ISOLASI DAN SKRINING KAPANG POTENSIAL PENGHASIL MONAKOLIN K

Herman Suryadi, Maksum Radji, dan Eko Ari Respa i

Departemen Farmasi FMIPA, Universitas Indonesia, Kampus UI Depok 16424. hsuryadi@ui.edu A!s rak
Monacolin K adalah o at utama dalam pen!o atan "iperkolesterolemia# Monacolin K dihasilkan oleh e erapa species Monascus sp dan Asper!illus sp# Penelitian ini ertu$uan untuk mencari isolat kapan! lokal %an! potensial men!hasilkan Monakolin K# &ampel %an! terdiri atas tanah, uah' uahan, dan i$i' i$ian, diskrinin! untuk mendapatkan isolat potensial den!an men!!unakan medium PDA# &elan$utn%a isolat terpilih dilan$utkan den!an (ermentasi# "asil (ermentasi diekstraksi den!an etil asetat pada p"), disarin!, dan ditotolkan pada plat K*+ ,6-F2.4# Pen!em an!an K*+ dilakukan den!an pelarut etil asetat / kloro(orm 0)-12-3, dan analisis kuantitati( Monakolin dilakukan den!an Densitometri men!!unakan 4ama! +*4 &canner III# "asil menun$ukan terdapat lima isolat potensial se a!ai pen!hasil Monakolin K, dan satu diantaran%a %an! didu!a se a!ai !alur Monascus sp#, men!hasilkan Monakolin den!an kadar tin!!i 0Yield, 5#. m!6!3#

A!s ra"
Monacolin K is a (irst line o( dru! in treatment "%percholesterolemia# Monacolin K is produced % several species o( Monascus sp and Asper!ilus sp# +he o $ective o( this research 7as to (ind a local (un!i 7hich potential in monacolin K production# &amples o( soils, (ruits, and !rains 7ere screened (or potential isolates usin! PDA as isolation medium# +he (ermented mediums 7ith selected isolates 7ere e8tracted 7ith eth%l acetate at p" ), (iltered, and spotted on +*4 plate , 6F2.4 # &pots development 7as carried out usin! eth%l acetate / chloro(orm 0)-12-3 as eluent, and monacolin concentration 7as measured % 4ama! +*4 &canner III# +he results sho7ed that (ive isolates 7ere potential producer o( monacolin K# Amon! them, one isolate 7hich presumed as Monascus strain produced hi!h amount o( monacolin K 0Yield, 5#. m!6!3# Keywords 1 Monacolin K, Monascus, fermentation, TLC Scanner

#$ PENDAH%L%AN
Perkem an!an industri mikro iolo!i modern dimulai pada a ad di!unakan untuk ke 2-# &elama !liserol, peran! dunia pertama metode mikro iolo!i memproduksi aseton, utanol, asam sitrat dan ahan kimia dasar lain# 9ra ditemukann%a Flemmin! pada erikutn%a dimulai den!an anti iotik a7al oleh peran! Ale8ander dunia II,

kesehatan, lin!kun!an, pan!an, dan ener!i, seperti pen!uraian lim ah er aha%a dan eracun, produksi o at'o atan 0anti iotik, hormon, vaksin dan lain'lain3, se a!ai sum er ahan makanan, dan sum er ener!i %an! ter arukan 013# &alah satu mikro a pen!hasil meta olit %an! sedan! erkem an! saat ini adalah Monascus sp %an! ditemukan oleh Pro(esor 9ndo dari ;epan! pada tahun 1522# Monascus sp men!hasilkan <at %an! dikenal se a!ai

selan$utn%a mikro iolo!i6:ioteknolo!i telah erperan pentin! dalam men!atasi masalah

Monakolin K, suatu meta olit sekunder %an! memiliki aktivitas se a!ai inhi itor Hidroksi Metil Guanin erperanan se a!ai pentin! o at dalam koen im ! men!ontrol melalui kolesterol, meta olit oleh Bahan : &ampel tanah, i$i' i$ian# Media PDA, larutan A@uades, Kloram(enikol 9tanol, 9til ase 1?, asetat, 0"M,'4oA3 reduktase %aitu suatu en<im %an! iosintesis kolesterol# Monakolin K di!unakan antihiperlipidemia kadar adalah mekanisme penurunan K

