Trabajo de Investigacin de cuerpo entero Optimizacin de la produccin de un extracelular fro activo proteasa alcalina de Stenotrophomonas maltophilia MTCC 7528

y su aplicacin en la industria de los detergentes

Biodetergentes se prefieren sobre los detergentes sintticos convencionales en vista de su mejor limpieza propiedades, entrada de baja energa y la reduccin de la contaminacin. Los derivados de biodetergentes organismos mesfilos / termfilo y tambin detergentes sintticos a base de perxido requieren alta la temperatura ptima para su actividad. Por lo tanto, las enzimas activas en fro son muy tiles, ya que funcionan a menor temperaturas y no requieren el aporte de energa. El propsito de este estudio fue el optimizacin de la produccin y purificacin de la proteasa alcalina en fro activo a partir de una novela psychro-tolerante Stenotrophomonas maltophilia MTCC 7528 y su aplicacin como un aditivo para detergentes para el fro lavar. Psychro tolerante a proteoltica bacteria S. maltophilia MTCC 7528 se aisl a partir del suelo de Glaciar Gangotri, Himalaya Occidental, India, que produce mximo proteasa (56,2 U / ml) a 20 C y pH 9,0 despus de 120 h de incubacin en condiciones de agitacin (120 rev / min). La enzima purificada tiene un peso molecular de 75 kDa con la mxima actividad y estabilidad a pH 10 y 20 C de temperatura. Se mostr una excelente compatibilidad con detergentes comerciales con mayor poder de limpieza a baja temperatura. La enzima elimina completamente la sangre y manchas de hierba y aumenta la reflectancia en un 26 y 23%, respectivamente. Detergentes a base de enzimas encontrar una amplia gama de aplicaciones en ropa y textiles industrias. Proteasa alcalina en fro activo de S. psychro-tolerante maltophilia puede ser un potencial componente para ser utilizado como un aditivo detergente para el lavado de fro que ser beneficioso para ahorrar energa como que trabajan a temperaturas ms bajas. Palabras clave: proteasas alcalinas, enzimas biodetergente, fro activos, lavar el rendimiento. INTRODUCCION Biodetergentes, tambin conocidos como productos qumicos verdes, cuenta por alrededor de 30% de la produccin total de la enzima en todo el mundo. Proteasa se usa en detergentes para eliminar la protena basada manchas por hidrlisis en pequeos pptidos que son dispersarse fcilmente en el licor de lavado. En la actualidad, tiene microorganismos han reconocido que el fro-adaptado proporcionar un amplio potencial biotecnolgico y la oferta numerosas ventajas econmicas y ecolgicas mas organismos mesfilos y termfilos y sus enzimas (Gounot, 1991; Margesin y Schinner, 1994; Brenchley, 1996; Gerday et al, 2000;. Soriano et al,. 2000; Margesin et al, 2002;. Soror et al, 2007).. En fro enzimas activas, tienen mayor eficiencia cataltica a baja temperaturas y se han aplicado en la biotecnologa slo muy poco en comparacin con su mesoflico y contrapartes termfilas (Margesin et al., 2005). La aplicacin de tales enzimas permite la reduccin de la la temperatura y la reduccin de los tiempos de procesamiento sin un prdida de eficiencia, lo que conduce a ahorro de tiempo y energa el consumo. Por lo tanto, es deseable buscar nueva fuente de enzimas en fro activos con propiedades novedosas de tantas fuentes como sea posible. Si bien ha habido numerosos informes sobre las enzimas activas en fro producidos por microorganismos (Hamamoto et al, 1994;.. Hoshino et al, 1997; Kun-Hee et al, 1999;. Hoffmann y Decho, 2000; Huston et al, 2000;. Irwin et al, 2001;. Zeng et al, 2003),. muy poca informacin se ha publicado en los microbios de Gangotri regiones glaciares del Himalaya occidental que puede ser un hbitat ideal para los organismos adaptados al fro y sus enzimas. En este trabajo, reportamos la produccin optimizacin, purificacin y aplicaciones de fro-activa proteasa alcalina de Stenotrophomonas maltophilia MTCC 7528, una nueva bacteria psychro tolerante aislados del suelo del glaciar Gangotri.

