NTE

16

Mikrobiyolojik Tan Yntemleri

Amalar
Bu niteyi altktan sonra,

nfeksiyon hastalklarnn tansnda kullanlan mikrobiyolojik tan yntemlerinin zelliklerini Hastadan mikrobiyolojik rnek alrken nelere dikkat edilmesi gerektiini Mikrobiyolojik tanda kullanlan direkt mikroskopik inceleme, kltr ve immunolojik testleri renmi olacaksnz.

indekiler

Giri Direkt Mikrobiyolojik Tan Yntemleri Mikroskopik Tan Amacyla alnan Hasta rneklerinin ncelenmesi - Mikroskopik inceleme ve kltr ndirek Mikrobiyolojik Tan Yntemleri - Serolojik testler ve Deri testleri zet Deerlendirme sorular Yararlanlan Kaynaklar

neriler

eitli mikrobiyolojik rneklerle ilgili bilgileri daha nceki nitelerden de okuyunuz. Antijen ve antikor yaplar hakkndaki bilgilerinizi gzden geiriniz.

1. GR
Genel olarak bir hastaln tans iin biri klinik, dieri laboratuvar olmak zere iki ynl inceleme yaplr. nfeksiyon hastalklarnda da bu kural geerlidir. Baz mikrobik hastalklarda sadece klinik inceleme ile kolayca tan konabilirken, byk bir ksmnda ise kesin tan ancak laboratuvar testleri ile konur. nfeksiyon hastalklarnda abuk ve doru tan konmas ok nemlidir. Zira hastaln tansnn gecikmesi hem hastann tedavisinin gecikmesi, hem de daha fazla temas olacandan evredeki kiilere bulatrmas ynnden son derece tehlikeli olabilmektedir. nfeksiyon hastalklarnn tansnda kullanlan laboratuvar incelemeleri iki balk altnda toplanabilir.

1.1. Klinik Laboratuvar Deneyleri

Bu grupta hematolojik testler (lkosit saym, periferik kan yaymas, eritrosit says, hemoglobin miktar, eritrosit sedimantasyon (kme) hz v.b.), biyokimyasal testler (idrarn kimyasal ve mikroskopik incelemesi, karacier fonksiyon testleri v.b.) ve CRP (C-Reaktif protein) saylabilir. Ayrca hastadan alnan rneklerin veya doku paralarnn (biyopsiler) patoloji laboratuvarnda incelenmesi de infeksiyon hastalklar tansnda kullanlr. Bu gruptaki deneyler nonspesifik = zgl olmayan deneylerdir. Bunlar mikroplu hastal yapan etkeni ortaya koymaz veya gstermez. Ancak konak organizmada bir infeksiyon varl ve hangi infeksiyonlar olabilecei konusunda yardmc, destekleyici bilgiler veren deneylerdir.

1.2. Mikrobiyolojik Laboratuvar Deneyleri

nfeksiyon hastalklarnda kesin tan hastaln etkenine ynelik olan bu deneylerle konur. Bu nedenle de spesifik = zgl deneylerdir. ki grupta incelenirler.

1.2.1. Direkt mikrobiyolojik tan yntemleri Hastadan alnan uygun hastalk rneinde infeksiyon hastalnn nedeni olan etken mikroorganizmay ortaya karmak, retmek ve onun hastalandrc etken olduunu kantlamak iin yaplan deneylerdir. Deneyler sonunda olumlu sonu alndnda kesin tan koydurucu deeri vardr. - 258 -

1.2.2. ndirekt mikrobiyolojik tan yntemleri nfeksiyon hastalnn seyri srasnda, etken mikrobun antijenlerine kar, organizmada oluan zgl immn cevab ortaya karmak iin yaplan deneylerdir. Hmoral tipte immn cevap sonucu oluan zgl antikorlar ortaya karan serolojik testler ile hcresel tip immn cevap oluumunu gsteren deri testleri bu grupta yer alrlar.

