BIOQUMICA PRTICA

Protocolos para anlise de biomolculas e exerccios complementares

BIOQUMICA PRTICA Protocolos para anlise de biomolculas e exerccios complementares Corpo tcnico: Profa. Dra. Ana Paula S. Azevedo dos Santos Profa. Ms Barbara Tereza Fonseca Silva Profa. Ms. Dbora Luana Ribeiro Profa. Dra. Elizabeth S. Barcelos Barroqueiro Profa. Dra. Maria do Socorro S. Cartagenes Profa. Dra. Sandra Nunes Profa. Ms. Selma do Nascimento Silva Profa. Ms. Serlyjane Penha H. Nunes Colaboradores: Cacionor Pereira da Cunha Junior Flavio Protsio Veras Gustavo Medeiros Frota Jeniffer Guimares de Sousa Joberth Mendes Cerqueira Maria Helena de Almeida Costa Thais Cristina Sousa Madeira Desing da capa: Profa. Dra. Patrcia Silva de Azevedo

NDICE Pgina

Apresentao

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01

Regras gerais de segurana em laboratrio ............................

05

02

Preparo de solues e reagentes ............................................

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03

Caracterizao de Carboidratos ..............................................

25

04

Caracterizao de Lipdios ....................................................... 34

05

Caracterizao de Aminocidos e Protenas ...........................

41

06

Caracterizao de cidos Nuclicos ........................................ 48

07

Desnaturao protica .............................................................

53

08

Enzimas ...................................................................................

59

09

Analise bioqumica da urina .....................................................

69

10

Colorimetria e espectofotometria .............................................

81

REFERNCIAS CONSULTADAS

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APRESENTAO

A Bioqumica a ciencia que estuda as biomolculas, isto , moleculas envolvindas com a formao e viabilidade da menor unidade viva a clula. Neste contexto, aspectos estruturais e funcionais so importantes para entendermos com estas estruturas esto envolvidas com os mecanismos de transformao ou metabolismo, permitindo a adaptao da clula ao ambiente. Outra caracteristica da vida, a hereditariedade, s possivel devido a propriedade de algunas molculas serem capazes de fazer cpias. As principias biomolculas so os carboidratos, lipdios, aminocidos, protenas, nucleotdios e cidos nucleicos. Estas juntamente com outras molculas regulatorias como vitaminas e minerais atuam nos mecanismos de gerao de energia, sintese e diviso celular. Com base em suas propriedades quimicas alguns experimentos podem ser feitos de forma a caracterizar as biomoleculas e ajudar a compreender suas aes na clula. A Bioqumica permite observar como a versatilidade das biomolculas so determinantes para a formao da clula. Considerando que esta, compe os tecidos, estes do sistemas e por ultimo o organismo, o entendimento das biomolculas permite compreender como tudo funciona n asua condio mais simples. Assim, nesta apostila iremos realizar alguns experimentos para determinar

caracteristicas estruturais e funciais das principias biomoleculas e, desta forma, a facilitar o aprendizado da bioqumia e perceber esta ciencia no est distante do nosso cotidiano, pelo contrario ela faz parte dele a todo momento.

1. REGRAS GERAIS DE SEGURANA EM LABORATRIO As regras gerais de segurana em laboratrio resultam de vrios anos de esforos de pessoas preocupadas em tornar o trabalho no laboratrio uma atividade segura. Assim, os laboratrios so lugares de trabalho que necessariamente no so perigosos, desde que certas precaues sejam tomadas. Acidentes em laboratrios ocorrem freqentemente em virtude da pressa excessiva na obteno de resultados. Todo aquele que trabalha em laboratrio deve ter responsabilidade no seu trabalho e evitar atitudes ou pressa que possam acarretar acidentes e possveis danos para si e para os demais. Deve prestar ateno a sua volta e se prevenir contra perigos que possam surgir do trabalho de outros, assim como do seu prprio. O usurio de laboratrio deve, portanto, adotar sempre uma atitude atenciosa, cuidadosa e metdica no que faz. Deve, particularmente, concentrar-se no trabalho que faz e no permitir qualquer distrao enquanto trabalha. Da mesma forma no deve distrair os demais enquanto desenvolvem trabalhos no laboratrio PORTANTO, a observncia das normas de segurana pessoal importante para a integridade fsica das pessoas que atuam de forma permanente (professores e tcnicos) ou eventual (pessoal de limpeza, alunos etc).

Vesturio Apropriado

1. Avental de mangas compridas, longos at os joelhos, com fios de algodo na composio do tecido. 2. Cala comprida de tecido no inteiramente sinttico. 3. Sapato fechado, de couro ou assemelhado. 4. culos de segurana. 5. Luvas

Vesturio NO RECOMENDADO

1. Bermuda ou short. 2. Sandlia, Chinelo, Sapato aberto. 3. Uso de braceletes, correntes ou outros adereos. 4. Avental de naylon ou 100% poliester.

HBITOS INDIVIDUAIS Faa no Laboratrio

1. Lave as mos antes de iniciar seu trabalho. 2. Lave as mos entre dois procedimentos. 3. Lave as mos antes de sair do laboratrio. 4. Certifique-se da localizao do chuveiro de emergncia, lava-olhos, e suas operacionalizaes. 5. Conhea a localizao e os tipos de extintores de incndio no laboratrio. 6. Conhea a localizao das sadas de emergncias. No Faa no Laboratrio

1. Fumar 2. Comer 3. Correr 4. Beber 5. Sentar ou debruar na bancada 6. Sentar no cho 7. No use cabelo comprido solto 8. No (ou evite) trabalhar solitrio no laboratrio 9. No manuseie slidos e lquidos desconhecidos apenas por curiosidade Atitudes Individuais com Bicos de Gs

1. Feche completamente a vlvula de regulagem de altura de chama. 2. Abra o registro do bloqueador da linha de alimentao. 3. Providencie uma chama piloto e aproxime do bico de gs. 4. Abra lentamente a vlvula de regulagem de altura de chama at que o bico de gs ascenda. 5. Regule a chama. RISCOS RELACIONADOS AOS PRODUTOS QUMICOS

Os produtos qumicos mais agressivos ao homem e ao meio ambiente podem ainda afetar pessoas que no tm conhecimentos de suas caractersticas, como o caso do
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pessoal da coleta de lixo, catadores de lixo etc. Estes, por serem leigos no assunto, ficam sobremaneira expostos s consequncias do seu manuseio inadequado. Alm do contato direto com a pele, os diversos agentes qumicos manuseados em laboratrios podem agredir o organismo humano por trs vias: a) Por inalao: constitui a principal via de intoxicao. A absoro de gases, vapores, poeiras e aerossis pelos pulmes e a sua distribuio pelo sangue, que os leva s diversas partes do corpo, extremamente facilitada pela elevada superfcie dos alvolos pulmonares. A equivocada cultura de que laboratrios tm naturalmente odor de produtos qumicos com freqncia leva a atitudes negligentes, provocando efeitos crnicos sade, com danos muitas vezes permanentes ou irreversveis. b) Por absoro cutnea: a pele e a gordura protetora so barreiras bastante efetivas, sendo poucas as substncias que podem ser absorvidas em quantidades perigosas. Os efeitos mais comuns da ao de substncias qumicas sobre a pele so as irritaes superficiais e sensibilizaes decorrentes da combinao do contaminante com as protenas. Como decorrncia destes fatos, o agente qumico pode penetrar pela pele, atingindo a corrente sangunea. Neste sentido necessrio especial cuidado quando houver danos integridade da pele feridas expostas devem ser devidamente protegidas. c) Por ingesto: pode ocorrer de forma acidental, ou ao ingerir partculas que estejam retidas no trato respiratrio, resultantes da inalao de ps ou fumos. Os riscos de ingesto por contaminao das mos e alimentos sero inexistentes se houver a devida ateno e higiene no trabalho.

Atitudes Individuais com cidos

1. Adicione sempre o cido gua; nunca faa o inverso. Atitudes Individuais com Solues

1. No transporte solues em recipientes de boca largas, se tiver que efetu-lo por certa distncia, triplique sua ateno durante o percurso e solicite um colega que o acompanhe. 2. No leve a boca a qualquer reagente qumico, nem mesmo o mais diludo. 3. Certifique-se da concentrao e da data de preparao de uma soluo antes de us-la.

4. No pipete, aspirando com a boca, lquidos custicos, venenosos ou corantes, use pra de segurana. 5. No use o mesmo equipamento volumtrico para medir simultneamente solues diferentes. 6. Volumes de solues padronizadas, tiradas dos recipientes de origem e no utilizadas, devem ser descartados e no retornados ao recipiente de origem

. Manuseio e cuidados com frasco de reagentes

1. Leia cuidadosamente o rtulo do frasco antes de utiliz-lo, habitue-se a llo, mais uma vez, ao peg-lo, e novamente antes de us-lo. 2. Ao utilizar uma substncia slida ou lquida dos frascos de reagentes, pegue-o de modo que sua mo proteja o rtulo e incline-o de modo que o fluxo escoe do lado oposto ao rtulo. 3. Muito cuidado com as tampas dos frascos, no permita que ele seja contaminada ou contamine-se. Se necessrio use o auxlio de vidros de relgio, placas de Petri, etc. Para evitar que isso acontea. 4. Ao acondicionar um reagente, certifique-se antes da compatibilidade com o frasco, por exemplo, substncias sensveis luz, no podem ser acondicionadas em embalagens translcidas. 5. No cheire diretamente frascos de nenhum produto qumico, aprenda esta tcnica e passe a utiliz-la de incio, mesmo que o frasco contenha perfume. 6. Os cuidados com o descarte de frascos vazios de reagentes no devem ser menores que os cuidados com o descarte de solues que eles do origem.

Descarte de slidos e lquidos

1. Dever ser efetuado em recipientes apropriados separando-se o descarte de orgnicos de inorgnicos.

Cuidados com aquecimento, includo: reao exotrmica, chama direta, resistncia eltrica e banho-maria.

1. No aquea bruscamente qualquer substncia. 2. Nunca dirija a abertura de tubos de ensaio ou frascos para si ou para outrem durante o aquecimento. 3. No deixe sem o aviso "cuidado material aquecido", equipamento ou vidraria que tenha sido removida de sua fonte de aquecimento, ainda quente e deixado repousar em lugar que possa ser tocado inadvertidamente. 4. No utilize "chama exposta" em locais onde esteja ocorrendo manuseio de solventes volteis, tais como teres, acetona, metanol, etanol, etc. 5. No aquea fora das capelas, substncias que gerem vapores ou fumos txicos.

CUIDADOS

COM

APARELHAGEM,

EQUIPAMENTOS

VIDRARIAS

LABORATORIAIS 1. Antes de iniciar a montagem, inspecione a aparelhagem, certifique-se de que ela esteja completa, intacta e em condies de uso. 2. No utilize material de vidro trincado, quebrado, com arestas cortantes. 3. No seque equipamentos volumtricos utilizando estufas aquecidas ou ar comprimido. 4. No utilizes tubos de vidro, termmetros em rolha, sem antes lubrific-los com vaselina e proteger as mos com luvas apropriadas ou toalha de pano.

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SAIBA COMO AJUDAR A SI MESMO E A OUTROS MEMBROS DO LABORATRIO EM CASO DE EMERGNCIA Memorize os nmero de telefone de segurana. Bombeiros 193 Polcia 190 SAMU 192 Localize onde est o estojo de primeiros socorros No execute nada que voc tenha dvidas, sem antes esclarec-las. Relacionar os produtos qumicos empregados, com danos e seus riscos, sintomas e tratamento especfico. Em caso de acidentes deve-se, mantendo a calma, desligar todos os

equipamentos e materiais prximos, evacuar a rea e no permitir a entrada no laboratrio de pessoas estranhas, enquanto aguarda a chegada de socorro. Algumas providncias imediatas devem ser tomadas: Havendo cortes no profundos, deve-se deixar sangrar um pouco e verificar se ficaram estilhaos de vidro. Lavar com gua corrente e desinfetar com lcool, protegendo o ferimento com gaze esterilizada. Se houver

sangramento ou hemorragia, pressionar o ferimento at cessar. Em caso de acidente com fogo, se as propores no forem grandes, abafase a chama com pano mido. Se alguma roupa pegar fogo nunca correr, e sim rolar no cho ou envolver-se num cobertor. Queimaduras trmicas, provocadas por chamas, gua fervente ou placas quentes devem ser resfriadas com gua e nunca gelo. Recomenda-se um jato fraco de gua levemente morna ou fria, demoradamente, sobre a zona queimada. Para aliviar a ardncia pode ser usado creme de sulfadiazina de prata a 1 %. Encaminhar para atendimento mdico. Em caso de queimadura com cido ou base, lava-se a regio atingida com gua corrente em abundncia para remover todo o reagente. Se o produto cair no vesturio, remov-lo imediatamente. Em seguida se providencia cuidados mdicos.

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Se houver queimaduras qumicas nos olhos, lav-los abundantemente com gua (lava-olhos) e em seguida procurar atendimento mdico. Quando houver inalao de gases, vapores ou poeiras, deve-se afastar a pessoa afetada da rea contaminada e lev-la para outro bem arejado, afrouxar-lhe a roupa e mant-la deitada de lado enquanto aguarda socorro mdico. Nunca dar gua, leite ou qualquer lquido. Se houver ingesto acidental de slidos ou lquidos deve-se levar a pessoa imediatamente a um hospital, cuidando para levar junto a anotao das especificaes da substncia ingerida. Jamais provocar o vmito. Todos os acidentes devem ser imediatamente relatados ao professor responsvel.