MATERIALES Y MTODOS Las especies microbianas y el cultivo Una bacteria psychro tolerante a S. maltophilia MTCC 7528 fue obtenido de microbiano tipo cultura coleccin (MTCC), Chandigarh, India el producido una extracelular fro activo proteasa alcalina. La cepa se cultiv en agar de leche descremada contenida (g / l): leche desnatada en polvo, 100; peptona, 5 y agar, 15; y se almacena a 4 C (Baghel et al., 2005)

Produccin de proteasa y ensayo de la enzima La produccin de proteasa se llev a cabo en un medio que contiene (g / l): glucosa, 10; peptona, 5; extracto de levadura, 5; KH 2 Correos 4 , 1 y Sulfato de magnesio 4 0,7 H 2 O, 0,2. El pH del caldo tratado en autoclave se ajust (pH 7) mediante la adicin de Na esterilizada 2 CO 3 solucin (20% w / v). De los medios de comunicacin inoculado a 1,0% (v / v) con 24 h de edad de cultivo (OD 0,6) y se incubaron a 15 2 C en un incubador agitador refrigerado (100 rpm) durante 48 h. Los cultivos de crecimiento se centrifugaron a 4 C (10.000 xg, 15 min) y el sobrenadante se utiliz para el ensayo de proteasa. Actividad de proteasa con azocasena (Sigma) como sustrato fue ensayada por el mtodo modificado de Secades y Guijarro (1999). Una unidad de actividad de la enzima se define como la cantidad que produjo un aumentar en un 420 de 0,01 en 30 min a 20 C. La concentracin de protenas se determin por el mtodo de Lowry et al. (1951) utilizando bovino albmina de suero tal como una protena estndar Optimizacin de las condiciones de fermentacin Los mtodos adoptados para optimizar los parmetros de crecimiento de fro activo produccin de proteasa tuvo como objetivo evaluar el efecto de una sola parmetro a la vez y ms tarde se manifiesta como condicin estndar. El tiempo de incubacin que vara desde 24 hasta 168 h y los efectos de diferentes inductores (BSA, casena, leche descremada, albmina de huevo a razn de 0,5-1% en los medios de comunicacin) se evaluaron en relacin con el rendimiento de la enzima. La cultura condiciones tales como la temperatura (4-45 C), pH (5-10) y el modo de Se optimizaron las condiciones de incubacin esttica y movimiento (120 rpm). Para evaluar el impacto de los metales pesados, el caldo de los medios de comunicacin era complementado con un nivel de tolerancia mxima de diferentes metales y se incubaron en condiciones ptimas durante 48 h. Los metales pesados utilizados fueron co 2+ , Hg 2 + , Cd 2 + , Cu 2 + , Zn 2 + y Cr 2 + a la concentracin final de 50, 10, 25, 100, 50 y 150 g / ml, respectivamente. Las enzimas producida por las clulas bacterianas fueron representados en trminos de unidades de actividad de la proteasa en el sobrenadante del cultivo y se midi segn mtodo estndar (Secades y Guijarro, 1999). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los resultados son la media de tres conclusiones independientes. Extraccin y purificacin de la proteasa El caldo de fermentacin, se incubaron a condiciones optimizadas, fue se centrifug a 4 C (10.000 x g, 15 min) y la proteasa extracelular en el sobrenadante del cultivo celular libre se obtuvo por el sulfato de amonio Precipitacin (Deutscher, 1990). El precipitado de protena fue disuelto en tampn de acetato de sodio 0,05 M (pH 5) y se dializ frente al mismo tampn durante 24 h con 6-8 cambios. La fraccin con mxima actividad de enzima se aplic a la columna de DEAE-Celulosa (3 12 cm, genei Bangalore, India), equilibrada previamente con 0,02 M tampn de acetato de sodio (pH 5), y se eluy con gradiente lineal de diez De NaCl (0,1-1 M, 20 ml de cada uno) en el mismo tampn. Total de 40 fracciones, 5 ml cada una, se recogieron y analizaron para protenas y enzimas actividad. Todas las etapas posteriores se llevaron a cabo a 4 C. La fraccin con alta actividad de proteasa se concentr por liofilizacin (Liofilizador MSW137, Macro Scientific Works, India).

