INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Departamento Microbiologa Laboratorio de Fisiologa y Bioqumica Microbiana
Autores: Herrera Rodrguez juan Manuel Garca Garca Citlalli Itzel Lpez Bailn Luis Uriel 6QV1 Equipo-3 1 - Octubre - 2013

Prctica No. 3 Determinacin de actividad de succinato deshidrogenasa de Escherichia coli..

HIPTESIS De acuerdo a la literatura [1] sabemos que la enzima succinato deshidrogenasa es una enzima regulada por glucosa, en presencia de este sustrato es reprimida su expresin gentica y con ello los niveles de la enzima bajan, por lo que esperamos que al hacer el ensayo, en presencia de un cultivo expuesto a glucosa la actividad se vea disminuida, por otro lado en caso contrario, el succinato estimula la produccin de la enzima por lo que la actividad esperada es alta. La determinacin de la actividad, se har por medio de una cadena transportadora de electrones [3] , puesto que esta enzima adems de participar en el ciclo de los cidos tricarboxilicos participa en la cadena transportadora de electrones a nivel de la CoQ. DESARROLLO ESPERIMENTAL. Diagrama de flujo.

Figura 1. Desarrollo experimental. 1

Descripcin. Lo que se muestra en la Figura No.1 es el diagrama que se sigui durante el proceso experimental, sin embargo hay ciertos pasos que son de vital importancia para poder obtener buenos. Los pasos crticos tienen un contorno rojo, en primera estancia sabemos que si se adicionan todos las sustancias (regulador de fosfatos, 2,6 diclorofenol-indofenol, KCN y Metosulfato de Fenazina) no hay gran problema puesto que no se encuentra la enzima que va a dar pie a las reacciones de una cadena transportadora de electrones artificial sin embargo en el paso donde dice Suspensin celular, debemos mencionar que se realizaron 4 diferentes combinaciones de fuentes de carbono entre Succionato y Glucosa, al adicionar la suspensin celular con las variaciones ya mencionadas la reaccin comenzara de forma inmediata por lo que se tenia que pasar de forma rpida al espectrofotmetro para comenzar con las lecturas correspondientes, estos pasos son bsicos por que como sabemos la combinacin de 2,6 diclorofenol-indofenol + Metosulfato de Fenazina con la enzima ya se dara la reaccin y es esto lo que se quiere determinar.

OBJETIVO GENERAL. Analizar los resultados obtenidos de la actividad de Succinato deshidrogenasa, en los cultivos crecidos en diferentes condiciones, concluyendo el papel fisiolgico de esta enzima.

OBJETIVOS PARTICULARES. Realizar la determinacin de la actividad enzimtica, por medio del mtodo de Ells. Observar en un grfico la cintica de la actividad de la enzima. Determinar si es una enzima regulada por glucosa. Determinar si el succinato la estimula. Realizar una cadena transportadora de electrones artificial.

CLCULOS Y RESULTADOS. Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E coli. Tabla 1. A continuacion de muestran los valores de Absorbancia como medida del crecimiento de la bacteria Escherichia coli. Crecimiento (Absorbencia a 600 nm) Matraces con ms fuente de carbono medio base Inicial Final absorbencia 1 2 3 4 succinato glucosa succinato glucosa 0.754 0.75 0.958 0.95 1.157 1.197 1.296 1.432 0.403 0.447 0.338 0.482

Cultivos previos.

Succinato Glucosa

Efecto de la fuente de carbono en la actividad de succinato deshidrogenasa. Tabla 2. Aqu se muestran los valores de % de Transmitancia obtenidos, en base a las diferentes fuentes de carbono. Tiempo (seg) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 % de transmitancia a 600nm de las suspensiones celulares crecidas en las fuentes de carbono 1. 2. 3. 4. Succinato/Succinato Succinato/glucosa glucosa/succinato glucosa/glucosa 8.1 7 9.1 6.8 9.8 7.6 9.3 7 10.9 8.1 9.9 7.4 12.1 8.5 10.4 7.7 13.2 8.8 10.8 8 13.4 9.1 11.2 8.2 15.6 9.3 11.6 8.5 17 9.6 12 8.7 18.4 9.8 12.4 8.9 19.9 10 12.7 9.1 21.6 10.2 13 9.3 3

Diferencias de % Transmitancia Inicial - % Transmitancia Final. Tabla 3. Aqu se muestra en resultado de la resta de las transmitancias obtenidas a diferentes tiempos. Transmitancia Inicial - Transmitancia final Tiempo S/S S/G G/S 30 1.7 0.6 0.2 60 2.8 1.1 0.8 90 4 1.5 1.3 120 5.1 1.8 1.7 150 5.3 2.1 2.1 180 7.5 2.3 2.5 210 8.9 2.6 2.9 240 10.3 2.8 3.3 270 11.8 3 3.6 300 13.5 3.2 3.9 G/G 0.2 0.6 0.9 1.2 1.4 1.7 1.9 2.1 2.3 2.5

MANEJO DE DATOS Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli Se obtiene la diferencia de las absorbancias a 600nm de cada uno de los 4 tratamientos. Ejemplo:

Efecto de la fuente de carbono en la actividad de succinato deshidrogenasa A cada dato obtenido de % de transmitancia a los diferentes tiempos se les resta el tiempo 0 respectivo. Ejemplo: Succinato/succinato ( ( ( ) ) ) ( ( ( ) ) )

GRFICAS.

Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de E. coli

0.5 absorbancia a 600nm 0.4 0.3 0.2 0.1 0 S/S S/G G/S G/G Condiciones de crecimiento y fuente de carbono adicionada

Figura 2. En esta grafica se compara el crecimiento de E. coli cuando es crecida en una fuente de carbono (succinato o glucosa) y posteriormente agregando otra fuente de carbono (succinato o glucosa) comparando la absorbancia a 600nm inicial y final.

14 12 %transmitancia a 600nm 10

Efecto de la fuente de carbono en la actividad de succinado deshidrogenasa de E. coli

S/S S/G G/S

8 6 4 2 0 0

G/G

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

Tiempo (segundos)

Figura 3. Comparacin de la actividad de la enzima succinato deshidrogenasa de E.coli cuando se cambian las fuentes de carbono 5

DISCUSIN. El principal objetivo de este trabajo era medir la actividad enzimtica de la succinato deshidrogenasa en Escherichia coli. Utilizando como variable la fuente de carbono a la cual fueron sometidos los cultivos de la bacteria. Donde se observaron fisiolgicamente dos caractersticas, el crecimiento y la actividad enzimtica de la SDHasa. Comenzaremos por el anlisis de las 4 variables de fuente de carbono en los cultivos, donde se tena a los cultivos primero uno en glucosa y el segundo en succinato, de ah se tomaron de cada uno, dos alcuotas y una de cada uno de los primeros se puso en glucosa y la segunda alcuota de cada uno en succinato, quedando los cultivos as: GlucosaGlucosa (G-G), Glucosa-Succinato (G-S), Succinato-Succinato (S-S) y Succinato-Glucosa (S-G). En donde en cuanto al crecimiento se sabe que la glucosa es una fuente de carbono que brinda ms energa que el succinato, pues en glucolisis se obtienen 36 ATPs y en succinato solo 2, es por ello que en el cultivo crecido en G-G se obtuvo el mayor crecimiento que en los otros 3, en el cultivo G-S, al haber crecido primero en glucosa y lego pasado a succinato se esperara que en reaccin a los 4, este fuera el segundo con ms crecimiento, lo cual no fue as, siendo el segundo con ms crecimiento el S-G, lo cual en comparacin con el S-S suena razonable, puesto que al cambiar a glucosa, este cultivo, obtuvo ms energa y con ello se desarroll ms que el S-S, el cual obtuvo los valores mas bajos. En el caso de G-S, pudo haber salido bajo, debido a que al cambiar la fuente da carbono, las bacterias deban cambiar la maquinaria enzimtica para poder utilizar el succinato y despus de ello al brindar poca energa el succinato, creci poco. Despus en cuanto a la actividad de la SDHasa, esta al ser estimulada por el succinato, es por ello que en los cultivos, donde se pasaron a succinato como fuente de carbono, como en S-S y G-S, se obtuvieron las actividades mayores de la enzima, siendo considerablemente mucho ms elevada en el cultivo S-S puesto que siempre fue estimulada la produccin de la enzima en este cultivo, en cuanto al cultivo de S-G, se sabe que [1} la glucosa inhibe la produccin de la enzima, lo cual se comprob, pues la actividad de esta en comparacin de S-S fue demasiado baja, y por ltimo en el cultivo de G-G, al nunca haber estado la bacteria en contacto con el succinato, no se estimul la produccin de la enzima y por ello no hubo un incremento de la actividad, a esta lectura de actividad de la SDHasa, podramos considerarla como la cantidad de la enzima en estado basal. Por ultimo tenemos un factor que pudo alterar los resultados, la exposicin a la luz de los reactivos, pues como se menciona en el desarrollo experimental, para medir la actividad de la enzima se sustenta en el que esta participa en la cadena transportadora de electrones, y haciendo una cadena artificial con reactivo que son coloridos, la actividad de la enzima se puede medir, pero esta, se ve alterada, al hacerse de modo artificial, por la luz, pues el MSF y el 2,6 DFIF son foto sensibles y se reducen por la luz, mas no por la accin de la enzima, es por ello que podra verse un poco incrementados los valores de las lecturas de la actividad, pero al ser un factor que latera todo el proceso, el incremento no altera de modo directo la interpretacin de los resultados.

CONCLUSIONES. La enzima succinato deshidorgenasa es regulada por represin catablica por glucosa La produccin de la enzima solo se estimula en presencia de succinato y ausencia de glucosa El succinato como fuente de carbono provee de menos energa a la clula que la glucosa

BIBLIOGRAFA. [1] Ruiz-Herrera, J. y L. Garcia. 1972. Regulation of succinate deshidrogenase in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 72: 2935. [2] Bohinsk. Bioquimica. 5ta edicin Person-Educacin. 580, 581. [3] Voet Donald. 2009. Fundamentos de bioqumica: la vida a nivel molecular. 2 Ed. Mdica Panamericana. Buenos aires Argentina. Pg. 530. [4] Owen Peter JH Freerr. Factores que afectan la actividad de la succinato deshidrogenasa. Graficas anexas.

ANEXO.

Fotorreduccin 2,6 DFIF + MSF

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12

E 600/min

Tiempo (min)

Figura 2. Efecto de la luz sobre el Diclorofenol indofenol y el Metasulfato de frenazina.

Act. Membranas
0.7 0.6 0.5

E 600/min

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Membranas (1:11)

Figura 3. Actividad enzimtica de la succinato deshidrogenasa en las membranas.