Web CEP Priego-Montilla

Unidades Didcticas d e Biologa Molecula r

JUDTA DE AADALUO A Consejera de Educacin y Cienci a

Segundo de Bachillerato
CEP Priego-Montill a

Excma . Diputacin Provincial da Crdoba

EgI

Unidad 1: Tecnologa del ADN recombinante

Unidad 2: Biologa molecular aplicada a la salud

Unidad 3: Biologa molecular aplicada a la agricultura y a la ganadera

Unidades Didcticas de Biologa Molecular

Unidades Didcticas de Biologa Molecular

MONTILLA , 2OO3

UNIDAD I: TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE

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DESARROLLO DE LA UNIDAD DIDCTICA:

"TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE"

- Guin: 1. Justificacin de la eleccin de la unidad didctica. 2. Objetivos. 3. Tratamiento preliminar en clase como introduccin a la unidad didctica y deteccin de ideas previas. 4. Contenidos: 4.1. Indice: 4.1.1. Conceptuales 4.1.2. Procedimentales 4.1.3. Actitudinales 4.2. Desarrollo 5. Mapa conceptual de la unidad didctica. 6. Prueba de evaluacin: 6.1. Actividades de recapitulacin del tema 6.2. Modelo de prueba de evaluacin 7. Bibliografa para el profesor y para el aula.

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1. JUSTIFICACIN DE LA UNIDAD DIDCTICA ELEGIDA.La asignatura de Biologa Molecular, optativa en 2 de Bachillerato en el itinerario de Ciencias de la Naturaleza y la Salud presenta un desarrollo curricular de contenidos enfocados a las aplicaciones de los numerosos y diversos avances de la Biologa Molecular, lo que hoy da se denomina BIOTECNOLOGA y que se concretan en aspectos tales como: terapias gnicas, produccin de frmacos mediante microorganismos clonados, animales y plantas transgnicas, clonacin de animales, etc; todos ellos son aspectos novedosos de gran inters e impacto social. El curriculum de la asignatura se agrupa en los siguientes bloques didcticos: 1. Biologa Molecular: un mbito de conocimiento pluridisciplinar. 2. Biologa Molecular y Medio Ambiente. 3. Biologa Molecular y Salud. 4. Biologa Molecular, Ciencia y Tecnologa. 5. Implicaciones ticas: Biotica. El primer bloque de contenidos "Biologa Molecular: un mbito de conocimientos pluridisciplinar" trata los conceptos bsicos y los procedimientos ms relevantes de la Biotecnologa y que sern aplicados a los siguientes objetos de estudio en los restantes bloques. Dentro de este primer bloque se encuadra la UNIDAD DIDCTICA seleccionada que lleva por ttulo: "TECNOLOGA DEL ADN - RECOMBINANTE" en la cual se van a sentar las bases conceptuales, procedimentales y actitudinales para la comprensin de las posibles aplicaciones en Salud, Medio Ambiente, Agricultura y Ganadera. En esta unidad didctica se trabaja paralelamente los bloques de Ciencia y Tecnologa as como el de Biotica, ya que por una parte se desarrollan tcnicas que permiten avanzar en Biologa Molecular y los logros conseguidos en sta implica avances en estudios evolutivos, aprovechamientos de minerales de baja ley, etc. y por otra la manipulacin gentica plantea problemas ticos que debern ser debatidos en su momento y, como consecuencia, elaborar conclusiones personales fundamentadas en los conceptos desarrollados en clase.

2. OBJETIVOS.En el desarrollo de la unidad didctica se pretende conseguir en los alumnos los siguientes objetivos: a. Conocer los orgenes de la Biotecnologa (Procesos fermentativos). b. Utilizar con precisin el vocabulario cientfico relacionado con las nuevas biotecnologas (ADN recombinante, enzimas de restriccin, taxi o vectores de clonado, sondas radiactivas de cidos nuclicos, ...). c. Saber aplicar en textos cientficos correctamente los trminos especficos del 12

apartado anterior. d. Realizar una secuenciacin lgica de aplicacin de la tcnica para la obtencin del ADN-recombinante y de su clonado. e. Dibujar mapas de restriccin a partir de enzimas y fragmentos de restriccin. f. Comprender las principales tcnicas de identificacin de genes (Hibridacin de colonias, borrones de SOUTHERN). g. Aplicar la Tcnica de SANGER o de didesoxi en la secuenciacin de cidos nucleicos. h. Comprender y valorar la importancia as como la utilidad de la Tcnica de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). i. Valorar las aplicaciones que se derivan del uso del ADN-Recombinante, por cuanto facilitan el tratamiento mdico para hacer frente a enfermedades y para mejorar la produccin de especies vegetales y animales que permitan hacer frente a las necesidades alimenticias de los seres humanos.

j. Comprender y valorar la utilizacin de los microorganismos en los procesos biotecnolgicos. k. Recoger informacin de diversas fuentes con el fin de valorar los criterios sociales, polticos y econmicos presentes en las investigaciones tecnolgicas. l. Valorar la necesidad de esclarecer cdigos de conducta y normas bioticas en las investigaciones relacionadas con la manipulacin gentica en general .

3. TRATAMIENTO PRELIMINAR Y DETECCIN DE IDEAS PREVIAS DE LA UNIDAD DIDCTICA.Como introduccin a la Unidad Didctica y para detectar las ideas previas as como los errores conceptuales que poseen los alumnos se disea la siguiente actividad: En primer lugar se les reparte a los alumnos el siguiente cuestionario que debern responder para despus hacer una puesta en comn. Escribe el significado que recuerdes de los conceptos: 1. ADN - polimerasa 2. Desnaturalizacin e hibridacin del ADN 3. Genoma 4. Cdigo gentico 5. Retrovirus 6. Retrotranscriptasa 13

7. Ingeniera gentica 8. Clonacin 9. Cebador 10. Bacterifago Con este cuestionario se pretende por una parte recordar conceptos bsicos, estudiados en Biologa, necesario para entender el tema y en segundo lugar conocer las ideas que poseen los alumnos sobre conceptos ms novedosos que, si bien no se han tratado en clase, si aparecen con gran frecuencia en los medios de divulgacin (por ejemplo clonacin, ingeniera gentica, ....) A continuacin se realizar otra actividad que presenta una enfoque ms prctico y quizs ms cercano al alumno. El procedimiento ser igual que en el anterior, se repartir el siguiente cuestionario del cul, una vez contestado, se har una puesta en comn: 1. Habrs odo hablas de PRODUCTOS TRANSGNICOS Tienes idea de lo que son? Explcalo. 2. Qu opinas sobre la posibilidad de que algn da se pueda conocer toda la informacin contenida en los genes? En tu opinin expresa las repercusiones positivas y negativas de tal conocimiento. 3. Explica como crees que se fabrica la insulina que deben inyectarse los diabticos. 4. La cerveza se fabrica desde hace milenios sabras decir que tipos de organismos participan en el proceso? 5. Seala si son falsas (F) o verdaderas (V) las siguientes afirmaciones: a) Los genes se encuentran en todas las clulas. b) Es imposible que una planta pueda producir una protena animal. c) Las clulas cerebrales llevan informacin para fabricar jugos digestivos. d) Es imposible que una clula especializa de la piel de un animal pueda producir una clula embrionaria que origine un organismo nuevo entero.

4. CONTENIDOS.4.1. Indice de los contenidos:

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4.1.1. Conceptuales: - Conceptos Bsicos de Biologa Molecular e introduccin histrica. Concepto de Enzimas de Restriccin ( E. R.) o Restrictasas. Ejemplos. Aplicaciones de las Enzimas de Restriccin: Elaboracin de mapas de restriccin ( ordenacin de fragmentos de restriccin en un cromosoma ). Polimorfismo en el tamao de los fragmentos de restriccin. Formacin de ADN-recombinante. Concepto de extremos pegajosos. Principales vectores de clonado: Plsmidos bacterianos, Virus, Csmidos. Clonado de ADN y seleccin de bacterias transformadas: biblioteca genmica.

- Identificacin del ADN clonado: . Hibridacin en colonias mediante sondas especficas. Clonacin de ARNm. Obtencin de una biblioteca de ADN complementario.

- Estructuracin del ADN clonado. Borrones de Southern. Secuenciacin de ADN: tcnica de didesoxi o de Sanger.

- Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y sus aplicaciones. 4.1.2. Procedimentales: - Elaboracin de un mapa de restriccin. Identificacin de individuos mediante la huella gentica.

- Actividad de insercin de un gen en un plsmido bacteriano. Simulacin de fabricacin de un ADN recombinante sobre papel recortable.

- Secuenciacin de ADN mediante la tcnica didesoxi. 4.1.3. Actitudinales: - Debate sobre las aplicaciones del ADN-recombinante en el tratamiento mdico de enfermedades y en la mejora animal y vegetal como posible solucin al hambre en los pases subdesarrollados.

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- Anlisis crtico de la necesidad de establecer normas bioticas ante las nuevas tcnicas de manipulacin gentica.

4.2. Desarrollo de los contenidos:

INTRODUCCIN: La biotecnologa es un campo de conocimiento nuevo que se ha extendido desde principios de la dcada de los 70 considerndose como "la aplicacin de organismos, sistemas y procesos biolgicos en las industrias de productos y servicios". Cada vez se incluyen ms disciplinas en el mbito de la biotecnologa y todas tienden a cumplir dos de los objetivos ms antiguos de la humanidad: a) Controlar la reproduccin, tanto humana como animal y vegetal. b) Controlar procesos naturales que proporcionen alimentos y sustancias de inters para la especie humana. Los antecedentes histricos de la biotecnologa se pierden en la noche de los tiempos puesto que el arte de la fermentacin era ya conocido por los babilonios hace 8000 aos para la fabricacin de la cerveza. Ms tarde hace 6000 aos, los egipcios utilizaban la fermentacin para la obtencin del pan y del vino. Otros ejemplos de procesos en los que los microorganismos proporcionan alimentos a los humanos son: - La utilizacin del "cuajo" extrado del estmago de terneros para formar queso a partir de la leche. - El uso de bacterias para fabricar yogur. - La fermentacin bacteriana del vino en vinagre. - La obtencin de antibiticos como la Penicilina a partir de hongos . Sin embargo nuevos procedimientos, desde la dcada de los aos 70 hasta la actualidad, se han ido aplicando a diferentes campos basndose en tcnicas de ingeniera gentica manipulando material gentico, obtenindose una serie de beneficios impensables hace un par de dcadas y de gran trascendencia como por ejemplo : - En agricultura y ganadera: plantas y animales transgnicos, clonaciones. - En alimentacin: alimentos transgnicos. - En medicina y farmacologa: terapia gnica, nuevas vacunas, etc. - En industrias: biocombustibles, biosensores. - En medio ambiente: tratamiento de residuos, conservacin de genomas, etc. As, la ingeniera gentica ha desarrollado una serie de tcnicas con las que se ha 16

revolucionado la biotecnologa, y que se aplican como herramientas en todas las ciencias biolgicas. El hecho ms caracterstico en esta nueva tecnologa es la posibilidad de introducir material gentico extrao en una clula con lo que se alteran sus caractersticas. Estas tcnicas se han referido con diferentes nombres: tecnologa del ADN recombinante, manipulacin gentica, clonacin gnica o ingeniera gentica. La transferencia de material gentico entre clulas de manera natural ocurre entre algunas bacterias mediante el fenmeno parasexual de la transformacin y entre clulas a travs de virus por transduccin. Para que esta transferencia sea operativa debe ocurrir: 1) Entre bacterias o clulas de la misma especie y 2) El material gentico ha de integrarse en el cromosoma bacteriano o eucaritico, lo cual ocurre al azar y de forma incontrolada. La transferencia de material gentico de manera artificial entre las clulas se realiza mediante una serie de tcnicas de ingeniera gentica que abarca: - Fragmentacin de ADN mediante nucleasas de restriccin - Unin de los fragmentos de ADN a vectores de clonado - Clonado de ADN y seleccin de clulas transformadas

DESARROLLO DE LA UNIDAD: Enzimas de restriccin.De todas las enzimas utilizadas en la manipulacin de genes las enzimas de restriccin, o mas precisamente denominadas nucleasas de restriccin, tienen una importancia extraordinaria ya que constituyen una herramienta de gran precisin imprescindible para fragmentar el ADN por sitios fijos. Las nucleasas de restriccin son enzimas que cortan el ADN cada vez que encuentran una determinada secuencia de bases que es especfica para cada una de ellas, hoy da hay identificadas ms de 100 enzimas de restriccin diferentes, cada una de ellas con una secuencia especfica diferente de corte (llamada secuencia de reconocimiento o secuencia diana), que suele comprender entre 4 o 10 bases. Son una herramienta para la ingeniera gentica, que podramos equiparar a unas "tijeras moleculares", de una presicin extraordinaria. Son nucleasas que producen fragmentos cuyo nmero est en funcin de las veces que se encuentre la secuencia de reconocimiento en el ADN. Permiten por tanto, cortar el ADN en fragmentos ms cortos y de manera especfica, controlada y reproducible. Las enzimas de restriccin se encuentran en diferentes especies de bacterias y son utilizadas por estas como mecanismo de defensa frente a la invasin de virus bacterifagos. La bacteria se protege del ataque de su enzima a su propio ADN modificndolo, generalmente por metilacin de las bases, de esta forma las dianas quedan inactivadas y las enzimas solo actuaran sobre el ADN de los bacterifagos. Es interesante resaltar que estas enzimas fueron descubiertas en los aos 50, al detectarse que algunas cepas de bacterias eran inmunes a la infeccin vrica. En aquellos aos no se sabia la importancia prctica de este descubrimiento, es un ejemplo ms de como la 17

investigacin bsica, cuyo nico objetivo es el conocimiento, ha llevado a uno de los descubrimientos de mayor importancia en la biologa en cuanto a su aplicacin y rentabilidad. Por el descubrimiento pionero de estas enzimas Smith y Nathans recibieron el premio Nbel en 1978. Las enzimas de restriccin se suelen nombrar con las iniciales de la bacteria de la que se asla, seguida de alguna inicial de la cepa o nmero si existiera ms de una. As por ejemplo, la Bam H I procede de la bacteria Bacilus amyloliquefaciens H.

Actividad 1: El fragmento de ADN siguiente es digerido por las Enzimas de Restriccin Eco RI, Hae III y Not I. Escribe los fragmentos resultantes de cada enzima por separado y con las tres enzimas a la vez.

5GGCC3 3CCGG5

Hae III

5GG3 + 3CC5

5CC3 3GG5

5GATTC3 3CTAAG5

Eco RI

5G3 + 3CTAA5

5ATTC3 3G5

5GCGGCCGC3

Not I

5GC3

5GGCCGC3

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3CGCCGGCG5

+ 3CGCCGG5

3CG5

5 TTAAATTGCGGAATTCGAGCTTAAGGGCCGCGCCGAGCGGCCGCAA 3 3 AATTTAACGCCTTAAGCTCGAATTCCCGGCGCGGCTCGCCGGCGTT 5 Aplicaciones de las enzimas de restriccin: A. Elaboracin de mapas gnicos o mapas de restriccin: Las diferentes bacterias proporcionan una gran variedad de enzimas de restriccin que fragmentan el ADN por cortas secuencias de bases diferentes y especficas en funcin de la secuencia de reconocimiento del enzima. Estas enzimas, aunque proceden de bacterias, cortan el ADN de cualquier organismo produciendo una coleccin de fragmentos caracterstica, que depende de las veces que en el ADN a cortar se encuentre la secuencia diana. Es posible analizar en el laboratorio los fragmentos de ADN generados por una determinada nucleasa de restriccin separndolos en funcin de su tamao por la accin de un campo elctrico, segn la tcnica denominada electroforesis. Se mueven en un campo elctrico porque estn cargados negativamente debido a las cargas negativas de los grupos fosfato. As son atrados hacia el electrodo positivo a travs de un gel de agarosa o de poliacrilamida. Cuanto ms pequeo sea el fragmento de ADN ms rpido ser su desplazamiento ya que encontrar menor resistencia. A continuacin se tie el gel con un colorante que revela la posicin de los diferentes fragmentos que aparecen en forma de bandas en el interior del gel. Sobre una determinada muestra de ADN cada enzima dar un patrn de bandas que se denomina patrn de restriccin que viene a ser como una huella dactilar nica y caracterstica de un determinado ADN.

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Como cada nucleasa de restriccin corta por secuencias diferentes, la misma molcula de ADN cortada cada vez por una enzima diferente dar una coleccin de fragmentos o patrones de restriccin de distinto tamao. Analizando con detalle las diferentes combinaciones de fragmentos y reconstruyendo hasta encajar todas las piezas de este puzle de ADN, es posible llegar a deducir el orden de los distintos fragmentos dentro del ADN original y tener as un mapa fsico, mapa de restriccin, detallado de un determinado gen, con diferentes dianas de restriccin y sus distancias, de gran utilidad para estudios posteriores sobre el gen.

Actividad 2: Elaboracin de un mapa de restriccin: Supongamos una molcula de ADN con 10000 pares de nucleotidos o 10 Kb el cual se va a cortar con dos nucleasas de restriccin: - Con la Eco R I se generan dos fragmentos de 2 y 8 Kb respectivamente - Con la Bg 1 II se generan dos fragmentos de 3 y 7 Kb respectivamente - Con ambas conjuntamente se generan tres fragmentos de 2, 3 y 5 Kb Dibuje el mapa de restriccin que se puede deducir de estos resultados.

B. Estudio de la variabilidad gentica de los individuos debido al polimorfismo en el tamao de los fragmentos de restriccin: Las enzimas de restriccin tambin pueden utilizarse para examinar la variabilidad gentica entre los individuos de una poblacin. Las mutaciones al azar, por pequeas que sean, incluso las de una nica base, si esta afecta a una diana de restriccin, hasta las mas grandes alteraciones del tipo de amplificaciones, delecciones, inserciones y traslocaciones de genes ..., van a dar como resultado diferencias en la longitud o tamao y en el nmero de fragmentos producidos por una determinada enzima de restriccin. Tales diferencias denominadas polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP), son la base de una tcnica muy til para determinar el grado de identidad o de parentesco entre genomas. Se han identificado miles de regiones del ADN dentro del genoma humano que presentan una gran variabilidad y que se pueden usar como sondas o marcadores polimrficos. Algunas de estas variaciones pueden no tener consecuencia alguna pero otras estn asociadas a genes que producen enfermedades congnitas. Por tanto, el anlisis de RFLP tiene dos aplicaciones importantes: el diagnstico de enfermedades congnitas y la obtencin de la huella gentica individual, que sirven para la identificacin de individuos en criminologa y en medicina forense, para la elaboracin de genealogas familiares, para pruebas de paternidad y en general para estudios de evolucin debido a que permite medir el grado de afinidad gentica entre poblaciones y especies.

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ACTIVIDAD 3: IDENTIFICACIN DE INDIVIDUOS MEDIANTE LA HUELLA GENETICA

B. Elaboracin de ADN- recombinante Muchas nucleasas de restriccin producen cortes escalonados, que dejan cortos fragmentos de una sola hebra (monocatenarios) en ambos extremos. Estos reciben el nombre de extremos coherentes, ya que pueden formar pares de bases complementarias con cualquier otro extremo producido por la misma enzima. Por tanto, una molcula circular de ADN que sea cortada en un nico punto por este tipo de nucleasa de restriccin tender a formar de nuevo un crculo mediante la unin (apareamiento de bases) de sus extremos coherentes. Este tipo de extremos han sido muy importantes en la tecnologa del ADN recombinante, puesto que permiten la unin entre dos fragmentos cualesquiera de ADN, siempre que hayan sido generados por la misma nucleasa de restriccin y tengan, por tanto extremos coherentes complementarios. Los dos extremos pueden sellarse con una enzima conocida como ADNligasa, que forma enlaces fosfodiester covalentes entre los extremos opuestos de cada hebra de ADN. La utilizacin combinada de las enzimas de restriccin y del ADN-ligasa ha hecho posible injertar fragmentos de cualquier ADN en elementos autoreplicantes (plsmidos, virus,)

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Actividad 4: Realiza un ejercicio de insercin de un fragmento de ADN celular que contiene un gen con informacin para fabricar una protena insecticida en plsmido bacteriano obteniendo un ADN recombinante para clonar. Dado el plsmido bacteriano siguiente, la enzima de restriccin Eco A I y el ADN celular que contiene el gen con informacin para fabricar el insecticida

ENZIMA DE RESTRICCION de la que disponemos es ECO A I que reconoce la secuencia: C T T A A G 5G T G A A T T C A A A A3 Gen Protena Insecticida 3C A C T T A A G T T T T5 A T C T T A A G T G A A T T C T A G A A T T C A

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1) Completa la secuencia de la otra hebra de ADN en el plsmido bacteriano. 2) Utiliza la enzima de restriccin y corta ambos ADN. 3) Incluye el gen insecticida en el plsmido. 4) Cierra el plsmido mediante la enzima ligasa. Nota: utiliza colores diferentes para los dos ADN. Vectores de clonado.La obtencin de fragmentos de restriccin de ADN tiene como finalidad el incluirlos en clulas hospedadoras las cuales al multiplicarse nos van a proporcionar numerosas copias de cada uno de los fragmentos ( clones de ADN ). Para introducir los fragmentos de ADN procedente de otra clula en la clula hospedadora se han de utilizar transportadores, Taxi o vectores de clonado que son molculas de ADN autoreplicantes. Los vectores ms usados son: Los plsmidos son molculas de ADN "extracromosmicas" relativamente pequeas, circulares y que contienen al menos un gen que confiere a la bacteria alguna propiedad que facilita la seleccin de aquellas colonias bacterianas que posean el plsmido; por ejemplo, hace a la bacteria resistente a un determinado antibitico. Un plsmido es un buen vector si se replica de forma autnoma en la bacteria, y si es fcil insertar en l un ADN que se quiera estudiar. - Los bacteriofagos son tambin buenos vectores que se utilizan, en general, para aplicaciones especiales. El Bacteriofago ms utilizado es el fago lambda ( ), que tiene un genoma de solo 49 Kb empaquetado en una cabeza proteca unida a una cola que permite su inyeccin dentro de una bacteria: dentro de esta, mediante un ciclo ltico, inducir la formacin de cientos de copias iguales de su ADN. La principal ventaja de usar vectores fgicos es que el ADN extrao o forneo se empaqueta junto con el ADN del fago, formando ambos el ADN recombinante, dentro de su cubierta proteca y penetra en las bacterias por el sistema de inyeccin propio del virus. Esto aumenta enormemente la eficacia de la tcnica.