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2. PREPARO DE REAGENTES E SOLUES

O preparo das solues e reagentes consiste de uma etapa importante para um experimento bem sucedido. Para isso necessrio verificar as normas tcnicas relacionadas ao preparo de solues, observar os rtulos dos produtos a serem manipulados, averiguar possveis incompatibilidades e condies fsico-qumicas para manipulao e atentar para a concentrao. A validade dos produtos varivel dependendo do local de armazenamento (temperatura, umidade, incidncia de luz, entre outros). Entretanto qualquer modificao no aspecto da soluo se faz prudente descart-la, atentando para as normas de segurana quanto eliminao de resduos. Assim para evitar desperdcios, observamos a rotina do laboratrio e manipulamos um volume de soluo suficiente para, no mximo, um ano de durao. SOLUES Solues so misturas homogneas unifsicas constitudas de duas ou mais substncias miscveis, que no reagem quimicamente entre si. As partculas dispersas so molculas ou ons invisveis a olho nu e ao microscpio. So formados por dois compostos, o soluto e o solvente. O solvente a substncia que dissolve o soluto e o soluto a substncia que est dissolvida no solvente. Nas solues de slido em lquido ou de gs em lquido, o solvente o lquido. Porm, quando a soluo de dois lquidos ou de dois slidos, o solvente o que existe em maior proporo. Soluo Diluda Soluo em que a proporo de soluto numa determinada soluo pequena. O parmetro soluo que apresenta no mximo um dcimo de mol de soluto por litro de soluo. Soluo Concentrada

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Soluo em que a proporo de soluto numa determinada quantidade de soluo grande. O parmetro soluo que apresenta mais de um dcimo de mol de soluto por litro de soluo. Soluo Saturada Soluo saturada a que contm a quantidade mxima possvel de um soluto em uma determinada temperatura e presso, perfeitamente dissolvido no solvente. Coeficiente de Solubilidade Coeficiente de solubilidade a quantidade de soluto necessria para saturar uma quantidade padro de solvente, em determinadas condies de temperatura e presso. A variao do coeficiente de solubilidade em funo da temperatura em um sistema de coordenadas produz uma curva, chamada de curva de solubilidade.

260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

(g de KNO3/ 100 g de gua)

Regi o da s soluoes supersa turadas (instve is)

Regi o da s soluoes no satura da s (ou inst ve is) (e stve is)

20

40

60

80

100

Temperatura (C)

Figura 1: Curva de solubilidade do nitrato de potssio (kno3)

As solues podem ser classificadas segundo o grau de solubilidade: - Soluo insaturada: apresenta quantidade de soluto inferior ao coeficiente de solubilidade nessa temperatura. - Soluo saturada: apresenta quantidade de soluto dissolvido exatamente igual ao coeficiente de solubilidade nessa temperatura. Pode ou no conter precipitado.

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- Soluo supersaturada: apresenta quantidade de soluto dissolvido superior ao coeficiente de solubilidade nessa temperatura. uma soluo instvel. UNIDADES DE CONCENTRAO Concentrao comum a relao entre a massa do soluto, em gramas, e o volume da soluo, em litro.
C= Massa do soluto Volume da soluo

Densidade da soluo a relao entre a massa, em gramas, e o volume da soluo, em centmetros cbicos.
D= Massa da soluo Volume da soluo

Ttulo a relao entre a massa do soluto e a massa da soluo, ambos na mesma unidade.
= Massa do soluto Massa da soluo

Ttulo em volume a relao entre o volume de soluto e o volume de soluo, ambos na mesma unidade.
v= Volume do soluto Volume da soluo

Molaridade ou Concentrao em Quantidade de Matria a relao entre a quantidade de matria, nmero de mol, do soluto e o volume da soluo em litros.
M= Nmero de mol do soluto Volume da soluo

Frao Molar relao entre o nmero de mol do soluto ou o nmero de mol do solvente com o nmero de mol da soluo.
X= Nmero de mol do soluto/ sol e!te Nmero de mol da soluo

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Molalidade a relao entre a quantidade de matria em nmero de mol absoluto e a massa do solvente em quilogramas.
M= Nmero de mol do soluto Massa da soluo

Normalidade a relao entre o nmero de equivalente-grama do soluto dissolvido e o volume da soluo em litros.

N= Nmero de e"u# ale!te$%rama de soluto Volume da soluo

Obs.: O equivalente-grama de um elemento qumico a relao entre tomograma e sua valncia no composto considerado. Equivalente-grama de um cido a relao entre o mol do cido e o nmero de hidrognios cidos ou ionizveis. Equivalente-grama de uma base a relao entre o mol da base e o nmero de hidroxilas. Equivalente-grama de um sal a relao entre o mol do sal e valncia total do ction ou nion. Equivalente-grama de um oxidante ou redutor a relao entre o mol da substncia e o nmero total de eltrons cedidos ou recebidos pela molcula. REAGENTES E SOLUES DE TRABALHO

SOLUO DE GLICOSE A 1% Soluto: glicose (C6H12O6). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Pesar 1g de Glicose e completar com gua destilada para 100mL, homogeneizando bem. Condies de armazenamento: manter em geladeira. Prazo de validade: aproximadamente 2 meses.

SOLUO DE FRUTOSE A 1% Soluto: frutose (C6H12O6). Solvente: gua destilada (H2O).

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Procedimento: Mea em uma proveta 1mL de Frutose. Transferir para um bquer, lavando vrias vezes a proveta. Completar com gua destilada para 100mL, homogeneizando bem. Condies de armazenamento: manter em geladeira. Prazo de validade: aproximadamente 2 meses.

SOLUO DE SACAROSE A 1% Soluto: sacarose (C12H22O11). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Pesar 1g de Sacarose e completar com gua destilada para 100mL, homogeneizando bem. Condies de armazenamento: manter em geladeira. Prazo de validade: devido sua instabilidade deve ser preparada pouco antes da realizao dos experimentos.

SOLUO ALCOLICA DE KOH 5% Soluto: Hidrxido de Potssio (KOH). Solvente: lcool etlico (C2H6O). Procedimento: Dissolver 5g de Hidrxido de Potssio (KOH) em lcool etlico e completar o volume para 100mL. Condies de armazenamento: manter a temperatura ambiente em frasco emtico. Prazo de validade: aproximadamente 6 meses.

SOLUO DE NaOH (HIDRXIDO DE SDIO) 2N Soluto: Hidrxido de Sdio (NaOH). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver cerca de 8 a 9g de NaOH puro em gua e completar ao volume de 100mL com gua destilada, ou: diluir 33mL de NaOH 6N com gua e completar o volume para 100mL. Obs.: Imediatamente aps a pesagem do NaOH, cubra-o com filme plstico. Substncia muito higroscpica. Condies de armazenamento: manter temperatura ambiente em frasco emtico. Prazo de validade: soluo estvel indefinidamente.

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SOLUO DE NaOH (HIDRXIDO DE SDIO) 10% Soluto: Hidrxido de Sdio (NaOH). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Pesar 10g de NaOH e dissolver em 70mL de gua destilada. Completar o volume para 100mL, homogeneizando bem. Obs.: Imediatamente aps a pesagem do NaOH, cubra-o com filme plstico. Substncia muito higroscpica. Condies de armazenamento: manter temperatura ambiente em frasco emtico. Prazo de validade: soluo estvel indefinidamente.

SOLUO DE ACETATO DE CHUMBO A 1% Soluto: Acetato de Chumbo (C4H6O4Pb). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver 1g de Acetato de Chumbo em gua destilada e completar o volume para 100mL. Condies de armazenamento: manter temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: aproximadamente um ano.

SOLUO DE CLORETO DE CLCIO A 5% Soluto: Cloreto de Clcio (CaCl2). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver 5g de Cloreto de Clcio em gua e completar o volume a 100mL. Condies de armazenamento: manter temperatura ambiente em frasco emtico. Prazo de validade: aproximadamente um ano.

SOLUO DE CIDO CLORDRICO (HCl) 1:2 Soluto: cido Clordrico (HCl). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Adiciona-se 100mL de cido Clordrico em 100mL de gua. Condies de armazenamento: manter temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: esta soluo estvel indefinidamente.
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SOLUO DE CIDO ACTICO 1:2 Soluto: cido actico (CH3COOH). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Diluem-se 100mL de cido actico glacial com gua destilada para 200mL. Condies de armazenamento: manter a temperatura ambiente em frasco emtico. Prazo de validade: esta soluo estvel indefinidamente.

SOLUO ALCOLICA DE PIRAMIDO A 5% Soluto: Piramido (C21H29N3O). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver 5g de Piramido em lcool etlico, completando o volume para 100mL. Condies de armazenamento: manter a temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: aproximadamente 6 meses.

SOLUO DE CIDO SULFOSALICLICO A 20% Soluto: cido Sulfosaliclico. Solvente: lcool etlico (C2H6O). Procedimento: Dissolver 20g de cido Sulfosaliclico em gua destilada e completar o volume para 100mL. Condies de armazenamento: manter a temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: esta soluo estvel indefinidamente.

SOLUO DE CIDO TRICLOROACTICO A 20% Soluto: cido Tricloroactico (CCl3COOH). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Diluem-se 20mL de cido Tricloroactico com gua destilada at 100mL.

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Condies de armazenamento: manter a temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: Esta soluo estvel indefinidamente.

SOLUO DE OVOALBUMINA A 10% Soluto: clara de ovo. Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Adiciona-se 50mL de gua destilada em 10mL de clara de ovo fresco, completa-se o volume para 100mL, em seguida homogeneizando bem. Condies de armazenamento: acondicionada em geladeira. Prazo de validade: Esta soluo deve ser preparada no momento do uso.

SOLUO DE TUNGSTATO DE SDIO A 10% Soluto: Tungstato de Sdio (Na2WO4). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver 10g de Tungstato de Sdio em gua destilada e completar o volume para 100mL. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.

SOLUO CLOROFRMICA DE COLESTEROL Soluto: Colesterol (C27 H46O). Solvente: clorofrmio (CHCl3). Procedimento: Diluir 0,5g de Colesterol em 50mL de clorofrmio. Condies de armazenamento: Diluir 0,5g de Colesterol em 50mL de clorofrmio. Prazo de validade: aproximadamente 1 dia.

SOLUO DE VERMELHO DE FENOL A 4% Soluto: Vermelho de Fenol (C19H14O5S). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver 4g Vermelho de Fenol em gua destilada e completar o volume para 100ml.

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Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.

REAGENTE DE MILLON Soluto: cido ntrico (HNO3) e mercrio (Hg). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Adiciona-se 40mL de cido ntrico concentrado frio em 20g de cido ntrico , deixa-se dissolver por aquecimento e dilui-se com gua duas vezes em volume. Deixa-se decantar durante 24 horas e usa-se a soluo superficial. Para recuperar a eficincia desta soluo, adicionam-se diversas gotas de soluo aquosa de NaNO2 a 1% ou KNO2 a 1%. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco e emtico. Prazo de validade: aproximadamente 6 meses. SOLUO DE -NAFTOL Soluto: -Naftol (C10H8O). Solvente: lcool etlico (CH3CH2OH). Procedimento: Pesar 5g de -Naftol e completar com lcool etlico para 100mL. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: aproximadamente 6 meses.

REAGENTE DE LUGOL Soluto: Iodato de Potssio (KIO3). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Pesar 5g de Iodo e 10g de Iodato de Potssio. Misturar em 60mL de gua destilada, em seguida completar o volume para 100mL, homogeneizando bem. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.

SOLUO DE LUGOL A 1% Soluto: Reagente de Lugol.

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Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Diluir 1mL do reagente de Lugol em 100mL de gua destilada. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.

SOLUO DE AMIDO A 1% Soluto: amido (C6H10O5)n. Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Misturar 2g de amido com 20mL de gua destilada. Derramar a pasta lentamente, agitando em um bquer com 200mL de gua fervente. Cessar a ebulio e deixar esfriar e sedimentar. Separar, por decantao, aspirao ou centrifugao a parte sobrenadante sem grumos. Para maior estabilidade da soluo, convm adicionar 1% de cido saliclico. Condies de armazenamento: Preparar um dia antes do experimento e manter na geladeira em frasco emtico. Prazo de validade: aproximadamente 6 meses.

REATIVO DE BENEDICT Solutos: citrato de sdio (Na3C6H5O7), carbonato de sdio anidro (Na2CO3) e sulfato de cobre (CuSO4) cristalizado. Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver 85g de citrato de sdio e 50g de carbonato de sdio anidro em cerca de 350mL de gua quente. Dissolver parte, em 50mL de gua quente, 0,5g de sulfato de cobre cristalizado. Transferir lentamente, com agitao constante, a soluo cprica para a primeira. Completar o volume para 500mL com gua destilada, e filtrar se necessrio. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco emtico. Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.

REATIVO DE FEHLING SOLUO A Soluto: sulfato de cprico (CuSO4).

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Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver 34,64g de sulfato de cobre cristalizado em 300mL de gua quente. Completar o volume para 500mL. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco emtico de vidro. Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.