Caracterizacin bioqumica de la proteasa purificada Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de proteasa y la estabilidad El pH ptimo para la actividad de la enzima se determin mediante el uso tampones siguientes: fosfato de citrato (pH 5-6), fosfato de sodio (pH 7), Tris-HCl (pH 8) y glicina-NaOH (pH 9-11). Las mezclas de reaccin se incubaron a 20 2 C durante 30 min y la actividad respectiva se midi. La estabilidad de la proteasa se determin mediante la pre- la incubacin de la enzima sin sustrato a diferentes valores de pH (5 - 11) durante 1 hora a 20 2 C. La actividad enzimtica residual en cada La exposicin se midi por ensayo como estndar. El efecto de los la temperatura se determin mediante la realizacin de la prueba estndar procedimiento dentro de un rango de temperatura de 4-50 C. Para determinar la estabilidad de la proteasa con los cambios de temperatura, la enzima era pre-incubaron a diferentes temperaturas durante 3 h y la actividad enzimtica se someti a ensayo segn el protocolo estndar. SDS-PAGE y zimograma Se realiz la SDS-PAGE de la fraccin liofilizada, utilizando un mini aparato de placa de gel (Bangalore Genei, India), por el mtodo de Laemmli (1971). Las bandas de protenas se visualizaron por tincin de la gel con azul de Coomassie y la masa molecular relativa de la protena se calcul utilizando marcadores de protenas estndar (Bangalore Genei, India) ejecutar de forma simultnea. El gel se analiz con un gel Sistema de documentacin (Geneline, Spectronics Corporation, New York). Gelatina zimografa se realiz en losa de poliacrilamida gel que contena SDS y gelatina (0,1%) como un co-polimerizado sustrato. La banda de la actividad se observ como un rea transparente incoloro agotamiento de gelatina en el gel sobre el fondo azul. Compatibilidad enzimtica y el anlisis de rendimiento de lavado de proteasa alcalina para el lavado fro. Proteasa activa en fro (crudo) como un aditivo detergente se estudi por utilizando el mtodo de Beg y Gupta (2003). La compatibilidad enzima Se estudi con detergentes comerciales. La solucin de detergentes (1% w / v) se llev a ebullicin durante 10 minutos para destruir cualquier proteasa ya presente (ensayo enzimtico se realiz para comprobar la actividad). La solucin se incub con detergentes fijo concentracin de la proteasa para diferentes intervalos de tiempo (0,5-3 h) a 20 C y la actividad residual se determin en comparacin con el control (Sin detergente). Los detergentes utilizados fueron Ariel y Tide (Procter and Gamble, India), Surf Excel y rueda (Hindustan Lever Ltd., India) y Nirma (Nirma Qumica, India). Adems, la anlisis de rendimiento de lavado de enzima bruta se estudi en blanco piezas de tela de algodn (5 x 5 cm) con manchas de sangre de pollo y de la hierba

savia. Concentrado hierba savia se obtiene de la maceracin de fresco hierba (100 g en 100 ml de agua destilada) en un mortero y mano de mortero y filtrada mediante el uso de una gasa. Se permiti que las piezas de tela sucios para sentarse durante la noche y tomada en frascos separados. Los siguientes conjuntos fueron preparados: a) frasco que contiene agua destilada (100 ml) + pao sucias (con sangre y la hierba de savia, de forma independiente). b) frasco que contiene agua destilada (98 ml) + pao manchado + 2 ml detergente de la rueda (1% w / v). c) frasco que contiene agua destilada (96 ml) + pao manchado + 2 ml detergente de la rueda (1% w / v) + 2 ml de enzima en bruto. Los matraces se incubaron durante 30 min (20 C) y se enjuagaron con fro agua y luego se seca al aire. El rendimiento de lavado se analiz mediante el uso reflectancia digital de metro (Foto instrumentos elctricos, India). La reflectancia relativa de las piezas de tela fueron examinados para probar enzima la eficiencia de la eliminacin de manchas. Piezas de tela sin tratar manchados con la sangre y la hierba savia se tomaron como control (Beg y Gupta, 2003; Adinarayana et al., 2003) RESULTADOS Y DISCUSIN Optimizacin de la produccin de enzimas Efecto del tiempo de incubacin Se observ el patrn de crecimiento y produccin de enzimas de 168 horas en los medios de produccin de la proteasa a 15 2 C (pH 7). La produccin de proteasa aumenta gradualmente y fue mxima (49 U / ml) a 120 h de incubacin. La enzima la produccin fue de crecimiento independiente (Figura 1). Similar a muchas enzimas proteolticas, que tambin se secreta en gran medida en la fase de crecimiento exponencial tarda (Dube et al, 2001. Efecto de la temperatura de incubacin y el pH de los medios de comunicacin La temperatura tiene gran influencia en la produccin de enzimas microbianas. La mxima produccin de proteasa (56,2 U / ml) se obtuvo a 20 C y totalmente inhibido en 45 C. Los resultados indicaron que la alta cantidad de enzima puede ser producido en entre el rango de temperatura de 15 a 25 C (Figura 2a). Por lo tanto, puede ser aplicable para los fines industriales que tiene pequea variacin de temperatura en proceso. El pH de la cultura afecta en gran enzimticos procesos y transporte de compuestos a travs de la clula membrana. La mxima produccin de enzima era alcanzado a pH 9 (62,2 U / ml) a 120 h de incubacin y 20 C (Figura 2b). Thangam y Rajkumar (2002) tambin reportado produccin de proteasa en medio alcalino por Alcaligenes faecalis, pero fue dentro de un estrecho rango de pH. Efecto de la agitacin y diferentes sustratos La produccin de enzimas se aument dos veces a partir de 18,2 a 45,7 Um / l en condiciones de agitacin en comparacin con condiciones imperturbable. El uso de carbono y barato fuentes de nitrgeno son importantes, ya que pueden significativamente reducir el costo de produccin de la enzima. La aislar utilizado casena para la produccin mxima de enzima (52,4 U / ml) seguido de leche descremada (46,6 U / ml), BSA (37,6 U / ml) y se albmina de huevo (26,3 U / ml). Sin embargo, la leche descremada es la mejor sustrato para la produccin de enzima adaptada al fro desde