2. DREKT MKROBYOLOJK TANI YNTEMLER

Bir infeksiyon hastalnn tansnda etkene ynelik deneyler ok nemlidir. nk bu hastalklarda etken mikroorganizmann ortaya konmas ile kesin tan mmkn olmaktadr. Etkene ynelik deneyleri yapabilmek iin ise infeksiyonlu hastadan uygun bir muayene maddesinin alnmas gerekir. nfeksiyon hastalklarnn tansnda baarl olabilmenin ve etkeni ortaya karmann ilk art ise hastadan muayene maddesinin doru bir ekilde, usulne uygun, titizlikle alnmas ve laboratuvara ulatrlmasdr. Mikrobiyolojide rnek alma ok nemli bir konudur. nk mikrobiyolojik deneyler hematolojik ve biyokimyasal deneylerden ok farkllk gsterir. nfeksiyonlu bir hastadan uygun bir muayene maddesinin alnmas ve bunun mikrobiyoloji laboratuvarna ulatrlmas hastadan sorumlu klinisyen hekim ve grevlilerin yapmas gereken bir itir ve mikrobiyolojik ilemler zincirinin en nemli halkasn oluturur. Bilinsizce ve dikkatsizce alnan ve uygun olmayan bir ekilde laboratuvara gnderilen muayene maddesinden tanda yardmc, deerli bir sonu almak mmkn deildir, bouna zaman, emek ve maddi kayptr. Mikroplar organizmada tm doku, organ ve sistemlere yerleip, hastalk oluturabildiinden hastadan alnacak muayene maddeleri de ok eitli olabilecektir. drar, balgam, dk, kan gibi. infeksiyonlu hastadan alnacak, bu muayene rneklerinin herbirinin kendine zel alnma teknii vardr. Mikrobiyolojik tan iin

muayene maddesi = rnek alrken dikkat edilmesi gereken noktalar ile ilgili ayrntl bilgi
nite 7'de verilmitir. Burada sadece bu amala alnan eitli hasta rnekleri bir liste halinde verilmitir.

- 259 -

Mikrobiyolojik muayene maddeleri

Gz rnekleri Sins rnei Boaz srnts Kulak rnekleri Mide ierii, alk mide suyu Dk Genital rnekler Kan Deri kaznts, sa, trnak

Burun salgs Nazofarenks srnts Az alkant suyu Balgam ve alt solunum yolu rnekleri Safra, duodenal sv drar Yara rnekleri Beyin-omurilik svs (BOS)

Ponksiyon rnekleri (Periton, perikard, plevra, eklem svlar ve dier aspirasyon svlar

3. MKROBYOLOJK TANI AMACIYLA ALINAN HASTA RNEKLERNN NCELENMES 3.1. Makroskopik = Gzle nceleme
Hasta rneinin ilk nce gzle incelenmesi bazan ok yararl olabilir. rnein menenjit pheli bir hastada BOS'n bulank grnmde olmas, BOS'un bekletildiinde dibinde rmcek a olumas, bir yaradan alnan cerahatn mavi-yeil renkte olmas, ishalli hastada dknn kanl-mukuslu olmas hastaln tehisinde nemli ip ular verir ve hangi mikrobiyolojik testlerin uygulanaca konusunda ynlendirici olabilir.

Mikrobiyolojik rnein makroskopik incelenmesinin ne yarar vardr?

3.2. Mikroskopik nceleme

Hastadan alnan rnekte yaplacak mikroskopik incelemeler tanda yardmcdr. Bu iki ekilde yaplabilir.

- 260 -

LAM: Hasta rneinden preparat hazrlamak iin kullanlacak lamlar ok temiz, yasz ve iziksiz olmaldr. %50'lik alkolle temizlenmeli, temiz bir bezle silinmeli ya da alkol yaklarak kurutulmaldr. Mmknse her defasnda yeni bir lam kullanlmaldr. rnek lamn ortasna konmaldr. Kullanlm tm lamlar %4 formol veya %5 formol veya %3 hipokloridli suya atlarak dezenfekte edilimelidir. 3.2.1. Dorudan, Boyasz, Taze nceleme Baz hasta rneklerinden ok az miktarda alnarak lam zerine konur. Boyamadan, taze olarak mikroskopta incelenir. drar, BOS gibi sulu rnekler nce santrifje edilerek, kntden taze preparat hazrlanp, incelenir. Bunlarda lkosit ve bakteri grlmesi infeksiyonu dndrr. Dk incelemelerinde ise, dorudan rnek mikroskopta bakldnda, eritrosit, lkosit veya parazit grlmesi tanda yardmc olur. Cerahat, balgam genital rneklerde de, santrifuje etmeden, taze inceleme yaplmaldr.

3.2.2. Boyal, Mikroskopik nceleme Hasta rneklerinden veya saf kltr halinde retilen mikroplardan bir miktar alnarak lam zerine ince bir ekilde yaylr ve tespit edilir. Daha sonra uygun boyama yntemleri ile boyanarak mikroskopta incelenir. Gram boyama, mikrobiyolojide enok kullanlan boyama yntemidir. Gram boyama sonucunda, preparatta bakteri olup olmad, bakteri varsa Gram zellii (Gram (-) veya (+) gibi), bakterinin ekli, dizilii grlebilir. Dier boyama yntemleri ve amalar unlardr.

Ziehl-Neelsen = ARB = Asido - Resistan Boyama : Aside direnli Mycobacteria = tberkloz etkeni boyamalarnda kullanlr.

Mantar incelemesi : Pamuk mavisi denen boya ile veya %10 KOH Solusyonu ile muamele edilerek rnekler incelenir.