SOLUO B Soluto: Hidrxido de Potssio (KOH) e Tartarato duplo de sdio e potssio (KNaC4H4O64H2O). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver 125g de Hidrxido de Potssio e 173g de Tartarato duplo de sdio e potssio em 400mL de gua destilada. Completar o volume para 500mL. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco emtico de polietileno. Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.

REAGENTE DE SELIWANOFF Soluto: Resorcinol (C6H4(OH)2) Solvente: cido clordrico (HCl). Procedimento: Dissolver 0,05g de Resorcinol em 100mL de HCl diludo (na proporo 1:2). Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco mbar e emtico. Prazo de validade: aproximadamente de 1 ano.

REAGENTE DO BIURETO Solutos: sulfato cprico (CuSO4), hidrxido de sdio (NaOH) e tartarato de sdio e potssio (KNaC4H4O64H2O). Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Dissolver 150mg de sulfato cprico em 50mL de gua quente. Misturar esta soluo com 30mL de soluo de NaOH a 10% e 600mg de tartarato de sdio e potssio. Completar o volume com gua destilada para 100mL.

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Condies de armazenamento: Armazenar em frasco de polietileno e ao abrigo da luz direta. Prazo de validade: Este reativo estvel indefinidamente, porm deve ser desprezado caso aparecer precipitado escuro.

SOLUO DE UREASE A 1% Soluto: urease Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Pesar 0,1g de urease e completar com gua destilada para 10mL, homogeneizando bem. Condies de armazenamento: Manter na geladeira em frasco emtico e mbar. Prazo de validade: aproximadamente 2 meses.

SOLUO DE FENOL SATURADO EM GUA Soluto: fenol (C6H5OH) Solvente: gua destilada (H2O). Procedimento: Pesar 100g de fenol e adicionar 39,5mL de gua destilada, homogeneizar bem. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco emtico. Prazo de validade: aproximadamente 1 ano.

SOLUO DE NINHIDRINA Soluto: ninhidrina (C9H6O4). Solvente: acetona (C3H6O). Procedimento: Pesar 0,2g de ninhidrina e diluir em 100mL de acetona, homogeneizar e acondicionar em frasco emtico. Condies de armazenamento: Manter a temperatura ambiente em frasco emtico. Prazo de validade: aproximadamente 1 dia.

EXERCCIOS 1- Cada litro de gua do mar possui cerca de 3,5g de cloreto de sdio (NaCl), ou seja C = 3,5
g /L.

Qual o volume de gua do mar necessrio ser evaporado para ter-se 700g

de sal?

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2- Uma soluo de sacarose (acar comum) possui concentrao C = 90,0 g/L. Quanto de acar existir em uma garrafa de 330 mL (miliLitros, ou 0,330L)? 3- Quantos mols existem um 0,4L de soluo Na2S 1,5M? 4 - Qual o volume de soluo AlCl3 0,8M necessrio para conter 2,0 mols deste sal? 5 - Quantas gramas de Na2CO3 existem em 0,8L deste sal, da concentrao M = 2,5 mol/L? (dados 23Na, 32C, 16O) RESULTADOS 1- Resoluo: 3,5 g/1,0L = 700g/(x)L 3,5g (x)L = 700g 1,0L ou seja, x = 200 L de gua do mar. 2- Resoluo: 90,0 g/1,0L = (x)g/(x)0,330L 90,0g 0,330L = (x)g 1,0L ou seja, x = 29,7g de acar. 3- Resoluo: M = 1,5 mol/1,0L = (x)mol/0,4L onde 1,0L (x)mol = 1,5mol 0,4L x = 0,6 mol deste cido. 4 - Resoluo: M = 0,8 mol/1,0L = 2mol/(x)L onde 0,8mol (x)mol = 2,0mol 1,0L x = 0,25 litros desta soluo. 5 - Resoluo: Primeiro achamos quantos mols existem em 0,8 litros desta soluo M = 2,5 mol/1,0L = (x)mol/0,8L onde 1,0L (x)mol = 2,5mol 0,8L x = 2,0 mol deste cido. Depois transformamos estes 2,0 mols em gramas, pois 1 mol de Na2CO3 = 106 gramas 106g 0,8 mol = 84,8 gramas de Na2CO3

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3. CARACTERIZAO DE CARBOIDRATOS O termo carboidrato denota hidratos de carbono, designao oriunda da formula geral (CH2O)n sendo substncias orgnicas constitudas por carbono, hidrognio e oxignio. Esses dois ltimos elementos, na maioria dos casos, esto presentes nos carboidratos na mesma proporo que na gua. Quimicamente so representados como poliidroxi-aldedos ou poliidroxi-cetonas ou substncias que liberam tais grupos por hidrlise. Estes grupos conferem aos carboidratos a capacidade de participar de vrias reaes como oxidao, reduo, esterificao, isomerizao e capacidade de formar ligaes glicosdicas. Algumas dessas reaes envolvem a formao de complexos corados, e a especificidade da identificao depende da estrutura dos carboidratos.

1. Teste de Molisch (reao geral para carboidratos) a) Fundamentao terica: Os monossacardeos mais importantes so formados por cinco ou seis tomos de carbono (pentoses e hexoses respectivamente). Por serem molculas muito ricas em grupamentos hidroxila (-OH), os monossacardeos podem ser facilmente desidratados por ao de cidos fortes concentrados como, o cido sulfrico (H2SO4). O cido rompe facilmente as ligaes glicosdicas presentes em molculas de polissacardeos, quebrando-os e fornecendo seus monossacardeos. Esses, por sua vez, so desidratados e podemos ter como produto: o furfural, quando o monossacardeo desidratado for uma pentose, e o hidroximetilfurfural (HMF), quando for uma hexose. Tanto o furfural quanto o HMF so substncias incolores, impedindo que a reao seja visualizada. Para resolver esse problema, adiciona-se um composto fenlico

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ao meio (alfa-naftol, conhecido como reativo de Molisch). O fenol reage com os produtos, incolores e provoca o aparecimento de um anel de colorao lils. A reao que ocorre a seguinte:
O O C5H10O 5
+

H2SO 4

H $!a&tol

Composto violeta

furfural
O HOH2C C6H12O 6
+

C H $!a&tol

H2SO4

Composto violeta

b) Objetivo: analisadas.

Evidenciar a presena de hidroximetilfurfural

monossacardeos

nas

amostras

c) Materiais: Vidrarias: 4 pipetas de vidro de 5mL 1 pipeta de vidro de 1mL 3 Tubos de ensaio Reagentes: Soluo alcolica de alfa-naftol a 5% cido Sulfrico concentrado Soluo de Glicose 1% Soluo de Frutose 1% Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Papel Toalha Descarte para pipetas Frasco com gua destilada d) Procedimento:

Identificar os tubos de ensaio como Glicose (Tubo 1), Frutose (Tubo 2) e gua (Tubo 3). Pipetar para primeiro tubo 2mL de glicose, ao segundo 2mL de frutose e

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ao terceiro 2mL de gua destilada, que vai servir como um controle negativo. Acrescentar 5 gotas da soluo de alfa-naftol e agitar. Pipetar cuidadosamente 2 mL de cido sulfrico concentrado com o tubo inclinado, deixando escorrer pelas paredes do tubo sem agitar.

e) Resultado esperado:

Tubo 1 (Glicose): Ocorre a formao de um anel vermelho na interface da reao indicando resultado positivo. Tubo 2 (Frutose): Ocorre a formao de um anel vermelho na interface da reao indicando resultado positivo. Tubo 3 (gua): No h formao de anel na interface indicando resultado negativo.

Glicose f) Resultado obtido:

Frutose

gua destilada

Tubo1: _____________________________________________ Tubo 2: _____________________________________________ Tubo 3: _____________________________________________

2. Reao de Seliwanoff (Reao para distino entre aldoses e cetoses) a) Fundamentao terica: Este teste permite diferenciar aldoses de cetoses que, sob ao de cidos fortes, so transformadas em derivados de furfural que se condensam com o resorcinol, presente no reativo de seliwanoff formando um produto vermelho de composio incerta. A reao com cetoses rpida e mais intensa pela maior facilidade de

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formao do derivado furfural. Logo, a frutose e o mel de abelha, por conter frutose reagem positivamente. A reao que ocorre a seguinte :
*"ue)#me!to

O
Furfural

O H

Cetose ' HCl

(esor)#!ol
Composto violeta

b) Objetivos: Identificar a presena de cetoses presentes nas solues pela reao de Seliwanoff.

c) Materiais: Vidrarias: 1 pipeta de vidro de 5mL 4 pipetas de vidro de 1mL 3 Tubos de ensaio Reagentes: Reagente de Seliwanoff cido Clordrico concentrado Soluo de Glicose 1% Soluo de Frutose 1% Mel de abelha Equipamentos: Banho-Maria Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Pina Papel Toalha Descarte para pipetas Frasco com gua destilada d) Procedimentos:
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Identificar os tubos de ensaio como Glicose (Tubo 1), Frutose ou mel de abelha (Tubo 2) e gua (Tubo 3). Pipetar para o primeiro tubo 1mL de glicose, ao segundo 1mL de frutose ou mel de abelha e ao terceiro 1mL de gua destilada, que vai servir como um controle negativo, com pipetas de 1mL. Adicionar em todos os tubos de ensaio 1,5mL de cido clordrico e 0,5mL de reativo de Seliwanoff*. Agitar cuidadosamente. Deixar em banho-maria fervente at completar a reao. Observar. e) Resultado esperado:

Tubo 1 (Glicose): No h mudana do reativo indicando resultado negativo. Tubo 2 (Frutose): Ocorre a formao de uma soluo vermelha indicando resultado positivo. Tubo 3 (gua): No h mudana do reativo, indicando resultado negativo.

Glicose

Frutose

gua destilada

f) Resultado Obtido: Tubo1:______________________________________________ Tubo 2: _____________________________________________ Tubo 3: _____________________________________________

3. Reao de Benedict (Identificao de Acares Redutores)

a) Fundamentao terica:

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Reao para identificar carboidratos redutores. Nas estruturas cclicas dos monossacardeos os tomos de carbono anomricos(C1 nas aldoses e C2 nas cetoses) so susceptveis de oxidao por vrios agentes oxidantes contendo ons cpricos (Cu2+) devido a presena de grupos aldeidos ou cetonas livres ou potencialmente livres. Na reao de Benedict os ons cpricos so reduzidos pela carbolina dos carboidratos a ons cuprosos formando xido cuproso que tem cor vermelho tijolo. Tal princpio til na anlise de acares e, por muitos anos, foi utilizado na determinao dos nveis sanguneos de glicose no sangue e na urina como diagnstico da diabetes melito. Atualmente, h testes mais sensveis para dosagem rpida da glicose, baseadas em ensaios enzimtico (glicofita/glicose-oxidase) e que so muito mais prticos, por no exigirem a disponibilidade dos reagentes mencionados. A reao que ocorre a seguinte: Ausncia de composto redutor: Meio alcalino Cu(OH)2 (azul) Aquecimento CuO (preto) + H2O

Presena de composto redutor: Meio Alcalino Cu (OH)2 (azul) Aquecimento Cu2O (amarelo/vermelho) + H2O

b) Objetivos: caracterizar a presena de aucares redutores atravs da reao de Benedict em solues de carboidrato.

c) Materiais: Vidrarias: 1 pipeta de vidro de 5mL 3 pipetas de vidro de 1mL 3 Tubos de ensaio
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Reagentes: Reagente de Benedict Soluo de Glicose 1% Soluo de Sacarose 1% Equipamentos: Banho-Maria Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Pina Papel Toalha Descarte para pipetas Frasco com gua destilada d) Procedimento

Identificar os tubos de ensaio como Glicose (Tubo 1), Sacarose (Tubo 2) e gua (Tubo 3). Pipetar, com auxlio da pipeta de 5mL, para os trs tubos de ensaio 5mL do reativo de Benedict. Acrescentar ao primeiro tubo 5mL de glicose, ao segundo 5mL de sacarose e ao terceiro 5mL de gua destilada, que vai servir como um controle negativo, com pipetas de 5mL. Agitar at completa homogeneizao. Deixar em banhomaria fervente por cinco minutos. Observar a reao.

e) Resultado esperado:

Tubo 1 (Glicose): A presena de um precipitado vermelho tijolo ou soluo amareloesverdeada indica a reduo do cobre, possibilitando um resultado positivo. Tubo 2 (Sacarose): No h mudana do reativo, a cor permanece azul, indicando resultado negativo. Tubo 3 (gua): No h mudana do reativo, a cor permanece azul, indicando resultado negativo.

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Glicose

Sacarose

gua destilada

f) Resultado obtido: Tubo1:______________________________________________ Tubo 2: _____________________________________________ Tubo 3: _____________________________________________ 5. Reao do Lugol (Identificao de Polissacardeos)

a) Fundamentao terica:

O iodo metlico presente no lugol forma complexos com a cadeia de alfaamilose do amido que um polissacardeo formado um composto de cor roxo a azulado.

b) Objetivo: Identificar a presena do amido pela formao de complexos com iodo presente no reativo de lugol.

c) Material: Vidrarias: 2 pipetas de vidro de 1mL 2 Tubos de ensaio Reagentes: Lugol Soluo de amido 1% Acessrios:
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 Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Papel Toalha Descarte para pipetas Frasco com gua destilada

d) Procedimento:

Em um tubo de ensaio identificado colocar 1 mL de soluo de amido e em outro 1 mL de gua destilada. Adicionar 5 gotas de lugol e observar os resultados

e) Resultado esperado:

Tubo 1 (Amido): Mudana de cor da soluo transparente ou leitosa para uma cor azul intensa, resultado positivo. Tubo 2 (gua destilada): No h mudana de cor da soluo, reao negativa.