Diklorometan, "4l 2 A, Beast 98tract, Am%lum or%<ae, K"2PC4, M!&C4 2"2C, A!ar# Alat : 4a7an petri, +a un! reaksi, 9rlenme%er, Ctokla(, Cven, :eker ,elas, Maat Pipet, Pipet Dolum, Mikroskop, Pipa kapiler 1 l, kertas sarin!, *empen!an K*+ , 6F2.4, 4ama! +*4 &canner seri III# Iso'asi Kapan( a# Pem uatan media isolasi PDA=.,6> Media Den!an cara PDA di uat den!an a@uades cara lalu

tri!liserida, *D* dan penin!katkan "D*# =2> Monakolin sekunder %an! diketahui dihasilkan

e erapa $enis kapan!, diantaran%a adalah !sper"illus tereus, !. parasiticus, !. fischeri, !. fla#us, !. um$rosus, !cremonium chryso"enum, Monascus purpureus, Monascus ru$er, %enicillium funiculosum, Trichoderma #iridae, Trichoderma lon"i$rachiatum=)># Untuk memperoleh $amur potensial pen!hasil Monakolin K perlu dilakukan isolasi dan skrinin! isolat $amur dari e erapa sampel tanah dan i$i' i$ian# Penelitian ini ertu$uan untuk memperoleh isolat un!!ul kapan! pen!hasil Monakolin K dalam $umlah %an! si!ni(ikan, dan potensial untuk dikem an!kan le ih lan$ut#

melarutkan )5 !ram PDA dalam 1 liter a@uades# memanaskan masukan media PDA sedikit demi sedikit sam il diaduk hin!!a larut sempurna# 4ek p"'n%a den!an p" meter %aitu sekitar .,6 -,2# +am ahkan larutan kloram(enikol se an%ak 1 ml per 1-- ml media, lalu disterilkan dalam otokla( suhu 121C4 selama )- menit# +uan!kan 1- ml media kedalam ca7an petri steril dan iarkan mem eku# Media isolasi tahap 2 dan stok kultur di uat den!an cara %an! sama tetapi tanpa penam ahan kloram(enikol# # Isolasi dari sampel tanah =.,6> Mula'mula permukaan tanah di ersihkan dari sampah dan kotoran, lalu diam il lapisan lem a di a7ahn%a, dimasukan dalam vial# . ml a@uades 9ncerkan -,1 !ram tanah dalam

&$ METODE PENELITIAN

steril# Inokulasikan -,1 ml suspensi keatas media PDA# Inku asi pada suhu 2EC4 selama .' 2 hari# Koloni $amur %an! tum uh diisolasi erdasarkan mor(olo!i dan (enotipn%a, koloni

terse ut

diam il

den!an

ose

kemudian

&e an%ak -,1 !ram sampel i$i' i$ian dihancurkan, lalu disuspensikan dalam . ml a@uades steril# Inokulasikan -,1 ml suspensi keatas media PDA# Inku asi pada suhu 2EC4 selama .'2 hari# Koloni $amur %an! tum uh dipilih %an! potensial dan(enotipn%a# # Penanaman, 9kstraksi, dan Analisis Filtrat Fermentasi =E> Am il 1 ose stok kultur, suspensikan dalam 1 ml a@uades# &etiap erlenme%er diinokulasi den!an 1 ml suspensi kultur# Proses (ermentasi dilakukan pada suhu 2E C4 selama 1- hari# Pada akhir tahap (ermentasi, lapisan a!ar dikerok den!an spatel# *alu masin!'masin! la u 9rlenme%er di eri 2. ml etil asetat dan ad$ust hin!!a p" ),- den!an men!!unakan "4l 2A# 9kstraksi dilakukan diatas shaker pada 1Erpm dan suhu kamar# *apisan etil asetat kemudian diam il dan disarin!, sehin!!a diperoleh (iltrat %an! $ernih# . l (iltrat ini ditotolkan keatas plat K*+ silika !el ,6- F2.4 %an! sudah diakti(kan den!an pemanasan# Pen!em an!an dilakukan den!an (ase !erak diklorometan dan etil asetat 02-1)- v6v3, lalu diperiksa den!an Cama" TLC Scanner pada pan$an! !elom an! 2)2 nm# Konsentrasi monakolin dihitun! erdasarkan kurva kali rasi %an! telah di uat# Me ode Ana'isis Kuan i a i) Monako'in a# Pem uatan larutan standar monakolin dan kurva a sor si# &tandar dilarutkan dalam monakolin Metanol di ditim an!, la u ukur# erdasarkan mor(olo!i

di!oreskan ke atas media PDA aru# Inku asi pada suhu 2EC4 selama .'2 hari# ;ika telah mendapatkan hasil %an! memuaskan koloni dipindahkan ke ta un! stok kultur, $ika tidak prosedur diulan!i la!i# c# Isolasi dari i$i' i$ian =.,6> aru, lalu Koloni terse ut diam il den!an ose kemudian di!oreskan keatas media PDA
C