diferentes cepas de la Antrtida sea comunicada por Dube y colaboradores (2001)

Efecto de iones metlicos Los metales pesados presentes en el entorno juegan un importante papel en el crecimiento de las bacterias. La produccin de enzimas fue reforzada por Cu 2 + (126,8%) y Cr 2 + (134,6%), mientras que Co 2 + (43,5%) peor produccin. Los otros metales pesados tales como Hg 2 + , Cd 2 + y Zn 2 + no tienen ningn efecto significativo pero mantener ms de 50% de la produccin de enzimas. Purificacin y caracterizacin de la proteasa La enzima se purific parcialmente por solo paso de iones cromatografa de intercambio. La protena de pellets obtiene despus de 80% de saturacin de sulfato de amonio fue disuelto en tampn de acetato de sodio y se carg en una DEAE-celulosa columna pre-equilibrada con el mismo tampn. El perfil de elucin de la columna de DEAEcelulosa

Figura 3. Cromatografa de intercambio inico de DEAE-celulosa de sulfato de amonio precipitado con S. maltophilia sobrenadante de cultivo. Precipitado dializada se aplic a una columna (3x12 cm) equilibrada en acetato de sodio tampn (0,02 M, pH 5). La elucin se realiz con gradiente de NaCl 0,1 a 1 M. El material removido de la columna (fraccin de 0,6 M) se concentr para su posterior aplicacin. cromatografa expuesto que la proteasa se eluy como un pico nico bien resuelto de actividad de la enzima en 0,6 M Concentracin de NaCl (Figura 3). Aproximadamente 55 veces la purificacin de la enzima en bruto se logr con la actividad especfica de 20.964 U / mg y migr como una sola banda en SDS-PAGE, lo que sugiere que la proteasa purificada era homognea Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de proteasa y estabilidad La enzima era activa sobre el rango de pH de 7 a 11 con la actividad mxima a pH 10 hacia azocasena. La actividad aument casi linealmente desde pH 6 a 10, y 84% de la actividad total de la enzima se manifiesta entre los pH 8 y 11 (Figura 4a). Los resultados que recomienda la enzima es proteasa alcalina. Era relativamente estable entre los intervalos de pH de 8 a 10 y retenido ms de 93% de su actividad original (Figura 4a). Similar resultado se tambin obtenido por Margesin et al. (2005) para purificarse proteasa de Pedobacter cryoconitis. El efecto de la la temperatura en la actividad de la proteasa se muestra en la Figura 4b. La temperatura ptima de 20 C se retiene el 100% de actividad de la enzima y por lo tanto puede ser clasificado como en fro proteasa tolerante (Morita, 1975). La actividad de proteasa fue aument de 4 a 20 C despus de que se ha rechazado. La la actividad de la enzima no se vio afectada despus de repetidas congelacin y descongelacin. La enzima fue estable a 20 C junto con la actividad 85% entre 4 a 20 C (Figura 4b). Las proteasas de estas caractersticas y sus productores organismos pueden tener aplicaciones interesantes en procesos biotecnolgicos.