Amido f) Resultado obtido:

gua destilada

Tubo1: ______________________________________________ Tubo 2: _____________________________________________

PESQUISA 1. Qual o princpio da reao de Molish e o que acontece quando a mesma aplicada a um monossacardeo?

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2. Na reao de Benedict carbonos anomricos so susceptveis de oxidao por vrios agentes oxidantes contendo ons cpricos isso devido a presena de quais grupos livres?

3. O princpio que utilizado na reao de Benedict foi por muito tempo um mtodo que permitia analisar aucares a nveis sanguneos contribuindo para determinao do diabetes melitos. Explique o princpio que utilizado na reao de Benedict que permite a analise dos aucares?

4. Qual reao que permite diferenciar aldoses e cetoses ?

5. Em que consiste a reao de lugol? 4. CARACTERIZAO DE LIPDIOS

Os Lipdeos so substncias orgnicas hidrofbicas que podem ser extrados de clulas e tecidos por solventes no polares como clorofrmio e ter. Fazem parte as gorduras, leos, ceras, esterides e outros. Em contato com a gua, alguns lipdeos podem vir a formar micelas, devido ao fato de possurem carter anfiptico, ou seja, um grupo carboxila em uma de suas extremidades, o que confere certo grau de hidrofilia molcula de lipdeo, e um grupo apolar na outra.

1. MANCHA CARACTERSTICA EM PAPEL DE FILTRO

a) Fundamentao terica Os lipdios so substncias capazes de em contato com as fibras do papel formar uma mancha que no se desfaz, deixando um aspecto transparente.

b) Objetivo: Observar a formao de uma mancha no papel de filtro caracterstico dos lipdios.

c) Material Vidrarias:

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2 pipetas de vidro de 1mL

Reagentes: leo vegetal

Acessrios: Papel de filtro

gua destilada

d) Procedimento Pipetar para o centro do primeiro papel de filtro 0,5 ml de gua, e para o centro do outro 0,5 ml de leo. Espere secar 20 mim e observe.

e) Resultado Esperado Formao de uma mancha translcida caracterstica da presena de lipdeos permanece no papel de filtro. O aluno pode ler o roteiro da aula pratica atravs do papel de filtro

f) Resultado Obtido __________________________________________________________________ _________________________________________________________________

2. SOLUBILIDADE DOS LIPDIOS

a) Fundamentao Terica Devido a natureza apolar, os lipdios apresentam baixa solubilidade em gua e boa solubilidade em solventes orgnicos. b) Objetivo : verificar a solubilidade dos lipdeos nos mais variados tipos de solventes.

c) Materiais Vidrarias: 5 pipetas de vidro de 1mL 5 Tubos de ensaio

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Reagentes: cido Clordrico 0,1N Hidrxido de Sdio 0,1N Etanol ter etlico

Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Papel Toalha

d) Procedimento: Colocar em tubos de ensaio os respectivos reagentes: Tubo 1: 3ml de gua destilada Tubo 2: 3ml de cido cloridrico 0,1N Tubo 3: 3ml de hidroxido de sdio 0,1N Tubo 4: 3ml de etanol Tubo 5: 3ml de eter etlico Adicionar em cada tubo 1ml de leo de soja, e observar. Colocar 2ml de ter etlico em dois tubos de ensaio. Adicionas a cada tubo duas gotas de NaOH 0,1N, e uma gota de fenolftaleina. Observar. No primeiro tubo adicionar leo ranoso gota a gota at descorar. Contar o nmero de gotas adicionadas. No segundo tubo adicionar o mesmo nmero de gotas da experincia anterior e observar os resultados. e) Resultado Esperado: o leo apresentar solubilidade no tudo 5, baixa no tubo 4 e insolvel nos 1, 2 e 3.

f) Resultado obtido __________________________________________________________________ _________________________________________________________________

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3. REAO DE SAPONIFICAO a) Fundamentao terica: Os lipdios podem ser caracterizados pelas suas caractersticas fsico-qumicas. Em geral so insolveis na gua e solveis em solventes apolares. Os triglicerois, na presena de bases, podem ser hidrolisados liberando glicerol e sais de cido graxos (sabes), de acordo com a reao:.

Glicerol

Sais de cido Graxo

Triacilglicerol Os sais de cidos graxos apresentam uma caracterstica anfiptica onde em soluo aquosa diminuem a tenso superficial da gua formando espuma sob agitao.

b) Objetivos: realizar a hidrlise alcalina dos triglicerdeos presentes no leo.

c) Materiais Vidrarias: 4 pipeta de vidro de 5mL 2 pipetas de vidro de 1mL 3 Tubos de ensaio

Reagentes: leo de soja ou de girassol Soluo etanlica de hidrxido de potssio 5% Soluo de Cloreto de clcio 10%

Equipamentos:

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Banho-Maria

Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Pina Termmetro Cronmetro Papel Toalha Descarte para pipetas Frasco com gua destilada

d) Procedimento Pipetar para um tubo de ensaio rotulado 2 mL de leo e 5mL da soluo de potassa alcolica. Aquecer no banho-maria fervente durante cinco minutos. A reao de hidrlise alcalina estar completa quando o tubo de ensaio apresentar uma fase. Pipetar para o tubo de ensaio rotulado (tubo 1) 1mL de gua e 2 mL da soluo de sabo. Agitar vigorosamente e observar. Pipetar para outro tubo de ensaio rotulado (tubo 2) 2 mL da soluo de sabo. Adicionar 5 gotas da soluo de cloreto de clcio. Agitar bem e observar.

e) Resultado esperado Tubo 1: Formao de espuma indica a presena de sais de cidos graxos Tubo 2: formao de precipitado indica a presena de sabes de clcio que no formam espuma

f) Resultado obtido Tubo 1: _________________________________________ Tubo 2: _________________________________________

4. DETECO DE COLESTEROL (MTODO DE SALKOWISKI)

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a) Fundamentao terica: O colesterol apresenta em sua estrutura o anel ciclopentanoperidro fenantreno, representado por quatro anis fundidos (A,B,C e D), apresenta uma funo alcolica na posio do carbono 3 do anel A, uma insaturao entra os carbonos 5 e 6 do anel B e uma cadeia alquila no carbono 17 do anel D. Embora as propriedades de solubilidade sejam anlogas as dos lipdios, os esteroides como o colesterol possuem estrutura e propriedades qumicas diferentes, podendo ser diferenciado atravs de reaes de colorao especfica. A reao de Salkowiski especfica para esteride contendo dupla ligao na molcula, ocorrendo desidratao na insaturao formando um composto colorido. b) Objetivo: Caracterizar a presena do colesterol pela reao de Salkowiski. c) Materiais Vidrarias: 2 pipetas de vidro de 1mL 1 Tubo de ensaio

Reagentes: Soluo Clorofrmica de colesterol cido Sulfrico concentrado

Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento: Em um tubo de ensaio identificado pipetar 1mL da soluo cloroformica de colesterol e adicionar 1mL de cido sulfrico concentrado, cuidadosamente pela parede. e) Resultado esperado

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Tubo 1: reao positiva com a formao de compostos de vermelho amarronzada.

Colesterol f) Resultado obtido Tubo 1: _______________________________________________

PESQUISA 1. Quais as caractersticas qumicas e estruturais dos lipdios e como eles se classificam? 2. Quais as funes biolgicas desempenhadas pelos lipdios na clula? 3. Explique a baixa solubilidade dos lipdios em solventes polares: 4. Descreva como ocorre o transito de lipidios pela corrente sangunea?

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5. CARACTERIZAO DE AMINOCIDOS E PROTENAS Todas as protenas existentes nos seres vivos, desde os vrus at os seres humanos, so constitudas por combinaes de apenas vinte aminocidos. Esses blocos constituintes da vida se unem entre si, como contas de um colar, para formar longas cadeias e molculas complexas que configuram a estrutura de todos os organismos vivos. O aminocido um composto orgnico que apresenta, em sua molcula, um grupo cido (-COOH) e um grupo amino (-NH2), alm de um radical -R, que vai ser responsvel pela diferenciao entre os diversos tipos de aminocidos existentes. As protenas podem ser caracterizadas e diferenciadas por propriedades especficas como a carga eltrica, massa molar, solubilidade e afinidade por certos compostos de carter sinttico ou natural. Alm disso podem tambm ser caracterizadas por reaes de precipitao e/ou colorao. Todas as reaes desenvolvidas baseiam-se na presena de ligaes peptdicas e tambm na presena de diferentes aminocidos, evidenciadas pela afinidade especfica que essas molculas possuem a certos compostos.

1. REAO DE BIURETO a) Fundamentao terica: Est reao especfica para substncias que possuem pelo menos dois grupos CO-NH unidos por carbono ou nitrognio como ocorre no biureto, que empresta o seu nome para a reao. Biureto o nome dado estrutura originada a partir da

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decomposio da uria, quando esta submetida a uma temperatura de, aproximadamente, 180oC:

As protenas e seus produtos de hidrlise que contm duas ou mais ligaes peptdicas do resultado positivo neste teste. A reao tambm positiva para as substncias que contm 2 grupos carbamnicos (-CO-NH2) ligados diretamente ou atravs de um nico tomo de carbono ou nitrognio. Esta uma reao geral para protenas. Esse fenmeno deve-se formao de um complexo entre o on Cu2+, presente no reativo, e os tomos de nitrognio presentes na molcula:

Figura 2: Representao da reao do on cobre com os grupos polarizados presente nos resduos de aminocidos

b) Objetivo: Identificar a presena de peptdios na amostra atravs do reativo de biureto.

c) Materiais Vidrarias: 1 pipeta de vidro de 5mL 2 pipetas de vidro de 1mL

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 Reagentes: Acessrios:

2 Tubos de ensaio

Reativo de Biureto Soluo de ovoalbumina 10%

Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Papel Toalha Descarte para pipetas

Frasco com gua destilada

d) Procedimento

Colocar 2 mL de reativo de biureto em dois tubos de ensaio. Ao primeiro juntar 1 mL de ovoalbumina e no segundo 1 mL de gua destilada. Agitar e observar a reao. e) Resultado esperado

Tubo 1 (ovoalbumina): formao de colorao violcea indicando positivo para protena Tubo 2 (gua destilada): No h mudana de cor, indicando reao negativa

Ovoalbumina

gua destilada

f) Resultado obtido: Tubo1: ______________________________________________

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Tubo 2: _____________________________________________

2. REAO XANTOPROTICA a) Fundamentao terica Os aminocidos so identificados pela presena de seus radicais que podem ser de cadeia aliftica ou cclica. Esta reao acontece devido presena nas protenas do grupamento fenil da tirosina e triptofano, com qual o cido ntrico forma nitroderivados que so coloridos no meio alcalino. uma reao especfica para identificao dos aminocidos tirosina e triptofano.

b) Objetivo: evidenciar a presena de resduos de tirosina e triptofano na soluo de ovoalbumina testada.

c) Materiais Vidrarias: 1 pipeta de vidro de 5mL 2 pipetas de vidro de 1mL 1 Tubo de ensaio

Reagentes: cido Ntrico concentrado Hidrxido de sdio 2N Soluo de ovoalbumina 10%

Equipamentos: Banho-Maria

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Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Pina Termmetro Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento Pipetar para um tubo de ensaio 1 mL de ovoalbumina, adicionar 10 gotas de cido ntrico e aquecer at ferver. Acrescentar 4 mL da soluo de hidrxido de sdio. Observar a reao.

e) Resultado esperado Reao positiva quando h a formao de uma soluo amarelada.

Aquecimento NaOH

Ovoalbumina

f) Resultado obtido Tubo1: ______________________________________________ Tubo 2: _____________________________________________

3. REAO DE MILLON a) Fundamentao terica

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Quando se aquece um composto que contm tirosina com o reativo de Millon, observa-se a formao de um produto colorido avermelhado. Explicado pela formao de um fenolato de mercrio por reao ao grupo hidroxifenil da tirosina com o mercrio do reativo. b) Objetivo: identificar a presena de tirosina, atravs do reativo de Millon, na soluo amostra. c) Materiais Vidrarias: 2 pipetas de vidro de 1mL 1 Tubo de ensaio

Reagentes: Reativo de Millon Soluo de ovoalbumina 10%

Equipamentos: Banho-Maria

Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Pina Termmetro Cronmetro Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimentos Pipetar para um tubo de ensaio 1 mL de ovoalbumina e acrescentar 5 gotas do reativo de Millon. Aquecer em Banho-Maria por 10 minutos e observar a reao. e) Resultado esperado

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Tubo 1 (Ovoalbumina): a soluo adquire colorao vermelha roxa, indicando positividade da reao.

Aquecimento

Ovoalbumina

f) Resultado obtido Tubo1: ______________________________________________ Tubo 2: _____________________________________________ PESQUISA 1) Em que se baseia a reao do biureto? 2) Em que se fundamenta a reao xantoprotica e que grupos de aminocidos so responsveis por esta reao? 3) Que aminocido pode ser identificado pela reao de Millon e de que forma isto acontece? 4) O que proteinria? 5) Qual significado e importncia da deteco da protena de Bence-Jones em urina de indivduos?

