103 104 transformani/g ADN. Vectorii centromerici (YCp) prezeni n 1 2 copii/celul, au fost obinui din plasmidele YRp prin ncorporarea unei secvene centromerice CEN dintr-un cromozom de drojdie (de exemplu: CEN IV) pentru a mri stabilitatea mitotica i meiotica a acestora. Ca urmare, rata de pierdere a plasmidelor este de numai 1% / generaie. Fig. 6. 3 reprezint schema general de construcie a unui vector centromeric din seria pRS 413 - 414 - 415 - 416. Vectorul este constituit dintr-o regiune care provine din fagimidul pBluescript SK +/- i o regiune originar din drojdii. I - din fagimidul pBluescript SK +/- se pstreaz: - oriColE1 - permite replicarea autonom n celula bacterian (n lipsa unui fag helper pentru f1), permind meninerea vectorului n forma ADN CCC; - gena ApR - confer rezisten la ampicilin celulelor bacteriene purttoare a vectorului; - ori f1 - originea replicrii fagului filamentos f1; prin co-infecia celulei bacteriene gazd cu un virus helper pentru f1 se declaneaz replicarea ADN de la ori f1 cu obinerea ADN monocatenar sens sau antisens n funcie de orientarea ori f1 (+ sau -); - lac Z - gena care codific pentru captul amino-terminal al galactozidazei; aceast regiune permite, prin complementaie intraalelic, selecia histochimic a vectorilor recombinani (purttori de ADN exogen la nivelul MCS). Prezena unui promotor inductibil upstream de gena lac Z permite obinerea de proteine de fuziune; II - din drojdii: - gena URA3 ( HIS3/ LEU2/ TRP1) confer prototrofie celulelor de drojdie transformante; - caseta ARS/CEN - permite replicarea autonom i asigur stabilitatea mitotic a vectorilor n descenden.
ori f1 (-) ori f1 (+) lac Z ApR
BssHII

T3

Kpn I

MCS
BssHII

T7

Sac I

URA3 oriColE1 ARS CEN

Fig. 6. 3. Schema general de construcie a vectorilor centromerici din seria pRS 413 - 414 - 415 - 416

Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

O variant a vectorilor centromerici o reprezint vectorii de tip YAC (Yeast Artificial Chromosomes) care conin n plus secvene telomerice de drojdie. Acestea le pemite YAC-urilor s se replice asemenea cromosomilor lineari. Dei YAC-urile nu sunt folosite n acelai tip de experimente de clonare ca celelalte categorii de vectori pentru drojdii, capacitatea lor de a clona secvene de ADN de pn la 400 kpb le-a adus o larg utilizare n studiile ce vizeaz caracterizarea genomului eucariotelor superioare. Vectorii episomali (YEp) prezeni n 20 50 copii/celul, conin o regiune mai extins din plasmida 2 m reprezentat de secvena ARS i situsurile REP1, REP2 i STB (REP3) ceea ce le confer capacitate de replicare autonom i stabilitate n descenden, astfel nct dup 10 generaii acetia sunt prezeni nc n 60 95 % dintre descendeni. Cea mai mare parte a vectorilor YEp mai prezint i secvena FLP din plasmda 2 m, secven care face posibil recombinarea ntre plasmidele purttoare, rezultnd o mare varietate de multimeri plasmidiali recombinani. Frecvena de 4 5 transformare cu vectori YEp este mare, atingnd 10 10 transformani / g ADN. Unul dintre vectorii episomali cu mare utilizare n ameliorarea diferitelor tulpini de drojdii, n special tulpini de laborator, este YEp 24 (Fig. 6. 4). Vectorul prezint: - o regiune bacterian provenit de la vectorul pBR322, reprezentat de genele pentru rezisten la ampicilin (ApR) i tetraciclin (TcR) i originea replicrii oriColE1; - o regiune de la drojdii reprezentat de un fragment extins din plasmida 2 m i gena URA3 ceea ce permite, pe de o parte, replicarea autonom a vectorului n celula de drojdie i, pe de alt parte, selecia transformanilor prin cultivarea produilor transformrii pe mediu minimal. Dat fiind auxotrofia pentru uracil (ura3) a celulelor de drojdie receptor, pe mediul minimal vor crete numai celulele transformate care au primit vectorul n urma procesului de transformare.

ApR

fragment din plasmida 2m

ori ColE1

YEp 24
7.7 kb

URA 3 TcR
Fig. 6. 4. Vectorul episomal YEp 24

Vectorii lineari (YLp) sunt prezeni ntr-o singur copie / celul i prezint la capete secvene repetitive bogate n guanin de tipul 5(dG1-3dT)3, asemntoare secvenelor telomerice de la drojdii sau ciliate. Aceti vectori sunt de aproximativ 100 ori mai puin stabili dect cromosomii obinuii, dup 10 generaii fiind prezeni n numai 20 40% dintre descendeni. Civa dintre cei mai utilizai vectori de la drojdii sunt cuprini n Tab. 2.
Tab. 2. Vectori utilizai la drojdii
Plasmida YIp 5 YRp 7 YRp 17 YEp 13 YEp 24 YCp 19 YCp 50 YLp 21 pYAC 3 2 m Dimensiune [kpb] 5.541 5.816 7.002 10.7 7.769 10.1 7.95 55 11.4 6.318 Originea replicrii n E. coli oriColE1 oriColE1 oriColE1 oriColE1 oriColE1 oriColE1 oriColE1 oriColE1 Originea replicrii n drojdii ARS1 ARS1 2 m 2 m ARS1 ARS1 ARS1 ARS1 2 m Fenotip selectabil n E. coli r r Ap , Tc r r Ap , Tc r r Ap , Tc r r Ap , Tc r r Ap , Tc r Ap r r Ap , Tc r r Ap , Tc Fenotip selectabil n drojdii URA TRP URA, TRP LEU URA URA, TRP URA TRP, HIS TRP, URA, HIS -