Gmleme yntemi: Daha ok spiral ekilli, basit boyalar almayan bakterilerin direkt mikroskopik incelemelerinde kullanlr. Sifilis gibi

Floresan Boyama : FAT = Floresan antikor teknii ile pekok mikrop, hasta rnei preparatnda dorudan gsterilebilir.

Parazit boyalar: Lugol, Eosin ve Giemsa ile dk veya dokularda parazit aranabilir.

- 261 -

nfeksiyonlu hastalardan alnan rneklerde hangi mikrobiyolojik boyama yntemleri uygulanabilir?

3.3. Kltr Yntemleri

Mikroplu hastalklarn tansnda esas ama hastadan alnan rneklerde etken mikroorganizmann saf olarak retilmesi ve idantifikasyonu (tanmlanmas) dur. Bunun iin rnekler mikrobiyoloji laboratuvarna gelir gelmez (bazlarnda daha hasta bandayken) uygun besiyerlerine ekilirler. Aratrlan hastaln zelliine gre muayene maddesi besin ortam, reme scakl, reme sresi ve oksijen younluu bakmndan ancak uygun koullarda tutulursa etken mikroplar retebilir ve tanmlanabilir. Mikroplarn retildii kltr ortamlar = besiyerleri ok eitlidir. Hem besiyerleri, hem de rneklerin besiyerlerine nasl ekildii ve reme koullar konusunda daha nceki nitelerde geni bilgi verilmitir. Normal flora iermeyen ve steril olmas gereken hasta rneklerinde (idrar, BOS, kan gibi) retilen mikroplar byk bir olaslkla hastalk etkenidirler. Boaz srnts, balgam, dk gibi rneklerde hastalk etkeni mikroplar, normal flora ile birlikte reyeceklerdir. Buradan hastalk etkeni olan mikroorganizmann saf kltr halinde ayrtedilmesi gerekir. Saf kltr halinde retilen hastalk etkeni, daha sonra idantifikasyon ilemlerine tabii tutulur ve mikrobun ismi konmaya allr. Tm bu ilemlerde eitli besiyerlerine ekim, boyalar, biyokimsal testler, immnolojik yntemler gerektii ekilde kullanlrlar. Mikrobik hastaln etkeni izole edilerek idantifikasyonu yapldnda, etkin bir tedavi yaplmas gerekiyorsa, antibiyotik duyarllk deneyi uygulanarak en uygun antibiyotigin tespiti yaplr.

Besiyerleri ve kltr ekim teknikleri ile ilgili niteleri gzden geiriniz.

4. MKROBYOLOJ LABORATUVARINDA ALIMA KURALLARI

Mikrobiyoloji labaratuvarlarnda hastalandrc mikroplarla alldndan muayene maddeleri, bunlardan yaplan preparat ve ekimler, retilen kltrler, dier eyalar, masa, banko, alet, zemin ve hava infeksiyon kayna olarak kabul edilip ok dikkatli davranlmaldr. La-

- 262 -

boratuvar alanlar nce kendilerini, ailelerini ve evresindekileri korumak grev ve sorumluluundadr. Ayrca altklar deneylerin kalitesi asndan saf kltrleri ve besiyerlernini kontamine etmemeleri gerekir. Mikrobiyoloji labaratuvarlarnda alma kurallar ylece sralanabilir:

Laboratuvarda alrken boyu ve kollar uzun olan temiz, beyaz gmlek giyilmeli, n iliklenmelidir. ok infekte materyalle alrken ek olarak arkadan balanan ameliyathane tipi gmlek (box gmlei) giyilmeli, gerekirse balk, maske ve eldiven kullanlmaladr. Laboratuvardan ayrlrken bu giysiler karlp orada braklmaldr.

Laboratuvarda fazla dolalmamal ve yksek sesle konuulmamaldr. Sert ve gereksiz hareketler yaplmamal, masalarn zerine oturulmamaldr. Laboratuvar alanlar dnda ziyaretilerin ve eitimsiz kiilerin girmeleri engellenmelidir.

Mikrobiyoloji laboratuvarlarnda yemek, imek, sigara imek tehlikeli ve genel bir kural olarak yasaktr.

Genelde bulac materyal ile alld iin personel kendini, yanndakileri ve evresini kontamine etmemeye byk zen gstermelidir.

Parmaklar, eller, kat, kalem ve dier eya yze ve zellikle aza srlmemelidir. Zarf ve etiket dile srlerek slatlmamaldr.

El temizliine ok dikkat edilmeli ve sk sk eller sabunla, ovuturarak ykanp, antiseptik solusyonla muamele edilmelidir.

Uzun sa, sakal ve byk, uzun trnak kontaminasyonu kolaylatrr. Ayrca yara, kesik, yank, ekzama gibi deri btnlnn bozulmas infeksiyona duyarll arttrr. Bu konulara zen gsterilmelidir.