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6. CARACTERIZAO DOS CIDOS NUCLICOS

Os

cidos

nuclicos

so

macromolculas

polimricas

constitudas

de

subunidades nucleotdicas unidas por ligaes fosfodister, responsveis pelo armazenamento e expresso da informao gentica. Existem dois tipos de cidos nuclicos: cido desoxirribonuclico (DNA) e cdo ribonuclico (RNA).

Cada nucleotdeo formado pela unio de uma base nitrogenada, um acar e um fosfato. As bases nitrogenadas podem ser de dois tipos: purinas (adenina ou guanina) e pirimidinas (citosina, timina ou uracila). O acar pode ser a desoxirribose, que caracteriza a molcula de DNA, ou a ribose, encontrada nas molculas de RNA (Fig.1).

Figura 3: Desenho esquemtico da estrutura dos nucleotdios

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No genoma humano so encontrados 46 cromossomos, cada um formado por uma molcula de DNA. O DNA uma longa molcula helicoidal constituda de dois filamentos de nucleotdeos enrolados de forma helicoidal. Os dois filamentos so unidos por pontes de hidrignio que se estabelecem entre as bases nitrogenadas, obedecendo ao seguinte pareamento: uma adenina se liga a uma timina por duas pontes de hidrognio (A=T); uma citosina se une a uma guanina por trs pontes de hidrognio (CG). Note que na molcula de DNA no encontrada a base uracila (U), exclusivas das molculas de RNA.

Se compararmos a molcula de DNA a uma escada veremos que o corrimo ser constitudo pelas molculas de desoxirribose e fosfato, enquanto as bases nitrogenadas correspondem aos degraus. A separao das duas fitas de DNA pode ser obtida ao serem rompidas as pontes de hidrognio entre as bases, o que se faz submetendo-se o DNA a temperaturas elevadas, por exposio a pH extremos ou diminuindo-se a fora inica. Na clula podemos encontrar dois tipos de DNA: o DNA nuclear e o DNA mitocondrial. Enquanto o primeiro codifica cerca de 100.000 genes, o segundo representa apenas 1 a 2% do DNA celular, codificando apenas 37 genes. Na mitocndria so encontrados de 1 a 10 molculas de DNBA mitocondrial, cuja forma circular e formada por dois filamentos: um filamento leve rico em citosina (L de light = leve) e outro filamento pesado rico em guanina (H de heavy = pesado). Diferente das molculas de DNA, as molculas de RNA so constitudas por um nicos filamento. Elas so produzidas a partir da informao contida nas molculas de DNA e podem ser dos seguintes tipos: RNA mensageiro (mRNA) A sequncia de nucleotdeos nessa molcula corresponde sequncia de aminocidos em uma cadeia polipeptdica. Antes disso, entretanto, a estrutura imediatamente formada a partir de DNA sofre modificaes, como a remoo de alguns seguimentos (os ntrons), para adquirir caractersticas particulares, nicas para cada protena a ser sintetizada.

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RNA ribossomal (rRNA) Unidos a protenas, constituem os ribossomos, responsveis por ler a

infomao gentica levada pelos RNAs mensageiros at o citosol. Podem permanecer livres no citosol ou ligados ao retculo endoplasmtico. So formados por duas subunidades (uma maior, outra menor) que se unem no momento da sntese protica. RNA transportador (tRNA) So responsveis por transportar os aminocidos at o local onde se dar a sua incorporao na cadeia polipeptdica em crescimento. Embora a molcula seja constituda de uma fita nica, pode se dobrar sobre si mesma, assumindo um aspecto de trevo ou semelhante a um crucifixo. Pequenas molculas de RNA Servem como iniciadores para a replicao de DNA, auxiliam na remoo dos ntrons durante a preparao do transcrito primrio do RNA mensageiro para traduo e alguns intervm no movimentos dos ribossomos no citosol.

1. Extrao de DNA a) Fundamentao Terica A extrao de DNA hoje uma tcnia extensamente utilizada com diversos fins, como na medicina forense, em investigaes criminais, na excluso de paternidade, na busca de marcadores tumorais ou agentes infecciosos, entre outros. A obteno do DNA pelos mtodos convencionais inclui lise celular e procedimentos que tornam o DNA disponvel para a extrao. Para isso, vrios so os passos laboratoriais necessrios e muitas vezes necessrio ajustar um protocolo dependendo do material utilizado para extrao e da finalidade do procedimento. A extrao de DNA realizada basicamente utilizando-se detergentes, sais e lcool. Veja as funes de cada um desses componentes.

Detergentes Rompem as membranas celulares pela desestruturao da bicamada lipdica

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Sais Fornecem ctions que diminuir neutralizam as cargas negativas do grupo fosfato

do DNA , diminuindo sua solubilidade e facilitando a aglomerao dessas molculas lcool Como o DNA tende a no ser solvel em lcool, sua desidratao com esse componente impede que fique dissolvido no meio aquoso, facilitando seu agrupamento. Quanto mais gelado o lcool, menos solvel ser o DNA.

Alm dessas solues, so comumente utilizados tampes, solues de fenol/clorofrmio, antioxidantes, alm de procedimentos como banho-maria e centrifugao que variam dependendo do protocolo utilizado para cada tipo de extrao. Esto listados abaixo alguns reagentes utilizados em diversos protocolos e suas funes. 1. EDTA (cido etileno diamono tetractico) e tampes Solues quelantes de ctions divalentes ou que mantm o pH por volta de 8.0. Impedem a ao de DNAses, enzimas que degradam o DNA usando esses ctions como cofatores ou quando o pH fica em torno de 7.0; 2. Fenol/clorofrmio Permitem a separao do DNA das protenas, desnaturando estas ltimas e tornando-as insolveis em fase aquosa, onde so encontradas as molculas de DNA; 3. Agentes antioxidantes, como PVP (polivinilpirrolidona), BSA (albumina de soro bovino) ou mercaptoetanol protegem o DNA da ao de compostos fenlicos, que oxidam o DNA, impedindo a ao de enzimas de restrio

b) Objetivo: Verificar a existncia de molculas de DNA em amostra de vegetais atravs da visualizao a olho nu.

c) Materiais Vidrarias Vidro de relgio 2 bqueres

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1 proveta de 100 mL 2 Bastes de vidro Funil de vidro

Amostra e Reagentes 1 banana gua destilada NaCl (sal de cozinha) Detergente para loua lcool etlico a 95% gelado (-10C)

Acessrios Banho-maria (60C) Balana analtica Papel de filtro Caixa de isopor com gelo

d) Procedimento

1. Corte e amasse a banana utilizando o basto de vidro 2. Em um bquer contendo 100 mL de gua, adicione 60 mL de detergente e 5 g de NaCl 3. Mexa at a total dissoluo 4. Adicione a banana amassada a essa soluo recm preparada 5. Deixe em banho-maria por 15 minutos 6. Resfrie a soluo rapidamente, colocando o bquer no gelo durante 5 minutos 7. Filtre 8. Adicione ao filtrado 100 mL de lcool gelado, deixando-o escorrer vagarosamente pela borda. 9. Observe 10. Com o basto de vidro limpo, faa movimentos circulares misturando as fases.

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11. Observe o resultado final.

e) Resultado esperado Precipitao das molculas de DNA com formao de nuvem na fase alcolica. PESQUISA 1. Por que o material precisa ser macerado para isolar o DNA? 2. Qual o papel do detergente presente no processo de extrao do DNA? 3. De que composta a molcula de DNA? 4. Visto que o DNA no solvel em lcool, o que ocorre com suas molculas quando colocadas neste meio? 7. DESNATURAO PROTICA

Protenas so polmeros de aminocidos unidos por ligaes covalentes. Os tipos de aminocidos (polares ou apolares) e as seqncias em que eles se encontram direcionam o enovelamento da cadeia polipeptdica, levando a uma conformao tridimensional especfica, que indispensvel para sua funo biolgica. Devido s diferenas nessas caractersticas estruturais, as protenas possuem diferentes propriedades fsico-qumicas, tais como: tamanho, massa molecular, carga eltrica e solubilidade. Essas propriedades, por sua vez, permitem que as protenas contidas em uma mistura sejam separadas umas das outras.

Figura 4: Representao da ligao peptdica

A perda da estrutura tridimensional levando a perda da funo da protena chamada de desnaturao. Muitas protenas podem ser desnaturadas pelo calor,

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assim como por mudanas do pH, cidos e bases, ons de metais pesados, certos solventes orgnicos, como o lcool ou as cetonas, por certos solutos como a uria ou, por detergentes. Muitas destas substncias ligam-se s cadeias de protenas formando precipitados.

O principio da precipitao das protinas consiste de que as mesmas so molculas eletricamente carregadas. A carga eltrica das protenas est na dependncia dos grupos ionizveis presentes nos radicais que fazem parte da molcula protica, podendo se apresentar de trs maneiras, ou como ctions, ou como nions ou como molcula neutra. A dissociao destas protenas em soluo depende da dissociao dos radicais dos aminocidos presentes na molcula, e consequentemente do diversos pKs. De uma maneira geral, considera-se que em pH neutro (ponto isoeltrico) a solubilidade destas protenas mnima. 1. Precipitao por cidos fortes e metais pesados

a) Fundamentos terica Os ons positivos de metais pesados (Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+) formam compostos insolveis com as protenas. Os metais positivos reagem com as cargas negativas de protenas, principalmente se o pH estiver acima do ponto isoeltrico da protena (ponto neutro), formando precipitados. Quando a protena est com pH abaixo do ponto isoeltrico, as bases provenientes de cidos fortes so exemplos de ons negativos que combinam-se com partes positivas de protenas, formando complexos insolveis, que precipitam na soluo. Como exemplos dessas bases podemos citar os alcalides, uma classe de compostos naturais, e as bases derivadas do cido tricloroactico (TCA). Esses reagentes tambm tm ao desnaturante, ou seja, provocam a perda da conformao tridimensional da protena de forma irreversvel. Conseqentemente, a protena separada por esse mtodo perde a sua funo. Esse mtodo bastante utilizado para remover protenas de amostras de soro, plasma e leite, quando se deseja analisar a presena de minerais, tais como clcio e magnsio, ou a contaminao por metais pesados, como chumbo e nquel.

b) Objetivos: Provocar a desnaturao de protenas em presena de cidos fortes

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c) Materiais Vidrarias 1 pipeta de vidro de 5mL 1 pipeta de vidro de 1mL 1 Tubo de ensaio Reagentes: Soluo de cido tricloroactico 20% Soluo de ovoalbumina 10% Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento

Pipetar para um tubo de ensaio 2 mL da soluo de ovoalbumina. Acrescentar 1 mL da soluo de cido tricloroactico.

e) Resultado esperado Tubo1: resultado positivo com a formao de uma soluo leitosa com precipitados brancos

Ovoalbumina

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f) Resultado Obtido ___________________________________________________________ ___________________________________________________________

2. Desnaturao da protena atravs de cidos

a) Fundamentao terica

Os nios de reagentes alcalides (tricloroactico, pcrico, etc.) so capazes de se combinar com protenas que possuam resduos de aminociods na forma de ctions (carregados positivamente) formando complexos insolveis. b) Objetivo: Provocar a desnaturao de protenas em presena de metais pesados.

c) Materiais Vidrarias: 1 pipeta de vidro de 5mL 1 pipeta de vidro de 1mL 1 Tubo de ensaio

Reagentes: Soluo de Acetato de chumbo a 10% Soluo de ovoalbumina 10% Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimentos

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Pipetar para um tubo de ensaio 2 mL da soluo de ovoalbumina. Acrescentar 5 gotas de soluo de acetato de chumbo. Observar a reao.

e) Resultados esperados Tubo1: resultado positivo com a formao de uma soluo leitosa com precipitados brancos

f) Resultado Obtido ___________________________________________________________ ___________________________________________________________

3. Precipitao fracionada por solues salinas concentradas

a) Fundamentao terica:

Os sais neutros tm efeitos pronunciados na solubilidade das protenas globulares, podendo tanto aumentar quanto diminuir a solubilidade da protena na soluo. A capacidade desses sais de influenciar a solubilidade das protenas uma funo de sua fora inica, que depende tanto de sua concentrao como do nmero de cargas eltricas dos ctions e nions que formam o sal. Entretanto, o efeito do aumento ou da reduo da fora inica na solubilidade pode ser diferente para cada tipo de protena, o que permite que elas sejam separadas de uma mistura apenas variando-se a concentrao de sal na soluo. medida que a concentrao do sal aumentada, a solubilidade da protena se reduz gradativamente. Em foras inicas suficientemente elevadas, uma protena pode ser quase completamente precipitada de sua soluo, um efeito denominado precipitao por salificao ou salting out. Um dos fatores que a concentrao elevada de sais pode remover a gua de hidratao das molculas de protena, reduzindo, dessa maneira, sua solubilidade; alm disso, outros fatores podem estar envolvidos como a competio entre os ons salinos adicionados e o soluto (protena), diminuindo a capacidade de solvatao do solvente aquoso.