Los csmidos son plsmidos a los que se les ha insertado la regin cos del fago lambda. Son tiles para insertar fragmentos de ADN grandes. La regin cos confiere al plsmido la facilidad de ser empaquetado in vitro . As cuando se inserta un largo fragmento, el ADN recombinante se puede empaquetar dentro de la cubierta del fago y, en consecuencia, ser inyectado en la clula; una vez dentro se comporta como un plsmido enorme. As pues, los csmidos permiten la clonacin de fragmentos muy largos de ADN forneo. El vector de clonado puede entrar en la clula hospedadora mediante diversos mecanismos: sumergiendo la clula y el vector de clonado unido al ADN forneo en una solucin de Cloruro clcico a 4 C lo cual hace a la membrana ms permeable y despus se pasa la clula trasformada a 42 C. Tambin se puede aumentar la permeabilidad celular mediante campos elctricos.

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Clonado de ADN y seleccin de bacterias transformadas: biblioteca genmica El clonaje de fragmentos de ADN consiste en obtener numerosas copias del mismo utilizando un vector procaritico o vrico. Fragmentos de ADN procedentes de cualquier fuente pueden ser amplificados ms de un milln de veces insertndolos en un plsmido o en un virus bacterifago y luego cultivndolos en clulas bacterianas o en levaduras, a esto se le llama clonar ADN o copiar muchas veces un fragmento de ADN. Para ello es necesario fabricar un ADN-recombinante que contenga el ADN a clonar, por lo que el proceso implica una serie de fases: 24

1. La generacin de fragmentos de ADN a partir del genoma de la especie que se va a clonar mediante una determinada enzima de restriccin. 2. Utilizar un vector autoreplicativo ( plsmido, ADN fgico o csmido) que ser fragmentado con la misma enzima de restriccin que el ADN genmico 3. Se ponen en contacto los fragmentos de ADN con el vector y muchos de ellos, aunque no todos, se unirn mediante enzimas ligasas originando numerosos ADNrecombinantes.Una cuestin importante es saber cuantas molculas de ADNrecombinante hacen falta fabricar para asegurarse que todos los fragmentos del genoma estn representados en la coleccin. As por ejemplo, el ADN de una clula humana diploide normal contiene seis mil millones de pares de bases ( 6x10). Esto significa que para representar el ADN genmico completo hacen falta un mnimo de 300.000 ADN-recombinantes con insertos de un tamao medio de20.000 pb. Si los fragmentos de ADN son mayores o menores harn falta respectivamente menos o ms ADN-recombinantes.En la prctica se busca obtener un nmero de recombinantes varias veces superior al nmero terico para asegurar la representacin completa del genoma y para compensar el hecho de que muchos vectores no adquieren el fragmento de ADN del genoma. 4. Las molculas de ADN-recombinante se mezclan con clulas en las cuales el vector es capaz de replicarse ( clulas hospedadoras ). Las clulas captan los ADNrecombinantes, que en condiciones adecuadas cada clula capta slo una molcula. El paso siguiente es hacer la extensin de la suspensin diluida de las clulas formando una delgada pelcula sobre la superficie de una placa de cultivo, de forma tal que las clulas queden separadas unas de otras. En la placa de cultivo el vector se multiplicar al multiplicarse las clulas hospedadoras, tanto si contienen el fragmento de ADN como si no. La multiplicacin de las clulas se manifiesta por: - la formacin de colonias celulares bacterianas individuales, en el caso de que se use como vector un plsmido. - La aparicin de calvas o claros en una placa con un cultivo bacteriano, en el caso de usar como vector un ADN fgico. Las calvas corresponden a puntos donde el fago lisa las bacterias al multiplicarse dentro de ellas.En cualquier caso todas las molculas de ADN-recombinante se clonan en forma de una colonia o de una calva. 5. Debido a que no todas las bacterias han incorporado vectores recombinados o no recombinados o simplemente no han incorporado ninguno hay que hacer una identificacin de aquellos clones individuales que han incorporado el vector recombinado para que a partir de ellos se realice la clonacin de los fragmentos de ADN insertados. El camino que se debe seguir es desprenderse en primer lugar de las colonias que carezcan del vector o que posean el vector pero sin inserto. Para ello resulta particularmente til usar como vector un plsmido que contenga genes de resistencia a antibiticos, as las clulas hospedadoras que no hayan incorporado ningn plsmido al poner el medio de cultivo en contacto con los antibiticos morirn. Para aislar las colonias que contengan plsmidos con los fragmentos de ADN se tiene un truco y es usar como vector un plsmido que contenga dos genes de resistencia a 25

antibiticos diferentes ( ampicilina y tetraciclina por ej.) e insertar el ADN forneo dentro de uno de los genes que codifican para la resistencia a antibiticos. Las colonias celulares con vectores recombinantes pueden distinguirse ahora de las que poseen plsmidos inalterados gracias a que las clulas que contienen los recombinantes dejan de ser resistentes a uno de los dos antibiticos al haber sido interrumpido por la insercin del fragmento de ADN.

De esta manera se obtienen los clones que contienen todos ADN-recombinantes del genoma de la especie en cuestin. As tenemos una Biblioteca genmica o recombinante. Una biblioteca genmica o recombinante es un conjunto de clones de ADN recombinantes en los que esta representado todo el genoma de un organismo. Cada miembro de la biblioteca (tanto si es una bacteria, un fago o un virus) contiene un segmento nico del genoma humano, de ratn, de maiz, de mosca, etc. Estas bibliotecas o libreras genmicas pueden almacenarse de forma que constituyen una fuente de clones de los que se pueden aislar genes diferentes.

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El objetivo que se persigue con la clonacin de genes es estudiarlos a nivel molecular: observar su expresin en distintos huspedes, determinar su estructura tridimensional y su comportamiento, comprobar sus interacciones con otras molculas, etc.

Identificacin del ADN clonado: Hibridacin de cidos nuclicos en colonias bacterianas con sondas especficas. El siguiente problema es la identificacin de la colonia o clon que contiene el ADNrecombinante con el gen que queremos obtener. Existen una gran variedad de tcnicas todas ellas se basan en una propiedad que sea exclusiva y detectable del inserto. Slo hay dos propiedades: la secuencia de los pares de nucletidos del inserto y /o la proteina codificada para un gen incluido en el inserto clonado.Estos dos atributos van a poder permitir el clon de inters entre unos pocos millones. Uno de los mtodos es la hibridacin en colonia con sondas especficas: Se utilizan cidos nucleicos marcados con istopos radiactivos (Por ej. Timina tritiada) que poseen la secuencia del gen que se busca, lo que implica que se debe saber la secuencia de nucletidos del gen en cuestin. Las cientos de colonias bacterianas que contienen los ADN recombinantes que crecieron en la placa de Petri se transfieren a un soporte slido (normalmente una membrana de nitrocelulosa) con el fin de sacar una rplica o copia de las colonias y trabajar con ellas, dejando en reserva las originales. Para ello se coloca la membrana de nitrocelulosa directamente sobre la superficie de la placa y la introducimos en una estufa a 38C durante dos dias. Las colonias dejan su "impronta" sobre la membrana y por tanto tenemos una rplica de la placa original. A continuacin la membrana de nitrocelulosa se introduce en una solucin 05 N de NaOH de manera que las bacterias se rompan y dejen libres a los plsmidos con el ADN-rec. Se neutraliza el medio y se somete a una temperatura de 80 C para facilitar la separacin de las dos hebras de ADN contenido en los plsmidos (desnaturalizacin). Una vez desnaturalizado el ADN, la membrana se coloca en otra solucin que contenga hebras de ADN (o ARN) marcado radiactivamente, cuya secuencia es complementaria a una de las hebras del gen que se quiere encontrar. Este ADN o ARN de la solucin al estar 27

marcado con un tomo radiactivo, su deteccin posterior es posible y sencilla. All donde la hebra marcada hibride dar una seal radiactiva en la membrana, identificable por revelado en autoradiografia y nos indicar la posicin que ocupa en la placa la colonia que contiene el gen que buscamos. El ADN o ARN marcado recibe el nombre de sonda radiactiva. Una vez identificada la colonia deseada, parte de sus clulas pueden rescatarse de la placa original reservada en la estufa, utilizando una aguja estril y sembrarla de nuevo en otra placa de Petri, donde seguir multiplicando el gen ilimitadamente. Finalmente el ADNrecombinante que se encuentra en el interior de estas clulas puede purificarse qumicamente, aislndolo de las clulas, y as disponer de l en un tubo de ensayo, en cantidades suficientes para ser utilizado en muchas manipulaciones de laboratorio diferentes.

En el caso de que se desconozca la secuencia de nucletidos del segmento deseado y, por tanto, no se disponga de una sonda se recurre a otros mtodos como es el de la identificacin de la protena que sintetice el gen del inserto para lo cual hay que utilizar vectores especiales que permitan que los genes clonados se transcriban y se traduzcan. Algunas veces, esta protena le confiere a la clula hospedadora una funcin que de por s da un carcter distintivo a la clula hospedadora, lo que sirve como identificacin del gen clonado.Por ejemplo, si el gen en cuestin lleva la informacin para la sntesis de una enzima capaz de hidrolizar el glucgeno (glucosidasa), en las colonias bacterianas aisladas 28

en distintas placas aadimos glucgeno en cada una de ellas. La identificacin en el medio de cultivo de molculas de glucosa libres nos indicar la presencia del gen en cuestin. Finalmente el ADN recombinante que se ha clonado e identificado puede purificarse qumicamente de las clulas que lo contienen. Una vez que se han obtenido cantidades utilizables del gen (miligramos) podemos manipularlo en el laboratorio, almacenarlo y , adems, siempre se va a tener la posibilidad de tener cantidades ilimitadas del mismo por cultivo celular.

Clonacin de ARNm. Bibliotecas de ADN complementario No existen mtodos que permitan el clonaje directo de molculas de ARN. La forma ms conveniente de estudiar el ARN es obtener una copia de ADN y clonar esta copia. Esto se suele hacer en el laboratorio utilizando la enzima transcriptasa inversa. Esta enzima incorpora desoxinucletidos a cadenas de ADN utilizando como molde hebras de ARN. Por tanto, se produce un ADN monocatenario con una secuencia complementaria a la del ARN; y recibe el nombre de ADN complementario o cADN. A continuacin, se puede utilizar una ADN polimerasa para obtener un cADN de doble cadena y proceder a su clonaje. Estos clones de cADN son especialmente importantes para el estudio de los genes que se expresan en una clula, es decir, aquellos que se transcriben a ARNm. Todos los ARNm de un tipo celular determinado, que pueden ser del orden de miles de ARNm, pueden ser inversamente transcritos. Esta mezcla de estos cADN pueden unirse a molculas vectoras y, los ADNs-recombinantes resultantes, pueden ser introducidos en clulas hospedadoras adecuadas y clonados. A esto se le llama una biblioteca o genoteca de cADN. El manejo directo de ARNm es bastante inestable y difcil en laboratorio por eso, su conversin a cADN simplifica enormemente su estudio. El disponer de bibliotecas de cADN es importante ya que cada clula o tejido en particular de un organismo expresa un conjunto determinado de genes que es propio y exclusivo de ese tejido y del momento concreto de la vida esas clulas. De esta forma una biblioteca de cADN representa a los genes expresados, por un tipo de clula en un momento concreto. Es posible construir plsmidos de tal manera que el cADN clonado dirija la sntesis dentro de una clula de grandes cantidades de la protena que codifica el cADN. Mediante esta "ingeniera gentica" se puede inducir a bacterias o a levaduras a producir protenas tiles, como por ejemplo la insulina humana, la hormona del crecimiento o el interfern, en cantidades enormes.

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Estructuracin del ADN clonado. Borrones de Southern Una vez obtenida una copia clonada de la regin del cromosoma portadora del gen que presenta inters, la dificultad siguiente con la que se encuentra un biotecnlogo es la de localizar la posicin de dicho gen en el segmento clonado. Si ese fragmento tiene una longitud normalmente de 20.000 pb, el gen puede tener el 10% de dicha longitud, por tanto hay que localizar la posicin del gen, por ejemplo, dentro de que fragmento de restriccin se encuentra y si el gen esta completo o slo contiene una parte de l. Aqu, otra vez la herramienta bsica es la hibridacin del fragmento desnaturalizado de ADN con sondas. Una vez cortado el ADN con distintas enzimas de restriccin, los fragmentos se separan por electroforesis en un gel. A continuacin el gel se pone en contacto con una membrana de nitrocelulosa con una solucin adecuada que transfiere el ADN de gel a la membrana, donde queda atrapado fsicamente. El ADN se desnaturaliza al tratarse con una solucin de pH muy elevado y la membrana se sumerge en una solucin que contiene una sonda marcada de ADN o cADN de cadena sencilla y complementaria del gen que se quiere detectar. La posicin del gen quedar sealada por una o varias bandas

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radioactivas en los fragmentos de restriccin que lo contengan (segn como hallan cortado las diferentes enzimas de restriccin al gen).Esta tcnica se conoce con el nombre de Southern-blot. Secuenciacin de cidos nucleicos: Tcnica didesoxi o de Sanger Desde hace unos aos es posible determinar de manera rpida y sencilla la secuencia de nucletidos de los fragmentos de ADN que se desea estudiar. Por el momento la manera ms fcil y exacta de secuenciar los aminocidos de una protena consiste en secuenciar su gen y utilizar luego el cdigo gentico como diccionario para traducir la secuencia de nucletidos en la secuencia de una protena. Uno de los mtodos ms utilizados es el que invento Fred Sanger en los aos setenta:

Sanger manipul los desoxinucletidos de las cuatro bases nitrogenadas en el sentido de eliminar el OH del C 3 obtenindose 2-3didesoxinucletidos, molculas que se incorporan normalmente a las cadenas de ADN al poseer un trifosfato normal en

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posicin 5, pero, una vez incorporadas, no pueden formar un enlace fosfodiester con el siguiente nucletido detenindose la sntesis de la cadena. Para esta tcnica se preparan cuatro reacciones de secuenciacin cada una de las cuales contiene: - La hebra de ADN a secuenciar. - Un cebador( fragmento de ADN complementario a uno de los extremos de la cadena de ADN a secuenciar ) marcado radiactivamente. - ADN polimerasa, encargada de la unin de los desoxinucletidos y los didesoxinucleotidos. Un 2'-3'-didesoxinucletidos de cada una de las cuatro bases marcados radiactivamente y los cuatro desoxinucletidos, con una proporcin bien definida entre el didesoxinucletido y el desoxinucletido correspondiente. Al aadir la polimerasa del ADN, la polimerizacin comienza en el cebador, pero cesa al incorporarse un didesoxinucletido. Si la proporcin de ddNTP a dNTP est bien elegida, se produce un conjunto de cadenas marcadas cuyas longitudes dependen de la situacin del didesoxinucletido respecto al extremo del ADN. Los fragmentos resultantes se separan por tamaos en un gel de acrilamida, se autorradiografan y la sucesin de las bandas da la secuencia de la hebra complementaria a la del ADN a secuenciar. Como resultado de esta nueva tecnologa, ya se han determinado las secuencias completas del ADN de ms de 100 genes de mamfero, incluidos los que codifican la insulina, la hemoglobina, el interfern y el citocromo c.

Actividad 5. El esquema que se representa corresponde a un gel de secuenciacin por el mtodo del didesoxi. Cal es la secuencia del ADN objeto de estudio?

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Tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa Para el estudio de la estructura y de la funcin gentica de ADN de inters, se necesitan suficientes cantidades del ADN. En la actualidad es posible clonar ADN sin necesidad de clulas vivas utilizando un sistema denominado reaccin en cadena de la polimerasa, PCR ( siglas del ingls Polymerase Chain Reaction). El mecanismo es bsicamente el utilizado por las clulas en el proceso de replicacin. La potencialidad de esta tcnica es impresionante, a partir de una sola molcula de ADN, la PCR puede generar 100.000 millones de molculas idnticas en una tarde. El ADN puede proceder de una muestra de tejido de un hospital, de un cabello humano, de una gota de sangre o semen de la escena del delito, de tejido de cerebro momificado o de un mamut muerto hace 40.000 aos y conservado en el hielo... Fue desarrollada por K.B. Mullis a partir de 1983. Se utilizan porciones de la secuencia que rodean la regin que va a ser amplificada, para disear dos oligonucletidos (15-20 unidades) sintticos de ADN. Cada uno de los cuales es complementario de cada una de las cadenas de la doble hlice de ADN. Estos oligonucletidos se utilizan como cebadores para la sntesis in vitro de ADN. Esta sntesis esta catalizada por una ADN polimarasa termoestable (ha de ser as porque se requiere calentar el ADN para que se separen sus dos hebras), obtenida de una bacteria termfila que vive en aguas termales, Thermus aquaticus. Cada ciclo de la tcnica consta de tres etapas: a) Desnaturalizacin del ADN: se realiza a 94 C , para que las dos hebras de ADN se separen. b) Hibridacin: los oligonucletidos se unen a las cadenas de ADN siguiendo la regla de la complementariedad de las bases. Se realiza a una temperatura de unos 70C, pero depende de la longitud de los oliginucletidos. c) Elongacin: se realiza una replicacin normal del ADN. Cada ciclo dura aproximadamente 5 minutos y para conseguir una amplificacin til se requieren al menos 20 ciclos de reacciones. Hoy en da se realiza de forma automtica en un aparato especial que permite un clonaje rpido en un sistema libre de clulas.

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Aplicaciones de la PCR: Las aplicaciones de la PCR son numerossimas , por lo que slo vamos a comentar algunas: a) Secuenciacin Una de las razones ms comunes para el uso de esta tcnica es la generacin de suficiente ADN molde para su secuenciacin. Es mucho ms sencillo y rpido que la clonacin en clulas, y la amplificacin y secuenciacin puede realizarse en una nica operacin continua. b) Estudios de expresin Se puede utilizar para el estudio de ARNm generados por expresin gentica. En primer lugar, el ARN es transcrito en reverso para dar ADN complementario el cual es amplificado de forma usual. Estos estudios de expresin pueden mostrar cundo estn siendo expresados genes tumorales o vricos y consecuentemente si alguna terapia est funcionando. c) Biologa evolutiva y estudios de mapeo Debido a su capacidad para trabajar con pequeas cantidades de ADN de baja calidad, esta tcnica permite el anlisis de tejidos preservados de especies extintas como el mamut, as como restos antiguos humanos. Mediante el estudio de la similitud de

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secuencias en genes conservados se pueden construir rboles filogenticos. El ADN mitocondrial, con su elevado nmero de copias, ha sido la diana de eleccin para la mayora de los trabajos evolutivos. La PCR Tambin se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano, y podra ser usado para hacer los mapas genmicos de otras especies. d) Diagnostico Esta vez en este campo en el que mayor impacto ha tenido. Su velocidad y sensibilidad la han hecho la tcnica ideal para el diagnstico prenatal de enfermedades hereditrias a partir de clulas corinicas o de clulas tomadas del lquido amnitico. e) Medicina forense y pruebas de paternidad La autora de un delito y la paternidad o maternidad de una persona desaparecida o que presenta una denuncia, pueden ser resueltos en un tiempo breve con ayuda de la PCR. En el primer caso basta un pelo, una gota de sangre o de semen; en el segundo, una simple muestra de sangre de las personas implicadas. Actividad actitudinal: Anlisis crtico de la necesidad de establecer normas bioticas de manipulacin gentica

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ACTIVIDADES: TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE.

1.- Qu funcin tienen las endonucleasas de restriccin? Qu utilidades se derivan de la misma? 2.-Qu vectores son utilizados para conseguir obtener ADN recombinante en clulas transformadas? 3.- Qu es un ADN recombinante? Describir el proceso que se sigue para su obtencin. 4.- En qu se basa la seleccin de clulas transformadas con genes de inters? 5.-Qu es una sonda de cADN? 6.-En qu consiste la tcnica de Southern-blot? Para qu sirve? 7.-Cul es el fundamento de la PCR ? 8.-Un fragmento de ADN tiene la secuencia 3' CCGCATAAG 5' . Se ha secuenciado mediante la tcnica de Sanger. Cuntas bandas se observan en el gel? Cuntas bandas y de qu tamao se encuentran para cada mezcla de reaccin? 9.- El esquema que se representa corresponde a un gel de secuenciacin por el mtodo de Sanger. Cul es la secuencia del ADN objeto de estudio? 10.- A partir del artculo del periodico El Mundo EEUU analiza el ADN de los cadveres de Tora Bora explica la tcnica a seguir para la identificacin de Bin Laden en los cadveres de los soldados afganos.

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UNIDAD II: BIOLOGA MOLECULAR APLICADA A LA SALUD

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DESARROLLO DE LA UNIDAD DIDACTICA: BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A LA SALUD Indice 1. Justificacin del desarrollo de la Unidad Didctica. 2. Objetivos. 3. Tratamiento preliminar en clase de la Unidad como introduccin a la misma y para detectar ideas previas. 4. Contenidos: 4.1. Guin: 4.1.1. Conceptuales. 4.1.2. Procedimentales. 4.1.3. Actitudinales. 4.2. Desarrollo de los contenidos. 5. Mapa conceptual de la Unidad Didctica. 6. Pruebas de evaluacin: 6.1. Actividades de recapitulacin de la Unidad 6.2. Modelos de prueba de evaluacin. 7. Bibliografa para el profesor y para el aula.

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1. JUSTIFICACION DE LA UNIDAD DIDACTICA "BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A LA SALUD" La Unidad Didctica Biologa Molecular aplicada a la salud corresponde al ncleo didctico Biologa Molecular y salud del desarrollo curricular de la asignatura Biologa Molecular, optativa de 2 de Bachillerato. Una de las numerosas aplicaciones de la Ingeniera Gentica es su aplicacin a la salud. Quizs sea la que ms esperanzas supone por la posibilidad de erradicar enfermedades hasta ahora sin solucin, como son las enfermedades genticas. Los alumnos de Segundo de Bachillerato del itinerario biosanitario que eligen Biologa Molecular como optativa manifiestan tener preferencia en estudiar carreras universitarias relacionadas con este campo de la salud: medicina, enfermera, farmacia, etc., por lo que, con la intencin de preparar a dichos alumnos en conocimientos bsicos sobre temas de actualidad relacionados con la Ingeniera Gentica en estas materias, se ha desarrollado la unidad "Biologa Molecular aplicada a la salud". El inters que despierta esta unidad se basa en la creciente importancia de las aplicaciones biotecnolgicas en la vida cotidiana en aspectos tales como: Terapia gnica, produccin de frmacos por microorganismos clonados, etc. La profundizacin en estas tcnicas, procedimientos y estrategias, adems de formar en conocimientos a los alumnos, les va a facilitar la toma de decisiones personales sobre implicaciones ticas y sociales en el mbito cientfico y sus aplicaciones. Los avances que se estn produciendo da a da en Biologa Molecular aplicada a la solucin de problemas sanitarios son de tan gran rapidez, que supone para el profesorado que imparte esta asignatura una puesta al da continua y una revisin permanente de la unidad. Ejemplo de ello lo tenemos en el Proyecto Genoma, que del ao 2000 al 2001 ha quedado obsoleto.