Laboratuvarda kullanlan aletler daima temiz ve bakml olmaldr. alma bittiinde veya laboratuvardan ayrlrken havagaz, su, elektrik ve vakum musluklar kontrol edilmelidir.

Kullanlan kirli lam, lamel, tp, pipet ve dier malzeme, nceden belirlenen dezenfektanl kaplar iine konmal, zeler ilem ncesi ve sonras yaklmal, ortada braklmamaldr. Mikroplu tp veya petriler ak olarak masa zerine braklmamal ve gmlek ceplerine kltr ieren malzeme konmamaldr.

Laboratuvar dna herhangi bir tehlikeli kltr veya materyal karlmamaldr.

- 263 -

Mikrobiyoloji laboratuvarlarnda acele edilmemeli, yava, tedbirli, temiz ve derli toplu bir ekilde ve aseptik koullara ok dikkat ederek bilinli bir alma yaplmaldr. Ekim yaparken veya alrken pencereler kapal olmaldr.

Sterilitesinden phe edilen malzeme kullanlmamaldr. Laboratuvar kazalar ilgili kiilere hemen bildirilmelidir. Masa ve yere kontamine materyal dklrse zeri dezenfektanla slatlm bezlerle rtlmeli, bolca dezenfektan daha ilave edilmeli, birka saat bekletip, sonra temizlenmelidir. Giysi kirlenmi ise nce otoklavlanr, sonra ykanr.

Laboratuvarda sinek ve bcek bulunmamal, bunun mcadelesi yaplmaldr. Mikrobiyoloji laboratuvarnda dzenli bir ekilde temizlik ve dezenfeksiyon yaplmaldr.

Yaplan btn almalarn kaytlar eksiksiz, doru ve zamannda yaplmaldr.

Mikrobiyoloji labaratuvarnda lrken nelere dikkat edilmelidir?

5. NDREKT MKROBYOLOJK TANI YNTEMLER

Infeksiyon hastalklarnn tansnda kullanlan Immnolojik yntemler nfeksiyon hastalklarnn tansnda etken mikrobu gstermek, retmek ve ortaya karmak gtr ve her zaman mmkn olmamaktadr. Byle durumlarda hastalk srasnda etken mikroba kar, organizmada oluan zgl bak yantn ortaya konmas tan da ok yararlanlan bir durumdur. Bu yntemler de iki grupta toplanabilir. Birincisi zgl antikorlarn saptand hmoral bak yantn gsteren serolojik testlerdir. kincisi, hcresel bak yant gsteren deri testleridir.

5.1. SEROLOJK TESTLERN MKROBYOLOJK TANIDAK YER

Bak yant olaylarnn kefedildii zamandan beri infeksiyon hastalklarnda etkene kar oluan zgl antikorlar ortaya karan serolojik testler tehis amacyla kulanlmaya balanmtr. Yakn zamana kadar sadece birka eit olan bu testler, gnmzde daha da geliti-

- 264 -

rilmi ve ok yaygn kullanm alan bulmulardr. stelik sadece zgl antikor aranmas deil, mikrop antijenleri aranmasnda da kullanlmaktadr. Ayrca bu deneyler sadece serumda deil gerektiinde dier vcut svlarnda veya sekresyonlarda da uygulanmaktadr. Bu nedenle serolojik deney szc yetersiz kalmakta, immnolojik deney terimi daha uygun olmaktadr. Antijen ve antikorun zgl olarak birlemesi esasna dayanan bu testler mikrobiyolojide iki amala kullanlrlar.

Hastalk etkeni mikroplara ait bildiimiz antijenleri kullanarak hastalarn serum, BOS ve dier vcut svlarnda zgl antikorlar aranmasdr. serolojik testler diye bildiimiz deneyler bu grupta yer alr (Antikor Arama).

Daha nceden aratrma labaratuvarlarnda hazrlanm, bilinen antikorlar (antiserumlar) kullanarak eitli ortamlarda mikrop antijenleri aranmasna ve tanmlanmasna ynelik deneylerdir (Antijen Arama).

nfeksiyon hastalklarnda antikorlar kuluka dneminin sonuna doru olumaya balar, hastalk dneminde ykselme gsterir ve iyilemeden sonra da bir sre yksek dzeyde kalrlar. Daha sonra antikor dzeyi azalr. Ancak baz hastalklarda mr boyu saptanabilir dzeyde zgl antikor bulunabilir. Hastaln akut dneminde IgM snf antikorlar, daha sonra ise IgG snf antikorlar mevcuttur. Bu nedenle baz hassas serolojik testlerle zgl IgM'lerin belirlenmesi halen geirilmekte olan infeksiyon hastaln gstermede daha gvenlidir. Immnglobulin snfnn belirlenemedii serolojik testlerde ise biri hastaln balangcnda, dieri iyileme dneminde olmak zere (ortalama 2-3 hafta ara ile) iki serum rneinde antikor aranmas nerilmektedir. ki serumda yaplan testlerde antikorda art saptanmas hastalk tans lehinedir. Tek bir serum rneinde deney yapldnda ise ok yksek antikor varl tany koydurabilir. Serolojik testlerde antikor varln gstermek kadar, antikor dzeyinin (miktarnn) belirlenmesi de nem tar. Bu nedenle ou infeksiyon hastalnda antikor miktarn belirlemek iin serolojik testlerde serum sulandrlmalar yaplr. rnein serum nce yar yarya (1/2) sulandrlr, daha sonra bu sulandrmlarla devam edilerek serum 1/2,1/4,1/8,1/16, 1/32,..... gibi titre edilir. Daha deiik titrasyonlar (sulandrmlar) da yaplabilir.