58

Os precipitados proticos resultantes da precipitao por salificao mantm sua conformao nativa e podem ser dissolvidos novamente, em geral sem haver desnaturao. Conseqentemente, a funo da protena pode ser recuperada aps o trmino do processo e remoo do sal.

b) Objetivos:Correlacionar a concentrao de sais neutros com a solubilidades das protinas

c) Materiais Vidrarias: 1 pipeta de vidro de 5mL 1 pipeta de vidro de 1mL 1 Tubo de ensaio

Reagentes: Soluo de concentrada de sulfato de amnio (NH4)2SO4 Soluo de ovoalbumina 10%

Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento Pipetar para um tubo de ensaio (A) 2 mL da soluo de ovoalbumina. Adicionar, pelas paredes, 2mL da soluo concentrada de (NH4)2 SO4 Pipetar para um tubo de ensaio (B) 2 mL da soluo de ovoalbumina. Adicionar, pelas paredes, 2mL da soluo concentrada de (NH4)2 SO4 destilada e) Resultado esperado TuboA: resultado positivo com a formao de uma soluo leitosa com precipitados brancos Tubo B: Sem alterao
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e 2mL de gua

f) Resultado Obtido ___________________________________________________________ ___________________________________________________________

PESQUISA 1. De quais formas se pode promover a desnaturao de protenas?

2. O que desnaturao protica? . 3. No que consiste a precipitao por salificao? 8. ENZIMOLOGIA As enzimans possuem, em geral, estrutura protica, sendo que foram descritas algumas molculas de RNA com atividade cataltica As enzimas, como todas as protenas, so sintetizadas pelas clulas e constituem catalizadores biolgicos, muito mais eficientes do que os catalizadores inorgnicos. Os catalisadores so substncias, que aceleram a velocidade de uma reao qumica, diminuindo a energia de ativao, sem serem consumidos no processo. Embora toda a estrutura da molcula seja necessria para o papel cataltico, a ligao com o substrato d-se apenas numa poro bem definida da enzima o stio ou centro ativo, formado por alguns resduos de aminocidos presentes na cadeia polipeptdica, que se aproximaram devido aos dobramentos inerentes da estrutura terciria. Portanto, a estrutura e a forma do centro ativo so uma decorrncia da estrutura tridimensional da enzima e podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanas

conformacionais na estrutura protica. As enzimas no alteram a constante de equilbrio nem a variao de energia livre das reaes, sendo regeneradas, sob a forma original, ao final da catlise. As molculas reagentes so denominadas substratos (S) e produtos (P)

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so formados ao final. As enzimas so, geralmente, bastante especficas com relao aos substratos, formando um complexo com estes durante a catlise: E S ES E P

Algumas teorias procuram explicar esta especificidade: 1- teoria de Fischer (chave-fechadura) , onde enzima e substrato seriam complementares; 2- teoria de Koshland do encaixe induzido, ou seja, o substrato durante a catlise se encaixa na enzima; 3- teoria que prope o perfeito encaixe no estado de transio, estado onde a barreira energtica (energia de ativao) foi vencida. Diversos so os fatores que influenciam a velocidade de uma reao enzimtica. Por terem estrutura protica, alteraes no pH, na temperatura, compostos orgnicos como a uria, na fora inica do meio reacional podem modific-las (s vezes, at a estrutura dos substratos alterada), modificando, assim, a velocidade das reaes. Como esperado, a concentrao de substrato e de enzima no meio reacional so determinantes para a velocidade reacional. Neste captulo apresentamos como objetivo geral evidenciar o

comportamento enzimtico como catalisador biolgico, tanto nas condies ideais, como sob as mais variadas mudanas de temperatura, pH, substratos (especificidade enzimtica), tempo de reao e concentraes do substrato.

1)

Atividade cataltica da Amilase salivar a) Fundamentao terica O amido um polissacardeo formado da unio de vrias molculas de glicose por meio das ligaes glicosdicas. Amido formado por molculas de alfa-Dglicose. O amido uma mistura de dois polissacardeos: o amido solvel, ou Amilose, possui apenas cadeias lineares de glicose unidas em ponte alfa-osdicas 1:4.

Figura 5: Representao das ligaes glicosdicas presentes no amido

61

Cadeias de alfa-D-glicose costumam enrolar-se em espiral, formando essa estrutura helicoidal na qual as hidroxilas esto voltadas para o exterior.

Figura 6: Estrutura helicoidal caracteristica da amilose

O lugol cora o amido porque o iodo fica preso no interior dessas hlices. Amilopectina corresponde ao amido ramificado, o segundo componente dos gros de amido. Ramificaes surgem sempre que so montadas pontes osdicas 1:6.

Figura 7: Representao das ligaes glicosdicas comuns nas ramificaes da amilopectina

Nos carboidratos complexos ramificados (amilopectina), os pontos de ramificao (pontes 1:6) do origem a cadeias laterais cujas extremidades so no redutoras. Durante o processo de digesto, a alfa-amilase quebra as pontes osdicas 1:4, mas no as 1:6, resultando numa estrutura bastante ramificada chamada dextrina-limite. Somente a amilo-1:6 glicosidase (enzima

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desramificadora) capaz de hidrolisar essas pontes 1:6, permitindo a completa digesto da amilopectina.

Figura 8: Aspecto estrutural do amido Quimicamente, a hidrlise tambm pode ser desencadeada pela ao de cidos fortes.

b) Objetivos: realizar a hidrolise qumica e enzimtica do amido.

c) Material Soluo de amido a 1% Soluo de lugol Soluo de HCl 1:2 Soluo salina a 0,95% Soluo de saliva: secretar 1ml d saliva em um tubo de ensaio adicionar 9ml de saliva e misturar

d) Procedimento da Hidrolise Qumica - Rotular um erlenmeyer para a anlise cida (amido+HCl) - Adicionar com auxlio de uma proveta 30ml da soluo de amido a 1% - Acrescentar 3ml de HCl 1:2

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- Rotular trs tubos de ensaio em AA1, AA2 e AA3, cada um deles contendo 5ml de gua destilada. - No tubo de ensaio rotulado em AA1, em tempo 0pipetar uma alquota de 5ml do erlenmeyer e deixar em banho de gelo. - No tubo de ensaio rotulado em AA2 pipetar uma alquota de 5ml do erlenmeyer, levar para o banho de gua fervente em tempo 10 e depois levar para o banho de gelo. - No tubo de ensaio rotulado em AA3 pipetar uma alquota de 5ml do erlenmeyer, levar para o banho de gua fervente em tempo 20 e depois levar para o banho de gelo. - Retirar os tubos de banho de gelo - Quando todos os tubos estiverem em temperatura ambiente adicionar 10 gotas de sol. De lugol em cada tubo.

e) Procedimento da Hidrolise enzimtica - Rotular um erlenmeyer para a anlise enzimtica (amido+sol. saliva) - Adicionar com auxlio de uma proveta 30ml da soluo de amido a 1% - Acrescentar 1ml de sol. de saliva a 1% - Rotular trs tubos de ensaio em AE1, AE2 e AE3, cada um deles contendo 5ml de gua destilada. - No tubo de ensaio rotulado em AE1, em tempo 0pipetar uma alquota de 5ml do erlenmeyer e deixar em banho de gelo. - No tubo de ensaio rotulado em AE2 pipetar uma alquota de 5ml do erlenmeyer, deixar em temperatura ambiente pelo tempo 10 e depois levar para o banho de gelo. - No tubo de ensaio rotulado em AE3 pipetar uma alquota de 5ml do erlenmeyer, deixar em temperatura ambiente pelo tempo 20 e depois levar para o banho de gelo.
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- Retirar os tubos de banho de gelo - Quando todos os tubos estiverem em temperatura ambiente adicionar 10 gotas de sol. De lugol em cada tubo.

f) Resultado esperado: desaparecimento gradativo da cor azul do lugol, indicando a quebra do amido.

g) Resultado Obtido __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ PESQUISA 1) Explique como a concentrao de substrato pode interferir na velocidade da reao 2) Faa um grfico, que evidencie o efeito da temperatura na atividade enzimtica 3) Discorra sobre a ao do pH na atividade enzimtica observada in vitro 4) Explique por que desnaturao implica em perda da atividade enzimtica.

2)

Caracterizao da Urease

a) Fundamentao terica

A urase uma enzima responsvel pela catalise da uria em amnia e dixido de carbono, de acordo com a reaoabaixo: (NH2)2CO + H2O CO2 + 2NH3 (NH4)2CO3

Esta esnzima encontrada em diversos microrganismos como bactrias, fungos e tambm em seres superiores como algumas plantas. Como grande parte dos catalisadores biolgicos a estrutura bioqumica da urase protica,

apresentando caractersticas compatveis com esta classe de biomolculas.

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b) Objetivos: demonstrar a natureza protica da enzima.

c) Materiais Vidrarias 3 Tubos de ensaio 8 pipetas de vidro de 2 ou 5 mL

Reagentes Soluo de urease Reativo de Biureto cido Ntrico Concentrado

Acessrios Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Papel Toalha Descarte para pipetas

gua destilada

d) Procedimentos

1) Reao do Biureto Em um tubo de ensaio marcado A colocar 2 gotas de soluo de urease e juntar 2ml de gua destilada.Agitar e adicionar 2ml do reativo de biureto. Em um tubo marcado de B colocar 2 ml de gua destilada e 2 ml do reativo de biureto. Misturar e compara os tubos

2) Reao de Heller

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Em outro tubo de ensaio colocar 4 gotas de soluo de urease e 2ml de gua destilada. Agitar. Manter o tubo inclinado e juntar pela parede 1ml de cido ntrico concentrado, sem agitar.

e) Resultado esperado: Positivo na reao de biureto no tubo A ocorrendo mudana de cor para lils.

Urease

gua destilada

Positivo no teste de Heller com o surgimento de um anel branco na interface de reao dos lquidos

Urease

f) Resultado Obtido __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _____________________________________________________________

PESQUISA 1) Qual a reao catalisada pela urase? 2) Qual a fonte da urase usada nos experimentos?

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3) Explique a ausncia de atividade da urase, quando previamente fervida 4) Explique a inibio da enzima por sais de mercrio

3) Enzimas Oxiredutases: Polifenol Oxidase a) Fundamentao Terica As oxidoredutases so enzimas relacionadas com as reaes de xido-reduo em sistemas biolgicos. As polifenis oxidases so enzimas responsveis pela oxidao de compostos fenlicos. Frutas e vegetais que contem compostos polifenlicos, quando cortados e expostos ao ar sofrem escurecimento, causando pela ao da polifenol oxidase sobre os compostos fenlicos que so oxidados a ortoquinonas. Essas ortoquinonas polimerizam com facilidade formando compostos escuros, as melaninas. Essas reaes de escurecimento enzimtico podem ser mais facilmente observadas em vegetais de cores claras como batatas, bananas e maas. A reao enzimtica do tipo: AH2 + O2 A + H2O. As enzimas que catalisam essas reaes contm cobre na estrutura. Os compostos produzidos na reao absorvem luz na regio do espectro entre 320 a 450nm e portanto pode-se avaliar espectrofotometricamente a atividade da polifenol oxidase. b) Objetivo:Extrair e avaliar a atividade da polifenol oxidase da banana. c) Procedimento - Extrao da polifenol oxidase da banana Pesar 23g de banana e homogeneizar em um liquidificador juntamente com 100mL de tampo citrato-fostato (cido ctrico 0,1M + K2HPO4 0,1M, pH 6,0). Centrifugar a 3000 rpm por 20min. O sobrenadante um substrato aquoso que contm a polifenol oxidase.

- Determinao da atividade da polifenol oxidase

68

Preparar 2 tubos de ensaio contendo em cada um deles de pirogalol 0,1M e 3mL do tampo citrato-fosfato, pH 6,0. Um tubo ser o branco (B) e o outro tubo teste (T).
Tubos B T C Substrato pirogalol (mL) 2,0 2,0 Tampo Ac, Ctrico-Fostafo pH 6 (mL) 3,0 3,0 3,0 H2O (mL) 2,0

Obs: Zerar o espectrofotmetro com gua em 390 nm. Fazer as seguintes adies, na ordem: Tubo B (branco) 0,1 mL de gua Tubo C (controle) 0,1 mL do extrato (no contm o substrato) Tubo T (teste) 0,1mL do extrato. Disparar imediatamente o cronmetro e proceder a leitura das absorbncias nos tempos indicados na tabela:
Tempo (minutos) 0,5 (30 seg) 1 2 3 4 5 6 7 8 10 TESTE Absorbncias (390 nm)

Terminada a leitura de todos os tempos indicados proceder a leitura dos tubos branco (B) e controle (C). Para cada um dos tempos fazer a seguinte subtrao: Abs = Absorbncia do teste (Leitura do branco leitura do controle).

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Representar graficamente a absorbncia em funo do tempo. A atividade comumente expressa nos laboratrios de controle das indstrias como aumento da absorbncia / min / g de material seco.

PESQUISA 1. Qual o intervalo de tempo no qual a velocidade da reao cresce

linearmente? Justifique. 2. 3. 4. Qual a atividade da enzima por mL da preparao enzimtica? Qual a importncia dessa reao enzimtica na indstria de frutas? Sugira uma forma de evitar o escurecimento enzimtico na

industrializao da banana.

9. ANALISE BIOQUMICA DA URINA

O exame simples de urina, exame sumrio de urina ou urina tipo I um dos mtodos mais prticos para diagnstico e acompanhamento de pacientes com alteraes do trato urinrio. O exame deve ser feito com urina recm-colhida, no meio do jato urinrio, em frasco limpo. A melhor amostra para exame a primeira urina da manh, por ser mais concentrada e ter pH mais baixo, permitindo melhor conservao dos elementos figurados e de cilindros, alm de facilitar a determinao semi-quantitativa da proteinria (presena de protena na urina). O exame tem incio pela avaliao da cor, turvao e cheiro da urina. Presena de espuma em abundncia indica proteinria. Vrios medicamentos podem alterar a cor da urina. Utilizam-se mtodos fsico-qumicos para anlise da densidade, do pH, pesquisa de protenas, glicose, e cetonas. O sedimento urinrio examinado ao microscpio. E o exame bacteriolgico da urina compreende a microscopia direta e a cultura.