Inku asi pada suhu 2E 4 selama .'2 hari# ;ika telah mendapatkan hasil %an! memuaskan koloni dipindahkan ke ta un! stok kultur, $ika tidak prosedur diulan!i la!i# d# Identi(ikasi mikro iolo!is $amur =.,2> Untuk pemeriksaan mikro iolo!is

di!unakan metode direct mountin"# 4aran%a, satu ose $amur dari stok kultur, dioleskan pada permukaan o$&ect "lass, kemudian ditetesi den!an satu tetes a@uades steril kemudian diaduk hin!!a tersuspensi lalu ditutup den!an co#er KC" "lass# 1A Kemudian untuk diamati mem uat di a7ah preparat mikroskop# &elain itu di!unakan $u!a larutan mikroskopis# Skrinin( Iso'a a# Pem uatan media (ermentasi =2> Media (ermentasi di uat dari yeast e'tract 4 !, amylum ory ae 1. !, K"2PC4 1!, M!&C4 -,.!, a!ar 1. !, dan a@uades hin!!a 1 liter# *arutkan semua ahan padat dalam a@uades panas aduk hin!!a larut sempurna# Kemudian disterilkan dalam otokla( suhu 121
C

4 selama 1. menit# &etelah din!in tuan! 2. ml iarkan

kedalam 9rlenme%er 1-- ml dan mem eku se a!ai media tanam#

Kemudian dilarutkan dalam metanol hin!!a konsentrasi 1-, 4-, 1-- dan 1--- ppm# Am il larutan 1ppm kemudian ukur den!an

spektro(otometer

UD'Dis

pada

pan$an!

masin! 1-, 4-, 1--, .--, 1---, 1.--, 2---, 2.-- dan )--- n! per spot# Pen!em an!an dilakukan den!an (ase !erak diklorometan dan etil asetat 02-1)- v6v3# Kemudian diiukur den!an Cama" TLC Scanner pada pan$an! !elom an! 2)2 nm# Kemudian di uat kurva kali rasi hu un!an antara konsentrasi dan luas puncak# kali den!an .- ml etil asetat dan diatur p"'n%a men$adi ),- den!an men!!unakan "4l 2A# 9kstraksi dilakukan seperti pada prosedur &krinin! Isolat0 3#

!elom an! 2-- / 4-- nm# # Pem uatan kurva kali rasi# Pada pelat K*+ ,6- F2.4 larutan aku Monakolin K ditotolkan den!an pipa kapiler 1 l sehin!!a diperoleh konsentrasi masin!' Dalidasi metode analisis dilakukan den!an penentuan atas deteksi dan u$i perolehan kem ali 0rekoveri3# *ermen asi Iso'a Terpi'i+ &etelah didapat cara menanamn%a e erapa $amur %an! potensial kemudian diseleksi kem ali den!an dalam 1-ml media (ermentasi dalam 9rlenme%er .-- ml dan diinku asi selama 21 hari pada suhu 2E C4# Pada akhir tahap (ermentasi, lapisan a!ar diam il den!an men!!unakan spatel# *alu masin!'masin! la u erlenme%er diekstraksi dua Kode isolat &1 A &4 A &6 A &2 A &E A &E : &E 4 &5 A &11 A &1) A &14 A &1E A &1E 4 &15 A &15 : &15 4 &2- A &16 Pem andin! Pertum uhan :aik, penuh :aik, penuh :aik, penuh :aik, penuh :aik, penuh :aik Meram at :aik, penuh :aik, penuh :aik, penuh :aik, tipis :aik, penuh :aik, tipis :aik, penuh :aik, penuh :aik, penuh :aik, tipis :aik, penuh :aik, penuh

,$ HASIL DAN PEM-AHASAN

Hasi' Iso'asi dan Skrinin( Iso'a kapan( Dari 2- uah isolat hasil isolasi, setelah diinku asi selama 1- hari diperoleh data pertum uhan dan konsentrasi monakolin K %an! dihasilkan 0ta el 13#