- 265 -

Serolojik testlerde serum sulandrm neden yaplr?

Aada bir serum sulandrmnn nasl yapld ematik olarak verilmitir. Serum sulandrmlar serum fizyolojik veya baka tampon solusyonlarla yaplabilir.
1 0,5ml 2

0,5ml dar atlr

Kontrol tp

0,1 ml HS 0,9 ml SF 1/10

0,5ml SF 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Serum titreleri

0,5 ml SF

ekil.1 Serum Sulandrm

Deney sonucunda hibir sulandrmda reaksiyon grlmezse, serolojik test (-) negatiftir, aranan antikor yok demektir. Serolojik test tplerinde reaksiyon varsa antikor varln gsterir. Reaksiyonun grld en son tpn dilsyonu, o serumun antikor titrasyonu olarak ifade edilir (rnein 1/80 gibi).

- 266 -

Serolojik Deneylerde Kullanlan Serumun Hazrlanmas Antisepsi kurallarna uyularak hasta hayvandan alnan arter veya ven kan, ok temiz (deterjan art bulunmayan) veya mmknse steril tplere konur. Tpn zerindeki etikette mutlaka kayt bulunmaldr. Phtlama iin oda ssnda 30 dak. bekletilir. Serum ayrnca steril bir cam ubuk veya pipet ile tpe yapk ksmlar ayrlr ve 1500 rpm devirde 10-15 dak. santrifje edilir, pht ktrlr. stteki serum steril bir pipetle steril baka bir tpe aktarlr.

Tp kapal tutulmal, buharlamas nlenmelidir. Serum berrak, hemolizsiz ve steril olmaldr. Serum ya hemen deneye alnr ya da 24 saat iinde kullanlacak ise +4C de buzdolabnda bekletilir. Daha sonra kullanlacak ise -20C de saklanan serumlar zun sre zelliklerini korurlar. ok daha uzun sre saklanacak ise (-)70C ve zeri veya mertiyolat, Sodyum azid gibi koruyucu madde ilavesi yaplmaldr.

Serumda dondurma-zme ilemi bir defadan fazla yaplmamaldr. Bunun iin bir serum rneinden ka deney allacak ise o kadar fraksiyona ayrarak dondurmak en iyisidir.

KBD gibi baz serolojik testlerde serum inaktivasyonu gereklidir. Bu ilem serumun 56 C de 30 dakika bekletilmesiyle gerekletirilir. naktive serum baka bir gn deneye alnacak ise deney ncesi 10 dakikalk 2. bir inaktivasyon yaplmaladr.

Deneyin gvenlii asndan tm serolojik testlerde (+) pozitif ve (-) negatif kontrol serum deneye konmaldr.

mmnolojik deney iin kan serumu nasl hazrlanr ve konur?

5.1.1. Agltinasyon Deneyleri Bakteri, eritrosit gibi hcreler yzeylerindeki Ag'lere kar antikorlar ile karlatrldnda kmeleme olutururlar. Bu kmeleme gzle grlebilir. Ayrca lateks, bentonit gibi sentetik partikllere istenilen Ag yaptrlr ve bunlar da zgl antikorlar ile karlanca gzle grlebilen kmelemeler olutururlar. Bunlara Lateks agltinasyonu denir. Agltinasyon deneylerinde kmelenen hcre eritrosit ise bu testlere hemagltinasyon ad verilir. - 267 -

Agltinasyon deneyleri lam zerinde bir damla Ag solusyonu, bir damla hasta serumu ile kartrlarak yaplabilir. Buna lam agltinasyonu denir. rnein CRP, RF lateks lam agltinasyonlar gibi. Bu testler 1-2 dakikada sonu verirler.