2. OBJETIVOS Con el desarrollo de la Unidad Didctica elegida se pretende conseguir en los alumnos los siguientes objetivos: a) Distinguir las enfermedades hereditarias de las que no lo son. b) Conocer las principales tcnicas de diagnstico de las enfermedades hereditarias. c) Profundizar en tcnicas, estrategias y procedimientos a emplear en la deteccin y solucin de problemas sanitarios. d) Comprender el desarrollo cientfico-tecnolgico del Proyecto Genoma Humano, as como conocer sus objetivos y valorar sus aplicaciones. e) Reconocer las implicaciones ticas, sociales, jurdicas y comerciales que se pueden derivar del Proyecto Genoma Humano. f) Conocer las tcnicas de la Terapia Gnica como solucin a las enfermedades hereditarias, los tipos de Terapia Gnica y sus aplicaciones. g) Aplicar los conocimientos adquiridos en la Unidad Tecnologa del ADNRecombinante a la sntesis de frmacos. h) Comprender y valorar la necesidad del uso de las vacunas como mtodo preventivo de enfermedades infecciosas y conocer las nuevas tcnicas de sntesis 44

i) j) k) l) m)

de vacunas (Vacunas recombinantes) mediante Ingeniera Gentica, ms seguras y eficaces. Conocer la tcnica de fabricacin de anticuerpos monoclonales como solucin a enfermedades infecciosas. Realizar ejercicios en los que se desarrollen tcnicas que permitan a los organismos transgnicos convertirlos en fbricas de frmacos. Valorar la importancia del uso de clulas madre con fines teraputicos. Ser capaces de recoger informacin de diversas fuentes sobre las ltimas investigaciones de los temas tratados en la Unidad y analizarlos. Valorar la necesidad de establecer cdigos de conducta y normas bioticas en las investigaciones relacionadas con la manipulacin gentica.

3. TRATAMIENTO PRELIMINAR EN CLASE, COMO INTRODUCCIN A LA UNIDAD DIDCTICA, Y DETECCIN DE IDEAS PREVIAS. Con el objetivo de detectar en el alumnado las ideas previas de la unidad, as como los errores conceptuales sobre la misma, se realizar al inicio las siguientes actividades: 1- Mediante una lluvia de ideas se les plantear a los alumnos los conceptos bsicos de la unidad: - Enfermedades genticas. - Proyecto genoma. - Terapia gnica. - Sntesis de frmacos mediante ingeniera gentica. - Clulas madre. Se har un comentario con relacin a los conceptos planteados a nivel de clase, aclarando aquellos que sean errneos. 2- Contesta razonadamente si son verdaderos o falsos los siguientes apartados: - La hemofilia se puede curar. - Las vacunas solo estn formadas por microbios o sus toxinas. - Las vacas pueden fabricar medicinas en sus mamas. - No se puede saber si un embrin es portador de una enfermedad gentica hasta que nace. Esta actividad se realizar por escrito de manera particular por cada alumno y posteriormente se har una puesta en comn.

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4. CONTENIDOS

4.1. ndice. 4.1.1. Contenidos Conceptuales. 4.1.1.1. Introduccin. 4.1.1.2. Enfermedades hereditarias y su diagnstico: A. Enfermedades hereditarias. B. Diagnstico de enfermedades hereditarias. C. Tcnicas moleculares aplicadas al diagnostico clnico. 4.1.1.3. Proyecto genoma humano ( PGH ) A. Objetivos. B. Proyectos pblico y privado. C. Beneficios esperados. D. Consideraciones sociales, ticas, jurdicas y comerciales. 4.1.1.4. Terapia gnica. A. Concepto y estrategias de aplicacin. B. Categoras. C. Aplicaciones. D. Tipos. E. Problemas planteados y soluciones. F. Tcnicas. 4.1.1.5. Sntesis de frmacos mediante ingeniera gentica. A. Hormonas proteicas. B. Protenas recombinantes de actividad especfica: Muteinas C. Vacunas recombinantes D. Anticuerpos monoclonales. E. Organismos transgnicos como productores de frmacos. 4.1.1.6. Clulas madre: Concepto y aplicaciones. 4.1.1.7. Consideraciones ticas y de impacto social. Biotica. 4.1.2. Contenidos Procedimentales. 4.1.2.1. Hacer una relacin de enfermedades hereditarias y no hereditarias. 4.1.2.2. Realizar ejercicios de aplicacin de pruebas de diagnstico de enfermedades hereditarias. 4.1.2.3. Comentar de forma crtica las repercusiones sociales, ticas, jurdicas y comerciales del PGH. 4.1.2.4. Identificar distintos tipos de terapia gnica en artculos periodsticos cientficos. 4.1.2.5. Anlisis de las ventajas de los frmacos elaborados mediante tcnicas de ingeniera gentica sobre los frmacos tradicionales. 4.1.2.6. Valorar las posibles ventajas sanitarias del uso de las clulas madre a partir de diversas fuentes de informacin. 4.1.3. Contenidos Actitudinales. 4.1.3.1. Valorar el espritu investigativo en su afn de solucionar los distintos tipos de enfermedades. 46

4.1.3.2. Reconocer la importancia del PGH y sus repercusiones en el futuro sanitario. 4.1.3.3. Adoptar un espritu de curiosidad ante las posibles soluciones representadas por la terapia gnica en las enfermedades genticas. 4.1.3.4. Reconocer la necesidad de que todos los frmacos, tanto tradicionales como de sntesis mediante ingeniera gentica, lleguen a todas las personas independientemente de sus circunstancias socioeconmicas. 4.1.3.5. Fomentar en los alumnos una capacidad crtica sobre los temas tratados en la unidad didctica.

DESARROLLO DE LOS CONTENIDOS.

4.1.1.1. INTRODUCCION Uno de los campos de aplicacin ms espectaculares de la biologa molecular es el de la medicina. Los avances ms significativos en este campo se estn enfocando fundamentalmente, al diagnstico y terapia de enfermedades congnitas, a prevenir enfermedades infecciosas fabricando nuevas vacunas y a mitigar enfermedades degenerativas a travs de arreglos metablicos en su base gentica o fabricando nuevos tejidos mediante la adecuada manipulacin de las llamadas clulas madre. Desde mediados de los aos 70, con la ayuda de nuevas y poderosas tecnologas para la manipulacin y anlisis del ADN, el campo de la gentica mdica se ha transformado. Hoy en da, los cientficos son capaces de localizar e identificar genes que generan protenas esenciales, caracterizar sus mutaciones y estudiar sus productos proteicos, llegando as a entender la causa de muchas enfermedades. La aplicacin comercial de la llamada tecnologa del ADN recombinante se inici en esta dcada, siendo los pioneros pequeas compaas de biotecnologa que arriesgaron su capital para producir principalmente protenas de inters teraputico y las vacunas recombinantes, que evitan inocular al microorganismo por lo que son ms seguras y eficaces. Fue a principios de loa aos 90, cuando se decidi unir esfuerzos en este campo a nivel internacional y comenz uno de los grandes proyectos de la humanidad, el Proyecto Genoma Humano, cuyo objetivo era localizar y secuenciar todos los genes que contienen nuestros cromosomas. ste proyecto finaliz en el 2001, mucho antes de lo que estaba previsto, y supone el punto de partida para estudios de biologa humana y medicina. En este tema nos acercaremos, por tanto, a las distintas aplicaciones de la biologa molecular en el campo de la salud, como el diagnstico, tratamiento de enfermedades y el Proyecto Genoma, para tratarlas desde las posibilidades actuales y ver cuales son sus perspectivas futuras.

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4.1.1.2. ENFERMEDADES HEREDITARIAS Y SU DIAGNSTICO.

A. Enfermedades hereditarias Se calcula que el 60 % de la poblacin humana sufre una enfermedad gentica a lo largo de su vida. Muchos de los trastornos genticos se heredan de padres afectados o portadores de la enfermedad, pero tambin pueden surgir espontneamente, a causa de errores en la meiosis, o durante las divisiones celulares que siguen a la fecundacin. Otros trastornos pueden manifestarse en clulas somticas en una etapa posterior de la vida, as es como comienzan casi todos los cnceres. Hay que diferenciar el estado de portador de defectos gnicos del estado de enfermo debido a un defecto gnico. Se estima que todos los individuos son portadores de unos 7 defectos gnicos muy graves en su genoma, pero stos no se expresan gracias a la existencia de alelos sanos, ya sean paternos o maternos, que suplen la funcin de los alelos alterados. La coincidencia de un mismo defecto gnico en la descendencia es baja y solo el 1-2 % de los nacimientos se producen con defectos gnicos graves. No obstante, si se consideran las enfermedades polignicas o multifactoriales (diabetes, arteriosclerosis..) o enfermedades, como el cncer y el Alzheimer, que aparecen a una edad ms avanzada, entonces el porcentaje de individuos afectados se acerca, a la mayora de la poblacin. Entre los trastornos que se deben total o parcialmente a factores genticos encontramos tres tipos: a) Trastornos monogenticos: son provocados por genes mutantes (muchas veces la alteracin se debe a la diferencia en un solo nucletido).La mutacin puede estar presente en un solo cromosoma de un par o en ambos cromosomas homlogos. La mayor parte de estos defectos son raros, con una frecuencia de hasta 1 en 500, aunque normalmente es menor. Se conocen actualmente ms de 5000 enfermedades monogenticas. En centenares de ellas se ha reconocido el defecto bioqumico bsico y, en muchas, se ha aislado y clonado el gen responsable. Algunas se deben a alelos mutantes recesivos como la anemia falciforme, la hemofilia, el albinismo o la fenilcetonuria; otras muchas son causadas por alelos mutantes dominantes, como el corea de Huntington o la acondroplasia (una de las causas de enanismo). b) Trastornos cromosmicos: el defecto se debe a un exceso o deficiencia de los genes contenidos en los cromosomas. Estas enfermedades se deben a cambios en la estructura de los cromosomas, como duplicaciones, delecciones, inversiones y traslocaciones, que pueden alterar genes si la rotura se produce en medio de un gen. Adems, las recombinaciones pueden separar algunos de los genes de las secuencias de ADN que los controlan, con graves consecuencias para la expresin de los genes. Tambin, este tipo de trastornos se debe a alteraciones en el nmero de cromosomas, cuando stos no se separan como deben durante la meiosis.

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Los trastornos cromosmicos son muy comunes, afectan aproximadamente a 7 de cada 1000 nios nacidos vivos y provocan cerca de la mitad de los abortos espontneos en el primer trimestre de embarazo. c) Trastornos polignicos o herencia multifactorial: cuando las enfermedades son debidas a la combinacin de numerosos genes defectuosos, produciendo defectos en el desarrollo que causan malformaciones congnitas y muchos trastornos frecuentes en la edad adulta. En este tipo de tipo de enfermedades parece jugar un importante papel los factores ambientales. Numerosas variedades de cncer, la artritis reumatoide o la esclerosis mltiple, son trastornos de este tipo.

B. Diagnstico de enfermedades hereditarias. Como es mejor centrar los esfuerzos en la prevencin de enfermedades que en la curacin de stas, la medicina emplea tcnicas de diagnstico y prevencin para la deteccin de enfermedades genticas o para evitar su propagacin a nuevos descendientes. Entre las tcnicas utilizadas destacan las siguientes: a)Consejo gentico: se aplica en familia que tienen antecedentes de enfermedades genticas. Se trata de suministrar informacin sobre la probabilidad de tener descendientes afectados por una enfermedad hereditaria; para lo cual se necesita el rbol genealgico de la familia y la realizacin de estudios genticos (bsqueda de genes concretos con sondas radiactivas o de anormalidades en los cromosomas). b)Estudios de diagnstico prenatal: el anlisis de clulas obtenidas de feto ofrece la posibilidad de predecir el defecto gentico con suficiente antelacin para permitir la opcin del aborto y evitar as el nacimiento de individuos afectados. Para detectar tales defectos genticos, se toman clulas del lquido amnitico, se separan de otros componentes y se cultivan, para realizar un anlisis citogentico (analizar cromosomas), analizar protenas, reacciones enzimticas y otras propiedades bioqumicas. Este proceso, llamado amniocentesis puede hoy detectar un gran nmero de defectos conocidos. c)Estudios en recin nacidos: para la deteccin de algunas enfermedades hereditarias que pudieran aparecer en un futuro prximo o lejano. Un ejemplo de ello, es el anlisis de sangre que se efecta para detectar la fenilcetonuria (a uno de cada 15.000 bebs les falta una enzima que debera transformar el aminocido fenilalanina en tirosina), causante de un retraso mental en los que la padecen.

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Tabla N 1: Algunas enfermedades genticas comunes Errores innatos del metabolismo Incidencia aproximada entre nacimientos vivos.

1. Fibrosis qustica 1/1600 Caucasianos 2. Distrofia muscular de Duchenne /3000 varones (ligado al cromosoma X) 3. Enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa defect)1/2500 Judos Ashkenazi 1/75000 otros 4. Enfermedad de tay-Sachs (hexosaminidasa defect) 1/3500 Judos Ashkenazi, 1/50000 otros 5. Pentosuria esencial (condicin beningna) 1/2000 Judos Ashkenazi; 1/50000 otros 6. Hemofilia clsica (factor VIII coagulacin defect) 1/10000 varones (ligado al cromos. X) 7. Fenilcetonuria (hidrolasa de fenilalanina defectuosa)1/5000 irlandeses celtas; 1/15000 otros 8. Cistinuria (gen mutado desconocido) 1/15000 9. Leucodistrofia metacromtica (arilsulfatasa A defectuosa) 1/40000 10. Galactosemia (transferasa de uridilo a galactosa 1-fosfato defectuosa) 1/40000 C.Tcnicas moleculares aplicadas al diagnstico clnico. El estudio de una enfermedad gentica ha de incluir adems del diagnstico clnico el anlisis molecular y/o citogentico, porque una prueba de laboratorio puede en muchos casos ser fundamental para el consejo gentico. La gentica para la medicina, ha pasado en poco tiempo de ser una ciencia bsicamente descriptiva a ser una ciencia en la que el anlisis molecular desempea un papel esencial y en la cual la intervencin teraputica comienza a estar basada en los datos moleculares. Desde el desarrollo de la tcnica de Southern en 1975 hasta el incipiente uso de loa microchips de ADN en la actualidad, se han desarrollado mltiples estrategias moleculares que permiten desvelar la compleja relacin entre gentica y enfermedad. En este apartado haremos un breve repaso a las tcnicas ms utilizadas en los laboratorios dedicados al diagnstico molecular de enfermedades genticas. Anlisis citogentico: En el anlisis citogentico se pueden detectar grandes alteraciones del genoma al microscopio, como grandes delecciones, grandes inserciones, traslocaciones o alteraciones en el nmero de cromosomas. Actualmente se sigue utilizando en el diagnstico prenatal, pero tambin es una herramienta muy til para el estudio de clulas tumorales. Entre las tcnicas de citogentica molecular destacan: 1.- La hibridacin in situ: que permite detectar y localizar secuencias especficas de cidos nucleicos, en cromosomas, clulas y tejidos; utilizando fragmentos de ADN o ARN marcados (sondas), que hibridan especficamente con sus secuencias complementarias de ADN o ARN citoplsmico. Cuando se desarrolla esta tcnica en 1969 la nica posibilidad de marcar las sondas era la radiactividad, actualmente se marcan con molculas fluorescentes fciles de manejar y detectar Esta tcnica se utiliza de manera rutinaria en los hospitales para el diagnstico y seguimiento de muchas enfermedades:

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- detectar aneuploidas cmo los sndromes de Down (trisoma 21), Patau (trisomia 13), Turner (XO)...para un diagnstico prenatal. Pero tambin las alteraciones en el nmero de cromosomas son muy frecuentes en procesos malignos y aparecen en tumores slidos y en leucemias (trisomia 12). detectar un cromosoma especifico para estudiar traslocaciones e inserciones. detectar un locus o una secuencia gnica determinada. Se utilizan en el estudio de microdelecciones como las responsables de sndromes como el maullido del gato, sndrome de Williams, etc. Tambin son de gran utilidad en el diagnstico, pronstico y seguimiento de cnceres que presentan microdelecciones, reordenamientos o amplificaciones gnicas.

2.- La hibridacin genmica comparativa: en esta tcnica se parte de un ADN tumoral marcado con fluorocromo de un color determinado (verde), que se compara con un ADN normal (control), marcado de distinto color (rojo). Ambos ADN compiten en la hibridacin sobre metafases previamente obtenidas a partir de un cultivo de sangre perifrica de un individuo normal. Si el ADN tumoral presenta delecciones, stas no hibridarn en las regiones homlogas presentes de las metafases normales, pero si lo har el ADN control. Por el contrario, si el ADN tumoral presenta regiones amplificadas competirn con ventaja en la hibridacin. As, mediante un microscopio de fluorescencia, se pueden determinar las ganancias y prdidas de material gentico del tumor con un solo anlisis. Esta tcnica no solo permite conocer el diagnstico, pronstico de un tumor, sino tambin conocer su evolucin, desde su origen hasta la formacin de metstasis. Anlisis molecular: La alteracin de un gen puede implicar desde un nico nucletido (mutacin puntual), hasta la eliminacin o duplicacin de grandes segmentos de ADN de millones de nucletidos. Las diferentes bacterias proporcionan una gran variedad de enzimas de restriccin que fragmentan el ADN en cortas secuencias de bases diferentes y especficas en funcin de la secuencia de reconocimiento de las enzimas. Estas enzimas, aunque proceden de bacterias, cortan el ADN de cualquier organismo produciendo una coleccin de fragmentos caracterstica, que depende de las veces que en el ADN a cortar se encuentre la secuencia diana. Es posible analizar en el laboratorio los fragmentos de ADN generados por una determinada nucleasa de restriccin separndolos en funcin de su tamao por la accin de un campo elctrico, segn la tcnica denominada electroforesis. Los fragmentos se mueven en un campo elctrico por las cargas negativas de los grupos fosfato siendo atrados a travs de un gel de agarosa o poliacrilamida. Cuanto ms pequeo sea el fragmento de ADN mas rpidamente se desplazara al encontrar menos resistencia. La tincin del gel con un colorante revela la posicin de los diferentes fragmentos en forma de banda en su interior. Sobre una determinada muestra de ADN cada enzima dar un patrn de bandas que se denominan patrn de restriccin. Las mutaciones al azar, por pequeas que sean, incluso las de una nica base, si sta afecta a una diana de restriccin, hasta las ms grandes alteraciones del tipo de amplificaciones, delecciones, inserciones y traslocaciones de genes..., van a dar 51

como resultado diferencias en la longitud o tamao y en el nmero de fragmentos producidos por una determinada enzima de restriccin. Tales diferencias denominadas polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin ( RFLP ), son la base de una tcnica muy til para diagnosticar muchas enfermedades congnitas. A la velocidad con que estn siendo localizados nuevos genes responsables de enfermedades y que son aislados e identificadas sus mutaciones, el diagnostico gentico mediante el anlisis de ADN crear tanta demanda que har falta un anlisis automatizado, como sucedi en la qumica clnica en la dcada de los 60. Algunas reas particularmente interesantes en la investigacin gentica son las correspondientes a diagnsticos prenatales, la predisposicin hereditaria a padecer enfermedades del corazn y al cncer. Todo esto se ve aun ms cerca desde que se public la secuencia completa del genoma humano a principios de 2001.

4.1.1.3. PROYECTO GENOMA HUMANO El Proyecto Genoma Humano supone un gran esfuerzo internacional, con el gran objetivo de identificar todos los genes que se encuentran en el ADN humano y secuenciar los 3.000 millones de nucletidos que lo componen; aunque el objetivo ltimo de este proyecto es interpretar el significado, el funcionamiento, la regulacin, la evolucin y la variabilidad de esta secuencia. La disponibilidad de esta informacin hace prever una revolucin en la medicina y biotecnologa sin precedentes. En 1984 se reunieron en Alta (EE.UU.) un grupo de cientficos con el objetivo de discutir la posibilidad de detectar directamente mutaciones del genoma con los mtodos disponibles. La conclusin fue que no era posible sino se pona en marcha un programa de gran envergadura y coste. En 1986 se reunieron 50 expertos en Santa Fe (EE.UU.) y concluyeron que secuenciar el genoma humano era posible y muy interesante. A partir de ese momento se produjeron numerosas reuniones donde esta propuesta adquiri el nombre de Proyecto Genoma Humano comenzado de manera oficial en 1990 bajo la direccin del premio Nbel, James Watson y con un plazo de 15 aos. A. Objetivos del Proyecto Genoma Las tcnicas bsicas de ingeniera gentica y gentica molecular permitan analizar uno o varios genes, pero eran insuficientes para un anlisis masivo de genes; por tanto uno de los primeros objetivos del proyecto fue el desarrollo de nuevos mtodos que permitiesen incrementar la cantidad de bases analizables simultneamente. Las tcnicas de secuenciacin solo permiten conocer unas 400 o 1000 bases a la vez, por lo tanto, la determinacin de secuencias continuas ms amplias debe realizarse por reconstruccin a partir de pequeas secuencias parciales. Para conocer el orden y posicin de las distintas secuencias parciales del ADN es muy importante el anlisis del genoma a niveles de resolucin bajos, pero que nos ofrezcan una visin de conjunto. As, pues los siguientes objetivos del proyecto fueron la construccin de mapas fsicos y genticos de baja resolucin para ubicar en fases sucesivas niveles de resolucin crecientes y llegar al mapa ms detallado, la secuencia de los 3.000 millones de pares de bases que componen el genoma humano ( Figura 3 ).

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a) M m a a) Mma) Mapas genticos: la construccin de los mapas genticos se basa en la determinacin de la frecuencia de herencia de distintos marcadores genticos o caractersticas fenotpicas (diferencias en la secuencia de un gen) en cada uno de los individuos de un rbol genealgico. Dos locus estn genticamente ligados si los alelos correspondientes detectables se heredan juntos, con una frecuencia significativamente superior a la que se heredara si se ubicaran en distinto cromosoma, ya que hay una unin fsica entre ellos y tienen tendencia a heredarse juntos. Debido a la existencia del fenmeno de entrecruzamiento en la meiosis, sabemos que cuanto ms cerca estn dos locus , menor es la probabilidad de entrecruzamiento y mayor la probabilidad de que se hereden juntos. A base de analizar las frecuencias de herencia de los distintos marcadores en multitud de individuos de un rbol genealgico es posible calcular la distancia gentica entre ellos, y as podemos tener una idea aproximada de la localizacin de los genes en los cromosomas. En 1994 se termin el primer mapa gentico de todo el genoma humano, con una resolucin de 2-5 cM (centimorgans en honor al genetista Thomas H. Morgan). Una distancia gentica de 1 cM equivale aproximadamente a una distancia fsica de 1 milln de pares de bases (1 Mb).