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Vectori de exprimare Vectorii de exprimare permit transcrierea unui segment de ADN heterolog sub controlul unui promotor aparinnd unei gene structurale. ntreaga regiune este alcatuit din: secvenele reglatoare i un promotor puternic (fr codonul AUG de iniiere al traducerii); situs pentru 1 - mai multe endonucleaze de restricie; secvena terminator al transcrierii. ADN heterolog poate fi clonat prin inserie n situsul pentru endonucleazele de restricie, fiind astfel ncadrat ntre secvenele eseniale (promotor i terminator) ale unui proces de transcriere; n urma procesului de transformare a unor celule de drojdie receptor cu vector recombinat, pot fi uor obinute proteine heterologe. Vectorii de exprimare sunt clasificai n funcie de tipul de promotor utilizat n: 1. vectori de exprimare cu promotori constitutivi; 2. vectori de exprimare cu promotori inductibili; 3. vectori de exprimare cu promotori hibrizi constitutivi/inductibili. 1. Un exemplu de promotor constitutiv utilizat n obinerea de vectori de exprimare la drojdii este cel al genei pentru gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaz, enzim implicat n calea metabolic a glucozei (Fig. 6. 5). Bitter i colab. (1984) au inserat acest promotor ntr-un vector de tip YEp i l-au utilizat pentru clonarea i exprimarea genei pentru 1-antitripsin, protein heterolog reprezentnd, n final, pn la 5% din totalul proteinelor celulare. Gena a fost inserat la nivelul unui situs multiplu de clonare restictat cu endonucleaza de restricie BamHI. Ca secven semnal pentru terminarea transcrierii i pentru poliadenilare a fost folosit segmentul de la captul 3' al genei pentru fosfoglicerat kinaz (Fig. 6. 6).
G lu c o z a

G lu c o z o 6 - fo s fa t

F ru c to z o 6 - fo s fa t

F ru c to z o 1 ,6 - b ifo s fa t

D ih id r o x ia c e to n a

G lic e ra ld e h id 3 - fo s fa t

g lic e ra ld e h id 3 - fo s fa t d e h id ro g e n a z a

P ir u v a t

A c e ta ld e h id a
a lc o o ld e h id ro g e n a z a

E ta n o l

Fig. 6. 5. Clea metabolizrii fermentative a glucozei pn la etanol n celula de drojdie

2. Exprimarea genelor clonate n vectorii de drojdii ce prezint inserai promotori inductibili este dependent de concentraia n mediul de cretere a drojdiilor a factorului inductibil, reprezentat, spre exemplu, de ionii de cupru sau de metanol. Utiliznd regiunea promotoare 5' a genei CUP1, gena codificatoare a metalotioneinei din drojdii, a crei activititate este indus de prezena n mediu a ionilor de cupru, s-a reuit clonarea i exprimarea genei pentru antigenul de suprafa a virusului hepatitei B. Celulele de drojdii transformate cu plasmide purttoare a acestei gene produc cantiti mari de protein viral ce poate reprezenta aproximativ 1-2% din totalul proteinelor celulare. Creterea drojdiilor transformate n fermentatoare mari a facut posibil obinerea a 50 - 100 mg protein viral / litru de cultur. Proteina recombinant obinut are un grad nalt de omologie cu cea natural, avnd proprieti similare cu cea izolat de la pacieni infectai i este utilizat n prezent la vaccinarea contra hepatitei B. 5

Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

Un alt promotor inductibil utilizat intens este cel pentru gena codificatoare a alcool (metanol) oxidazei, enzim implicat n prima treapt de degradare a metanolului n peroxizomii drojdiilor metilotrofe. Promotorul genei pentru alcool oxidaz este inhibat de prezena n mediul de cultur a glucozei i etanolului, este derepresat de glicerol i indus de metanol. Prezena promotorului respectiv permite obinerea unor cantiti mari de protein heterolog (pn la 35% din totalul proteinelor celulare) de mare puritate.

PGPD

gena pentru 1 - antitripsina

ApR capat 3' PGK

LEU 2
ori ColE1

fragment din plasmida 2 m

(include ARS)

Fig. 6. 6. Vector de exprimare cu promotor constitutiv pentru exprimarea genei care codific 1-antitripsina
(ApR - gena pentru rezisten la ampicilin; oriColE1 - originea replicarii din ColE1; LEU2 - gena pentru b-izopropilmalat dehidrogenaz - confer prototrofie la Leu celulelor de drojdie transformante; fragment din plasmida 2 m care conine i secvena ARS pentru replicare autonom n celule de drojdie; PGPD -promotorul genei pentru gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaz; gena pentru a 1-antitripsin (gena de interes) integrat la situsul de restricie pentru BamHI; captul 3' al genei pentru fosfoglicerat kinaz pentru terminarea transcrierii genei de interes)