Resim 1 : Lateks Lam Agltinasyonu deneyinin yapl ile negatif ve pozitif bir test sonucu

Daha hassas olan agltinasyon deneyi tp agltinasyonudur. Serolojik deney tplerinde serum sulandrmlar yaplr. Ag konur. Bir sre inkbe edilir. Aglinasyon grlen tplerdeki sonular titre ile ifade edilir. rnek deneyler: Salmonellozis'te Gruber-Widal agltinasyonu, Brucellozis'te Wright agltinasyonu gibi. Hemagltinasyon deneylerine rnek; kan gruplarnn tayini, Atipik pnmonilerde souk agltinasyon gibi. Ayrca pekok infeksiyon hastalnda kendi ismi ile anlan agltinasyon deneyi vardr. Listeria agltinasyon deneyi gibi.

Resim 2 : Tp Agltinasyonu. 1. tp (+) ve dibe km bir deney sonucunu, 2. tp ayn tpn alkalanm halini, 3. tp ise () bir deney sonucunu gsteriyor.

- 268 -

5.1.2. Presipitasyon Deneyleri Suda eriyebilen, partikl halindeki Ag'lerin, antikorlar ile birletiklerinde nce bulanklk, sonra kme oluturmas esasna dayanan testlerdir. Bu testler de tpte, dilsyonlu yaplabilir. Ancak daha ok kullanlan bir jel veya agar iinde yaplan presipitasyondur. zel olarak hazrlanm jelatin veya agar bir lam zerine veya petri iine dklerek dondurulur. Agar iine kk ukurlar alr. Karlkl ukurlarn birine Ag, dierine antikor (hasta serumu) konur. kisi de agar iinde diffze olur (yaylr). Karlatklar yerde beyaz renkte bir bulanklk = presipitasyon bant oluur. Resim 2'yi inceleyiniz. Agarda yaplan presipitasyon deneylerinde dk voltajl elektrik akm uygulandnda Ag ve antikorun diffzyonu daha hzlanr. Test sresi ksalr. Bunlara elektroimmnodiffzyon ad verilir.

Resim 3 : Presipitasyon deneyi.

5.1.3. Kompleman Birleme Deneyi Kompleman balayan antikorlarn (IgG ve IgM snf) ortaya karlmasnda kullanlr. rnek: Kist hidatik tansnda kullanlan Weinberg, Sifilis tansnda Kolmer deneyleri gibi

5.1.4. aretlenmi Antikor Deneyleri Serolojik deneylerde ama; bilinen antijen veya antikordan birini kullanarak zgl balanma ile dierini aramaya ve saptamaya yneliktir. Bu deneylerde karlalan esas zorluk, antijenle antikor birlemesi gereklese bile; bunun grlebilir, saptanabilir hale getirilmesindedir. Eski teknikler ile ok dk dzeydeki antikor veya antijen varln ortaya koyma ans azdr. Ancak iaretlenmi antikor deneyleri dediimiz bu gruptaki gelimi, yeni tekniklerle ok az miktarda bile olsa antikor veya antijen varl gsterilebilir, hatta llebilir.

- 269 -

stelik bu deneylerde aranan antikorun hangi snf olduu, ksaca Ig, G, IgM, IGA olup olmad ortaya karlabilir. Bu da infeksiyonun seyri ve tipi (akut-kronik) hakknda gvenilir bilgi verir. Bu grupta enzim-immun assay (EIA), radioimmun assay (RiA) ve floresan antikor teknikleri (FAT) yer alr. Bu deneylerde temel prensip udur: Bilinen bir antijen sabit bir yzeye nceden tespit edilir. (rnein (FAT)'de lam zerine, EIA ve RA'da polistren tp veya mikropleyt ukurlarnn i yzeyine). Ortam iine antikor aranan hasta serumu konur. Serum iinde aranan antikor varsa, tespit edilmi, bal haldeki antijenle birleir. antijenle antikor birlemesi gerekletiinde, ortama iaretli ikinci bir antikor katarak, bunun da immn komplekse balanmas salanr. Daha sonra ne kadar iaretli antikor baland llerek deney deerlendirilir. Antikor iaretli olduundan bunlarn lm de kolaydr. Eer serumda aranan antikor yoksa immn komleks olumayacak ve bylece sonradan katlan iaretli antikor da balanamayacaktr. Deney yaplrken aradaki ykama ilemleriyle balanamayan eyler ortamdan uzaklatrldndan lm srasnda ieretli antikor da saptanamaz. aretli antikorun olmamas ise aranan zgl antikorun da olmadn, ksaca deneyin negatif olduunu gsterir. Bu tip deneylerde kullanlan iaretli antikorlara konjugat ad verilir. Antikor iaretlemede floresan boyas, enzim veya radioaktif madde kullanlr. Floresan konjugat, enzim Konjugat eklinde de isimlendirilir. Deney adlar da iaretleyici maddeye gre verilir. (FAT, EIA, RA gibi). Bu deneyler standardize, hazr, kit eklinde ticari olarak hazrlanm ve kullanma sunulmutur. Yaplan ilem, kit ile birlikte verilen deney aaklamalarn aynen ve titizlikle uygulamaktadr. Enzim mmn Assay (EIA veyaELSA): aretli antikor deneyleri iinde son yllarda en geni kullanm alan bulmu ok hassas bir serolojik test yntemidir. Yukarda da akland gibi aranan antikorun antijenle birleip, birlemediini ortaya karmada, enzimle iaretli ikinci bir antikor kullanlr. Enzimle iaretli anti-immunglobun yapsndaki bu ikinci antikor, imnun komplekse balanr. Ortama enzimin etkiledii substratn eklenmesiyle renk oluumu, temelde bir spektrofotometre olan zel EIA okuyuclarn da llerek, deerlendirilir. EIA, pek ok mikrobik hastaln tansnda kullanlmaktadr. zellikle mikroskopi ve kltr yntemleriyle gsterilmesi ok zor olan bakteri, virs, parazit ve mantar infeksiyonlarn-