Tabel 1 ( Hasil isolasi dan skrinin" )solat kapan" Pi!mentasi Putih Kunin! muda Kunin! pucat Kunin! muda Putih Putih Putih Putih Kunin! pucat Kunin! Putih Merah tua Merah tua Merah tua Merah tua Merah tua Kunin! muda Merah tua Merah tua Konsentrasi Monakolin0n!6ml3 14,-E261 61,25624 )2,446-5 E,)5E1-1 4.,4E66) 4E,.4E55 4.,542)2

Untuk isolasi $amur potensial ini di!unakan

C

direndam, dan daun teh# *okasi pen!am ilan sampel dipilih dan dilakukan secara random dari ;akarta, Depok, dan :ekasi# Pada tahap isolasi ini di!unakan media PDA den!an penam ahan kloram(enikol se an%ak 1-- m! per liter# sarin! a!ar didapat (iltrat %an! $ernih untuk tahap K*+'Densitometri# "asil analisis menun$ukan ada enam isolat %an! potensial, empat diantaran%a men!hasilkan Monakolin K den!an kadar %an! relati( tin!!i 0ta el 13#

er a!ai sampel %aitu 1 &ampel

tanah, eras, media dari eras %an! dire us pada suhu 1-- 4 selama 1. menit, kacan! tanah, !andum, asam $a7a, $eruk, apel, pisan!, eras merah 0"on! Fu3, media dari "on! Fu %an! Penam ahan akteri kontaminan# kloram(enikol Pen!enceran ini dimaksudkan untuk men!ham at pertum uhan suspensi sampel dimaksudkan a!ar pertum uhan tidak terlalu padat ataupun terlalu $aran! sehin!!a proses selan$utn%a le ih mudah# &etelah . hari inku asi, koloni $amur %an! tum uh diam il den!an ose dan di!oreskan pada permukaan media PDA 0streak plate method3 untuk men!isolasi koloni kapan! sehin!!a didapat isolat murni# Isolat murni ini lalu dipindahkan kedalam ta un!, diinku asi selama . hari a!ar tum uh miselium dan askospora %an! cukup0stok kultur3# Untuk u$i skrinin!, diam il 1 ose stok kultur dan disuspensikan dalam 1 ml a@uades ,lalu dituan! ke dalam 2. ml media (ermentasi, diinku asi selama 1- hari sam il terus diamati# &etelah hari ke 1- lapisan a!ar dihancurkan, lalu diekstraksi men!!unakan etil asetat se an%ak 2. ml pada p" ) 0diatur den!an larutan "4l 2A3# 9ktraksi erlan!sun! dalam erlenme%er diatas rotary shaker, dan dikocok den!an kecepatan 12- rpm selama 1 $am# "asil ekstraksi lalu disarin! men!!unakan kertas

Me ode ana'isis Monako'in K

Untuk men!hitun! konsentrasi monakolin %an! dihasilkan maka terle ih dahulu harus di uat kurva kali rasi dari monakolin standar %an! diukur pada pan$an! !elom an! maksimum pada 2)2 nm# Data kurva kali rasi dapat dilihat pada !am ar 1, diperoleh kurva kali rasi den!an persamaan 1 % G ),E52 8 / 24,152# &etelah dihitun! tern%ata ada e erapa isolat %an! men!hasilkan Monakolin K den!an $umlah %an! cukup ermakna, %aitu isolat nomer &E :, &11 A, &15 :, &15 4# dan pem andin!, erturut'turut men!hasilkan monakolin se esar 0ppm3 1 61,)-H )2,4.H 4.,45 H 4E,..H dan 4.,54 0ta el 13# *imit deteksi 0konsentrasi terendah3 %an! dapat dideteksi pada ketin!!ian ) kali noise adalah pada konsentrasi 4- n! per spot dan hasil u$i perolehan kem ali adalah 54,52 ? dan 52,52 ? 0data tidak ditampilkan3#

Konsentrasi monakolin 0n!3 Gam$ar * ( Kur#a kali$rasi standar monakolin K secara KLT+densitometri.

%ji *ermen asi Monako'in K

Isolat potensial terse ut diskrinin! la!i den!an 7aktu (ermentasi le ih lama dan skala le ih esar untuk melihat keterulan!ann%a dan potensi produksin%a# Fermentasi dilakukan untuk men!etahui erapa an%ak Monakolin

%an! dihasilkan $ika dilakukan (ermentasi den!an $an!ka 7aktu %an! optimal# U$i dilakukan pada suhu kamar selama 21 hari, dan didapat hasil konsentrasi monakolin masin!' masin! isolat 0m!6ml3 &E :, 25,22H &11A, 142,21H dan .-,2-H &15 :, E),-6H &15 4,