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b) Mapas fsicos: son mapas que nos indican la distancia fsica existente entre los distintos marcadores. Existen distintos tipos, pero hay dos que destacan por su importancia dentro del Proyecto Genoma Humano: los mapas fsicos de restriccin y las genotecas ordenadas. La construccin de mapas fsicos de restriccin se basa en la fragmentacin de los cromosomas y el ordenamiento preciso de los fragmentos resultantes. Se empieza cortando el ADN en fragmentos grandes y separndolos mediante electroforesis. El mapa est terminado cuando se consigue demostrar la continuidad entre los distintos fragmentos delimitados por los sitios de restriccin. Como se parte del cromosoma completo, los fragmentos son pocos y relativamente grandes, por lo tanto el mapa es completo pero de baja resolucin. El inconveniente de este tipo de mapas es que al final no se dispone de ADN en condiciones adecuadas para proceder a su secuenciacin. Es decir, se obtiene solamente un mapa sobre el papel. Para la construccin de un mapa fsico de tipo genoteca ordenada ( Fig.4 ) se parte de una coleccin desordenada de clones (fragmentos del cromosoma introducidos en plsmidos), que hay que ordenar para reconstruir el cromosoma original. Para encontrar el orden de los distintos clones entre s, se analiza y compara el patrn de fragmentos (nmero y tamao) que se obtiene al cortar el ADN de los clones individualmente. La deteccin de bandas comunes en dos o ms clones es indicativa de que contienen regiones idnticas y, por lo tanto, de que se solapan. Un grupo de clones ordenados entre s se denomina cntigo. La ventaja de este tipo de mapa es que en cualquier momento se dispone de ADN listo para proceder a su secuenciacin.

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La integracin de los mapas genticos y fsicos, es imprescindible. El mapeo gentico mediante anlisis de ligamiento es la nica estrategia que permite detectar la regin del genoma responsable de una enfermedad hereditaria de la cual slo se conoce su manifestacin externa o fenotipo. Pero ya se ha mencionado que los mapas genticos presentan dos inconvenientes, su baja resolucin y la falta de correspondencia entre la distancia fsica (bases) y la distancia gentica (cM) a lo largo del cromosoma. La integracin del mapa gentico en el mapa fsico soluciona todos los problemas. En la figura 3 se muestran diversos tipos de mapas integrados hasta llegar a la secuencia del ADN. Pero el proyecto no acaba aqu, sino que se propone interpretar la secuencia. Esto significa encontrar todos los genes y regiones reguladoras y averiguar cmo se interrelacionan.
B. Proyectos Genoma: pblico y privado.

El Proyecto Genoma Humano oficial se trata de un consorcio cientfico internacional encabezado por los Institutos Nacionales de Salud de EE.UU. y la fundacin britnica Wellcome Trust. Despus de 13 aos llevan gastados 250 millones de dlares y cuentan con la colaboracin de ms de un millar de cientficos y tcnicos de 16 laboratorios de EE.UU, Gran Bretaa, Francia, Canad, Alemania y Japn. Su actual director, Francis Collins, en la primavera del ao 2000 anunci que ya haban ledo las dos terceras partes de la molcula de ADN y tenan el primer borrador con el 90 % del genoma y con una precisin del 99 %. Por otra parte, un antiguo director del proyecto, Craig Venter en 1998 decidi continuar la aventura en solitario y fund una empresa llamada PE Celera Genomics de la que es el presidente, tomando la delantera al consorcio pblico internacional. En la primavera del ao 2000 anunci que ya tenan la secuencia de bases completa del genoma humano. Las estrategias utilizadas por el grupo pblico y el privado son casi opuestas. El consorcio pblico ha procedido de una manera lenta y ordenada, elaborando primero mapas a gran escala de los cromosomas (genticos y fsicos) y aumentando poco a poco su resolucin (como hemos explicado anteriormente). En Celera, sin embargo, se ha utilizado una tcnica ms radical e imprecisa que se conoce como shotgun (escopeta de genoma total), que consiste en partir de un golpe el genoma en 70 millones de fragmentos de forma aleatoria y secuenciar cada uno de ellos. La dificultad est en ordenarlos, trabajo que realizaron los superordenadores de la compaa privada en pocos meses. Desde el 12 de Febrero de 2001 ya se dispone de la secuencia del primer borrador del genoma humano y, lo ms importante, todo el mundo puede acceder libremente a travs de Internet a estos datos. La presentacin se realiz conjuntamente con la presencia del director del consorcio pblico y el presidente de la empresa privada Celera Genomics. Una de las primeras sorpresas que se observan al tener la secuencia completa, es el hecho de que tengamos solamente 35.000 genes cuando las primeras estimaciones cifraban ms de 100.000. Esto viene a significar que el resto de seres vivos no son en modo alguno simples, y por otra parte tambin significa que un pequeo incremento en el nmero de genes dispara nuestra complejidad, lo que hace que no seamos slo el resultado de la suma de nuestros genes sino que el resultado final depende de las relaciones que entre ellos se producen.
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Otro aspecto muy interesante, ha sido el descubrir que todos los seres humanos compartimos un 99,98 % de nuestro material gentico, lo que derrumba muchos argumentos a favor de la discriminacin racial. Sabemos pues, que somos individuos de una nica especie, la especie humana, y el trmino raza slo sirve para definir grupos que presentan diferencias externas, debidas a nfimos cambios que han permitido al hombre adaptarse a los ms recnditos hbitats de este planeta. Pero queda mucho por hacer, tenemos ahora un borrador del genoma humano al que todava le faltan algunas piezas por colocar. El Proyecto Genoma Humano tratar de tenerlo completo en el 2003 y la empresa Celera dice que ya tiene el 99% de los 23 cromosomas humanos. Tambin, queda por catalogar las variaciones en el ADN humano, los cambios que son responsables de las enfermedades y quedan por identificar la mayora de los genes y su funcin. Hace falta saber que gen produce cada protena, que papel juega cada protena en un individuo sano. Tambin, hay que investigar el papel de ciertas protenas en diversas enfermedades y si su manipulacin puede servir para curarlas.

C. Beneficios esperados del Proyecto Genoma

El Proyecto Genoma significa mucho ms que la mera identificacin de los genes; entender la gentica humana permitir desentraar los secretos de la evolucin de las especies, respetar la razas y la biodiversidad, luchar contra enfermedades hoy aparentemente incurables, determinar de forma equilibrada la influencia del ambiente y de los factores heredados sobre la salud y la enfermedad (trastornos mentales, infecciones, hbitos txicos..), entender el funcionamiento normal de nuestro organismo, para as poder predecir y prevenir su disfuncin. Con el genoma humano hemos descubierto una nueva gentica, la gentica de la susceptibilidad que es clave en ms del 60 % de las enfermedades que afectan a la especie humana en la edad adulta. Mientras que las mutaciones nos llevan casi irremediablemente a padecer una enfermedad familiar heredada, la susceptibilidad gentica, generalmente dependiente de varios genes distribuidos en diferentes puntos del genoma, nos indica nuestra predisposicin a padecer una patologa determinada (diabetes, cardiopata, demencia, obesidad, hipertensin...), pero nos deja abierta la puerta de la prevencin para evitar que esa enfermedad a la que estamos predispuestos se manifieste. La identificacin precoz de los factores de riesgo nos permite poder luchar ya contra la manifestacin de algunas de estas enfermedades. A continuacin del estudio detallado del genoma llegar otra ciencia la farmacogenmica, que permitir desarrollar frmacos especficos para combatir enfermedades en las que existe un defecto gentico subyacente, identificando a las personas que van a responder al medicamento, evitando efectos secundarios, toxicidad... Quien sepa poner esta informacin al servicio de la medicina del siglo XXI tendr la hegemona comercial de los procedimientos que usen las ciencias mdicas en muchas dcadas.
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Tendra sentido que la propiedad de las secuencias se atribuyera a grupos de investigadores o a determinadas empresas? Se trata de una informacin fundamental para el progreso de todos.

D. Consideraciones sociales, ticas, jurdicas y comerciales del Proyecto Genoma.

La entrada de la empresa privada en el descifrado del genoma ha hecho que el proyecto, que parti de la iniciativa pblica, se haya convertido en un campo activo de la biotecnologa comercial estadounidense, que pugna por proteger su trabajo a travs de las patentes de los genes ms interesantes. Esta actitud ha levantado una polmica de carcter tico, ya que puede traducirse en la privatizacin del conocimiento de elementos esenciales del funcionamiento del cuerpo humano, los genes; el nico verdadero patrimonio de la humanidad. Fue entonces cuando los presidentes de las dos potencias que ms han invertido en el proyecto, Bill Clinton y Toni Blair, en el mes de Marzo del ao 2000, hicieron una declaracin conjunta en la que confirmaron que ya se tena el primer borrador de la secuencia completa (para adelantarse a la empresa privada), e insistieron en que toda la comunidad cientfica del planeta debera tener libre acceso a las investigaciones sobre el mapa del genoma humano e instaban a que la empresa privada adoptar esa poltica. Propiciar la libre disposicin de la informacin gentica no es un mero gesto de generosidad, es una medida para lograr un mayor progreso para la humanidad y no est reida con la proteccin de las invenciones que del trabajo con las secuencias se deriven. Otro aspecto nada despreciable es cmo se va a utilizar e interpretar la informacin que nos proporciona el conocimiento del material gentico humano. Se habla de la posibilidad de que las empresas contraten a la gente en funcin de su calidad gentica, de que las aseguradoras mdicas privadas no suscriban plizas con pacientes de riesgo o que, adems de curar verdaderas enfermedades, se intenten modificar caractersticas individuales y se hagan prcticas eugensicas. Adems, la terapia gnica solo estar al alcance de los ms ricos. A todas estas discriminaciones sociales hay que aadir los perjuicios psicolgicos, ya que conocer que uno o varios genes son responsables de una enfermedad no implica que se sepa como se cura. Esto hace dudar a muchos especialistas de la utilidad de facilitar informacin gentica a pacientes que viviran angustiados por una enfermedad que podra no manifestarse. Adems, hay que tener en cuenta que el resultado de las pruebas puede afectar a diferentes miembros de la familia y es lgico pensar que el conjunto de la misma puede verse afectado al deteriorarse las relaciones debido a sentimientos de culpabilidad y de ansiedad. Desde los inicios del proyecto genoma se plante la necesidad de asegurar la privacidad absoluta de la informacin gentica de cada individuo. Los Institutos Nacionales de la Salud estadounidenses crearon en 1992 un organismo llamado Etical, Legal and Social Implications (ELSI). Esta institucin se encarga de vigilar y establecer ciertas normas relativas a la confidencialidad de los datos genticos, el consentimiento informado del paciente a la hora de someterse a un chequeo de este tipo y la proteccin del individuo frente a posibles discriminaciones sociales basadas en conjeturas genticas. Tambin, se dedica a vigilar cualquier prctica de eugenesia, es decir, esta pendiente de que el conocimiento de los genes,
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su funcionamiento y su manipulacin sirvan para curar enfermedades y no para alterar caractersticas del individuo que no supongan una verdadera patologa. Los principales proyectos de subvencin del Proyecto Genoma dedican tambin una parte de los fondos a la investigacin de los aspectos sociales, ticos, jurdicos y comerciales que previsiblemente surgirn. El que se utilice con xito los conocimientos que este proyecto va ha proporcionar, depender de la honestidad de quienes tienen que regular para evitar abusos, de los depositarios del conocimiento para ponerlo al servicio de la salud y el bienestar, y de la madurez social para beneficiarse del progreso de la ciencia.

4.1.1.4. TERAPIA GENICA A. Concepto y estrategias de aplicacin de la Terapia Gnica

La Terapia Gnica consiste en introducir nuevas copias de un gen ( gen teraputico ) en una clula para sustituir el gen que est daado o ausente. En la actualidad el concepto de Terapia Gnica amplia su aplicacin a la inhibicin de genes no deseados, como en los tejidos neoplsicos ( cancerosos) o en microorganismos invasores para controlar las enfermedades infecciosas, por ej, el virus VIH. El gen a insertar en la clula puede ser: a) Una copia sana de un gen en las clulas del paciente a fin de compensar el efecto de un gen defectuoso o ausente. b) Un gen especialmente diseado para que suministre una nueva propiedad a las clulas. Por ej. Introducir en los Linfocitos T un gen que produzca una protena inhibidora de la replicacin del virus del SIDA.

Fig.5. Terapia Gnica.

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B. Categoras en la Terapia Gnica

La Terapia gnica se puede aplicar a dos tipos de clulas: 1.- A clulas somticas. Se trataran las clulas de un individuo localizadas en tejido. Es la nica utilizada en la actualidad. 2.- A clulas germinales (espermatozoides u vulos). No se aplica la Terapia Gnica en ellas porque cualquier modificacin gentica pasara a la descendencia y esto conllevara problemas ticos.
C. Aplicaciones de la Terapia Gnica

Las posibilidades de aplicacin de la Terapia Gnica son las siguientes:

Curacin de enfermedades genticas debidas a un solo gen ( Monognicas ). Puede ocurrir que el gen proceda de una mutacin recesiva, como por ej. La deficiencia ADA, la hipercolesterolemia familiar, la fibrosis qustica o la hemofilia; o que proceda de una mutacin dominante. Estas enfermedades requieren un tratamiento ms sofisticado y la Terapia Gnica est an lejos de poder conseguir una aplicacin eficaz. Tratamientos de cnceres. Tratamientos de enfermedades infecciosas.

D. Tipos de Terapia Gnica

Los tipos de Terapia gnica que se contemplan prcticamente en estos momentos entran en varios grupos: 1.- Suplementacin gnica. Ante un gen defectuoso, que por tanto produce una protena defectuosa que produce una enfermedad por ej. Hemofilia) la Terapia Gnica consistira en introducir en la clula una nueva copia del gen que est sano y origine una protena funcional. 2.- Supresin gnica. Hay genes que actan en exceso originando una enfermedad, como es el caso de los oncogenes ( genes que producen cncer). La Terapia Gnica consistira en la introduccin de un gen oncodepresor ( anulara la actuacin del oncogen ) o en interferir en la expresin del gen mediante oligonucletidos antisentido ( se uniran a los ARN mensajeros de los oncogenes inutilizndolos por lo que no se podran traducir ) o mediante el uso de las ribozimas ( enzimas que destruyen el ARN mensajero del oncogen por lo que tampoco se producen protenas de efecto cancergeno ). 3.- Mtodos negativos dominantes. Con este mtodo se consigue anular la funcin de una protena normal ( productora de una enfermedad al estar presente en un parsito) al introducir una protena mutante equivalente a la anterior, la cual interfiere la funcin de la primera. Es til para anular el efecto infeccioso de los microorganismos, particularmente sera interesante para tratar los ataques vricos contra los cuales no existen ms medios que los preventivos: las vacunas.

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4.- Destruccin autoltica. El trmino hace referencia a la muerte celular de aquellas clulas neoplsicas ( o cancerosas ) que existe en un tejido u rgano afectado de cncer. Hoy da este proceso se consigue mediante quimioterapia y radioterapia con el inconveniente de que se destruyen tanto las clulas sanas como las enfermas ( de ah que a las personas afectadas se les caiga el pelo ). La Biologa Molecular est investigando en este sentido y ha conseguido utilizar genes suicidas que son aquellos que provocan la muerte celular o apoptsis slo en las clulas enfermas. E. Problemas planteados y soluciones de la Terapia Gnica

Son varios los problemas que plantea la terapia gnica: - 1) La obtencin del gen teraputico. - 2)Conocer las secuencias genticas del control del mismo, las cuales permitirn su expresin. - 3)La adecuada transferencia del ADN exgeno a las clulas diana, o blanco, elegidas. - 4)El control de la expresin del gen una vez en el interior de la clula. Hay que considerar que como consecuencia de varios millones de aos de evolucin, las clulas se han encargado de que el nico material gentico intracelular que sobreviviera fuese el del hospedador, por lo que no es un problema trivial engaar a la clula para que acepte el ADN extrao y lo mantenga intacto, sin embargo mediante diversas tcnicas se ha conseguido la manipulacin del material gentico y su aceptacin por la clula enferma as como su expresin. Las soluciones a los problemas planteados son las siguientes: 1) La obtencin del gen teraputico se consigue mediante las sondas moleculares marcadas radiactivamente capaces de identificar el gen, las enzimas de restriccin actan como tijeras moleculares cortndolo por los lugares de comienzo y finalizacin. 2) Conocer las secuencias control del gen teraputico se consigue mediante experimentos en el laboratorio en cultivos celulares en los que, manipulando el material gentico, se consiga la expresin de dicho gen al identificar la protena que codifica en el medio de cultivo. Esto es difcil pero, sin duda, el conocimiento del Genoma Humano completo ayudar a conseguirlo en todos los genes del individuo. 3) La adecuada transferencia del gen (o ADN exgeno) a las clulas diana elegidas. En el laboratorio se usan diversos mtodos fsicos de eficacia y toxicidad variable: Hacer precipitar el ADN con fosfato de calcio para que se adhiera a la superficie celular y sea captado. Hacer pasar corrientes elctricas a travs de las clulas, de manera que el ADN, que tiene carga negativa por el ac. Fosfrico, perfore la clula en su camino hacia el nodo y quede atrapado dentro. Microinyectar ADN directamente en el ncleo de clulas aisladas. Esta es la ms certera de todas las tcnicas aunque, con diferencia, la menos practicable. Es justo decir que el campo de cualquiera de estos mtodos en la Terapia Gnica humana es muy reducido. Para introducir ADN en clulas humanas se requieren mtodos de administracin ms sofisticados que comprenden diversos Vectores virales o no virales.

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Vectores virales: Los virus son agentes que de forma natural introducen su material gentico en la clula por lo que, con las necesarias modificaciones en el mismo ( introducir un gen teraputico ), se pueden utilizar como vehculo de genes.

Fig. 6 Tcnicas en Terapia gnica

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.
Fig7. Para producir vectores vricos, se utilizan clulas llamadas de encapsidacin. Estas clulas expresan de modo estable las protenas vricas de la cpsida. En cpsidas vacas puede meterse un gen teraputico al introducir en estas clulas un genoma vrico que lo contenga.

Fig.8.Un virus para infectar una clula se fija a la membrana celular. Los genes vricos son liberados en el ncleo y utilizan la maquinaria de replicacin de la clula para producir nuevos virus. Si el virus esta modificado conteniendo genes teraputicos puede entrar de la misma forma en la clula y sintetizar protenas teraputicas sin produccin de nuevos virus.

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Los virus ms utilizados son : *Los retrovirus o ARN-virus: tienen como ventajas que se les puede modificar por ingeniera gentica y hacerlos minimamente patgenos o no patgenos, adems llevan las enzimas necesarias para convertir el ARN en ADN y despus integrarlo en el cromosoma. Sin embargo presentan una limitacin y es que solo son capaces de integrar su genoma en clulas que se estn dividiendo. Los Lentivirus ( un subgrupo de los retrovirus que incluye el VIH ) pueden integrarse en clulas que no se dividen. *Los Adenovirus o ADN-virus: a diferencia de los anteriores infectan clulas que no estn en divisin. Pero tienen la desventaja de que no integran su ADN en el de la clula hospedadora. *Los Herpes- virus: son virus neuropticos, por lo que se usan para la entrega de genes al tejido nervioso en el que pueden permanecer latentes por tiempo indefinido. La desventaja es que suelen ser lticos para las clulas a las que se les suministra los genes.
Vectores no virales Debido a los problemas que presentan los virus como vectores de ADN en los que, a pesar de modificarlos para evitar su patogenicidad, pueden adquirir propiedades que sean nefastas, se ha desarrollado la idea de crear vectores puramente qumicos en los que los elementos de la estrategia vrica son sustituidos por componentes de sntesis. -El ms antiguo utilizado es el Liposoma : vescula esferoidal cuya pared est formada por micelas lipdicas que por su composicin fusionan fcilmente con la membrana plasmtica y as puede descargar su contenido ( en este caso, gentico ) en el interior de la clula. Los liposomas no son tan fciles de manejar y en la Terapia Gnica no han tenido el impacto que se haba pronosticado.

Fig.9 Penetracin de un liposoma en una clula conteniendo un gen teraputico

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-En un intento de crear una molcula Vectora de genes hbrida que pueda fijar ADN y lo suministre especficamente a una clula se han realizado algunos ingeniosos complejos moleculares. Uno de los mejor estudiados es el complejo ASIALOGLUCOPROTEINA-POLILISINA . La polilisina tiene carga positiva y acta como regin de unin para el ADN. La Asialoglucoproteina ( ASGP ) aprovecha el hecho de que los hepatocitos poseen un receptor para las protenas que han perdido su cido silico y as pueden captarlas de forma especfica. En animales de experimentacin se comprueba que el complejo ADN y ASGPpolilisina dirigen el ADN hacia el hgado, en el que an no se sabe lo que ocurre, lo ideal sera que se mantuviese en forma epismica estable. *Lo mejor es la transferencia directa de ADN desnudo a la clula. En las clulas musculares se ha conseguido y adems los genes transferidos se han expresado durante un ao o ms tiempo. No todas las clulas se comportan de igual manera. *Cromosomas artificiales: Debido a que en la transferencia de genes extraos o forneos a una clula requiere que vaya incluida la secuencia de nucletidos de control de dichos genes y sta suele estar situada a una distancia considerable del gen en cuestin, es necesario transferir a la clula un largo fragmento de ADN lo cual no siempre es posible de insertar en un genoma vrico. Por esta razn se estn consiguiendo unos avances cientficos con respecto a este problema y es el uso de cromosomas artificiales: cromosomas completos que llevan el gen y la secuencia control incluida. En la actualidad se han creado cromosomas artificiales que contienen fragmentos de ADN de las levaduras ( vector no viral) y a estos se le agregan genes humanos. Debido a los avances en el conocimiento del GENOMA HUMANO los que se pretende es fabricar cromosomas artificiales humanos para la transferencia de genes en cuyo caso no hace falta el uso de vectores no virales. 4) El problema del control de la expresin de los genes una vez en el interior de la clula es difcil de resolver ya que las clulas son bastantes eficientes para desactivar genes a pesar de que contengan sus elementos de control. Esto es un obstculo comn en los experimentos de terapia gnica: una vez conseguido transferir el gen a la clula, pronto se vuelve inactivo para la trascripcin y por tanto intil. Se ha comprobado que la manera de mantener un gen activo es haciendo que este contenga un promotor (zona donde se acopla la ARN-POLIMERASA) adecuado que permita su transcripcin.