- 270 -

da, hem zgl antikor aranmasnda, hem de mikrop antijenlerinin saptanmasnda mikrobiyoloji laboratuvarlarna kolaylk ve yenilik getirmitir. Ayrca EIA, hormon, ila dzeyi, tmor iaretlerinin tayininde kullanlabilen bir immunolojik testir.

Antijen

Antikor (Hasta serumu)

Emzimle iaretli anti - immnglobulun

Renk deiimi

Resim 5 : EIA ile antikor lm

Resim 4 : EIA deneylerinin okuyucu aletle deerlendirilmesi.

- 271 -

RadioImmun Assay (RA): Prensip olarak EIA' e benzer. Bu deneyde antijen-antikor birlemesini ortaya karmada, radioaktif bir madde ile iaretli antikor deneye eklenmektedir. Deney sonular Gamma Coonter denen radioaktif madde len aletlerde hassas bir ekilde deerlendirilir. Kullanm alan EIA ile ayndr. Floresan Antikor Testi (FAT): Bu deneyde de prensip ayndr. Floresan boyas ile iaretlenmi antikor kullanlr. Deney sonular zel floresan mikrskoplarda deerlendirilir.Kullanm alan EIA ve RIA ile ayndr.

5.2. Deri Testleri

Deri iine Ag'li sv vererek allerji testi yapmak suretiyle, bu Ag'lere kar organizmada daha nceden bak yant oluup olumadnn gsterilmesidir. Deri testinin pozitiflii, kiinin test edilen Ag'le daha nce karlatn gsterir. Ancak deri testleri Ag'le (veya mikropla) ne zaman karlald hakknda bir bilgi vermez. nk pekok mikrobik hastalkta deri testi mr boyu (+) pozitif olarak kalr. Bu nedenle deri testi sonularnn klinik ve dier laboratuvar bulgularna ek olarak deerlendirilmesi gerekir. Deri testleri iki amala kullanlr.

Birincisi : Anaflatik tip ar duyarllk reaksiyonlarn ortaya karlmasnda kullanlr. abuk sonu verir. 5 - 30 dakika iinde. Allerjen tespitinde uygulanr.

kincisi : Hcresel tip ar duyarll gsteren ve en erken 24 saatte sonu veren testlerdir. nfeksiyon hastalklarnn tansnda uygulananlar bu gruptaki testlerdir. Tberkloz'da PPD, Kist hidatikte Casoni deri testi gibi.

zet
Hastalklarn tans, tpta enok nem ve emek verilen konulardan biridir. Hastalklarla baedebilmenin ilk koulu, doru olarak ve abuk bir ekilde tan konmasdr. Hastalk tans hem klinik hem de laboratuvar incelemeleri ile konur. Son yllrda teknolojinin gelimesine paralel olarak laboratuvar tan yntemleri de ok gelimitir. nfeksiyon hastalklarnn tansnda kullanlan mikrobiyolojik yntemler iki amaldr. Bunlardan birincisi direkt yntemlerdir, ksaca mikrobik hastaln etkenini ortaya karan, gsteren deneyler- 272 -

dir. Bu grupta direkt mikroskopik inceleme ve etkenin retilmesini ve tanmlanmasn salayan kltr yntemleri yer alr. Etkene ynelik deneyler hastadan alnan muayene maddesinden yaplrlar. Bu deneylerde baarl bir sonu alabilmek iin hastadan muayene maddesinin son derece titizlikle, usulune uygun, belli kurallara gre alnmas arttr. Aksi takdirde bouna ura verilmi olur. Mikrobiyolojik tan yntemlerinin ikincisi indirekt (dolayl) zelliktedir ve infeksiyonlu hastada etkene kar oluan zgl immn cevab gstermeyi amalar. Hmoral bak yant, ksaca zgl antikorlar gsteren deneylere serolojik testler de denir. Bunlarn ok eitleri vardr. Balcalar agltinasyon, hemagltinasyon, lateks agltinasyonu, presipitasyon, kompleman birlemesi, enzim immno assay (EIA=ELSA), Radio immuno assay (RIA), Florresan antikor teknii (FAT) deneyleridir. Hcresel immn cevab gsteren deri testleri, mikrobiyolojik tan amacyla kullanlrlar ancak deerleri fazla deildir.