Pem andin! 1 0Monascus sp#3, 61,42 0ta el 23# Tabel 2 ( ,ata konsentrasi monakolin hasil fermentasi Ao# Kode Isolat Konsentrasi spot 0n!6spot3 1# 2# )# 4# .# &E : &11 A &15 : &15 4 M .purpureus )56,122 2.),.-2 41.,)14 21),.)) )-2,)46 Konsentrasi monakolin0!6ml3 25,224)E .-,2-141 E),-6221 142,2-6. 61,4651E Bield 0m!6! su strat3 .,2E ),)E .,.4 5,.1 4,-5

a
Gambar 2 ( )solat S*-C.a/ di$andin"kan den"an "alur Monascus purpureus .$/ koleksi La$. Mikro$iolo"i, %uspitek L)%), Serpon". Konsentrasi monakolin tertin!!i %an! di erikan oleh isolat &154 terse ut 0Bield 5,. m!6! su strat3 produktivitasn%a hampir sama den!an hasil dari kultur kocok %an! telah dioptimasi oleh peneliti "un!aria, namun masih "asil identi(ikasi mikro iolo!is terhadap isolat %an! potensial didu!a ah7a isolat nomer &E : dan &11A adalah dari !enus !sper"illus, sedan!kan isolat nomer &15 : dan &15 4 adalah !enus Monascus. "asil ini disimpulkan dari pen!amatan terhadap pertum uhan, pi!men %an! dihasilkan, entuk askospora dan (ilamenn%a 0!am ar 23# le ih kecil $ika di andin!kan den!an hasil kultur (ermentasi padatn%a =11># "al ini menun$ukkan ah7a isolat &154 %an! diperoleh san!at potensial untuk dikem an!kan le ih lan$ut#

DA*TAR A/%AN
=1># &tan ur%,P#F#, Ihitaker, A#, and "all, &#;# Principles o( Fermentation +echnolo!%, 2th ed#, Per!amon Press, 155.# =2># Akira 9ndo# Monakolin K, ! 1e2 Hypo+ cholesterolemic !"ent That Specifically )nhi$its0+Hydro'y+Methyl"lutaryl Coen yme ! 3eductase. +he ;# C( Anti iotics# 15E-# =)># &iamak M#&#, Aasrin M#, &aeid "#, Far<aneh A# M#, &aeid M#, M#J# :akhtiari# Screenin" of Lo#astatin %roduction $y 4ilamentous 4un"i# Iran :iomed ;# 2 0131 25')), 2--)# =4># A# +hompson K ,loria *im# ! La$oratory Manual 5f Tropical Mycolo"y and 6lementary 7acteriolo"y. Pustaka Ilmu Universit% o( Mala%a Press# 156.#

.$ KESIMP%LAN
Dari e erapa isolat potensial %an! diperoleh0&E :, &11 A, &15 : dan &1543 isolat &154 san!at potensial untuk dikem an!kan se a!ai pen!hasil Monakolin K pada skala %an! le ih esar# Monakolin hasil (ermentasi dapat ditentukan kadarn%a den!an metode Densitometri den!an men!!unakan alat Cama" TLC Scanner 0, den!an limit deteksi 4- n! per spot#

=.>#

Anthon% ,aud%

6 9lisa eth ,aud%,

=5># +ouchstone, ;#4 K F# Do

ins# %ractice of

Mc,ra7# Micro$iolo"y for 6n#ioremental Scientists and 6n"ineers. "ill International :ook 4ompan%# 15E-# =6>. :ooth, 4#0ed#3 Method in Micro$iolo"y, 8olume 9. Academic Press# 1521# =2># Anonim# 4armakope )ndonesia 6disi )8. Departemen Kesehatan repu lik Indonesia# ;akarta# 155.# =E># ,isele B# Mi%ashira# Kinetics of Monascus ru$er Secondary Meta$olites %roduction on 3ice, :nder 8aria$le )nitial Cell Concentration. Departement o( 4hemical 9n!ineerin!# :ra<il#

Thin Layer Chromato"raphy ;nd 6dition. ;ohn Iile% K &ons Inc, 15E)# =1-># 4K 4amp ell, 9M ;ohnson, 4M Philpot and DI Iarnock# 4un"i# ,#, o( ,# )dentification P"*& "#F#, of 61 and tereus# %atho"enic =11># &<akacs, strain

4olindale Ave#, *ondon# 1556# Morov$an, JP#+en!erd%# Producton o( lovastatin % a 7ild Asper!illus :iotechnol# *ett#,2-0431 411'41., 155E#