1.

Fundamento terico
2. Determinacin de protenas (Ejemplo)

ESPECTOFOTOMETRIA VISIBLE

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La mayora de los problemas analticos reales comienzan con una compleja mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o ms componentes de la misma. Se pueden plantear las siguientes cuestiones: de carcter cualitativo: de qu componente se trata?, de carcter cuantitativo: cunto hay de ese componente?

A) B)

Determinacin cualitativa y/o cuantitativa

Mtodo instrumental de anlisis, como

es la espectrofotometra para medir la absorcin de radiacin ultravioleta y visible que interacta con la materia (tomos y molculas). tcnica considerada como cuali y cuantitativa basndose en la medicin del color o de la longitud de onda de una radiacin e intensidad de la misma.

La luz del sol y sus componentes

Desde el siglo XVII sabemos,

con los trabajos de Newton y Huygens, que la radiacin luminosa, la luz, se desva al atravesar un medio de densidad distinta, como el agua. Sufre una dispersin. As, cuando la luz blanca que procede del sol atraviesa gotas de lluvia, esta se desva, y sus componentes, que son las de luz de color rojo, naranja, amarillo, verde, azul, ail y violeta, se separan formando el arco iris.

Emisin y radiacin
Cmo medir la radiacin emitida o la radiacin absorbida por los cuerpos?.
Un aparato capaz de obtener el espectro de una

radiacin, es decir, de separar la radiacin en sus componentes, se llama un espectroscopio. Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un espectrgrafo, y si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrmetro. Cuando es capaz de medir tambin la intensidad de la radiacin, se llama espectrofotmetro.

ESPECTROFOTOMETRA
Definicin

Mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones biolgicas.

El espectrofotmetro es un instrumento que

permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia

ESPECTROFOTMETRO

1.

2. 3.

4.

Un espectrofotmetro tpico posee cuatro componentes bsicos: una fuente de radiacin que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre ( usualmente es lmpara de tungsteno para luz visible,y deuterio para ultravioleta), un compartimiento para la muestra, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiacin que pasa por la muestra.

ESPECTROFOTMETRO

LUZ VISIBLE

Es una regin muy estrecha pero la ms importante, ya que nuestra retina es sensible a las radiaciones de estas frecuencias. A su vez, se subdivide en seis intervalos que definen los colores bsicos (rojo, naranja, amarillo, verde, azul y violeta).

Espectrofotmetro
La luz monocromtica atraviesa la muestra, y llega al detector.

Las mediciones fotomtricas se hacen en base a la relacin entre la potencia de luz que alcanza al detector cuando est interpuesta la muestra (P) y cuando no lo est (P0) o cuando est interpuesto un blanco.

Espectro de absorcin caracterstico

Espectro de emisin caracterstico

 Se acostumbra a llamar cuerpo

negro al

cuerpo ideal que absorbe todas las longitudes de onda y, por consiguiente, emite radiacin tambin a todas las longitudes de onda. Sera, en definitiva, un emisor perfecto de radiacin. A cada temperatura emitira una cantidad definida de energa por cada longitud de onda.

Transmitancia y absorbancia
La transmitancia se define como T = P / P0

y la absorbancia como

A = - log T = - log P / P0

Espectrofotmetro puede registrar la luz en el rango de UV o del visible

Al campo de luz UV de 200 a 400 nm

se le conoce tambin como rango de UV cercano , la espectrofotometra visible solamente usa el rango del campo electromagntico de la luz visible , de 400 a 800 nm.

Ley de Lambert - Beer

Relaciona la absorcin de luz con

las propiedades del material atravesado.

LEY DE LAMBERT Y BEER

La ley explica que hay una relacin exponencial

entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y A, la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.

A = cl

Donde: A = absorbencia = Coeficiente de extincin molar. l = longitud de la celda.

COEFICIENTE DE EXTINCIN MOLAR

Es una medida de la cantidad de luz absorbida

por unidad de concentracin.

Un compuesto con un alto valor de coeficiente de

extincin molar es muy eficiente en la absorcin de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por medidas de absorcin cuando se encuentra en disolucin a concentraciones muy BAJAS.

PROTENAS y la absorcin en la regin UV

Las bandas de absorcin ms significativas se

encuentra en el ultravioleta cercano, en el intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm. Concretamente absorben en este rango las cadenas laterales de los aminocidos aromticos, la histidina y la cistina. La cistina presenta una banda centrada a 250 nm, n-->s* (max ~ 300 M-1.cm-1), pero apenas se puede considerar, ya que es muy dbil y el porcentaje relativo de puentes disulfuro es muy pequeo en una protena.

PROTENAS
Los aromticos absorben de 260-290 nm. La fenilalanina. Es el menos importante cuantitativamente, aunque muestra un espectro complejo con mltiples bandas diferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta tambin bandas de mayor energa que solapan con el espectro del enlace peptdico en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por encima de 280 nm su contribucin al espectro en la zona del ultravioleta cercano de protenas suele ser pequea. La tirosina presenta un mximo a 275 nm con un hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores longitudes de onda cuando se produce la desprotonacin del OH del anillo aromtico. El triptfano agrupa al menos tres bandas diferentes.bajo el espectro centrado a 280 nm. Tambin presenta bandas en la zona del UV lejano.
Un cambio de pH produce grandes efectos en los espectros de tirosina y

triptfano ya que el lugar de protonacin afecta directamente a la conjugacin electrnica de la cadena lateral.

Curva Patrn
Es un marco de referencia que se construye de

cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albmina srica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de protenas presente en una muestra incgnita. En determinaciones colorimtricas, se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reaccin y la cantidad del reactivo que la provoca. La intensidad de color se mide con un espectrofotmetro o colormetro en funcin de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de protena, mayor cantidad de producto de reaccin y por lo tanto, mayor intensidad de color.

CURVA PATRN BLANCO

La absorbancia de una solucin es la resultante de la

absorbancia del soluto cuya concentracin se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben tambin a esa longitud de onda.
Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para

ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todas los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de ste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmitancia.

CURVA PATRN

Cuantificacin de Protenas

Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos propsitos.

Cuantificacin de Protenas
Existen diferentes mtodos para la

cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes.

BIURET
Se basa en la formacin de un complejo coloreado

entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

BRADFORD
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G
250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de
formar un complejo prpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos. OHProtena + Cu2+ Cu1+

Cu1+ + BCA

complejo prpura BCA- Cu1+

LOWRY
Este procedimiento involucra la formacin de un

complejo cobre - protena en solucin alcalina. Este complejo reduce al reactivo fosfomolibdicofosfotungstato lo que produce una intensa coloracin azul.

Este mtodo se basa en la reaccin de Biuret, donde los enlaces peptdicos reaccionan con el Cu2+ en condiciones alcalinas produciendo Cu+, despus se reduce el reactivo de Folin por las protenas tratadas con cobre a azul heteropolimolibdeno. El color se desarrolla en la segunda reaccin (con el fosfomolibdotungstato) y es primeramente debida a los aminocidos tirosina, triptfano, y en menor grado por cistena, cistina e histidina.

Cuadro comparativo de sensibilidad de las tcnicas de cuantificacin de Protenas

GRACIAS