3. n unele cazuri proteinele heterologe obinute pot fi toxice pentru celula de drojdie determinnd rate sczute de cretere. n scopul ameliorrii procesului de obinere a compuilor respectivi s-au construit o serie de vectori care conin promotori hibrizi constituvi / inductibili a cror funcionare nu este simultan. Astfel, interferonul este toxic pentru celula de drojdie. Cu toate acestea a fost posibil clonarea genei pentru interferon n drojdii i exprimarea ei cu ajutorul unor vectori ce prezentau un promotor hibrid format din secvena 5' a promotorului genei pentru gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaz n care a fost inclus secvena activatoare tip enhancer (UAS - upstream regulating sequence) a genei GAL 10 ce codifica pentru galactoepimeraz (UASG) (Fig.6. 7). Funcionarea UASG este indus de prezena n mediul de cultur a galactozei (nivelul de exprimare a genei crete de aproximativ 1000 ori) i este inhibat de prezena glucozei, nivelul de exprimare a genei GAL 10 fiind de 1000 - 2000 ori mai mic n aceste condiii. Celulele de drojdie sunt crescute iniial pe mediu cu glucoz ceea ce asigur obinerea unei densiti celulare mari, nivelul de exprimare a genei pentru interferon fiind foarte sczut la fel ca i eventualul efect toxic al interferonului. n etapa urmtoare celulele sunt trecute pe mediu cu galactoz ca surs unic de carbon, rezultatul fiind activarea UASG i transcrierea genei pentru interferon , ajungndu-se, n final, la circa 2g interferon / litru de cultur. Un exemplu asemntor l reprezint cel al clonrii i exprimrii genei pentru factorul de cretere epidermal necesar pentru regenerarea esuturilor. n acest caz, secvena activatoare UASG a fost nlocuit cu promotorul genei ADR2, gena structural a alcooldehidrogenazei citoplasmatice ADH II. Promotorul genei ADR2 este inactivat de concentraiile mari de glucoz din mediul de cultur i este indus de scderea concentraiei acesteia. Dup creterea celulelor de drojdie pe mediu bogat n glucoz i atingerea densitii celulare optime, odat cu consumarea glucozei din mediu, are loc activarea promotorului ADR2 sub influena cruia are loc exprimarea genei pentru factorul de cretere epidermal. Produsul obinut prezint o structur identic cu cea a hormonului izolat din celulele umane.

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

UASG

PGPD

gena pentru interferon

ApR

capat 3' PGK

LEU 2
ori ColE1

fragment din plasmida 2 m

(include ARS)

Fig. 6. 7. Vector de exprimare cu promotor hibrid inductibil/constitutiv pentru exprimarea genei pentru interferon g
(are aceeai structur ca vectorul de exprimare cu promotor constitutiv, dar, n plus, prezint secvena UASG - secven tip enhancer a genei GAL 10 pentru galactoepimeraz)

Vectori de secreie Drojdiile pot fi manipulate genetic pentru producerea de proteine care sunt secretate n mediu utiliznd vectori de secreie. Polipeptidele secretate de celulele eucariote sunt sintetizate sub forma unui precursor cu un capt amino-terminal extins, precursor care sufer mai multe modificri ce includ procese de clivare proteolitic, formarea unor puni disulfurice i, eventual, O- sau N-glicozilri, n final rezultnd forma matur a proteinei. La drojdii s-au folosit diverse secvene semnal pentru direcionarea secreiei n mediu a proteinelor heterologe. Dintre acestea amintim secvena semnal a factorului killer, cea a genei pentru proteaz alcalin extracelular (XPR2) n cazul drojdiilor capabile s degradeze n-alcanii, i secvena semnal (pre-prosegmentul precursorului) a factorului de mperechere. Aceasta din urm este reprezentat de regiunea amino-terminal de 85 de aminoacizi a produsului genei MFa1 i se termin cu un situs dibazic Lys-Arg recunoscut de endoproteaza numit kexin care cliveaz la acest nivel produsul primar de traducere n cursul procesrii spre forma matur. Proteinele heterologe secretate de celulele de drojdie manipulate genetic sunt proteine de fuziune care ncep cu pre-prosecvena MF1 i continu cu proteina propriu-zis. n cele mai multe cazuri polipeptida ce urmeaz a fi secretat flancheaz situsul dibazic de clivare, astfel nct n urma aciunii kexinei se elibereaz proteina de interes. I. Experiment de construire a vectorilor shuttle la Saccharomyces cerevisiae. Experimentul const n construirea unui vector de clonare replicativ din seria pRS, denumit pBY, pornind de la vectorii YEp 24 i pBluescript SK +/-. Principalele etape ale acestui experiment sunt : (1) izolarea ADN plasmidial reprezentat de vectorii parentali; (2) restricia vectorilor cu endonucleaze de restricie (Hind III) i tratamentul cu fosfataz alcalin (pentru a evita recircularizarea vectorilor parentali); (3) ligarea fragmentelor de restricie cu obinerea vectorului pBY ; (4) transformarea celulelor de drojdie cu vectorul pBY. I.1. Izolarea ADN plasmidial reprezentat de vectorii parentali. ADN plasmidial de YEp24 i pBluescript SK +/- se izoleaz din tulpina bacterian Escherichia coli K-12 DH5, conform protocolului de lucru prezentat n Cap. 2. 3. (metoda lizei alcaline). Se verific electroforetic i spectrofotometric puritatea i integritatea ADN izolat i se calculeaz concentraia ADN exprimndu-se n g ADN/l. I.2. Digestia vectorilor cu Hind III si tratamentul cu fosfataz alcalin n desfurarea protocolului de lucru se va ine cont de indicaiile din Cap. 3. 2, cu urmtoarele observaii: se realizeaz 4 amestecuri de restricie, notate A, B, C i D; pentru digestia ADN plasmidial de YEp24 se realizeaz dou variante de lucru - cu i fr fosfataz alcalin - pentru observarea aciunii fosfatazei alcaline; ca marker de migrare se folosete ADN de fag restrictat cu HindIII (rezult 8 fragmente de restricie).

Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

ori f1 ApR lacZ' ApR

ori f1

pBluescriptSK+ 2,96 kbp.

lacZ' PCS p lacZ' ori f1 lacZ' ApR

ori Col EI

ori Col EI

Hind III digestion

HindIII
ApR ARS2m

ligation

pBY 6293 bp
ori

ARS2m

ARS2m p lacZ' URA3

ori

YEp24 7,769 kbp

HindIII
URA3 URA3

TcR

HindIII

Fig. 6. 8. Structura noului vector pBY

(secvena ARS pentru replicare autonom n celula de drojdie ; URA3 permite selecia celulelor de drojdie transformate ; ori- ColE1 pentru replicare n celula bacterian ; ori f1 permite replicarea dup modelul fagilor filamentoi; ApR marker pentru selecia n celula bacterian; LacZ selecia transformanilor prin complementaie inter-alelic; situs MCS incluznd situsul de restricie BamH I pentru inserarea ADN heterolog).

Amestecurile de restricie se realizeaz n tuburi Eppendorf sterile:

Componenta reaciei Ap distilat steril Tampon pentru Hind III [10 X] ADN plasmidial YEp24 [1,5 g ADN/l] ADN plasmidial pBluescript SK+/[2 g ADN/l] ADN fag (dilutie 1:5) Hind III [10U/l] Fosfataz alcalin [1U/l] A 26 l 4 l 6 l 2 l 2 l B 26 l 4 l 6 l 2 l C 23 l 4 l 10 l 3 l D 23 l 4 l 10 l 3 l -

Volum total:

40 l

40 l

40 l

40 l

Componentele reaciilor de restricie vor fi adugate exact n ordinea menionat, schimbndu-se vrful pipetei la fiecare tub i component al reaciilor. Enzimele utilizate vor fi meninute pe ghea. Dup realizarea amestecurilor, probele se incubeaz pe baie de ap, la 37oC, timp de 2,5 ore. La terminarea timpului de digestie se realizeaz precipitarea fragmentelor de restricie. Pentru fiecare prob se va face urmtorul amestec de reacie: tot volumul probei (40 l) + 1/5 volume soluie EDTA 0,25M + 1/2 volume soluie acetat de amoniu 5M + 3 volume etanol 100% rece (-20oC). Probele se incubeaz 15 minute la -20oC. Se centrifugheaz 15 minute la 14000 rpm (4oC). Sedimentul se spal de 2 ori cu etanol 70% i se centrifugheaz 15 minute la 14000 rpm. ADN rezultat se reia n 25 l soluie TE. Pentru verificarea eficienei reaciei de restricie probele vor fi supuse n continuare unei electroforeze n gel de agaroz n sistem submers (Cap. 2. 2). Pentru electroforez se folosesc tampon TBE 0,5X i agaroz 1% (preparat n TBE 0,5X), iar ca marker de migrare 1 l amestec albastru de bromfenol - sucroz. Schema de ncarcare a gelului de electroforez este : cte 5 l din

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

probele de ADN restrictat, cte 5 l din probe reprezentate de ADN plasmidial de YEp24 i pBluescript SK +/- nedigerat (folosite ca markeri pentru reaciile de restricie), 5 l ADN plasmidial E. coli V517 scala de plasmide. Restul de 20 l din probele de digestie vor fi folosii n etapa urmtoare ligarea fragmentelor i obinerea noului vector pBY. Probele se las la migrat la un voltaj de 2.5 3 V/cm.

Fig. 6. 9. Gelul de verificare a reaciei de restricie a ADN plasmidial de YEp24 i pBluescript SK +/(godeurile : 1 ADN / Hind III; 2-3 - ADN plasmidial YEp24/ Hind III; 4 ADN plasmidial YEp24/Hind III i tratament cu fosfataz alcalin; 5 ADN plasmidial YEp24; 6 ADN plasmidial pBluescript SK+/ Hind III; 7 ADN plasmidial pBluescript; 8 ADN plasmidial E. coli V517)

I.3. Ligarea moleculelor de ADN restrictate Moleculele de ADN restrictate sunt supuse reaciei de ligare conform schemei din tabelul urmtor. n timpul pregtirii reaciei, tuburile cu probe i enzimele sunt meninute pe ghea. Ca i n cazul reaciei de restricie, componentele sunt adugate n ordinea menionat. Probele sunt incubate la 14oC, peste noapte.
Componenta reaciei ap distilat steril tampon de ligare (10X) Reacia A (YEp24/Hind III + AP) Reacia B (YEp24/Hind III) Reacia C (pBlue/Hind III) ATP (10 mM) ADN ligaz de fag T4 (diluie 1 :2 n tamponul de ligare) L1 3 l 2.5 l 10 l 5 l 2.5 l 2 l L2 11 l 2.5 l 5 l 2 l 2.5 l 2 l L3 2 l 1 l 5 l 1 l 1 l L4 2 l 1 l 5 l 1 l 1 l

Volum total

25 l

25 l

10 l

10 l

Verificarea eficienei reaciilor de ligare i identificarea fraciei reprezentate de vectorul nou obinut pBY, se realizeaz prin electroforez n gel de agaroz n sistem submers, folosind tampon de electroforez TBE 1X, agaroz 0.8% (preparat n TBE 1X), 3 l ADN din fiecare prob, 1 l marker de migrare (albastru de bromfenol-sucroz).