F. Tcnicas de Terapia Gnica

En clulas somticas se utilizan tres tcnicas de Terapia Gnica mediante las cuales se introduce material gentico en las clulas del individuo enfermo, usando el vector adecuado:
a) Terapia ex vivo (fuera del cuerpo): Consiste en extraer clulas con genes defectuosos del cuerpo del enfermo y en el laboratorio se le introduce una copia del gen sano y despus se vuelven a introducir las clulas en el cuerpo. Esta tcnica se usa en clulas 64

sanguneas, las cuales tienen el inconveniente de tener una vida limitada a pocos meses, por lo que en la actualidad se est intentando hacer la introduccin del gen en las clulas madre de la mdula sea para tratar enfermedades como la hemofilia. Otras clulas sanguneas objetivo de la terapia gnica son los linfocitos: por su fcil acceso se puede extraer, manipular y volver a inyectar. La primera experiencia ( 1990 ) de Terapia Gnica con xito se realiz en una nia de 4 aos con deficiencia ADA, trastorno en el que la enzima adenosina desaminasa es hipofuncional o afuncional. Este defecto conduce a una acumulacin txica de desoxi-ATP que afecta particularmente a los linfocitos T, los cuales son destruidos, por lo que el individuo que lo padece posee una inmunodeficiencia, se convierte en un individuo burbuja , sin defensas, expuesto a todo agente invasor. Esta enfermedad de baja frecuencia se debe a un defecto en un gen ( defecto monognico ). La tcnica empleada fue la siguiente: se extrajeron los Linfocitos T y en ellos se insertaron copias normales del gen defectuoso y se volvieron a introducir en la sangre de la nia que tras cuatro transfusiones sus constantes fisiolgicas mejoraron.

Fig. 10. Tipos de Terapia Gnica

b) Terapia in situ ( en el mismo lugar): En esta tcnica se introducen los genes correctores directamente en los tejidos donde se necesitan. Se ha utilizado para enfermedades cuyo efecto est localizado, como por ejemplo la fibrosis qustica la cual afecta a los pulmones, inyectando en los bronquios los genes sanos. Tambin se ha utilizado esta tcnica en tratamientos de tumores cancerosos introduciendo en estos genes suicidas que destruyen el tumor al provocar la muerte celular. En este tipo de terapia tiene especial aplicacin en la piel: es un blanco atractivo para la trasferencia de genes ya que es el rgano ms grande del cuerpo y de ms fcil acceso, adems es posible cultivarla y expandirla in vitro sin que se pierdan las clulas madre. El problema est en que se descaman las clulas y se van perdiendo por lo que si estn modificadas genticamente, los genes pronto se pierden. Para solucionarlo se ha conseguido modificar los queratinocitos con actividad mittica de la base de la piel (estrato basal) equivalentes a las clulas madre del tejido. Estas clulas genticamente modificadas son capaces de secretar el producto del gen exgeno al torrente sanguneo evitando as su perdida. 65

Tratamientos especficos mediante terapia gnica que se pueden realizar a travs de la piel son: 1- Enfermedades hereditarias de la piel: los queratinocitos portan versiones corregidas de los genes cuyas mutaciones dan lugar a las siguientes enfermedades: -Ictiosis lamelar ( gen de la transglutaminasa -1) -Epidermolisis ampollosas ( genes de citoqueratina, colgeno....) -Xenoderma pigmentoso ( genes de reparacin del ADN) 2- Ulceras crnicas, heridas extensas: los queratinocitos producen factores de crecimiento epitelial que favorecen la cicratizacin. 3- Enfermedades sistmicas: los queratinocitos hacen de factora secretora del producto terapetico para su accin local o a travs del sistema circulatorio. Por ejemplo: -Secrecin de la hormona del crecimiento, contra el enanismo. -Factor de coagulacin, contra la hemofilia. -Interfern-, contra enfermedades vricas. 4- Enfermedades metablicas: los queratinocitos portan genes que les permiten depurar los productos txicos circulantes, como el ADA ( adenosin desaminasa) y la fenilcenoturia (fenilalanina hidroxilasa).
c)Terapia in vivo ( dentro del cuerpo ) : es la esperanza del futuro. Consiste en inyectar en la sangre del enfermo vectores, a modo de taxi ( generalmente virus ),que contienen los genes deseados. Los vectores, a modo de frmacos, interaccionan slo con las clulas diana del cuerpo ( las que tienen los receptores especficos en su membrana para un determinado tipo de vector ) y transfieren su contenido gentico a dichas clulas. Especial inters tiene esta terapia en El hgado: debido a la importancia y variadas funciones que desempea en el organismo es un objetivo interesante: manipular genticamente los Hepatocitos. Sin embargo existen varios inconvenientes: es un rgano de difcil acceso, el hepatocito se divide un promedio de una o dos veces durante toda la vida del individuo y aquellos vectores que slo se introducen en las clulas en divisin tienen muy limitada su posibilidad, y adems la Red de clulas del Sistema Retculo Endotelial que hay alrededor de los hepatocitos son capaces de captar y degradar partculas destinadas a los hepatocitos. Las clulas neoplsicas: las clulas cancerosas son un punto de mira muy importante en la Terapia Gnica. Estas se han tratado desde varios puntos: Aumentar la capacidad inmungena de la clula tumoral la cual se haba vuelto muy tolerante inmunolgicamente, incorporar genes txicos o suicidas para poder eliminarlas o marcar las clulas neoplsicas pasa dirigir especficamente los vectores genticos.

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4.1.1.5. SINTESIS DE FRMACOS MEDIANTE INGENIERIA GENETICA. Mediante el empleo de tcnicas de Ingeniera Gentica se pueden obtener hoy da medicamentos de gran valor teraputico. A. Hormonas proteicas: insulina y hormona del crecimiento La insulina humana y la hormona del crecimiento, fueron dos de los primeros productos proteicos recombinantes que se comercializaron. Insulina Hasta 1982, los diabticos tenan que inyectarse insulina de procedencia animal, de vaca o de cerdo. La insulina del cerdo difiere de la humana en un aminocido; al no ser idnticas, el uso de insulina de cerdo produca efectos secundarios no deseados. La solucin a este problema se produjo gracias a la produccin biotecnolgica de insulina humana Se pueden utilizar dos tcnicas distintas para la obtencin de insulina humana. La ms inmediata es la de la transformacin de insulina de cerdo. La hormona extrada del pncreas del cerdo se modifica por sustitucin del aminocido diferente mediante intercambio cataltico. Pero la ms imaginativa y menos costosa es la producida por bacterias mediante ingeniera gentica. Si se inserta un gen humano, el que codifica la insulina, en el material gentico de una bacteria, sta fabricar esta hormona. Las bacterias tienen la ventaja de multiplicarse en un cultivo apropiado si se dan las condiciones ptimas de temperatura, pH, nutrientes, etc.,de una manera rapidsima, de forma que en muy poco tiempo se pueden obtener ingentes cantidades de bacterias y, en consecuencia, de la protena. Este importantsimo hecho se produjo con el descubrimiento de las enzimas de restriccin. Con estas tijeras moleculares se puede cortar la molcula de ADN por donde nos interese, para unirla despus en otros fragmentos de ADN y formar ADN recombinante. La molcula de insulina est formada por dos cadenas peptdicas unidas por dos puentes disulfuro. En este mtodo, los genes que cifran cada una de las dos cadenas que forman la insulina se colocan en un plsmido bacteriano justo detrs de los que dirigen la sntesis de beta-galactosidasa. Las bacterias sintetizan esta enzima junto con la cadena de insulina correspondiente. Despus de separar las cadenas de insulina de la enzima, slo queda unirlas con tcnicas bioqumicas relativamente sencillas.

Fig. 11 Sntesis de Insulina mediante Ingeniera Gentica.

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Hormona del crecimiento

Antes del uso de hormona del crecimiento humana recombinante (hGH) los nios con defectos del crecimiento eran tratados con hGH obtenida de glndulas hipfisis de cadveres. Ulteriormente, ya adultos jvenes, hasta ahora unos 20 individuos han adquirido la enfermedad de Creuzfeldt-jacob, un trastorno neurodegenerativo mortal, como consecuencia de contaminacin presente en la hormona purificada. De modo similar, el uso de factor VIII no recombinante, no revisado, proveniente de sangre almacenada ocasion la infeccin de miles de hemoflicos en todo el mundo con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH o HIV). Aun hoy, a pesar de los estrictos procedimientos de deteccin, los productos sanguneos no recombinantes contaminados siguen siendo una va potencial de transmisin del VIH . La fuente tradicional de hGH (cerebros de cadveres humanos) presentaba el doble inconveniente de su limitado suministro y de su posible contaminacin por patgenos humanos. Lograr producir hGH recombinante, en la bacteria Escherichia coli, constituy una hazaa que permiti satisfacer fcilmente la demanda mundial de hGH (para el tratamiento del dwarfismo hipopituitario) con un producto seguro. En general, la produccin eficaz de protenas recombinantes implic el desarrollo de una gama de vectores de expresin, para su aplicacin en bacterias, hongos filamentosos, levaduras y clulas cultivadas. La eleccin de un sistema de expresin depende en gran medida de las propiedades de la protena. Muchas protenas humanas se producen en E. coli como agregados insolubles y pueden lograrse mayores rendimientos de material activo utilizando clulas eucariotas. El uso de clulas de mamferos es particularmente importante cuando la actividad de la protena depende de que experimente modificaciones post-traduccin correctas (por ej., la adicin de restos glucdicos o de cidos grasos), puesto que las clulas procedentes de insectos y de levaduras ejecutan distintas pautas de modificaciones. As, mientras que E. coli es adecuada para la produccin de hGH, para la del activador tisular del plasmingeno (t-PA) humano, autntico y activo, es imprescindible utilizar clulas de mamfero. Para otras protenas, como la insulina, la eleccin es menos crtica y se ha usado tanto el E. Coli ( bacteria ) como el S. Cerevisiae( levadura).
B. protenas recombinantes de actividad especifica

En la siguiente tabla se muestran ejemplos de protenas recombinantes que han obtenido la licencia para su uso teraputico. En trminos de ventas, la insulina y la hormona del crecimiento humano han sido dos de los productos con ms xito, con aplicaciones obvias. Sin embargo, las sustancias ms nuevas, como los factores de crecimiento hemopoytico, presentan un potencial superior. Estas ltimas protenas, como la eritropoyetina (EPO) y los factores estimulantes de colonias mieloides (CSFS) controlan la produccin de clulas sanguneas estimulando la proliferacin, diferenciacin y activacin de tipos celulares especficos.

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Protenas recombinantes autorizadas para uso teraputico. Protena Uso clnico Insulina Hormona del crecimiento Activador tisular del plasmingeno Eritropoyetina G-CSF GM-CSF Factor VIII Interfern-a, Interfern-p Interfern-y Antgeno de superficie de la hepatitis B (a) Esclerosis lateral amiotrpica. (b) Complejo relacionado con el SIDA. -La eritropoyetina estimula la produccin de eritrocitos a partir de clulas eritroideas progenitoras inmaduras. Se ha utilizado con xito para tratar la anemia que resulta del fallo renal, as como otras anemias agudas o relacionadas con tratamientos teraputicos. Tambin podra tener utilidad clnica para aliviar el dficit plaquetario asociado a la quimioterapia anticancerosa. Se espera que a mediados de los 90, la eritropoyetina sea la protena teraputica ms vendida. -El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), que se utiliza para complementar la quimioterapia anticancerosa, y se estn efectuando ensayos clnicos con l para otras seis indicaciones, incluyendo enfermedades infecciosas. -El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrfagos(GMCSF)cuyo uso en los transplantes de mdula sea ya est aprobado y se est ensayando clnicamente para otras dos indicaciones. -El interfern, en varios pases est aprobado el empleo del interfern para el tratamiento de enfermedades vricas y de diferentes tipos de cncer, con frecuencia en combinacin con otros agentes. Se ha predicho que las ventas globales de las tres protenas supondrn aproximadamente la mitad del total de EPO hacia el final de la dcada. diabetes dwarfismo hipopituitario lisis del cogulo anemia quimioterapia anticancerosa trasplantes de mdula sea hemofilia cnceres, hepatitis B, leucemia cnceres, ALS(a) verrugas genitales cnceres, ARC,(b) osteopetrosis vacuna de la hepatitis B

-Las muteinas, cuando se ha clonado y expresado el DNAC para una protena teraputica es relativamente sencillo preparar derivados que transporten secuencias aminoacdicas alteradas. Se ha llevado a cabo un considerable esfuerzo tratando de producir protenas con actividades biolgicas nuevas, o mejoradas (a veces se les denomina mutenas), mediante mutagnesis de las protenas teraputicas convencionales. Entre los ejemplos de mutenas que han sido evaluadas en ensayos clnicos, o en modelos de
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enfermedad, se incluyen el factor de necrosis tumoral (carcinoma de clulas renales),' G-CSF (fibrosarcoma METH-A), interleucina-Ip (hematopoyesis), interfern B (carcinoma celular renal metasttico), factor de crecimiento fibroblstico bsico (lceras gstricas inducidas por cido actico) e interleucina-2 (estimulacin de linfocitos B y T)
C. Vacunas recombinantes

La vacunacin contra las enfermedades bacterianas y vricas ha sido uno de los grandes xitos de la historia de la medicina humana y veterinaria. El ejemplo ms significativo de la efectividad de la vacunacin es, probablemente, la erradicacin de la viruela. La polio ha sido tambin controlada en los pases desarrollados, al igual que la difteria que ha sufrido una gran regresin. A pesar del tremendo progreso conseguido, las enfermedades infecciosas son todava el gran problema de la humanidad, ms de 10 millones de muertes al ao se deben a enfermedades infecciosas, por lo que hay una necesidad apremiante de nuevas vacunas para patgenos virales, bacterianos y parsitos , las cuales deben ser ms efectivas y seguras que las que se vienen utilizando habitualmente. Las vacunas utilizadas actualmente no son la nica va de atacar el problema ni la nica medida sanitaria requerida. Sin embargo, son la va ms simple y ms econmica para reducir los costes que provocan las enfermedades infecciosas. Existen dos estrategias clsicas de vacunacin ; una de ellas consiste en la vacunacin con organismos patgenos muertos y la otra utiliza organismos vivos atenuados que no causan la enfermedad pero proceden de un organismo patgeno. Ambas vacunas protegen contra la enfermedad en las condiciones apropiadas. Sin embargo algunos patgenos son imposibles de cultivar fuera de sus hospedadores naturales por lo que no es posible generar una vacuna viva atenuada o inactivada por cultivo de estos agentes. La manipulacin gentica proporciona nuevas tcnicas para abordar el problema de diferentes maneras as la Tecnologa del ADN Recombinante permite la transferencia de la informacin gentica desde el organismo patgeno a otros hospedadores ms manejables como E. Coli, levaduras o clulas de mamferos. Las tcnicas de Biologa Molecular permiten analizar la virulencia y patogenicidad de estos organismos patgenos. Se pueden manipular directamente los virus y otros microorganismos ,mientras que se puede hacer indirectamente en otros casos en los que se usan plsmidos para transferir la informacin por recombinacin con el genoma . Los avances en el conocimiento de los procesos inmunolgicos, han ayudado a esclarecer que requerimientos inmunolgicos son necesarios para que una vacuna proporcione inmunidad a largo plazo. La vacuna ideal debera: - Generar una gran cantidad de linfocitos de memoria B y T. - Ser susceptible de ser procesada para producir pptidos que se asociaran con los antgenos MHC. - Estimular las respuestas mediadas por las clulas T. - Mantener un determinado nivel de antgeno durante cierto tiempo, de modo que las clulas B fueran continuamente reestimuladas para producir anticuerpos circulantes.

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D. Anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos, o inmunoglobulinas (Igs), son protenas producidas por los vertebrados superiores en clulas especializadas. Estas molculas de protena son fabricadas en respuesta a una serie de sustancias que son reconocidas como de origen externo, extraas por el organismo. Su papel es el de unirse a las mismas, denominadas antgenos, y activar inicialmente una serie de mecanismos que conducen a la destruccin de la molcula extraa y su separacin del Sistema.

Las inmunoglobulinas se agrupan en cinco clases, aunque todas ellas comparten algunas caractersticas en su estructura. La estructura bsica de la Ig es un multmero constituido por dos tipos de polipptido, una cadena ligera (L) y una cadena pesada (H). stas se encuentran unidas segn la frmula general (H2L 2)n y en todos los anticuerpos naturales todas las cadenas pesadas son idnticas y todas la cadenas ligeras son idnticas. La estructura de la IgG, la inmunoglobulina que aparece con mayor frecuencia. Presenta dos zonas idnticas en el extremo N-terminal que constituyen el sitio de unin al antgeno, la especificidad de esta zona depende de la secuencia aminoacdica del extremo N-terminal de ambas cadenas, pesada y ligera. La secuencia aminoacdica que constituye el sitio de unin al antgeno es muy variable entre diferentes anticuerpos, en los que el resto de la molcula contiene una secuencia aminoacdica que es constante en todos aquellos que forman parte de una clase determinada (o subclases, en el caso de IgG). La mitad carboxiterminal de la molcula es responsable de la activacin de diferentes sistemas electores biolgicos, llevando a cabo la eliminacin o destruccin del antgeno. Hay varias subclases de IgG que presentan diferentes propiedades biolgicas; su condicin depende de las diferencias en las secuencias aminoacdicas que presentan las regiones constantes de las cadenas pesadas. Fig.12La teora de la seleccin clonal. El animal inmunolgicamente preparado contiene muchos clones de linfocitos B, cada uno de los cuales sintetiza un nico anticuerpo especfico. El encuentro con un antgeno apropiado da lugar a la proliferacin y maduracin de la clula. El resultado es un clon de muchas clulas plasmticas maduras, todas ellas secretoras del mismo anticuerpo que presenta la misma especificidad que el producido por el linfocito original

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Las inmunoglobulinas son producidas por clulas especializadas llamadas linfocitos B. stas se forman en la mdula sea a lo largo de toda la vida del animal, y circulan a travs de los sistemas sanguneo y linftico. Cuando se encuentra un antgeno con un linfocito que tiene un receptor especifico para-dicho antgeno, este linfocito comienza a proliferar creando clulas crnicas a si mismas, todas ellas secretoras del mismo anticuerpo, segn la teora de la seleccin clonal. Los anticuerpos, adems de servir para nuestra defensa autnoma contra infecciones y sustancias extraas, son herramientas muy valiosas en la cura6n de enfermos que no son capaces de producirlos y para el estudio de molculas biolgicas. En medicina se utilizan sueros con anticuerpos presentes en el suero de animales(generalmente se usan caballos) que han sido expuestos deliberadamente a ciertos antgenos extraos, se encuentran formando una mezcla compleja con diferentes inmunoglobulinas, esta heterogeneidad limita su utilizacin. La tcnica de los anticuerpos monoclonales super estas limitaciones y permite preparar cantidades ilimitadas de anticuerpos homogneos. Est basada en el hecho de que cada linfocito B forma solamente un nico y especfico anticuerpo. La esencia de esta tcnica consiste en inmortalizar las clulas maduras responsables de la produccin de anticuerpos (clulas plasmticas como producto maduro obtenido por activacin de linfocitos B), consiguiendo que se multipliquen indefinidamente. Esta inmortalidad se consigue hibridando las clulas plasmticas y clulas tumorales, como las de los mielomas, con capacidad de multiplicacin indefinida. Las clulas hijas resultantes se denominan hibridomas, las cuales son heterocariotas (con dos ncleos diferentes) y se pueden clonar haciendo que se dividan, y producirn anticuerpos homogneos o monoclonales. No obstante, el anticuerpo ideal para la terapia humana seria el anticuerpo totalmente humano; pero los humanos no pueden ser inmunizados para suministrar clulas capaces de sintetizar anticuerpos, y los hbridos entre mielomas de ratn y clulas humanas sintetizadoras de anticuerpos no son estables. La solucin est en crear ratones transgnicos que produzcan Ig humanas.
E. Utilizacin de organismos transgnicos como productores de frmacos.

Los organismos transgnicos pueden contener genes que expresen la sntesis de medicamentos como por ejemplo: - Produccin de vacunas y otros medicamentos en huevos de gallinas. Dos compaas estadounidenses han creado un programa piloto para insertar frmacos en huevos puestos por gallinas genticamente manipuladas, llevan un gen que les permite producir en sus huevos factor de crecimiento humano, anticuerpos, interfern para el tratamiento del cncer...etc.

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Las dos empresas inoculan los genes a las aves mediante un virus diseado para que no se pueda replicar y en el que se inserta el gen responsable de la fabricacin de la protena. Si este virus accediera alas clulas primordiales del blastodermo que ms tarde se desarrollaran en vulos y espermatozoides el gen para la fabricacin de la protena pasara a las siguientes generaciones de gallinas en vez de repetir el proceso de inoculacin del gen en cada generacin . Una de las compaas est realizando una microinyeccin del virus que utiliza como vehculo gentico en el proncleo de la yema del huevo, de esta manera el gen queda expresado en todas las clulas de la gallina. - Vacuna de patatas transgnicas para el clera. Investigadores de la Universidad de Loma Linda( California) han desarrollado una vacuna experimental contra el clera a partir de patatas modificadas genticamente. Los resultados de este preparado en ratones han sido publicados en el ltimo nmero de Natura Biotechnology. En 1997, otro grupo de investigadores utiliz judas transgnicas para lograr un preparado inmunognico contra el parvovirus humano, pero la vacuna deba ser extrada. Ahora, el equipo dirigido por el bilogo William Langriq ha creado una planta de patata que por s misma constituye una vacuna comestible. Para fabricar este preparado, los investigadores utilizaron un gen que codifica una protena no daina de la toxina del clera y posteriormente lo incorporaron al genoma de un tipo de patata. Cuando alimentaron a un grupo de ratones con este tubrculo, comprobaron que los animales producan anticuerpos contra la enterotoxina del Vibrio cholerae, la bacteria causante del clera, reduciendo sensiblemente los efectos de la infecci6n.