70

Neste livro, nos deteremos ao exame qualitativo de urina (EQU), que nos fornece informaes de grande utilidade clnica, no apenas no mbito do funcionamento do sistema urinrio, mas tambm de outros rgos, como o pncreas endcrino e o fgado. A presena de glicosria e/ ou cetonria so bons indicativos de Diabetes Mellitus, j a presena de bilirrubinria, urobilinogenria, cristais de blirrubina, e/ ou cristais de urato de amnia so indicativos de doena heptica. Neste exame so analisados aspectos fsico-qumicos da urina que, somados a outros exames laboratoriais e aos achados clnicos, ajudam no diagnstico de vrios quadros patolgicos.

Caracterizao de Glicose na Urina Mtodo de Benedict a) Fundamentao terica A glicose um monossacardeo que apresenta o grupo aldedo livre. A presena de glicose na urina pode ser evidenciada na reao de Benedict, onde a ao redutora do carboidrato age sobre os sais de cobre em meio alcalino, produzindo um precipitado amarelo ou vermelho tijolo de xido cuproso.

b) Objetivo:Determinar a presena de glicose em uma amostra de urina. c) Materiais Vidrarias: 1 pipeta de vidro de 5 mL 1 pipeta de vidro de 1 mL 1 Tubo de ensaio Reagentes: Reagente de Benedict Amostra: Urina Equipamentos: Banho-Maria Acessrios: Estante para tubos de ensaio

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Pra de borracha Pina Termmetro Cronmetro Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento Em um tubo de ensaio identificado, limpo e seco, pipetar 5 mL do Reativo de Benedict e adicionar 10 gotas de urina lmpida agitar e ferver em banho-maria por 5 minutos.

e) Resultados esperados Resultado positivo para glicose: lquido de cor vermelho tijolo Resultado negativo para glicose: lquido de cor azul ou verde

Negativo f) Resultado obtido

Positivo

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

g) Interpretao do resultado A glicosria acompanhada de hiperglicemia indicativo de Diabetes melitus, entretanto, sem hiperglicemia pode ser doena tubular renal ou sndrome de Fanconi

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(defeito reabsortivo generalizado dos tbulos renais). Resultados falso-positivos podem ocorrer em ingesto elevada de carboidrato pouco antes da coleta da urina.

Determinao de Albumina na Urina Mtodo de Heller a) Fundamento da tcnica A reao se baseia na coagulao da protena, presente na urina, pelo cido ntrico, manifestada atravs de anel branco leitoso. A coagulao causada pela perda da solubilidade da protena no estado desnaturado, provocado pelo cido.

b) Objetivo: Evidenciar a presena de proteinria pela desnaturao com cido ntrico. c) Materiais Vidrarias: 2 pipetas de vidro de 5 mL 1 Tubo de ensaio Funil de vidro Bquer de 25 mL Reagentes: cido Ntrico Amostra: Urina filtrada Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Suporte para funil Papel de filtro Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento

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Em um tubo de ensaio limpo e seco pipetar 3 mL de urina filtrada e adicionar 2 mL de cido ntrico, lentamente no fundo do tubo, de modo que os dois lquidos no se misturem. e) Resultado esperado Resultado positivo para protena: Formao de anel branco leitoso na superfcie de contato dos dois lquidos. Resultado negativo: Formao de anel transparente na superfcie de contato dos dois lquidos.

Negativo

Positivo

f) Resultado obtido ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ g) Interpretao do resultado O resultado de proteinria positiva indicativo de leso glomerular com perda da protena de alto peso molecular que normalmente no filtrada pelo glomrulo intacto.

Determinao de Albumina na Urina Mtodo Sulfossaliclico a) Fundamentao terica A reao consiste da desnaturao da protena pelo cido sulfossaliclico com formao de metalprotena.

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b) Objetivo: Evidenciar a presena de protena na urina pela desnaturao com cido ntrico. c) Materiais Vidrarias: 1 pipeta de vidro de 5 mL 1 pipeta de vidro de 1 mL 1 Tubo de ensaio Funil de vidro Bquer de 25 mL Reagentes: cido Sulfossaliclico 20% Amostra: Urina flitrada Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Suporte para funil Papel de filtro Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento Em um tubo de ensaio identificado, limpo e seco, colocar 5 mL de urina filtrada e adicionar 5 gotas de soluo de cido sulfossaliclico e misturar.

e) Resultado esperado Resultado positivo para protena: Turvao ou precipitao do lquido. Resultado negativo: Lquido translcido.

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Negativo

Positivo

f) Resultado obtido ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ g) Interpretao do resultado O resultado de proteinria positiva indicativo de leso glomerular com perda da protena de alto peso molecular que normalmente no filtrada pelo glomrulo intacto.

Determinao de Corpos Cetnicos na Urina a) Fundamentao terica Os corpos cetnicos (acetona, acido diacetico e beta-hidroxibutirico) so procedentes do metabolismo dos acidos graxos.Tem maior relevncia clinica no diagnostico da cetoacidose diabetica, entretanto, cetonuria pode ser encontrada em outras situacoes: dieta rica em gordura, cetoacidose alcoolica, jejum prolongado, febre, apos execicios fisicos, gravidez, pos-operatorios. Com o auxlio reagente de Imbert, apresentando na sua composio o nitroprussiato de sdio, este reage em meio actico sobre a acetona formando composto colorido.

b) Objetivo: Evidenciar a presena de corpos cetnico em uma amostra de urina c) Materiais Vidrarias: 2 pipetas de vidro de 5 mL 1 pipeta de vidro de 1 mL 1 Tubo de ensaio

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Reagentes: Reagente de Imbert Hidrxido de amnio Amostra: Urina flitrada Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Suporte para funil Papel de filtro Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento Em um tubo de ensaio limpo, seco e identificado, colocar 5 mL de urina, 1mL do reativo de Imbert. Agitar e inclinar o tubo deixando escorrer pela parede de tubo 2 mL de hidrxido de amnio, cuidadosamente de modo a no se misturarem os lquidos. e) Resultado esperado Resultado positivo para cetonria: aparecimento de anel violcio a roxo na superfcie de contato dos lquidos. Resultado negativo para cetonria: formao de anel transparente na superfcie de contato dos lquidos.

Negativo

Positivo

f) Resultado obtido

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______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

g) Interpretao do resultado A cetonria caracterstica em pacientes diabticos e pode ocorrer em indivduos normais quando submetidos a jejum prolongado. Reaes falso-positivas podem ocorrer no uso de levodopa, metildopa e captopril. O acido beta-hidroxibutirico no detectado pela reao do nitroprussiato de sdio, podendo a cetonria pode ser negativa caso este seja o corpo cetnico predominante.

Deteco de Fadiga Muscular por meio da Urina Test de Donnaggio a) Fundamentao terica A fadiga muscular capaz de provocar desequilbrio bioqumico, facilmente constatado pela reao de Donnaggio, a qual somente ocorre em meio cido, sendo indispensvel verificar o pH da urina a ser examinada. Se a mesma apresentar pH neutro ou alcalino, dever ser acidulada com algumas gotas de cido actico, em quantidade suficiente para que ela se torne cida. Esta exigncia sumamente importante, porque sem a sua observncia, observa-se resultados irregulares e duvidosos.

b) Objetivo: Determinar fadiga muscular por intermdio de amostra de urina. c) Materiais Vidrarias: Tubos de ensaios Funis de vidro Pipetas graduadas de 10 mL Reagentes:

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Soluo aquosa de tionina Merck a 0,1% (esta soluo deve ser preparada a quente para que o corante se dissolva completamente) Soluo aquosa de tionina a 0,01% Soluo de molibdato de amnia a 4% (preparada a soluo acidula-se com 1 gota de cido clordrico para cada 25 mL de soluo) cido actico Amostra: Urina flitrada Acessrios: Estante para tubos de ensaio Pra de borracha Suporte para funil Papel de filtro Papel de Tournesol Papel Toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento Aps coleta e verificao de pH (a urina deve ter pH < 7), filtra-se a urina. Em seguida ferve-se durante 1 minuto, espera-se esfriar e filtra-se novamente. Nestas condies, a amostra pode ser submetida ao Test de Donnaggio, constitudo em 2 fases.

1 Fase: A reao feita em uma srie de 6 tubos de ensaio, designados por A1, A2, A3, A4, B1 e B2, nos quais os reativos sero colocados em diferentes propores, dentro da ordem exposta no quadro abaixo e que deve ser atentamente observada. Deve se ter o cuidado de agitar a cada nova mistura. 1 lugar Tubo A1 2 mL mol. de am. 2 lugar 2 mL de urina 3 lugar 1 mL tion. 0,1%

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Tubo A2 Tubo A3 Tubo A4 Tubo B1 Tubo B2

2 mL de urina 2 mL de urina 2 mL de urina 1 mL mol. de am. 1 mL de urina

1 mL tion. 0,1% 1 mL mol. de am. 2 mL tion. 0,1% 1 mL de urina 2 mL tion. 0,1%

2 mL mol. de am. 1 mL tion. 0,1% 1 mL mol. de am. 2 mL tion. 0,01% 1 mL mol. de am.

Aps repouso de 24h, procede-se a leitura desta 1 fase. Os resultados obtidos nos diversos tubos so expressos por nmeros que obedecem a uma graduao que vai de 0 (negativo) a 5 (fortemente positivo), graduao esta correspondente ao maior ou menor deposito de tionina formado e colorao mais ou menos intensa do lquido sobrenadante. Designa-se por 0 (zero), quando a tionina precipita-se completamente no fundo do tubo e a urina apresenta-se completamente lmpida e clara. Designa-se por 5 (cinco), quando pelo contrrio, a coluna lquida fica inteiramente corada, no havendo precipitao alguma de tionina. Os graus so, pois, os seguintes: 1 Levssima positividade (urina ligeiramente corada e quase total precipitao da tionina); 2 Leve positividade (urina um pouco mais corada e grande precipitao de tionina); 3 Mediana positividade (acentuada colorao da urina e mdia precipitao de tionina); 4 Grande positividade (forte colorao da urina e pouca preciptao de tionina); 5 Forte positividade (intensa colorao da urina e nenhuma precipitao de tionina). A soma dos graus de cada tubo constitui o resultado da primeira fase da reao.
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2 Fase: Tomam-se os tubos que apresentaram reao positiva na 1 fase e verifica-se a reao cida do lquido, reao esta que poderia ter sido modificada eventualmente pela fermentao da urina. Caso no seja cida, procede-se nova acidulao pelo cido actico e ferve-se durante 1 minuto. Aps 12 ou 14h de sedimentao, faz-se a leitura do resultado parcial desta 2 fase, pelo mesmo mtodo adotado na 1 fase. O resultado obtido, somado ao da 1 fase, dar a soma global, com que se constri o diagrama, que representar o grau de fadiga do examinado.

e) Resultado obtido ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

f) Interpretao do resultado A reao de Donnaggio sempre positiva aps esforo muscular. Com o treinamento, porm, h diminuio e mesmo desaparecimento de positividade da reao, o que torna este teste um timo meio para o controle do treinamento dos desportistas.

PESQUISA 1) A presena de glicose na urina (glicosria) determinada por agentes redutores no-especficos, como na reao de Benedict, ou com tiras com reagentes especficos para a glicose. Os primeiros, alm de menos sensveis, produzem reao falso-positivo em presena de vrios acares, cidos e alguns medicamentos. Explique a reao de Benedict, identificando os agentes responsveis pelo processo de oxidao-reduo.

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2) Com o passar do tempo, alm da eventual alterao de pH devido fermentao da urina, que outra alterao podemos esperar no tubo positivo para a reao de Benedict? 3) A determinao do teor de glicose circulante (glicemia) o elemento bsico para o diagnstico de diabetes, no sendo fundamental a pesquisa de glicosria, pois resultados falsamente positivos ou negativos podem ser encontrados. Exemplifique estas situaes. 4) Concentraes elevadas de glicose na urina esto associadas a algumas condies no necessariamente patolgicas. Exemplifique situaes fisiolgicas em que podemos encontrar glicosria. 5) Qual o papel do nitroprussiato de sdio, presente no reativo de Imbert, na caracterizao de corpos cetnicos na urina? 6) Em que condio a cetonria pode estar presente mesmo que no seja detectada pela anlise da urina? 7) Presena de cetonria em pacientes diabticos indica descompensao metablica grave. Por outro lado, indivduos normais aps jejum prolongado tambm podem apresentar cetonria. Explique os mecanismos envolvidos nas duas situaes. 8) O que representa o anel branco leitoso formado no tubo positivo para a reao de Heller? 9) Explique o mtodo sulfossaliclico para deteco de proteinria (protena na urina). 10) Qual a importncia clnica da deteco precoce de microalbuminria (excreo urinria de albumina entre 30 e 300mg/24h ou entre 20 e 200g/min, na ausncia de infeco urinria ou doenas agudas) em pacientes diabticos e ou hipertensos?