Fig. 6. 10. Gelul de verificare a reaciei de ligare a fragmentelor de restricie obinute pentru YEp24 i pBluescript SK +/(godeurile : 1 ADN / EcoR I, Hind III ; 2 YEp24/Hind III; 3 pBluescript SK +/-; 4 ligare L2; 5 ligare YEp24/Hind III (digestie parial) + pBluescript SK +/- / Hind III; 6 ligare L1; 7 autoligare ADN plasmidial YEp24/Hind III i tratament cu fosfataz alcalin ; 8 - autoligare L3; 9 - autoligare L4; 10 ADN plasmidial pBluescript SK +/-; 11 ADN plasmidial YEp24)

II. Transformarea genetic cu vectori shuttle Transformarea genetic reprezint principalul procedeu de introducere n vitro de material genetic exogen n celule pro- sau eucariote. Acest proces permite realizarea unor studii fundamentale privind structura i funcionarea genelor pro- i eucariote, cartarea i screening-ul genelor i a unor studii aplicative privind ameliorare genetica a diferitelor categorii de organisme.

Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

La Saccharomyces cerevisiae, exist mai multe modaliti de realizare a transferului de material genetic, cu eficiene diferite, dintre care menionm : - transformarea chimic; - transformarea celulelor intacte cu vectori plasmidiali, prin electroporare. A. Transformarea chimica n prezena LiCl Mecanismul care st la baza acestei metode este, n principal, formarea de pori la nivelul peretelui celular al celulelor de drojdie sub aciunea ionilor de Li (Li+) i, probabil, eliberarea unor receptori membranari pentru ADN exogen. Ceilali reactivi utilizai au rolul de a facilita ptrunderea ADN transformant n celula de drojdie: ADN carrier (ADN din sperm de hering preparat n soluie stoc 10 mg/ml n TELI) mrete eficiena transformrii avnd un rol cu prepoderen cantitativ; PEG are rolul de a concentra ADN transformant i ADN carrier la suprafaa celulelor de drojdie. Aceast metod asigur o frecven de transformare mai mare dect n cazul transformarii prin fuziune de protoplati i, spre deosebire de electrotransformare, nu necesit aparatur special. Protocol de lucru Tulpina receptor folosit este S.cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2) Vector shuttle utilizat pentru transformare: YEp24 Se realizeaz o cultur de S. cerevisiae Ts5 n YPG lichid i se incubeaz 18 ore la 28oC. 1,5 ml cultur se centrifugheaz 5 minute la 6500 rpm. Supernatantul se arunc, iar sedimentul celular se resuspend n 1 ml soluie TELI , pH 8.0 i se incubeaz 30 minute la 30oC. Din suspensia format se repartizeaz cte 200 l n 5 tuburi Eppendorf (de 1,5 ml). n fiecare dintre cele 5 tuburi se adaug cte 20 l ADN carrier. n 4 dintre tuburi se adaug i cte 40 l extract vector (tubul nr.5 va fi notat ca Martor). Se incubeaz 30 min la 30oC. Dup agitare la vortex, n fiecare dintre cele 5 tuburi se adaug cte 200 l soluie TELI-PEG. Se incubeaz 20 minute la 30oC, apoi 10 minute la 42oC. Din fiecare tub se nsmneaz pe cte 2 placi Petri (100 l/plac) cu mediu YNB-leuglucoza i se incubeaz 48 ore la 28oC.
Medii i soluii Mediu YPG Mediu YNB-leu-glucoza : yeast nitrogen base 0.67 % ; sulfat amoniu 0.5 % ; glucoza 2.0 % ; agar 2.0 % ; leucin 3 mg/l soluie TELI - pH 8.0 : Tris 10 mM; EDTA 1 mM ; LiCl 50 mM soluie TELI-PEG : 25 ml soluie TELI + 40 % polietilenglicol 6000

B. Transformarea electric - electrotransformarea Electrotransformarea presupune expunerea celulelor, tratate sau nu nainte cu un agent labilizator al peretelui celular, n prezena ADN-ului exogen, la pulsuri de cmp electric cu o anumit amplitudine i durat. Aceste pulsuri determin dezorganizarea reversibil a membranei plasmatice, ceea ce conduce la o cretere a permeabilitii acesteia, inclusiv pentru macromolecule de tipul ADN. Mecanismul molecular al penetrrii particulelor exogene prin membrana celular nu este elucidat. Condiiile optime de electropulsare (intensitatea cmpului electric, durata pulsului, compoziia mediului de suspensie, cantitatea de ADN plasmidial, numrul de celule, etc) sunt determinate prin ncercari pentru fiecare experiment n parte. n multe experimente de electrotransformare parametrii cei mai importani par a fi intensitatea i durata pulsului electric aplicat deoarece acesta produce o dezorganizare temporar a membranei celulare. De asemenea, celulele supuse electrotransformarii trebuie s se gseasc n faz logaritmic de cretere, iar tamponul utilizat este glicerolul n soluie apoas, deoarece literatura de specialitate menioneaz faptul ca glicerolul i sucroza sunt cei mai eficieni stabilizatori osmotici. Un alt parametru important n electrotransformare este densitatea suspensiei celulare i concentraia ADN exogen. n literatur se menioneaz c numrul de transformani crete linear cu creterea numrului de celule pn la o anumit valoare, dup care apar erori datorit heterogenitii cmpului electric aplicat. Saturaia n ADN plasmidial corespunde unui raport ntre numrul moleculelor de ADN exogen i numrul de celule de aproximativ 100:1. La concentraii mai mari de ADN plasmidial frecvena transformrii scade. O posibil interpretare a acestor rezultate ar fi aceea conform creia doar o subpopulaie de celule de drojdie este competent pentru transformare. n experimentele noastre am utilizat o cantitate de cca 200 ng ADN plasmidial la 1.5 ml suspensie (ce conine cca 5.1 x 8 10 celule / ml). Protocol de lucru Tulpina receptor utilizat este Saccharomyces cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2). ADN transformant este reprezentat de ADN vector YEp24 10