4.1.1.6. Clulas madre.

La mayora de poblaciones celulares diferenciadas de un vertebrado, no son permanentes, sino que estn sujetas a renovacin. Las clulas diferenciadas pueden generarse en los adultos de dos maneras distintas: - mediante simple biparticin de las clulas diferenciadas existentes, que se dividen dando pares de clulas hijas del mismo tipo - a partir de clulas madre indiferenciadas, mediante un proceso que implica cambio en el genotipo celular. Las clulas madre son clulas indiferenciadas pluripotenciales, es decir que son capaces de convertirse en cualquier tipo de clula adulta y dar lugar a diversos tejidos y rganos. Se pueden dividir sin lmites y cuando se dividen cada clula hija, puede permanecer como clula madre o puede iniciar una va irreversible hacia la diferenciacin. Por si solas no pueden crear un ser vivo, se puede decir que son clulas en blanco, como cintas vrgenes que todava no estn programadas para comportarse como clulas del rin, piel, hueso, cerebro. Por primera vez se han podido cultivar en el laboratorio con ayuda de nutrientes, a partir de un blastocito, nombre que se da al embrin de pocos das de edad y formado por unas 140 clulas, que en principio pueden generar toda clase de tejidos. ( THOMSON y colaboradores). Estos blastocitos humanos se haban engendrado por motivos clnicos, mediante tcnicas de fertilizacin in vitro. Estos embriones no tenan utilidad y fueron donados por varias parejas que haban recurrido a la reproduccin asistida para lograr un embarazo. Si
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no se hubieran donado a la Ciencia, estos embriones sobrantes se habran destruido. Thomson y colaboradores cultivaron estas clulas durante unos das con ayuda de nutrientes y se vio que eran inmortales, es decir, podan crecer indefinidamente sin diferenciarse. Mas tarde, comprobaron que estas clulas madre eran pluripotenciales, es decir, podan transformarse en toda clase de tejidos corporales. Al inyectar estas clulas en ratones transgnicos con un Sistema Inmunitario dbil, se observo que podan generar( hueso, msculo, cartlago, tej. Neural y tejido intestinal) distintos tipos de tejidos humanos. Esto implica que en un futuro se podrn utilizar estas clulas para generar el tipo de tejido concreto que se necesite en cada transplante. Los cientficos han observado que estas clulas producen altos niveles de un enzima llamada Telomerasa, que les alarga la vida y les permite propagarse indefinidamente. Por lo tanto tambin es posible utilizar las clulas madre contra el deterioro corporal que provoca el envejecimiento. Tambin se podran utilizar para comprobar la eficacia de nuevos medicamentos, ya que estas clulas se podran manipular para crear modelos de enfermedades humanas, mas tiles que el ratn y otros animales experimentales. Por otra parte las clulas madre podran ser muy tiles para estudiar y analizar todos los detalles del desarrollo embrionario, que algunas veces falla, dejando a muchas parejas sin la posibilidad de tener hijos, conociendo as las causas de los fenmenos de infertilidad o los abortos. A su vez, la experimentacin con estas clulas podra lograr importantes avances en el diagnstico y prevencin de defectos congnitos. Estas clulas como su nombre indica son las progenitoras de todos los componentes bsicos del organismo. Por lo tanto, la observacin de los procesos de divisin y diferenciacin de estas clulas puede ayudar a los cientficos a comprender mejor los problemas que pueden provocarlas anormalidades en el desarrollo del feto. Informndonos tambin sobre los genes que regulan la diferenciacin celular y el desarrollo de los tejidos. El descubrimiento de los mecanismos genticos que controlan estos procesos, podra permitir el desarrollo de nuevos tratamientos para la curacin de tejidos daados ( infarto, espina dorsal daada...). En definitiva, el estudio de las clulas madre va a facilitar el conocimiento sobre los procesos de reproduccin y diferenciacin de las clulas que componen nuestro organismo. Cuanto mejor se conozca el desarrollo de esta compleja maquinaria biolgica, mejor se podrn prevenir y combatir sus posibles averas. No obstante desde el punto de vista tico, para algunas personas, la utilizacin de las clulas madre es algo inaceptable; ya que para obtenerlas es necesario contar con los embriones humanos de los que se obtienen. Sin embargo los cientficos estn convencidos que los beneficios que proporcionaran a la Humanidad, justificaran la utilizacin de estos embriones.
En todas las clnicas de reproduccin asistida, quedan muchos embriones sin utilizar que se destruyen. Si la opcin est entre donar estos embriones a la Ciencia o destruirlos, me parece ms tico lo primero. ( Doctor Thomson. Universidad de Wisconsin ).

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4.1.1.7.Consideraciones ticas y de impacto social. biotica.

A partir de los aos 80 la bioindustria ha experimentado un desarrollo caracterizado por la incorporacin de numerosas empresas, no siempre de gran envergadura, que se han visto atradas por las enormes perspectivas que ofrecen las aplicaciones de la ingeniera gentica en el campo de la biotecnologa. Por otra parte, las grandes compaas se han visto obligadas a invertir enormes capitales para conquistar nuevos mercados. De forma paralela se han llevado a cabo investigaciones sobre las actitudes pblicas hacia la biotecnologa en diversos pases avanzados. Ha de tenerse en cuenta que son varios los factores que intervienen en la opinin y postura de la sociedad ante este hecho totalmente nuevo. Por una parte hay que considerar los grandes beneficios que aporta la biotecnologa en los distintos campos de la medicina y farmacia, agricultura, ganadera, etc., con la construccin gentica de frmacos, vacunas, semillas de plantas resistentes, especies transgnicas ms valiosas para su utilizacin y un sinfn de beneficios para la calidad de vida. Sin embargo tambin existen graves riesgos tanto fsicos como ticos que deben ser controlados. Qu puede pasar si los seres manipulados no estn sujetos a un estricto control e inundan los ecosistemas? Qu puede ocurrir si en la investigacin se manipulan genticamente seres humanos, no slo para desterrar defectos genticos o enfermedades hereditarias, sino para conseguir individuos superiores seleccionando diversos genes? Qu puede ocurrir si se comercializa la clonacin de seres humanos? Qu puede ocurrir si en la competicin por acaparar mercado se hacen ofertas a la sociedad de dudosa ndole moral? Recordemos que ni la clonacin ni muchas de las manipulaciones genticas estn aun optimizadas y sistematizadas como para utilizarlas en seres humanos. Recordemos tambin que para clonar a Dolly se necesitaron 700 embriones, las manipulaciones son bastante complicadas y los cientficos continan discutiendo sobre su edad biolgica real. Olvidndonos por un instante de la moral, quin puede asegurar la ausencia de malformaciones y el xito. de la clonacin humana? Existe un repudio generalizado respecto a la utilizacin puramente mercantilista, por parte de numerosas empresas bioindustriales. En cuanto al riesgo asociado al desarrollo biotecnolgico, de las encuestas realizadas en Espaa, los ms jvenes encuestados son los que consideran que existe menor riesgo. Del mismo modo, y separando la muestra por grado de instruccin, los de ms alto grado son los que consideran mayor riesgo.
Numerosos pases adoptan medidas en defensa de la dignidad humana:

La mayor parte de los pases se han encontrado con sus legislaciones desfasadas, incapaces de recoger aspectos como las tcnicas de reproduccin asistida, la clonacin en mamferos, las terapias gnicas, la manipulacin gentica de microorganismos y plantas, los xenotransplantes, etc. Diversas iniciativas, en las que participan polticos, cientficos y filsofos, tratan de regular las principales actuaciones posibles en este terreno. Las ltimas tendencias se encaminan
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hacia la responsabilidad, no slo respecto a la humanidad actual sino tambin respecto a las generaciones futuras. Espaa es uno de los pases con una legislacin ms avanzada y de los primeros en incorporarse a la firma de acuerdos internacionales, como el Convenio Internacional sobre Derechos Humanos y Biomedicina del Consejo de Europa (Convenio de Oviedo) del 4 de abril de 1997; la Declaracin Universal sobre el Genoma y los Derechos del Hombre de la UNESCO, del 11 de noviembre de 1997; y el Protocolo Internacional de Prohibicin del Clonaje de Seres Humanos, firmado en Pars el 12 de enero de 1998. Los principales aspectos de estos acuerdos, referidos a la especie humana se pueden resumir as: -Tcnicas de Ingeniera gentica: Tendrn una finalidad exclusivamente preventiva, de diagnostico y terapia , siempre que no impliquen modificacin del patrimonio gentico de la descendencia. Por tanto quedan fuera de tratamiento en cualquier caso las clulas de la lnea germinal. -Patrimonio gentico: Debern ser respetados la dignidad y los derechos de todos los individuos cualesquieran que sean sus caractersticas genticas, Queda reconocido el derecho a la identidad y singularidad gentica del ser humano. Se prohibe cualquier discriminacin en relacin con el patrimonio gentico de los individuos. Solo se permiten pruebas de carcter predictivo si poseen una finalidad terapetica. -Reproduccin asistida: La eleccin del sexo de los hijos en las tcnicas de fertilizacin in vitro est prohibida , excepto en el caso de que tal eleccin tenga por finalidad evitar una enfermedad hereditaria grave. -Clonacin: Se prohbe toda intervencin cuyo objetivo sea crear un ser humano genticamente idntico a otro ser humano vivo o muerto. No hay excepciones, incluso en los casos de esterilidad absoluta de la pareja. -Trasplantes de rganos: Sobre la venta de organos, est prohibida la utilizacin lucrativa de cualquier parte del cuerpo. Sobre la donacin de rganos, est prohibida la extraccin de rganos y otros tejidos no regenerables en personas que no puedan dar su consentimiento, con la excepcin del trasplante de tejidos entre hermanos.

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5. MAPA CONCEPTUAL BIOLOGA MOLECULAR Y SALUD

ENFERMEDADES HEREDITARIAS

Se deben a

ALTERACIONES EN EL ADN

Pueden ser de varios tipos

son conocidas a travs del

se pueden diagnosticar mediante

MONOGENETICOS CROMOSOMICOS POLIGENICOS

PROYECTO GENOMA HUMANO

ANLISIS MOLECULAR Y CITOGENETICO

DIAGNOSTICO

CLINICO

Tiene como objetivos

Aplicaciones en

CONSTRUCCIN DE MAPAS FISICOS Y GENETICOS DE LOS CROMOSOMAS

LA CURACIN DE ENFERMEDADES

Mediante

TERAPIA GENICA

UTILIZACIN DE CELULAS MADRE FRMACOS POR ING. GENETICA

SNTESIS DE

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6. PRUEBAS DE EVALUACIN. 6.1. ACTIVIDADES DE RECAPITULACIN DE LA UNIDAD. Actividad N 1: Lee detenidamente los dos artculos publicados en El Pas y El Ideal,el da que la comunidad cientfica present la secuencia completa del genoma humano( 12-2-2001) : El anlisis del genoma confirma que el ser humano solo tiene unos 30.000 genes; El genoma humano es similar en todas las razas y sorprendentemente bajo ; y contesta a las siguientes preguntas:

1.- Qu es el Proyecto Genoma Humano? 2.- Qu fue lo que se present en la primavera del ao 2000 en la Casa Blanca? 3.- Qu ha presentado el 12 de febrero del 2001 la comunidad cientfica a la sociedad? Qu extensin tiene el genoma humano?Cuntos genes tenemos? 4.- Si el genoma humano tiene un nmero de genes similar al de otro mamfero y slo el doble que una mosca, A qu se debe que seamos unos seres mucho ms complejos? 5.- Qu son los polimorfismos mononucleotdicos (SPN)? Qu importancia tienen y qu aplicaciones se pueden derivar de su conocimiento?
Actividad N 2 Observando los esquemas siguientes explica de forma razonada a qu tipo de Terapia gnica corresponden los siguientes casos:

A) 1- Aislamiento del plsmido bacteriano. 2- Introduccin, mediante ingeniera gentica, del gen P53, gen supresor del tumor de mama, el cual suele estar defectuoso en la mayora de los cnceres. 3- El plsmido, modificado genticamente, se introduce en un liposoma y se inyecta directamente en la mama afectada por cncer.

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B) 1- Un individuo posee un tumor cerebral. 2- Se asla un gen HLA-B7, que produce una protena de superficie de membrana que acta como antgeno. 3- Se introduce el gen HLA-B7 en el genoma de un Herpes-virus, al que previamente se le han suprimido los genes responsables de la patogenicidad. 4- Se inyecta en la sangre del individuo los virus.

Actividad N 3 Lee detenidamente los artculos referidos correspondientes.

y contesta

a las cuestiones

- Artculo cientfico:xito en ratones de una terapia gnica contra la diabetes tipo 1 - De qu gen y protena son deficitarios los enfermos de diabetes tipo 1? - Indica el tipo de terapia gnica utilizada en este experimento y el vector usado. En qu rgano fue inyectado?. - El artculo propone otra alternativa para dichos enfermos. Explcala y comprala indicando las ventajas y los inconvenientes de usar una u otra.

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-Artculo cientfico:La inyeccin de un gen logra que el msculo produzca una sustancia que inhibe el crecimiento tumoral En este caso Cual es el vector gnico usado Indica a qu tipos de enfermos est orientada esta tcnica y cual es la base cientfica de la misma. Haz un resumen de las ventajas mdicas que supone esta tcnica e indica otras aplicaciones mdicas que puede tener.

-Artculo cientfico:Una terapia gentica erradica el cncer de colon en ratones - En este artculo se combina la accin de dos genes para curar el cncer de colon, explica su accin. - Comenta la posicin de Espaa respecto de las investigaciones en Ingeniera gentica respecto del resto de los pases desarrollados. -Artculo cientfico: Cmo cascar un huevo y curar con l una enfermedad - Explica el proceso de insercin de un gen que contiene la informacin para la produccin de un medicamento en una gallina. - Qu ventaja supone la insercin de dicho gen en clulas embrionarias que originarn las gnadas frente a la insercin en clulas que den lugar a tejidos no reproductores?. - Artculo cientfico: Vacuna de ADN inmuniza a ocho monos frente al sida - Comenta la composicin de dicha vacuna. - Sobre que tipo de clulas acta? - Explica la terapia seguida en cada uno de los grupos.

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6.2. MODELO DE PRUEBA DE EVALUACION

1- Enfermedades hereditarias. Pon un ejemplo de enfermedad hereditaria: Monognica, Polignica y Cromosmica. 2- Proyecto genoma. Diferencia la tcnica empleada en la secuenciacin del Genoma Humano por las dos entidades dedicadas a ello: empresa privada y consorcio pblico. 3- Las Tcnicas de Terapia Gnica pueden hacer posible en un futuro que se alteren los genes de un individuo enfermo buscando su mejora. Comenta brevemente los posibles vectores de genes que se pueden utilizar para ello. 4- Cita enfermedades humanas tratadas con productos obtenidos por ingeniera gentica y explica razonadamente las ventajas que supone el uso de estos medicamentos frente a los tradicionales. 5- Qu son las clulas madre?. De donde se obtienen?. Para que se pueden utilizar?. 6- Biotica: Haz un anlisis crtico que valore tanto positivamente como negativamente el uso de las tcnicas de Ingeniera Gentica en el campo de la Salud.

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7.BIBLIOGRAFA PARA EL PROFESOR Y PARA EL AULA. Biologa Molecular en Medicina. T. M. Cox y J. Sinclair. Editorial Mdica Panamericana. El Proyecto Genoma Humano: Rompiendo el Cdigo Gentico de la Vida.T.F.Lee Editorial Gedisa. Coleccin Lmites de la Ciencia. Biologa Celular y Molecular. G. Karp. Editorial Mc Graw-Hill Interamericana. Biologa Molecular y Biotecnologa. J. M. Walker y E. B. Gingold. Editorial Acribia, S.A. Biologa Molecular de la Clula. Alberts. Bray. Lewis. Raff. Roberts. Watson. Editorial Omega. Revistas Mundo Cientfico. Artculos Cientficos de diferentes Peridicos.

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UNIDAD III: BIOLOGA MOLECULAR APLICADA A LA AGRICULTURA Y LA GANADERA

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DESARROLLO DE LA UNIDAD DIDACTICA: BIOLOGA MOLECULAR APLICADA A LA AGRICULTURA Y A LA GANADERA

Indice 1. Justificacin del desarrollo de la Unidad Didctica. 2. Objetivos 3. Tratamiento preliminar en clase de la Unidad como introduccin a la misma y para detectar ideas previas. 4. Contenidos: 4.1. Conceptuales 4.2. Procedimentales 4.3. Actitudinales 5. Mapa conceptual de la Unidad Didctica 6. Pruebas de evaluacin 6.1 Actividades de recapitulacin 6.2 Textos relacionados con la unidad 6.3 Modelos de pruebas de evaluacin 7. Bibliografa para el profesor y para el aula

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1. JUSTIFICACIN DE LA UNIDAD DIDCTICA. BIOLOGA MOLECULAR APLICADA A LA AGRICULTURA Y A LA GANADERA.

La Unidad Didctica "Biologa Molecular aplicada a la agricultura y a la ganadera" corresponde al ncleo didctico "Biologa molecular y Medio Ambiente" del desarrollo curricular de la asignatura Biologa Molecular, optativa de 2 de Bachillerato. El gran inters que despierta esta Unidad se basa en la creciente importancia de las aplicaciones biotecnolgicas en la vida cotidiana, como la creacin de organismos, la clonacin de dichos organismos, la posible clonacin humana etc....La profundizacin en las tcnicas que hacen esto posible, adems de formar en conocimientos a los alumnos, les va a formar una opinin personal sobre las implicaciones ticas que estos temas conllevan. Los alumnos que en 2 de Bachillerato eligen esta asignatura optativa, manifiestan gran inters por los temas medioambientales y muchos de ellos van a estudiar carreras universitarias relacionadas con este campo: biolgicas, veterinaria, ingeniera agrnoma, ecologa, etc...por lo que resultan muy interesantes para ellos los avances relacionados con la Ingeniera Gentica en estos temas. Los estudios que se estn realizando en el campo de la Biologa Molecular aplicados a la mejora de la agricultura y ganadera, avanzan con gran rapidez, lo que supone para el profesorado que imparte la asignatura una puesta al da continua y una revisin permanente de la unidad.
2. OBJETIVOS

Con el desarrollo de esta Unidad Didctica se pretende conseguir en los alumnos los siguientes objetivos: a) Conocer las principales tcnicas de manipulacin de los cultivos vegetales b) Conocer las principales tcnicas de modificacin gentica en plantas c) Aplicar los conocimientos adquiridos en la Unidad "Tecnologa del ADNRecombinante a la manipulacin gentica en vegetales. d) Conocer las diferentes aplicaciones que tiene la manipulacin gentica en plantas y cmo repercutir en el campo de la agricultura. e) Valorar el posible peligro que supone para la sociedad, el que estas nuevas plantas modificadas compitan con la agricultura tradicional y se desarrolle un gran monopolio en poder de unas cuantas empresas multinacionales. f) Valorar los posibles riesgos de contaminacin gentica, para el medio ambiente. g) Valorar los grandes beneficios que las plantas transgnicas conllevan. h) Conocer las principales tcnicas de modificacin gentica en cultivos de clulas animales. i) Conocer y valorar las posibles aplicaciones del apartado anterior, como la fabricacin de frmacos y vacunas. j) Conocer las principales tcnicas de modificacin gentica en animales. k) Valorar las posibles aplicaciones de estos animales genticamente modificados: mejora en la produccin ganadera, estudios sobre expresin gnica, utilizacin como biorreactores de determinados frmacos para el hombre. l) Conocer en que consiste la clonacin y sus posibles aplicaciones
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ll) Diferenciar entre clonacin reproductiva y clonacin teraputica m) Valorar la necesidad de establecer cdigos de conducta y normas bioticas en las investigaciones relacionadas con la manipulacin gentica.
3. TRATAMIENTO PRELIMINAR EN LA CLASE, COMO INTRODUCCIN A LA UNIDAD DIDCTICA, Y DETECCIN DE IDEAS PREVIAS.

Con el objetivo de detectar en los alumnos que idea tienen sobre los temas que vamos a tratar en esta Unidad, se realizara la siguiente actividad: Mediante una "lluvia de ideas" se les plantear a los alumnos los conceptos bsicos de la Unidad: - Qu son las plantas transgnicas? - Aplicaciones de las plantas transgnicas -Qu son los animales transgnicos? - Aplicaciones de los animales transgnicos - Qu es la clonacin? Se har un comentario en relacin a los temas planteados entre todos, aclarando los conceptos que resulten errneos.

4. CONTENIDOS

4.1. Contenidos Conceptuales 4.1.1. Biotecnologa en la agricultura: Introduccin 4.1.1.1. Tcnicas de manipulacin gentica en las plantas A. Tcnicas de manipulacin de cultivos celulares B. Tcnicas de modificacin gentica de cultivos celulares 4.1.1.2. Aplicaciones de la manipulacin gentica en las plantas A. El mejoramiento de procesos bsicos en las plantas B. Fabricacin de metabolitos secundarios C. La conservacin de especies y variedades vegetales D. Mejora de la calidad nutricional y tecnolgica E. Obtencin de plantas resistentes a enfermedades y plagas F. Identificacin de patgenos G. Resistencia a herbicidas H. Tolerancia al estrs I. Modificaciones durantes el desarrollo de la planta J. Produccin de plsticos biodegradables K. Biorremediacin 4.1.1.3. Plantas transgnicas: riesgos y beneficios A. Beneficios B. Riesgos 4.1.2. Biotecnologa en la ganadera: Introduccin.
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4.1.2.1 Manipulacin cromosmica en animales A. Poliploida B. Clonacin animal 4.1.2.2 Manipulacin directa del ADN A. Clonado de genes en cultivos de clulas de mamfero B. Transgnesis en animales. Fabricacin de animales transgnicos

4.2. Contenidos Procedimentales 4.2.1. Comentar de forma crtica las repercusiones sociales y comerciales de la fabricacin de alimentos transgnicos. 4.2.2. Anlisis de las ventajas de esta nueva agricultura sobre la agricultura tradicional. 4.2.3. Analizar las aplicaciones de los animales transgnicos en la investigacin cientfica. 4.2.4.Analizar las aplicaciones de la clonacin 4.2.5. Identificar las diferentes opiniones de los expertos sobre estos temas, en distintos artculos periodsticos. 4.3. Conocimientos Actitudinales 4.3.1. Valorar la investigacin cientfica en su afn de buscar mejoras para la sociedad. 4.3.2. Valorar los posibles riesgos para la sociedad que estos temas pueden traer. 4.3.3. Valorar la polmica que suscita la manipulacin de genomas que han sido producidos a travs de millones de aos por la evolucin. 4.3.4.Valorar ticamente el hecho de la clonacin reproductiva. 4.3.5. Fomentar en los alumnos una capacidad crtica sobre los temas tratados en la unidad.

4.1.1.- BIOTECNOLOGA EN LA AGRICULTURA: INTRODUCCIN Desde la aparicin de la agricultura hace aproximadamente unos 10.000 aos, el hombre ha venido manipulando, consciente o inconscientemente, el material gentico de muchas especies vegetales con objeto de obtener de ellas el mximo rendimiento. A principios de siglo, la gentica proporcion una base cientfica en la que asentar este proceso. Desde entonces, los mejoradores han conseguido la transferencia a algunas plantas cultivadas de ciertos caracteres favorables presentes en las especies silvestres filogeneticamente ms o menos prximas. En la actualidad los mejoradores de plantas tienen una gran esperanza en incorporar a sus programas las modernas tcnicas de ingeniera gentica molecular y gentica somtica. El inters de los mejoradores estriba en
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que las nuevas tcnicas permiten obviar con relativa facilidad las barreras de incompatibilidad sexual interespecficas, ya que las tcnicas de fusin celular permiten poner juntos genomas de especies alejadas filogenticamente y, por otra parte, las tcnicas de ADN recombinante permiten la transferencia a las plantas cultivadas de genes evolutivamente tan alejados, como los de las bacterias o los animales. En la manipulacin gentica de plantas, se requiere la interrelacin de dos importantes disciplinas: la biologa celular y la biologa molecular. Numerosas especies vegetales son regeneradas desde clulas cultivadas si pared (protoplastos) que al fusionarse originan un nuevo hbrido con nuevas caractersticas genticas. Tambin las plantas transgnicas son obtenidas por la introduccin de un fragmento de DNA distinto al suyo en protoplastos o clulas, a partir de las cuales pueden regenerarse plantas transgnicas completas. Los principales objetivos en la manipulacin de plantas son obtener aumentos en las cosechas, mejorar su calidad (tanto nutricional como tecnolgica), conseguir resistencias a enfermedades y plagas, tolerancia al estrs (por ej., calor, frio, sequa, salinidad, humedad..) y resistencia a los herbicidas. A esto podran aadirse las aplicaciones biotecnolgicas como la produccin de metabolitos secundarios por cultivos en biorreactores (por ej., el cultivo de clulas para la produccin de frmacos, esencias, pigmentos...) La agricultura ocupa el segundo lugar en las aplicaciones de la biotecnologa, precedida tan slo por la medicina, ya que la produccin y distribucin de alimentos y dems productos agrcolas, tales como el algodn y el tabaco, constituyen el mayor sector industrial del mundo. Por tanto no es de extraar que las grandes compaas dedicadas a la agricultura biotecnolgica, predigan para este sector un futuro eficiente, fiable, rentable y no agresivo para el medio ambiente.