La masa molecular de la proteasa La masa molecular de la enzima se determin en la base de su movilidad relativa a los patrones de protenas en SDS-PAGE mediante el uso de sistema de documentacin de gel. Por interpolacin, la masa molecular del polipptido nico cadena era 75 kDa. La actividad proteoltica de la protena banda fue confirmada por anlisis de zimograma. Similar masas moleculares tambin se ha informado de otra proteasas alcalinas previamente caracterizados (Thangam y Rajkumar, 2002). Estabilidad de la proteasa con detergente y lavado anlisis de rendimiento a baja temperatura Adems de pH, se espera una buena proteasa detergente ser estable en presencia de detergentes comerciales en baja temperatura para el lavado en fro. Proteasa purificada a partir S. maltophilia expuesto tremenda estabilidad y compatibilidad con una amplia gama de localmente disponibles detergentes comerciales a 20 C (Figura 5a). Similar resultados se obtienen tambin por otros trabajadores de diferentes cepas de Bacillus sp. pero a 60 C (Adinarayana et al., 2003; Beg y Gupta, 2003). Era ms estable con

Figura 4. Influencia del pH (a), y la temperatura (b) en la actividad () y la estabilidad () de la purificado proteasa. La actividad relativa se define como el porcentaje de actividad detectada con respecto a la mxima actividad de proteasa

Detergente Wheel 'conserva la actividad 92 y el 87% despus de 0,5 y 1,0 h de incubacin (Figura 5a). Sin embargo, ms de Actividad de 65% se mantuvo con toda la probada detergentes, incluso despus de 3 h. En comparacin con la anterior resultados, es evidente a partir de la figura 5b que la proteasa alcalina de S. maltophilia exhibi alta eficiencia para la extraccin de sangre y manchas de hierba a 20 C y los aumentos la reflectancia en un 25,7 y un 23,2% de la sangre y la hierba manchas, respectivamente (Figura 5b). Por lo tanto, puede ser recomendado que la suplementacin de la fro-activa aislado proteasa alcalina a partir de S. maltophilia MTCC 7528 podran significativamente animar la limpieza de la manchas proteinceas que resulta en la remocin completa manchas a baja temperatura. Conclusin La alta actividad de las enzimas a bajas y moderadas temperaturas ofrece potenciales beneficios econmicos (Gerday et al., 2000). La capacidad de los microorganismos para crecer ms amplia gama de temperatura los hace atractivos para los aplicaciones industriales y biotecnolgicas (Kuddus y Ramteke, 2009). El presente anlisis microbiano concluy que asla la proteasa alcalina a partir de S. maltophilia MTCC 7528 es una proteasa activa en fro que es estables a pH alcalino y con detergentes comerciales. Estas propiedades indican las posibilidades de esta proteasa como un aditivo detergente para el lavado en fro para mejorar la la limpieza de las manchas protenicas. El lavado con

Figura 5. (A) La estabilidad y compatibilidad de la proteasa alcalina de S. maltophilia en la presencia de detergentes comerciales a pH 10 y 20 C de temperatura. (B) Lavado el rendimiento de la proteasa alcalina a partir de S. maltophilia en combinacin con detergente comercial (Rueda) a 20 C. Cuando, (A) de tela manchada con

sangre, (B) Tela manchada de sangre se lava con detergente solo, (C) pao manchado de sangre lav con detergente y enzima, (D) de tela manchada con la hierba savia, (E) Hierba savia manchado tela lavada con detergente solo, (F) Grass tela manchada savia lava con detergente y enzima. detergentes tambin requiere una gran cantidad de energa en particular cuando hecho a alta temperatura debido a base de perxido blanqueadores necesitan mayor temperatura para que funcione correctamente. Por lo tanto, la reduccin de la temperatura de lavado mediante el uso de fro-activa proteasa puede ahorrar mucha energa. El organismo tambin puede encontrar aplicaciones en biorremediacin ambiental de los residuos protenicos en las regiones fras.