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

1,5 ml cultur de S. cerevisiae Ts5 n mediu YPG, n faz logaritmica de cretere (18 ore) se centrifugheaz 6 minute la 6000 rpm. Sedimentul se resuspend n 1,5 ml soluie glicerol 20%, se citete la spectrofotometru absorbana la = 650 nm i se calculeaz densitatea celular. Se determin concentraia ADN de YEp 24 prin citirea A260. Pentru electroporare se realizeaz 10 probe folosind camere de electroporare de 2 mm3, fiecare prob fiind format din : 200 l suspensie celular i 20 l ADN transformant. Se realizeaz i un Martor care are aceeai compoziie ca probele dar nu este supus curentului electric. Cele 10 probe sunt suspuse electrotransformrii la diverse intensiti ale cmpului electric (kV/cm): 0.250; 0.500; 0.750; 0.870; 1.000; 1.125; 1.250; 1.375; 1.500; 1.625. Pentru toate probele curentul electric este reprezentat de pulsuri bipolare de cte 10 sec, cu pauze de cte 10 sec, durata total a trenului fiind de 22 msec. Dup electroporare, din fiecare cuv se iau 100l i se aduc 1000 l cu YPG, se incubeaz 2 ore la 30oC. Se realizeaz diluii zecimale n funcie de densitatea celular a suspensiei citit iniial i din ultimele 2 diluii se nsamneaz 0.1 ml pe plci cu YNB suplimentat cu leucin . Dup incubarea plcilor 72 ore la 30oC, se numr coloniile de electrotransformani i se calculeaz frecvenele i eficienele de transfomare pentru cele 10 probe. Ca martor sunt nsmnate celulele ce nu au fost supuse electroporrii, pe mediu complet (YPG). Eficiena transformrii este estimat prin raporarea numrului de celule transformate la numrul de celule martor. III. Fuziunea de protoplati Protoplatii reprezint sisteme experimentale importante, cu implicaii n elucidarea unor probleme majore ale biologieie moleculare i celulare, biochimiei i geneticii. nlturarea peretelui celular a creat posibilitatea studierii directe a proprietilor fizice, i fiziologice ale plasmalei, ct i a altor citomembrane. Protoplatii permit, de asemenea, descifrarea mecanismelor care intervin n fuziunile membranare, precum i nelegerea proceselor de biosintez a componentelor peretelui celular. Tehnologia protoplatilor a facilitat i separarea, n condiii optime, a diferitelor componente celulare (mitocondrii, nuclei, peroxizomi), permind cunoaterea interrelaiilor morfo-funcionale de la nivelul diferitelor compartimente celulare. Importana protoplatiilor deriv i din perspectivele oferite pentru experimentele de inginerie genetica celular i molecular. Dup ce Eddy i Williamson (1957) au pus la punct o tehnic eficient de preparare a protoplatilor la drojdii, folosind enzime litice din sucul digestiv de Helix pomatia, cercetrile privind izolarea i utilizarea protoplatilor de drojdii n experimentele genetice au luat o mare amploare. Aceste sisteme celulare au fost utilizate cu succes n hibridarea somatic prin fuziune de protoplati. Astfel, tehnica fuziunii de protoplati a prezentat i prezint, nca, o importan deosebit n realizarea hibrizilor intra-, interspecifici i intergenerici, pornind de la tulpini de laborator cu markeri de auxotrofie sau tulpini industriale cu markeri mitocondriali. Protoplatii sunt sisteme celulare fragile, astfel nct pentru meninerea viabilitii, integritii i metabolismului lor normal, trebuiesc realizate condiii speciale de izolare, manipulare i cultur. Astfel, masa de protoplati este influenat de vrsta i starea fiziologic a culturii. Celulele tinere de S. cerevisiae, aflate n faz exponenial de cretere, sunt imediat convertite n protoplati, pe cnd cele n faz staionar sunt rezistente la liz. n timpul tranziiei de la faza exponenial la faza staionar, se constat o cretere rapid a rezistenei la protoplastizare, datorit diferenelor structurale ale peretelui celular. Procedeele de preparare a protoplatilor de drojdii pot fi clasificate n : 1. procedee de inhibare specific a sintezei peretelui celular ; 2. procedee de digestie enzimatic a peretelui celular cu enzime din sucul digestiv de Helix pomatia (un complex de peste 35 de enzime, dintre care amintim : endo (1,3) i endo (1,3) glucanaz, manaz, chitinaz, celulaz, lipaz, poligalacturonaz), sau cu enzime microbiene de tipul zymolyaz de Arthrobacter luteus, lyticaz sau novozym 234 (Fig.6.11 - a,b). Deoarece protoplatii sunt sensibili la variaiile presiunii osmotice, este necesar asigurarea unei osmolariti echilibrate a mediului cu stabilizatori osmotici de tipul zaharurilor nemetabolizabile i a srurilor anorganice (manitol, sorbitol, clorur de poatsiu, sulfat de magneziu, sulfat de amoniu). S-a constatat ca unii aminoacizi cu sulf, cum ar fi cisteina, accelereaz procesul de izolare a protoplatilor de drojdii prin tratamentul enzimatic cu suc digestiv de Helix pomatia. Ulterior, o serie de cercettori au realizat sensibilizarea celulelor de drojdie la tratamentul enzimatic cu compui mercapto - : 2 - mercaptoetanolamin, 2 mercaptoetanol, tioglicolat i ditiotreitol. S-a presupus c aceti compui acioneaz asupra proteinelor din structura peretelui celular prin desfacerea legturilor disulfurice, facilitnd aciunea litic a enzimei. Primele cercetri referitoare la fuziunea controlat a protoplatilor la drojdii au fost iniiate de Ferenczy (1974) i au fost impulsionate n urma descoperirii i folosirii ca agent de fuziune a polietilenglicolului (PEG). Ulterior, s-a demonstrat ca fuziunea chimic cu PEG este mediat de ionii 2+ 2+ de calciu (Ca ). Rolul PEG i Ca n procesul de fuziune a fost ns ndelung controversat. Astfel, 11

Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

Lucy (1984) a presupus ca evenimentul central n procesul de fuziune membranar este interaciunea i fuziunea bistraturilor lipidice ale celor dou membrane, proces n care proteinele nu intervin. PEG i Ca2+ determin deshidratarea membranelor i schimbarea permeabilitii datorit dezorganizarii locale a bistraturilor lipidice. Prin reducerea repulsiei electrostatice i a forelor de hidratare a lipidelor apare un contact strns ntre bistraturile lipidice. Lipidele celor dou bistraturi se unesc, fapt ce implic pierderea temporar a configuraiei bistratificate n punctul de fuziune. n final, cele dou bistraturi fuzioneaz i se produce restabilirea structurii normale a plasmalemei. Conform altor cercetatori, ionii Ca2+ intervin n fuziune prin creterea intracelular a concentraiei Ca2+ i activarea unor enzime ce determin dezorganizarea lipidelor. Astfel, s-a presupus c n cazul fuziunii mioblastelor, spre exemplu, ionii Ca2+ activeaz fosfodiesteraza ce determin ruperea bistraturilor lipidice (Fig. 6.11 c,d). Electrofuziunea reprezint o alt tehnic de fuziune a protoplatilor. n esen, metoda const n expunerea protoplatilor unui cmp electric pulsatoriu de intensitate nalt i de scurt durat. n aceste condiii, se realizeaz o rupere local a membranelor care devin astfel permeabile. Procesul este reversibil. n timpul fuziunii se formeaz ntre membranele celor dou celule puni lipidice, astfel nct cele dou membrane se refac mpreun n zona de contact. Punile formate determin apariia unor pori cu diametrul foarte mic, fapt care are ca rezultat apariia unei tensiuni de suprafa foarte nalt. Etapa urmtoare const n fuziunea celulelor ntr-o sfer. n realizarea fuziunii, se pornete, de regul, de la tulpini de laborator ce prezint markeri biochimici de auxotrofie, fapt ce uureaz izolarea ulterioar a produilor de fuziune. Prin fuziunea de protoplati sunt depite barierele sexuale ce mpiedic realizarea ncrucirilor ntre tulpinile de drojdii ce aparin aceluiai tip de mperechere ( x , a x a). Fenomenul de reversie a protoplatilor de drojdii presupune parcurgerea a dou etape: (1) formarea unui nou perete celular i (2) realizarea mitozei i citochinezei i repetarea ciclului celular. S-a pus problema dac peretele celular este sintetizat de novo sau este necesar existena unui model supramolecular (resturi ale peretelui celular iniial), primer pentru sinteza noului perete. Cercetrile de microscopie electronic utiliznd tehnici de fluorescen i criodecapaj, au adus dovezi n sprijinul ipotezei privind sintetizarea de novo a peretelui celular. Reversia la starea celulei iniiale este un proces gradat, determinat genetic, ce presupune existena ctorva generaii de revertani. Iniierea reversiei este marcat de desfurarea primei citochineze care se realizeaz imediat ce peretele celular a fost complet regenerat. Regenerarea protoplatilor la drojdiile din genul Saccharomyces se realizeaz pe medii solide cu gelatin, agar sau polietilenglicol (Fig. 6.11 - d). n ceea ce privete produii de fuziune, descendena hibrizilor selecionai pentru complementaia markerilor de auxotrofie sau pentru markeri de rezisten, poate fi caracterizat pentru confirmarea originii hibride prin: (1) sporulare i segregare meiotic sau segregare mitotic, (2) stabilirea fuziunii nucleare - formarea de heterocarioni sau homocarioni, (3) stabilirea gradului de ploidie. 1. Segregarea meiotic i mitotic. La tulpinile de drojdii ce prezint sporulare i meioz (S. cerevisiae MAT a/) se poate realiza analiza tetradic i, implicit, stabilirea constituiei genetice a descendenei produilor de fuziune. n experimentele de fuziune de protoplati s-au utilizat ns, i tulpini de laborator de S. cerevisiae heterotalice de acelai tip de mperechere (fuziuni de tipul a x a, sau x ), sau tulpini industriale ce nu prezint sporulare i meioz. Urmrind capacitatea de sporulare i mperechere a produilor de fuziune / sau a/a, s-a constatat c acetia sunt deficitari n sporulare, dar prezint capacitate normal de mperechere (a/a x /), iar descendenii, dup sporulare, pot fi analizai genetic. n absena capacitii de sporulare se poate iniia pierderea cromozomilor n mitoz (haploidizare) cu acriflavin, radiaii ultraviolete, nitrosoguanidin, etc. Prin aceast metod a fost indus seregarea parentalilor i a recombinanilor la Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis i Hansenula polymorpha, fapt ce a permis analiza ulterioar a descendenilor i, implicit, caracterizarea produilor de fuziune. 2. Formarea heterocarionilor i a homocarionilor. n urma fuziunii de protoplati se pot obine heterocarioni, heteroplasmoni sau hibrizi. Prima etap ce urmeaz fuziunii protoplatilor aparinnd la dou tulpini diferite de drojdii este formarea heterocarionilor multinucleai. S-a stabilit ca la S. cerevisiae, n urma fuziunii de protoplati apar cu o frecven mare celule poliploide. De asemenea, este posibil s se obin produi de fuziune pornind de la trei parentali haploizi diferii. Aceste rezultate demonstreaz c produsul de fuziune conine 2 sau mai multi nuclei. n aceast faz se realizeaz ns, intermixarea citoplasmatic i, probabil, fuziunea unora dintre nuclei. Numrul de nuclei per produs de fuziune poate fi determinat prin colorare cu acridin orange, DAPI sau Giemsa. 3. Gradul de ploidie al produilor de fuziune poate fi determinat prin metode diferite. La drojdiile ce sporuleaz, de tipul S. cerevisiae a/, se poate aplica analiza tetradic. O alt metod const n stabilirea gradului de ploidie prin msurarea cantitii de ADN din celul. La unele drojdii,