4.1.1.1.- TCNICAS DE MANIPULACIN GENTICA EN LAS PLANTAS. En la actualidad se dispone de dos tcnicas de manipulacin en plantas: A) Las tcnicas de manipulacin de cultivos celulares B) Las tcnicas de modificacin gentica de cultivos celulares

A.- Tcnicas de manipulacin de cultivos celulares

Plantas enteras, parte de ellas e incluso clulas nicas pueden hacerse crecer en medios lquidos, semislidos o slidos, que contengan medios nutritivos adecuados. Se conocen diferentes tcnicas de cultivo in vitro, las ms empleadas son: la micropropagacin clonal y la manipulacin de la poliploida. La micropropagacin clonal o propagacin vegetativa in vitro permite clonar en poco tiempo un gran nmero de especies (prcticamente todas las plantas superiores); siendo un procedimiento importante para la seleccin y produccin de plantas en grandes cantidades, y para la investigacin en biologa vegetal. Existen muchas variantes de

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micropropagacin, desde el cultivo de meristemos, obtenidos de yemas, al cultivo de clulas aisladas en medio lquido por disgregacin de un callo. El procedimiento ms usado es el siguiente: de la planta madre se obtiene unos fragmentos que se denominan explantes, stos se esterilizan y se siembran en el medio de cultivo produciendo un callo. Un callo es una masa amorfa de clulas sin diferenciar, que puede ser partido en mltiples fragmentos, o crear una suspensin celular, y seguir su crecimiento mientras haya medio de cultivo. Se puede iniciar la especializacin de sus clulas cuando se cambia la relacin en la concentracin de las hormonas auxina y citoquinina (hormonas implicadas en el duplicacin celular en vegetales). Una de las primeras aplicaciones del cultivo in vitro fue el cultivo de meristemos, con objeto de regenerar plantas sanas libres de virus. Las virosis constituyen un gran problema en plantas, donde no existen tratamientos eficaces para combatirlas. En las plantas que se reproducen por semilla no hay demasiada dificultad, ya que normalmente los virus no se transmiten a travs de semillas. En aquellas que se multiplican asexualmente, sin embargo, las virosis son muy dificiles de eliminar. En estos casos, el cultivo in vitro de meristemos es una tcnica muy eficaz para librar al cultivo de los virus. La razn est en que los virus no suelen invadir los meristemos, probablemente a la falta de vascularizacin de estos tejidos. Las plantas regeneradas a partir de meristemos sern, por tanto, sanas. Otra aplicacin de los cultivos in vitro es la propagacin a gran escala cuando el porcentaje de semillas que germinan es muy bajo. Un caso particularmente interesante es el de los cultivos en que se utiliza semilla hbrida para la siembra. Algunos hbridos son muy valiosos y la nica manera de conservar sus caractersticas es a travs de la micropropagacin clonal. Un buen nmero de especies se propagan hoy por cultivo in vitro plantas ornamentales como el rosal, plantas cultivadas como el esparrago, la pia, la patata, la remolacha, y las fresas, o rboles como los manzanos y los eucaliptos. Un problema importante con estas tcnicas es la variacin gentica que se observa con frecuencia en las clulas cultivadas y en las plantas derivadas de ellas. Las plantas regeneradas a partir de suspensiones celulares o callos muy viejos, suelen presentar distintas anomalas cromosmicas, sobre todo poliploida y aneuploida. Esto se conoce con variacin somaclonal y algunas de estas variaciones se aprovechan para obtener variedades con caractersticas tiles. Por ejemplo para la patata, se han obtenido variantes que alteran la cosecha, la resistencia a enfermedades, el color de las flores, el color de la piel del tubrculo, el contenido en azcar... Para el aprovechamiento y anlisis de los mutantes somaclonales, la mayora de los cuales son recesivos, las plantas regeneradas a partir del cultivo in vitro se dejan autofecundar y en la descendencia se seleccionan las plantas homocigticas para las distintas mutaciones. Una aplicacin industrial importante de la micropropagacin y la variacin somaclonal es la produccin de medicamentos, pigmentos y aditivos alimentarios de todo tipo. Un ejemplo lo constituyen los cultivos in vitro de la hierba doncella de Madagascar (Catharantus roseus). Esta planta produce alcaloides utilizados como antitumorales y antihipertensivos. Se han obtenido distintas variantes somaclonales de esta especie, que, a travs de un proceso de seleccin en sucesivos trasplantes, han dado lugar a variaciones con niveles muy altos de estas sustancias.

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La manipulacin de la poliploida o produccin de haploides consiste en la produccin de plantas haploides mediante el cultivo de anteras y ovarios. La mayora de las tcnicas in vitro incluye la regeneracin de plantas a partir de anteras cultivadas o de granos de polen inmaduros, aunque tambin pueden utilizarse vulos aislados. Esto se consigue desviando de su ruta natural o gametognesis a los granos de polen o a los vulos cultivados, reprimiendo genes de ls gametognesis o inducciendo genes de la embriognesis. Las plantas haploides son especialmente tiles en: a)produccin de lneas homocigticas tras la duplicacin de los cromosomas, es decir lneas puras para futuros cruces o hibridaciones. b) deteccin y seleccin de mutantes recesivos.

Figura 1: a) Mtodo de iniciacin de cultivos de callos culinares (procedentes de tallos) b) Organognesis inducida por diferentes relaciones de auxina y citoquinina

Tabla 1: Problemas y ventajas de la variacin somoclonal

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Figura 2: Induccin de plantas diploides homocigticas y haploides mutantes B.- Tcnicas de modificacin gentica de cultivos celulares

Las clulas cultivadas pueden someterse a tratamiento que modifiquen su patrimonio gentico. Las tcnicas se clasifica en directas e indirectas: Entre las tcnicas indirectas cabe destacar la transformacin de clulas mediada por Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria, presente en el suelo, es patgena de plantas dicotiledneas, a las que les produce un tumor, al penetrar por los tejidos vegetales lesionados, causando una proliferacin celular en el punto de la lesin. Durante el contacto con las clulas vegetales se transfiere un segmento de ADN del plsmido Ti (inductor de tumores) hasta el interior de la clula vegetal, donde se integra en uno o ms de sus cromosomas. El tipo silvestre de T-DNA contiene genes que codifican para la produccin de aminocidos poco frecuentes, y tambin para hormonas vegetales como las auxinas y las citoquinas. La produccin de hormonas en exceso causa una vescula que se forma en el sitio de la infeccin, y la bacteria puede utilizar los productos como fuente de carbono y nitrgeno.

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Este fenmeno natural es empleado para utilizar a la bacteria Agrobacterium tumefaciens como vector de genes que se deseen introducir en una clula, con lo que se "transforma" dicha clula, la cual puede regenerar por micro-propagacin, una planta entera que ser transgnica. El principal problema de utilizar Agrobacterium como vector es que no transforma a todas las especies de dicotiledneas con igual eficiencia y que normalmente no infecta a plantas monocotiledneas, las cuales constituyen un grupo de especies alimenticias muy importante.

Figura 3: Ciclo de vida de la Agrobacterium tumefaciens

Figura 4: Transferencia gnica directa en protoplastos. El ADN es introducido directamente dentro de los protoplastos y los productos gnicos pueden ser analizados por expresin transitoria o por integracin tras seleccin.

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Entre las tcnicas directas son de destacar: la fusin de protoplastos, la seleccin de mutantes y la transferencia directa de genes. La fusin de protoplastos proporciona la transferencia de todo el genoma de una clula vegetal a otra clula vegetal de distinta especie (incluso de especies actualmente incompatibles), con lo que se obtienen hbridos de inters. Un protoplasto es una clula vegetal desprovista de su pared celular, para lo cual se emplean enzimas como pectinasas, para destruir la lmina media de la pared, y despus celulasas y hemicelulasas para desorganizar la pared celulsica. Se han aislado protoplastos de prcticamente todos los rganos y tejidos vivos de plantas e incluso de cultivos de callos y de clulas en suspensin. La fusin de dos protoplastos puede conseguirse mediante la adiccin de sustancias qumicas llamadas fusgenos (por ej. polietilen-glicol, iones Ca2+ a pH elevado), que producen una difusin lateral de las protenas de las membranas que entran en contacto, slo se consigue un 10 % de fusiones. Otra tcnica es la electrofusin, que consiste en aplicar un impulso elctrico de corta duracin (10-200 s), con lo cual se forman poros en la membrana y se fusionan, se consiguen entre un 50-60 % de fusiones. Mediante este sistema de fusin protoplasmtica se ha conseguido hibridar la patata comercial (Solanum tuberosum) con una especie de patata silvestre (Solanum brevidens), sexualmente incompatible con la patata comercial y que es resistente a tres virus que producen graves enfermedades en la patata. La seleccin de mutantes permite obtener plantas con alguna caracterstica que interese, como resistencia a herbicidas, a plagas, o la fabricacin de algunas sustancias de inters. Los mutantes se producen mediante el tratamiento con mutgenos qumicos o mutgenos fsicos (rayos X, ultravioletas..), con lo que se obtiene un cambio gentico en un gen o en unos pocos genes. La transferencia directa de genes est en la lnea de la ingeniera gentica, pues permite introducir un gen de cualquier especie sin ayuda de un vector, en una clula vegetal, que luego regenerar una planta transgnica. Esto se consigue por distintos mtodos: - mtodos qumicos como el uso el polietilenglicol (un fusgeno) - la microinyeccin de ADN con pipetas especiales en ncleos de plantas - la macroinyeccin de ADN para meristemos empapados - los liposomas que son vesiculas lipdicas que trasportan fragmentos de ADN que se introducen por endocitosis. - la transformacin biolstica: esta tcnica se basa en bombardear clulas con partculas de tungsteno o de oro en cuya superficie van adheridas molculas de ADN con los genes que interesen. Las heridas que se producen en la pared celular y en la membrana no suponen ningn riesgo para la clula porque arreglan rpidamente. As se han conseguido plantas transgnicas de cereales como trigo, soja y maz.

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- la electroporacin o introduccin de ADN a travs de los poros formados por la aplicacin de corriente continua y pulsos elctricos.

4.1.1.2.- APLICACIONES DE LA MANIPULACIN GENTICA EN PLANTAS Las aplicaciones de la biotecnologa en este campo ms relevantes o en perspectiva de serlo pronto son:
A.- El mejoramiento de procesos bsicos de las plantas.

1.- Aumento de la produccin: manipulando el proceso de la fotosntesis. Aunque hay muchos factores que contribuyen al aumento en la produccin vegetal, uno de los ms importantes es el papel que desempea la fijacin de carbono. La Ribulosa bifosfatasa carboxilasa-oxigenasa (Rubisco) es la enzima responsable de la fijacin del CO2 por combinacin con ribulosa-5-fosfato, para dar dos molculas de cido 3fosfoglicrico. Sin embargo adems de esta reaccin de la carboxilasa, tambin cataliza una reaccin entre ribulosa-5-fosfato y oxgeno, para obtener una molcula de cido 3fosfoglicrico y una del compuesto bicarbonado del cido fosfogliclico. La ltima actividad oxigenasa es responsable de la prdida de CO2 dependiente de la luz conocida como fotorespiracin. La fotorespiracin parece reducir la eficacia de la fijacin de carbono. Por tanto para mejorar la produccin de carbohidratos habra que lograr un incremento de la actividad carboxilasa frente a la actividad oxigenasa de la Rubisco. La molcula de Rubisco es un compuesto de ocho subunidades idnticas grandes y ocho subunidades idnticas pequeas, codificadas en los cloroplastos y en el ncleo respectivamente. Los genes, presentes como pequeas familias multignicas, han sido clonados y caracterizados, y son asequibles a la manipulacin. La subunidad grande de la Rubisco contiene el sitio cataltico de la enzima, y es posible manipular su estructura para aumentar la actividad carboxilasa a concentraciones determinadas de CO2 , por ejemplo aumentando la afinidad de la enzima por el CO2. Alternativamente, podra ser posible suprimir la actividad oxigenasa de la enzima, pero las enzimas que carecen de actividad fotorespiratoria no son viables. Hay que tener en cuenta que si la actividad carboxilasa incrementa su eficacia, pueden surgir otras limitaciones en el flujo del carbono, por tanto, habr que prestar especial atencin a otras enzimas que intervienen en los procesos que dividen al carbono entre los sitios de produccin y de almacenamiento en los tejidos. 2.- Fijacin del nitrgeno La maquinaria biolgica para la fijacin de nitrgeno est limitada, en la naturaleza, a los organismos procariotas, tanto aerbicos ( p ej. Azotobacter) como anaerbicos (por ej. Klebsiella) bacterias y cianobacterias (por ej. Anabaena). Sin embargo plantas superiores como las leguminosas pueden explotar esta propiedad mediante una asociacin simbitica con especies como Rhizobium y Bradyrhizobium que son capaces de formar ndulos en la

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raz. La simbiosis consiste en que dichas bacterias reducen el dinitrgeno a amonio intercambiandolo por compuestos carbonados derivados de la fotosntesis. Los procedimientos para manipular genticamente la simbiosis de la fijacin del nitrgeno requieren un gran conocimiento de los procesos de reconocimiento, infeccin y desarrollo de los ndulos. La eficacia en el proceso de fijacin de nitrgeno podra incrementarse limitando la prdida de energa en forma de ATP en los procesos que requieren hidrgeno. El hidrgeno es un inhibidor de la nitrognasa. Se ha identificado un gen que produce una hidrogenasa que consume hidrogeno. Este gen ha sido transferido a varios Rhizobium, aumentando la eficacia de la fijacin de nitrgeno y mejorar el crecimiento en leguminosas. La nodulacin y fijacin son inducidas slo en condiciones bajas de nitrgeno ambiental. Puede que cuando se conozcan mejor los procesos simbiticos, se puedan modificar para que la cantidad de nitrgeno no sea un factor limitante. Con todos los avances que se han conseguido en la tecnologa de la transferencia de genes podra ser posible introducir genes implicados en los procesos de fijacin directamente en plantas que no sean leguminosas. Sin embargo, debido a la complicada naturaleza del proceso de fijacin del nitrgeno, antes de que esto pueda ser logrado se requiere un mayor conocimiento de la totalidad de los genes implicados. Se ha visto que algunas formas de "ndulos" pueden ser inducidas en races de cereales como el trigo, pero hasta ahora esas estructuras no tienen actividad fijadora de nitrgeno.
B.- Fabricacin de metabolitos secundarios

Un amplio nmero de agentes qumicos comerciales hoy en da derivan directamente de material vegetal, incluyendo un 25 % de todas las prescripciones farmacuticas. Los tipos de compuestos obtenidos se clasifican en cinco clases segn su aplicacin: frmacos, esencias, perfumes, pigmentos, y agentes qumicos tiles en agricultura. Bioqumicamente, la gran mayora de los compuestos son metabolitos secundarios. Los productos se acumulan solamente en una serie de especies restringidas, e incluso a veces en una nica especie o gnero y a menudo en un rgano o tejido especfico, o en una etapa especfica del desarrollo de esa especie. En los pasados 30 aos, se ha realizado un gran esfuerzo al pasar en los estudios de la planta intacta a la explotacin de tcnicas de clulas en cultivo para producir metabolitos secundarios especficos. Las ventajas potenciales de la tecnologa in vitro incluyen producir bajo condiciones ambientales definidas, libres de enfermedades y plagas. Sin embargo han sido descritos numerosos problemas tcnicos y biolgicos en el desarrollo de estos procesos, ya que, se ha encontrado que se acumulan niveles muy bajos de metabolitos secundarios especficos e incluso ms bajos que los que se acumulan en el interior de la planta. Pero solventados algunos de estos problemas y teniendo en cuenta conjuntamente parmetros genticos, fisiolgicos y bioqumicos se pueden construir sistemas de produccin a gran escala para determinados agentes qumicos especficos.

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Las estrategias ms utilizadas estn basadas en: - sistemas fermentadores, en los cuales las clulas son cultivadas y cosechadas, extrayendose de ellas los productos. - sistemas de lecho-fijo, en los que las clulas son inmovilizadas como agregados multicelulares, en matrices biolgicamente inertes, como geles o espumas y el producto es liberado por las clulas. Los sistemas de cultivo en masa han sido utilizados con xito para la produccin comercial de la shikonina, un pigmento rojo, por la Mitzui corporation de Japn. El xito del proceso est basado primero en la explotacin de la variabilidad biosinttica in vitro, por la seleccin de lneas celulares que producen altos niveles del compuesto. Las clulas son cultivadas en una fermentacin en dos etapas: en la primera, las clulas son crecidas en un tanque, y en la segunda estn sujetas a un cambio en la composicin del medio, por ejemplo, uno de esos cambios favorece la produccin de shikonina en lugar de la divisin celular. Los sistemas de cultivo inmovilizados tienen que ser todava empleados en un proceso comercial completo, pero hay muchas ventajas tanto fisiolgicas como desde el punto de vista de la ingeniera qumica sobre el sistema de cultivo en masa. Por ejemplo, la naturaleza agregada de las clulas vegetales inmovilizadas en s mismas promueve el aumento de produccin y, una vez establecidos, los cultivos pueden permanecer en una fase de produccin continua durante varios meses. La produccin industrial con alto rendimiento en cultivos celulares es una realidad en la obtencin de sustancias como la codena, morfina, reserpina, digitoxina y quinina.
Tabla 2: Algunos productos vegetales tiles

Figura 5: Produccin de metabolitos secundarios po clulas vegetales cultivadas in vitro

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Figura 5: Produccin de metabolitos secundarios por clulas vegetales cultivadas in vitro

C.- La conservacin de especies y variedades vegetales.

Mediante las tcnicas de micropropagacin y de crioconservacin (conservacin en frio de gemoplasma) se estn salvando de desaparecer muchas especies silvestres y variedades de especies cultivadas. En la actualidad existen bancos genticos internacionales donde se guardan clulas de miles de especies y variedades cultivadas. Un ejemplo lo tenemos en el cultivo por micropropagacin de la escasisima especie espaola, de la familia de los cipreses, llamada "sabina de Cartagena" (Tetraclinis articulata).

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D.- Mejora de la calidad nutricional y tecnolgica.

Ya que las bases bioqumicas y moleculares de la calidad de los productos sern diferentes segn los distintos tipos de cultivos (protenas, carbohidratos, aceite, metabolitos secundarios..), se tropieza con la dificultad de mejorar la calidad de diversas formas. Por esta razn y tambin por su importancia econmica, se ha concentrado mucho esfuerzo en el estudio de las calidades nutricionales y tecnolgicas de los productos de almacenamiento de las semillas de cereales, leguminosas y Brassicas. En estas especies el inters por mejorar la calidad nutricional se centra en el hecho de que las protenas almacenadas en sus semillas contienen un bajo contenido en uno o varios aminocidos esenciales. Por ejemplo el trigo, la cebada, y el maz tienen un bajo contenido en lisina, mientras que las leguminosas tienen protenas con un bajo contenido en los aminocidos que contienen azufre. La utilizacin de la ingeniera gentica para mejorar la calidad de las protenas en cereales puede ser abordada de diversas maneras: - mediante el aislamiento y clonacin del gen de la protena, insertando en l codones nuevos para los aminocidos deficientes, e introduciendo el gen de nuevo en la planta. Pero esto est todava por demostrar, en cereales. - modificando la expresin de los genes existentes y as protenas que son ricas en los aminocidos deficitarios son sintetizadas con prioridad. Las propiedades bioqumicas de los cultivos pueden tambin ser modificadas para mejorar la calidad en relacin, a las necesidades tecnolgicas e industriales. Por ejemplo: La calidad del trigo, para la fabricacin del pan, depende en gran parte de las propiedades viscoelsticas del gluten, que a su vez est formado por dos protenas principalmente, la gliadina y la glutenina. Con la manipulacin de sta ltima se puede obtener un trigo de alta calidad para la fabricacin del pan. Tambin el gluten de los cereales, es el objetivo del estudio de un equipo de cientficos del Centro Nacional de Biotecnologa dirigido por Enrique Menndez. Estos investigadores han descubierto el primer mtodo eficaz para detectar esta protena, presente en el trigo, la cebada, el centeno y la avena, que provoca vmitos, diarreas, y lesiones intestinales en los pacientes celacos, cuyo organismo no tolera esta sustancia. El hallazgo del gluten puede ser un primer paso para la creacin de cereales transgnicos sin gluten. Tambin se estn investigando en las protenas de la cebada para mejorar la produccin de cerveza, y en los genes de semillas oleaginosas para aumentar el rendimiento, mejorar y obtener aceites especiales.
E.- Obtencin de plantas resistentes a enfermedades y plagas.

Los principales objetivos diseados habitualmente por ingeniera en plantas estn relacionados con la resistencia a insectos, virus, hongos, bacterias y nematodos. Este campo se ha extendido rpidamente, as que tomaremos distintos ejemplos sobre estos trabajos de un amplio rango de cultivos vegetales.