Deerlendirme Sorular
1. Bir infeksiyon hastalnn tansnda etkeni ortaya karmak ve retmek iin yaplan deneyler hangileridir? A) Direkt mikrobiyolojik tan yntemleri B) ndirekt mikrobiyolojik tan yntemleri C) Serolojik testler D) Deri testleri E) Hepsi

2. Aadaki serolojik testlerden hangisinde antikorun snf (IgG,IGM veya IgA olup olmad) belirlenebilir? A) EIA. B) RIA. C) FAT. D) Hepsi. E) Hibiri.

- 273 -

3. Mikrobiyolojik rnekleri direkt mikroskopik incelemek iin enok hangi boyama yntemi uygulanr? A) Ziehl-Neelsen boyama B) Gram boyama C) Gmleme yntemi D) Floresan boyama E) KOH ile muamele

4. Serolojik testlerle ne llr veya gsterilir? A) Infeksiyon etkenine kar oluan zgl antikorlar gsterilir. B) Serumdaki hcreler gsterilir. C) Eritrosit sedimantasyon hz llr D) Kann basnc llr E) Hepsi

5. nfeksiyon hastalklarnn akut dnemlerinde serumda hangi antikorlar daha yksek saptanr? A) IgG snf antikorlar B) IgM snf antikorlar C) IgA snf antikorlar D) IgD snf antikorla E) IgE snf antikorlar

6. Aada baz serolojik test rnekleri verilmitir. Bunladan bir tanesi serolojik test deildir. Bulup iaretleyiniz. A) Agltinasyon B) Hemagltinasyen C) Presipitasyon D) Ziehl-Neelsen E) ELSA

- 274 -

Yararlanlan Kaynaklar
AKALIN, H.E , Kangra, G.; nfeksiyon Hastalklar (Akut Bakteriyel nfeksiyonlara Yaklam) Gne Kitabevi, Ankara, 1991. BARON, E.J. , Finegold, S.M. ; Diagnostic Microbiology, The C.V. Mosbly Company Nineth Edition. St. Louis, USA, 1994. BLGEHAN Hakk; Klinik Mikrobiyolojik Tan. Bar Yaynlar, Faklteler Kitabevi, zmir, 1992. HOWARDJ. Barbara et all; Clinical and Pathogenic Microbiology, The C.V. Mosby Company, Washington, D.C., 1987. JAVETZ, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A. ; Review of Medical Microbiology, Seventeenth Edition, Appleton and Lange, USA, 1987.

- 275 -

Cevap Anahtar

NTE 1
1 D, 2 A, 3 B, 4 C, 5 A, 6 E, 7 E, 8 C, 9 B, 10 C, 11 C

NTE 2
1 E, 2 C, 3 D, 4B, 5 D, 6 E, 7 B, 8 A, 9 B, 10 E

NTE 3
1 E, 2 A, 3 D, 4 A, 5 B, 6 A, 7 A, 8 D, 9 A, 10 A

NTE 4
1 A, 2 B, 3 C, 4 A , 5 E, 6 B, 7 D, 8 D, 9 B, 10 C

NTE 5
1 A, 2 A, 3 D, 4 D , 5 A, 6 C, 7 D, 8 A, 9 D, 10 D

NTE 6
1 B, 2 B, 3 C, 4 A , 5 B, 6 E, 7 B, 8 C, 9 C, 10 B

NTE 7
1 E, 2 E, 3 A, 4 B , 5 C, 6 C, 7 C, 8 B, 9 D, 10 A

- 276 -

NTE 8
1 D, 2 A, 3 B, 4 D, 5 A, 6 C, 7 A, 8 D, 9 E, 10 A

NTE 9
1 A, 2 C, 3 C, 4D, 5 C, 6 D, 7 C

NTE 10
1 A, 2 D, 3 C, 4 D, 5 B, 6 A, 7 E , 8 A

NTE 11
1 B, 2 D, 3 A, 4 B, 5 A, 6 C, 7 E

NTE 12
1 A, 2 E, 3 B, 4 C , 5 B, 6 C, 7 D, 8 C, 9 A

NTE 13
1 C, 2 E, 3 B, 4 E , 5 A, 6 B, 7 E

NTE 14
1 C, 2 B, 3 D, 4 E , 5 D, 6 E, 7 E, 8 B, 9 C

NTE 15
1 B, 2 E, 3 C, 4 A , 5 E, 6 B

NTE 16
1 A, 2 D, 3 B, 4 A , 5 B, 6 D

- 277 -