12

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

ploidia poate fi estimat i prin msurarea dimensiunii celulei. Se poate aprecia gradul de ploidie i pe baza viabilitii sporului, innd cont de faptul ca triploizii produc spori cu o viabilitate scazut. Prin combinarea acestor metode de analiz s-a demonstrat ca produii de fuziune de la S. cerevisiae, provenii de la dou sau mai multe tulpini haploide sunt predominant diploizi, dar pot s apar cu frecven mare i triploizi sau tetraploizi. De asemenea, au fost identificai i produi aneuploizi. Apariia acestora demonstreaz faptul c, ntre nucleii heterocarionului se poate realiza transferul unor cromosomi individuali, ntr-o manier similar cu cele observate n producerea de citoductani (Fig.6.11). Parte experimental Pentru fuziunea de protoplati se folosesc urmtoarele perechi de tulpini de drojdii :
A S.cerevisiae Ts5 (a ura3 leu2) S.cerevisiae 17/17 ( his) S.ellipsoideus Ni (Ni 7mM) H.polymorpha Ni (Ni 7mM)
R R

B x x x x S.cerevisiae D-585-11c (a lys) S.cerevisiae 9744 ( leu2) S.cerevisiae SMR4 CdR (Cd 0.8 mM) H.anomala CdR (Cd 0.8mM)

Experimentul necesit parcurgerea mai multor etape: A. Izolarea de protoplati n aceast etap se urmrete izolarea de protoplati pentru fiecare dintre tulpinile de drojdii menionate mai sus. Tulpinile se cultiv n mediu YPG, 16 ore la 30oC, cu agitare. 1.5 ml cultur se centrifugheaz 5 minute la 6000 rpm. Sedimentul celular se resuspend n 500 l Tris-HCl 0.05 M (pH 7.5). Se adaug: 500 l soluie (KCl 1.2M + MgSO4 0.02M) i 10 l -mercaptoetanol (mercaptoetanolul poreaz peretele celular al drojdiilor, iar soluia de KCl + MgSO4 este stabilizator osmotic). Tuburile se agit timp de 15 min.

Fig. 6.11. Aspectul celulelor de drojdie n timpul protoplastizrii, fuziunii si reversiei protoplatilor
a. ultrastructura celulei de S. cerevisiae (25000 x); b. ultrastructura protoplatilor de S. cerevisiae (24600 x) ; c. aglutinri ale 2+ protoplatilor de S. cerevisiae induse de PEG n prezena Ca (20500 x) ; d. diferenierea unor puni citoplasmatice ntre protoplati adiaceni la S. cerevisiae (31500 x) ; e. aspectul celulelor de S. cerevisiae dup reversia protoplatilor (17600 x).

Se centrifugheaz 5 minute la 6000 rpm, iar sedimentul celular se resuspend n 750 l soluie KCl 1.2M + MgSO4 0.02M. Se adaug 500 l soluie zymolyaz (soluie stoc 2mg/ml) pentru distrugerea peretelui celular. Se incubeaz 1 or la 37oC cu agitare. La sfritul acestei etape se obin protoplati de drojdii. Se centrifugheaz probele 5 minute la 6000 rpm, iar sedimentul celular se resuspend n 1 ml soluie KCl 1.2 M + MgSO40.02M. B. Fuziunea protoplatilor i regenerarea produilor de fuziune: 1 ml suspensie protoplati A (obinui n etapa anterioar) se amestec cu 1 ml suspensie protoplati B. Amestecul se centrifugheaz 5 minute la 5000 rpm. Sedimentul se resuspend n 1.5 ml soluie ce conine 1.34 ml PEG 6000 concentraie 40% i 0.16 ml soluie CaCl2 0.1M. Probele se in 10 minute la 20oC, iar 100 l suspensie se nsamneaz pe plci Petri cu mediu de regenerare (YPG + KCl 0.6 M, topit i rcit la 44oC).

13