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10. COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA Na bioqumica, as anlises de biomolculas podem ser realizadas de forma qualitativa, onde a molcula pesquisada est presente ou ausente em uma amostra, ou de forma quantitativa, onde se pode determinar a quantidade exata da molcula pesquisada em um determinado material biolgico. Um dos principais instrumentos para as anlises quantitativas na bioqumica so os mtodos de pticos como a colorimetria e a espectrofotometria. Estas anlises se baseam na capacidade de algumas solues absorverem a luz. Considerando que a luz definida como uma radiao electromagntica composta de uma gama de comprimentos de ondas (nm), as anlises colorimtricas se baseam na absoro da luz visvel pela substncia a ser dosada e na espectrofotometria o princpio semelhante, entretanto, o espectro de luz absorvido apresenta comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. Assim, quanto maior a concentrao da molcula pesquisada, maior a absoro de luz, sendo relaes diretamente proporcionais. UV Visve IV

Cor

Comprimento de onda (nm)

Violeta Azul Verde Amarela Laranja Vermelho

390-455 455-492 492-577 577-597 597-622 622-780

Tabela 1: Relao das cores com os respectivos comprimentos de onda Um raio de luz monocromtica ao atrevessar uma soluo contendo uma substncia, uma parte da luz ser absorvida (Absorbncia) e outra parte ser transmitida atravessando a soluo (Transmitncia). A luz pode ser refetida pelo

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Io = IA + I

recipiente que contm a soluo, entretanto, nas anlises bioqumicas este fenmeno pode ser desconsiderado j que a natureza das cubetas (quartzo ou vidro) onde as solues so depositadas para a leitura ou eliminadas por comparao de amostra. Pode-se escrever portanto que:

Io a intensidade da luz incidente na amostra ser igual a luz absorvida (IA) e a luz transmitida (IT) de acordo com o esquema abaixo:

IA Io
Luz Monocromtica

l
Espessura da soluo

Figura 10: Representao dos fenmenos pticos

A Transmitncia a razo a intensidade da luz emergente (I) e a intensidade da luz incidente (I0), isto :

T = I / Io

A absorbncia (A) definida como logartimo negativo da transmitncia e, experimentalmente, um parametro mais adequado por apresentar uma relao linear com a concentrao da substncia absorvente. Esta relao determinada pela Lei de Lambert-Beer que obtida da relao de duas leis disintas: a lei de Lambert que diz que cada camada sucessiva do meio absorve uma frao igual da radiao, destacando a importncia da espessura da cubeta usada; a lei de Beer determina a relao entre a absoro e a concentrao da substncia em soluo, sendo razes diretamente proporcionais.

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Os fotocolorimetros e espectrofotmetros so aparelhos que se baseam nestes fenmenos fsico-quimicos para quantificar uma determinada amostra tendo um padro de referncia. Para a medida da absoro de luz visvel ou invisvel, as industrias oferecem vrios modelos de aparelhos com o objetivo de viabilizar as anlises bioqumicas. Para o seu funcionamento, todo fotocolorimetro ou espectrofotometro apresenatam uma fonte de luz, que em geral uma lmpada de tungstnio para luz visivel e uma de lmpada de deutrio para ultravioleta. O feixe de luz direcionado para um monocromador, onde um comprimento de onda selecionado, permitindo ento a emisso de uma luz monocromtica. A luz incide no compartimento onde a cubeta, contendo a amostra, encaixado. A luz transmitida pela amostra alcana um fotomultiplicador que converte o estimulo optico em eltrico que ento convertido em valores de absorbncia, transmitancia ou at mesmo em concentrao, dependendo dos recursos do aparelho em uso.

Figura 11: Esquema funcional do espectrofotmetro As vantagens deste metodo so na simplicidade do seu fundamento, fcil aplicao e emprego amplo, entretanto, apresenta algumas desvantagens como incompatibilidade com alguns tipos de amostra (suspensses ou amostras diferentes que absorvem no mesmo comprimento de onda). 1. Determinao quantitativa de glicose a) Fundamentao teorica A glicose pode ser determinada pelo metodo da ortotoluidina a partir da reao com uma amina aromtica que reage com a glicose em soluo de cido actico a quente. A ortotoluidina se condensa com ao grupo

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aldeido da glicose formando uam glicosilamina e uma base de Schiff correspondente. b) Objetivo: determinar a concentrao de glicose e montar uma curva dose resposta. c) Material Vidraria Pipetas Tubos de enasio Provetas Bequer Reagentes Soluo Padro de glicose (10mg de glicose diluida em 100 mL de gua destilada e contendo 0,2g de cido benzico) Ortotuluidina a 5% (colocar 950 mL de cido actico glacial em um bequer de 1000mL e colocar 1,5g de tiuria e misturar, adicionar50mL de ortotoluidina; manter em frasco ambar e temperatura ambiente) Acessrios: Estante de tubos de ensaio Pra de borracha Papel toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento Monte os tubos de ensaio de acordo com a tabela abaixo:

Tubos B T1 Glicose-padro 0,08mL gua destilada 1,0mL 1,92mL Sol. Ortotoluidina 10,0mL 10,0mL Absorbancia

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T2 T3 T4 T5

0,16mL 0,24mL 0,32mL 0,40mL

1,84mL 1,76mL 1,68mL 1,60mL

10,0mL 10,0mL 10,0mL 10,0mL

Homogeneizar os tubos e levar para o banho-maria por 10minutos. Ler em filtro de 630nm. Calcule a concentrao da glicose para cada alquota e monte uma curva correlacionando a concentrao e a absorbncia. e) Resultado obtido ___________________________________________________________ ___________________________________________________________

2.

Determinao quantitativa de protenas a) Fundamentao terica Substncias contendo ligaes peptidicas forma um complexo corado com sais de cobre em soluo alcalina. Se tambm tiverem grupos aromticos, estes reduzem o reagente formando complexos coloridos. b) Objetivo: Determinar quantitativamente a concentao de protenas c) Material Vidraria Pipetas Tubos de enasio Provetas Bequer Reagentes Reativo de Biureto

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 Soluo padro de protena: pesar soroalbumina bovina (B.S.A.) 5mg/mL de NaOH a 1% Acessrios: Estante de tubos de ensaio Pra de borracha Papel toalha Descarte para pipetas

d) Procedimento Monte os tubos de ensaio de acordo com a tabela abaixo: Tubos Glicosepadro B T1 T2 T3 T4 T5 0,10mL 0,20mL 0,30mL 0,40mL 0,50mL 1,0mL 1,90mL 1,80mL 1,70mL 1,60mL 1,50mL 10,0mL 10,0mL 10,0mL 10,0mL 10,0mL 10,0mL gua destilada Sol. Ortotoluidina Absorbancia

Homogeneizar os tubos e por 10minutos em temperatura ambiente. Ler em filtro de 540nm. Calcule a concentrao de protena para cada alquota e monte uma curva correlacionando a concentrao e a absorbncia. e) Resultado obtido ___________________________________________________________ ___________________________________________________________

3.

Determinao de Vitamina A a) Fundamentao terica

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O retinol, retinal e cido retinico so formas ativas da vitamina A, uma vitamina lipossolvel sintetizada pelas plantas como carotendes mais complexos. A vitamna A participade vrias funces biolgicas principalmente na manuteno da viso e da pele. b) Objetivo: Determinar a concentrao de vitamina A em uma amostra c) Materias Vidrarias Erlenmeyer 150mL Tubos de ensaio Proveta Pipetas Funil de separao Bequer Reagentes Hidroxido de potssio 33% Etanol amnico cido cloridrico a 25% ter de petrlio Sulfato de sdio anidro Hexano cido Trifluoactico (1mL de cido trifluoroactico + 3mL de cloroformio) Equipamentos Banho-Maria Espectrofotometro Balana Acessrios

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 Estante para tubos de ensaio Pra de Borracha Suporte para funil Papel toalha

d) Procedimento Pese 5-10g de amostra (manteiga) e coloque em um erlenmeyer e adicione 10mL de hidroxido de potssio de 33% e 40 mL de etanol amlico. Aquea por 30 minutos em refluxo. Resfrie rapidamente em banho de gelo e adicione 17mL de cido clordrico a 25% mantendo sempre a amostra refriada. Adicione 50mL de ter de petrlio. Feche o erlenmeyer e agite vigorosamentepor 3 minutos. Transfira para um funil de separao, espere a separao das duas fases e reserve a fase organica. Filtre em sulfato de sdio anidro e evapore em 35C. Dissolva o extrato em 1mL de cloroformio. Adicione 4 mLde cido trifluoactico. Determina a absorbncia a 620nm contra um branco contendo todos os reagentes exceto o extrato. Compare a com uma curva padro. e) Resultado obtido ___________________________________________________________ ___________________________________________________________

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REFERENCIAS CONSULTADAS BRASIL. Ministrio da Sade. Normas e Manuais Tcnicos: Lavar as Mos Informaes para Profissionais de Sade. Srie A. Braslia, Centro de

Documentao, 1989. COSTA, M.A.F. Biossegurana: segurana qumica bsica para ambientes biotecnolgicos e hospitalares. So Paulo: Ed. Santos, 1996. COSTA, M.A..F. Qualidade e Biossegurana: uma necessidade de integrao. Revista Biotecnologia, N.4, jan/fev, 32-33, 1998. E.; VARELLA, M.D.; ASSAD, A.L.D. Biosafety in Brazil and its Interface with other Laws. http://www.bdt.org.br/bdt/oeaproj/biossegurana, 1998. Percepo de Riscos em Biossegurana de Laboratrios Centrais de Sade Pblica no Brasil, Ncleo de Biossegurana Fiocruz-RJ - CGLAB-BSB,2001.

www.usp.br/fo/biossegur/biosseguranca.htm/

LEHNINGER, A.L., NELSON, D.L. & COX, M.M. Princpios de Bioqumica. 2 ed., Editora Sarvier, So Paulo, 1995.

ALLINGER, N. L.; CAVA, M. P.; JONGH, D. C. de; JOHNSON, C. R.; LEBEL, N. A.; STEVENS, C. L. Qumica orgnica. 2o edio. Rio de Janeiro: Editora Guanabara, 1978.

MORITA, T.; ASSUMPO, R.M.V. Manual de Solues, Reagentes e Solventes: Padronizao, Preparao, Purificao. 2 Edio. So Paulo: Editora Edgard Blucher Ltda., 1972.

CAMPBELL, J.M.; CAMPBELL,J.B. Matemtica de Laboratrio Aplicaes Mdicas e Biolgicas. 3.ed. So Paulo: Livraria Roca, 1986.

91

HART, A.; SCHUETZ, R. D. Qumica orgnica. Rio de Janeiro: Editora Campus LTDA, 1983.

AMARAL, L. Qumica orgnica. So Paulo: Editora Moderna Ltda,1981.

FELTRE, R. Solues. In.: Qumica - Fsico-Qumica. 2.ed. So Paulo, SP. Editora Moderna.1983. p. 1-75.

SOLOMONS, T.W G., Qumica orgnica. Rio de Janeiro: LTC, 1983. V. 2.

NEPOMUCENO, M.F; RUGGIERO, A.C. Manual de Bioqumica: Roteiros de Anlises Bioqumicas Qualitativas e Quantitativas. Ribeiro Preto, SP: Tecmedd, 2004. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN. Setor de Cincias Biolgicas. Departamento de Bioqumica. Bioqumica: aulas prticas.

Curitiba: Scientia et Labor, 1987. 116p.

VOET, D.; VOET, J.G. Bioqumica. 4 ed. Porto Alegre: Artmed, 2005.

CHAMPE, Pamela C., HARVEY, Richard A, FERRIER, Denise R. Bioqumica Ilustrada. 3 edio. Porto Alegre: Artmed, 2006.

CISTERNAS, Jos Raul, Varga, Jos, Monte Osmar. Fundamentos De Bioqumica Experimental. So Paulo: Atheneu, 1997.

KAMOUN, P. LAVOINNE, A. VERNEUIL, H. Bioqumica e Biologia Molecular. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2006.

VALIM, Yara Maria Lucisano (Coord). Prticas de Bioqumica- Conceitos Gerais. USP: Ribeiro Preto, 2008.

REMO, Jos Oscar dos Reis; SIQUEIRA, Antonio Joo S; AZEVEDO, Ana Maria Ponzio. Bioqumica: Guia de Aulas prticas. PUCRS: Porto Alegre, 2003.

92

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE. Roteiro de Aulas Prticas. Instituto de Biologia Departamento de Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro, 2007. ALMEIDA, F. A. Microalbuminria como marcador precoce de comprometimento da funo renal. Disponvel em: http://departamentos.cardiol.br/dha/revista/8-

3/micro.pdf Acesso em: 09 de maro de 2009. GUYTON, Arthur C. & HALL, John E. Tratado de Fisiologia Mdica. 11 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2006. PORTO, Celmo Celeno. Semiologia Mdica. 5 ed. Rio de Janeiro: Guanabara. MILLER, O. et al. Laboratrio para o Clnico. 8 ed. So Paulo: Editora Atheneu, 1998. MURRAY, Robert K. et al. Harper: Bioqumica. 9 ed. So Paulo: Editora Atheneu, 2002. STUDART, Lauro & ALMEIDA, Otaclio. O controle da Fadiga pela Urina. Disponvel em: http://www.revistadeeducacaofisica.com.br/artigos/1939/46_ocontroledafadiga.pdf. Acesso em: 09 de maro de 2009.

93