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1.- Resistencia a insectos. Se utilizan unas determinadas protenas (endotoxinas) que se producen durante la esporulacin de una bacteria (Bacillus thuringiensis). Las protenas son inofensivas para humanos, animales domsticos y la mayora de los insectos. Sin embargo, dichas protenas son txicas para tipos de insectos especficos; por ej: lepidpteros, escarabajo de la patata y muchos dipteros. La compaa Monsanto ha logrado modificar los genes de la patata para que expresen las endotoxinas de Bacillus thuringiensis, de manera que estas plantas ofrecen una drstica resistencia al escarabajo de la patata de Colorado y esto conlleva una gran reduccin en el empleo de pesticidas qumicos para controlar esta plaga. Estn en desarrollo en muchos laboratorios procedimientos similares para proteger a una amplia gama de cultivos, como por ejemplo el algodn, tomate, patata, tabaco y maz. 2.- Resistencia a virus. . Diversas estrategias han sido empleadas para conferir resistencia a virus patgenos de cultivos celulares, pero la que mejores resultados esta dando es la proteccin por sobreexpresin de genes de la cpsula viral. Aunque el mecanismo no es muy conocido, hay una amplia evidencia que muestra que la expresin constitutiva de protenas de la cpsula viral reduce la infeccin significativamente, retrasando el desarrollo de sntomas y disminuyendo la acumulacin de virus en las pocas plantas infectadas. Esto ha sido demostrado para: el Virus del Mosaico del Tabaco, el Virus del Mosaico de Pepino, el virus del Mosaico de la Alfalfa, el Virus X, y Y del enrrulamiento de la hoja de la patata, etc.. Otro mtodo consiste en transferirles genes vricos que limiten la capacidad de los invasores para replicarse dentro de las clulas de la planta. Esta estrategia induce la resistencia a enfermedades anteriormente intratables y abre nuevas posibilidades para el control efectivo de las enfermedades vricas antes de que puedan arraigar. Los objetivos en general son encontrar estrategias que produzcan plantas transgnicas resistentes a todas las cepas de un virus en particular y preferiblemente a una serie de virus patgenos .3.- Resistencia a hongos patgenos. Debido a la gran complejidad de las interaciones hongo-planta, se han descrito menos investigaciones en el desarrollo de procesos moleculares para conferir resistencia en el hospedador que en otras plantas patgenas. Sin embargo esta situacin est cambiando, ya que se estn realizando trabajos sobre la expresin de genes de quitinasa y -1,3glucanasas en plantas transgnicas, que es de esperar degradaran especficamente las paredes de la hfas de los hongos invasores. 4.- Resistencia a bacterias patgenas. Tomado la patata como ejemplo, han sido obtenidas plantas transgnicas de patata que expresan varias protenas antibacterianas. El fragmento peptdico (cecoprin) procedente de una protena de la hemolinfa de un gusano de seda gigante, que se cree acta como ionforo contra un amplio espectro de especies bacterianas, ha sido introducido y expresado en plantas transgnicas de patata. De forma semejante, la lisozima, una enzima
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(en este caso de pollo) que degrada los pptido-glicanos de las paredes celulares bacterianas ha sido expresado en plantas transgnicas. Ensayos de campo han indicado que la expresin de cecoprn aporta una resistencia significativa a enfermedades bacterianas como la putrefaccin suave y la patanegra (putrefaccin de la raz). 5.- Resistencia a nematodos patgenos. Los rpidos avances en tcnicas moleculares, como la amplificacin de secuencias por PCR, ahora significan que la importancia econmica de la relacin hospedador-parsito de los nematodos endoparsitos (por ejemplo nematodos que forman quistes y ndulos en las races) puede ser estudiada con ms detalle. Los procedimientos que se han seguido implican la interrupcin de la alimentacin de las clulas de nematodos para conferir resistencia a hospedador.

.F.- Identificacin de patgenos Se han producido grandes avances en la utilizacin de las tcnicas moleculares para la identificacin de determinados patgenos por ejemplo de virus. Inicialmente se empleaban sondas de cDNA, pero con la ventaja de la utilizacin de PCR bien para cebadores especficos o para cebadores aleatorios. Han surgido muchas aplicaciones nuevas. Un ejemplo son los ensayos rutinarios para virus, donde se puede utilizar PCR, por ej. el virus del Mosaico del Pepino que es un serio agente patgeno en su semilla. Ensayos rutinarios en las semillas cultivadas pueden ser efectuados con una sensibilidad de deteccin superior a 1 CMV-semilla infectada en un lote de 1.000 semillas de pepino.
G.- Resistencia a herbicidas

Existen alrededor de 30.000 especies de plantas silvestres que proliferan junto a las plantas cultivadas, compitiendo por el espacio, el agua, la luz y los nutrientes, reduciendo as significativamente el rendimiento de los cultivos. Las dificultades en el control qumico de las malas hierbas estriba en que los herbicidas pueden destruir los cultivos al mismo tiempo que las plantas indeseables. As pues, la cantidad y potencia del herbicida que un agricultor puede utilizar estn condicionadas por la sensibilidad del cultivo. El desarrollo de cultivos resistentes a los herbicidas ha sido una de las prioridades para las compaas de biotecnologa agrcola. Uno de los primeros ejemplos de resistencia artificial con xito fue contra el glifosato, herbicida ampliamente utilizado que Monsanto fabrica bajo el nombre comercial de Roundup. El glifosato acta acoplndose a una enzima que las plantas necesitan para sintetizar los aminocidos y desactivndola. El gen que codifica esta enzima fue alterado para que produjese otra modificada, con menor afinidad para el herbicida, pero que mantena su funcin original. En 1996 dicho gen haba sido introducido en ms de 30 plantas de cultivo utilizadas en silvicultura, lo que les permita resistir dosis de glifosato de otro modo letales. El atractivo para los agricultores reside en que les permite controlar las malas hierbas de modo ms eficiente y econmico; ya que pueden limitar el nmero de

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aplicaciones del herbicida lo que les ahorra tiempo y costes, tanto en combustible como en herbicida. Por aadidura, menos herbicida significa menos dao al medio ambiente. La produccin de plantas resistentes a herbicidas es fcil porque los lugares de accin de los principales herbicidas son conocidos y son habitualmente una enzima nica. Se emplean tres estrategias para obtener resistencia a herbicidas en plantas transgnicas: - amplificacin del gen diana, por ejemplo enzimas de tipo silvetre. - introduccin de un mutante, gen no sensible a herbicidas. - introduccin de un gen para una enzima que puede degradar o inactivar el herbicida. La resistencia a los principales herbicidas, como glifosato, sulfonil ureas, imizalinonas, y triacinas; ya se ha conseguido.

H.- Tolerancia al estrs

Se estn haciendo estudios para conseguir plantas resistentes a determinados factores ambientales que les provocan estrs como el calor, las heladas, la salinidad, la sequa, anaerobiosis como la inducida por la inundacin, radiacin ultravioleta etc...Las bases moleculares de estos procesos son conocidos y los genes implicados han sido clonados y secuenciados e identificadas sus secuencias reguladoras. Muchas de las consecuencias fisiolgicas del estrs, estn causadas por una forma destructiva de oxgeno denominada radicales libres. Estas molculas activadas aumentan en las plantas sometidas a helada, sequa, inundacin o enfermedad. Trastornan la estructura celular de la planta al atacar las protenas, los lpidos y los cidos nucleicos. Las plantas disponen de algunas defensas en forma de enzimas y vitaminas, que actan como antioxidantes. Para explotar este sistema defensivo natural, los investigadores intentan incrementar su produccin de enzimas protectoras mediante ingeniera gentica. Sin embargo, el mayor problema reside en la regulacin de estos genes una vez introducidos en la planta ya que slo se necesitan en determinadas situaciones de emergencia y su expresin continuada conlleva efectos secundarios no deseados. Adems de las inclemencias del tiempo, la calidad del suelo es otro factor que afecta a la productividad de las explotaciones agrcolas. Los mtodos modernos de agricultura intensiva exigen la utilizacin de grandes cantidades de fertilizantes para mantener el nivel de nutrientes del suelo requerido por los cultivos. Sin embargo, a largo plazo podra resultar ms fcil y barato modificar la planta para adaptarse al suelo que modificar el suelo para adaptarse a la plantas. Los investigadores estn estudiando, por ejemplo, maneras de inducir en las plantas la resistencia a la sal. Ello hara posible la extensin de las tierras de cultivo a reas marginales de suelos pobres, o incluso el regado con agua de mar.

I.- Modificaciones durante el desarrollo de las plantas

Debido a la complejidad y diversidad de la naturaleza de los procesos implicados en el desarrollo de las plantas, sera muy extenso profundizar en este campo; as que hablar de tres ejemplos especficos de la aplicacin de la biotecnologa en plantas modificadas
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durante su desarrollo: el control de la feminidad y masculinidad (fertilidad/esterilidad), maduracin del fruto, y coloracin de la flor. 1.- Control de la esterilidad masculina y femenina. En algunos cultivos, el crecimiento y la produccin de plantas hbridas podra ser muy superior al encontrado en lneas innatas. Pero las semillas de plantas hbridas F1 no se reproducen y los cultivadores necesitan tener semillas nuevas cada ao. Esto atrajo la atencin de los investigadores y comenzaron a buscar los genes relacionados con los procesos de fertilidad-esterilidad y a aplicar las tcnicas de biologa molecular en este campo. As, por ejemplo se ha conseguido un hbrido F1 de una semilla de aceite de colza que es frtil y produce semillas. Aplicndolo al maz, la industria podra ahorrar varios cientos de millones de dlares, reemplazando este proceso por la produccin de semillas hbridas de forma manual. 2.- Maduracin del fruto. Una considerable proporcin de procesos agrcolas producen prdidas despus de la recoleccin. Las tcnicas moleculares podran ser utilizadas para disminuir esta prdida. Por ejemplo, en frutos como el tomate, que manifiesta una subida de la produccin de etileno durante su maduracin. Estudiando la va de produccin del etileno se vio que hay dos enzimas involucradas en el proceso, la ACCsintasa y EFE (enzima formadora de etileno). La produccin de etileno no se realiza en plantas transgnicas que expresan construcciones sin sentido para ambas enzimas. Los tomates transgnicos de estas plantas pueden continuar sin pudrirse ms tiempo y ser transportados con menor riesgo. Un proceso similar podra ser utilizado para la vida media de algunas flores. 3.- Modificaciones sobre los colores de las flores. Las vas metabolicas que conducen al desarrollo del color de la flor estn actualmente bien caracterizadas. Los principales antocianos que contribuyen a los colores de las flores son las antocianinas delfinidinas (malva-azul), cianidina (carmes-magenta) y pelargonidina (rosa-escarlata-naranja). Es relativamente sencillo la introduccin de un gen sin sentido de la calcona sintasa y esto podra dar flores blancas, una reduccin del color, o una disminucin del color dependiendo del desarrollo, segn los promotores o el sitio de insercin. La empresa Calgene Pacific (Melbourne, Australia) est intentando producir una rosa azul mediante la adicin de la enzima requerida para producir delfinidina dirigida mediante un promotor especfico de ptalo.
J.- Produccin de plsticos biodegradables.

Las plantas transgnicas tambin puedn ser utilizadas como sustitutas del petrleo en la fabricacin de plsticos, que tienen, adems, la ventaja de que son biodegradables. Investigadores estadounidenses de la multinacional agroqumica Monsanto y suizos del Instituto de Ecologa, Biologa y Fisiologa Vegetal de Laussana han conseguido crear,

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a partir de berro y colza, una variedad transgnica capaz de producir un tipo de plstico biodegradable. Para conseguirlo, han partido de la bacteria Alcaligenes eutrophus , que produce un tipo de polmero de reserva (polihidroxibutirato y otros polihidroxicidos) cuyo inters radica en que sirve de materia prima para la fabricacin de envases y utensilios de un plstico biodegradable. La introduccin de cuatro genes de la bacteria confiere a la planta la capacidad de acumular dicho plstico. Adems, y gracias a la manipulacin de varias rutas metablicas, se ha podido restringir esa acumulacin a los compartimentos donde se almacena el almidn en los tejidos de reserva, donde no tiene efectos perjudiciales para la planta y donde la recoleccin es fcil. Tambin se ha logrado incorporar esos genes a la planta del algodn, lo que puede permitir obtener un material textil con nuevas propiedades.
K.- Biorremediacin.

La actividad industrial ha introducido deliberada o accidentalmente en el medio ambiente una enorme variedad de compuestos qumicos que nunca anteriormente haban existido en la biosfera, alterando drsticamente el equilibrio de los distintos ecosistemas. Cualquier solucin a los problemas ambientales que utilice seres vivos, se conoce con el nombre de biorremediacin. Una patente norteamericana registrada en 1994 describe cmo plantas genticamente modificadas de la familia de las crucferas (coles o Brassicas, mostaza y rbanos) pueden ser adaptadas para absorber metales txicos o valiosos a travs de sus races. Las plantas acumulan los metales en concentraciones de hasta un 30 % del peso seco de sus races. Las plantas utilizadas para descontaminar suelos deben ser capaces de realizar una o ms de las siguientes actividades: - absorber con sus races los metales de las partculas del suelo o del lquido del suelo - enlazar los metales con el tejido de sus races, fsica o qumicamente - transportar los metales desde sus races hasta sus brotes - impedir que los metales se disuelvan en el suelo Para resultar tiles, las plantas no slo deben acumular metales, sino tambin crecer con rapidez en una gran variedad de condiciones y ser fciles de recolectar. Despus de todo los metales no desaparecen cuando se desplazan del suelo a las plantas. Si las plantas mueren, los metales vuelven al suelo. Para una correcta eliminacin de los metales de una zona, las plantas deben ser cortadas y su contenido metlico tratado, de modo no contaminante, en otro lugar. Los investigadores buscan propiedades adecuadas, tanto entre las plantas cultivadas como entre las silvestres. Algunas especies silvestres de crucferas son propias de suelos con contenido metlico. Por ejemplo, la hierba de la rabia, es comn en los suelos que contienen serpentina, un mineral muy rico en magnesio, en el sur de Europa. La hierba de la rabia tiende a crecer y reproducirse muy lentamente, lo que la hace poco apta para el cultivo a gran escala; pero sus genes responsables de la acumulacin de metal podran ser transferidos a especies cultivadas de la misma familia, que producen varias cosechas al ao.

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Las tcnicas genticas desarrolladas en los ltimos aos han venido en auxilio de los especialistas en descontaminacin de suelos. El tratamiento habitual es una combinacin de bacterias y plantas que chupan los contaminantes del suelo. Esta es la opcin ms recomendada por la comunidad cientfica internacional, para eliminar los residuos txicos de los lodos vertidos en el valle del Guadiamar por la rotura de la presa de Aznalcoyar. Un informe de un grupo de expertos del CSIC recomienda la siembra de distintas especies de Brassica. Esta planta se caracteriza por su capacidad para extraer varios de los metales contenidos en los lodos: plomo, zinc, cobre y cadmio; pero es incapaz de extraer el arsnico. Hasta ahora, su variabilidad qumica ha fustrado los intentos de los cientficos de convertirlo en una combinacin inocua. Pero, recientemente en una especie de lamo, los especialistas han conseguido introducir un gen que le permite extraer del suelo mercurio altamente txico y transformarlo es una forma inocua, que libera en el aire. Esto abre nuevas expectativas y todo parece indicar que habr plantas especializadas genticamente en la extraccin de arsnico, dentro de unos aos.

4.1.1.3.- PLANTAS TRANSGNICAS : RIESGOS Y BENEFICIOS. Desde 1986 ha habido ms de dos mil pruebas sobre el terreno de cultivos transgnicos en todo el mundo. Los ensayos de campo han sido realizados por organizaciones de investigacin pblica (Universidades, Institutos Agrcolas de Investigacin), y por compaas comerciales. Hasta la fecha se han desarrollado ensayos de campo en al menos 21 pases diferentes, la mayora (85%) se realizan en Norte Amrica (USA, Canad) y Europa (Francia, Blgica, Reino Unido, Holanda). Estos ensayos implican 25 cultivos vegetales diferentes. Los cultivos principales son: maz, arroz, patata, brassicas, abedul, nogal, algodn, colza, soja, girasol, tabaco, tomate, lamo etc...Esta lista no hay duda de que se ampliar rpidamente, por ejemplo, con otros cultivos como el trigo. As, mientras que los organismos genticamente modificados van ocupando un lugar cada vez mayor en la agricultura, las reglas que rigen su utilizacin son an poco consistentes. Los defensores de la biotecnologa abogan por la desregulacin, tendencia que est siendo seguida en Estados Unidos, mientras que mucha gente siente preocupacin porque se liberen organismos transgnicos en la naturaleza sin que su seguridad haya sido confirmada.
A.- Beneficios

Los estudios de economa agraria indican que para dar de comer a 6.000 millones de personas, la poblacin actual, debern producirse en las prximas tres dcadas tantos vegetales como los obtenidos desde el comienzo de la agricultura hasta el ao 1992. Algunos expertos aseguran que una agricultura intensiva como la que vamos a requerir no puede basarse en la tecnologa actual. El uso intensivo de fertilizantes, de energa y de productos agroqumicos tiene un indudable impacto ambiental negativo. Se hace necesaria la obtencin de nuevos cultivos de mayor rendimiento y ms respetuosos con el medio ambiente. Para muchos cientficos y economistas, entre ellos el Banco Mundial, la solucin a este problema pueden ser el cultivo de plantas transgnicas para la produccin de alimentos.

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Como la ingeniera gentica puede ser empleada para modificar diferentes etapas de la produccin, desde la aceleracin del crecimiento de plantas alimenticias hasta el aumento de la produccin o el retraso de la maduracin o el marchitamiento; el objetivo final consiste en disear plantas idneas para cada condicin de cultivo y cada exigencia del mercado. Adems, podra haber beneficios significativos en el medio ambiente por el hecho de que las plantas genticamente resistentes a plagas y enfermedades, no tendran que ser protegidas en el mismo grado mediante la aplicacin de productos qumicos, como las plantas tradicionales. Algunos de estos productos son muy persistentes y permanecen en el medio contaminando incluso a los acuferos. Por tanto, se persigue una agricultura que d respuesta a la demanda de alimentos en el futuro, utilizando menos fertilizantes y menos productos qumicos, y la respuesta parece estar en los avances de la biotecnologa aplicados a la agricultura.
Tabla 3: Ejemplos de los beneficios potenciales de las plantas transgnicas

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B.- Riesgos

Como toda nueva tecnologa, hay tambin riesgos inherentes y stos deben ser conocidos para su disminucin. El debate sobre el alcance de estos riesgos es complejo y algunos de sus aspectos suscitan gran inquietud. Las preocupaciones de la sociedad, polticos, consumidores y grupos ecologistas se centran principalmente en tres aspectos: - Saber si el consumo de plantas genticamente modificadas (PGM) es peligroso para la salud humana y si estas plantas al entrar en la cadena alimenticia, pueden perjudicar a otros organismos. - El riesgo de contaminacin gentica, es decir, de diseminacin de transgenes entre las especies salvajes, y perturbar de esta manera la diversidad gentica de los ecosistemas. - El riesgo de que algunas grandes empresas controlen los medios de produccin alimentaria, exploten a las agriculturas pobres y comercialicen plantas transgnicas sin ensayos de seguridad apropiados. As, en el terreno alimentario, hay que evaluar en primer lugar los riesgos directos a los que est expuesto el hombre, y luego el eventual riesgo indirecto relacionado con el consumo de productos elaborados a partir de animales alimentados con PGM. Los procedimientos de seguridad aplicados por los Estados sobre las PGM son muy parecidos en todo el mundo. Se aplican gen por gen, y se trata de: 1) identificar todo el material gentico introducido 2) evaluar el riesgo de transferencia del transgen a otras plantas u organismos 3) evaluar la seguridad de los productos del gen. Adems, todo se remite al principio llamado de "equivalencia sustancial". Este principio, se basa en la idea de que las modificaciones inducidas, es decir, las que no se han introducido deliberadamente, no deberan tener ninguna consecuencia notable en la planta transformada. Hasta el momento, catorce genes han sido introducidos aisladamente, o en asociacin, a plantas cuyos productos estn presentes en la alimentacin europea o a otras que son objeto de alguna demanda de permiso de comercializacin o de cultivo en la UE. Evaluar si estos catorce genes presentan peligros ha requerido mucho tiempo y en la prctica la infraestructura y los gastos necesarios para estas investigaciones son relativamente modestos. Las modalidades actuales de evaluacin prevn un estudio de la toxicidad crnica y aguda. Pero esta investigacin se tiene que hacer con la protena producida por la transgnesis aislada, por ejemplo de una bacteria, pero no de la propia planta transgnica. Esto se explica por la necesidad de aumentar la concentracin e introducir el producto en los animales de experimentacin, pero se sabe que despus de su sntesis, una protena expresada por un husped diferente sufre modificaciones (post-transcripcionales) y se

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alteran sus propiedades biolgicas y fsicas. Por tanto, se corre el riesgo de sacar conclusiones de seguridad, que pueden ser prematuras. Los tests actuales permiten, en efecto, cierta evaluacin de la seguridad, pero son poco eficaces para descubrir efectos ms discretos o de aparicin lenta. Uno de estos efectos es la aparicin de alergias. Por lo tanto, es lgica la reaccin de los consumidores y de los polticos en exigir el etiquetaje de los alimentos y de los ingredientes genticamente modificados que entran en la cadena alimenticia. Una exigencia que es estatutaria en los pases miembros de la UE y se extender muy pronto a los aditivos alimentarios producidos a partir de las plantas transgnicas. Hacer que los consumidores puedan decidir si quieren o no comprar este tipo de alimentos parece una respuesta inteligente a las inquietudes del pblico. Sin embargo la rapidez con la que se desarrollan las nuevas tecnologas es tal, que ser imposible dentro de unos aos tener un sistema de produccin alimentario moderno totalmente exento de plantas modificadas genticamente. Habr que someter, por tanto, a las tecnologas gnicas a un profundo examen cientfico previo, a nivel de salud y de medio ambiente y esto constituir un gran reto para las autoridades reguladoras. La seguridad de algunas PGM que ya han entrado en la cadena alimenticia no inspira preocupacin, pero no podemos decir lo mismo de las que aparezcan en el futuro. A menos que el desarrollo de los instrumentos de evaluacin no avancen al mismo ritmo que la ingeniera gentica, los organismos consultivos sern incapaces de garantizar la seguridad necesaria frente a las PGM que vayan llegando. Respecto al segundo aspecto: pueden ciertos genes extraos escapar a la naturaleza a partir de plantas transgnicas? Si, cuando son cultivadas en regiones donde haya plantas salvajes emparentadas. Sin embargo los cultivos transgnicos no son los nicos que dejan escapar genes. Debido a la seleccin de que han sido objeto y, tambin, a la existencia de hbridos interespecies, las plantas cultivadas son ya genticamente diferentes de las variedades salvajes. La contaminacin gentica por transferencia de genes de las plantas cultivadas a las salvajes se remonta a los comienzos de la agricultura. Los genes de resistencia a los herbicidas se propagarn y provocarn la aparicin de malas superhierbas? Las variedades salvajes que adquieran esto genes por cruzamientos interespecies sobrevivirn a los herbicidas y se multiplicarn. Por lo tanto la eficacia de los herbicidas ir en declive y estos productos habrn de sustituirse por otros. En cambio, la adquisicin de los genes no aportar a las plantas no sometidas a los herbicidas ninguna ventaja selectiva que, fuera de su campo, les permita proliferar. Por tanto, es difcil creer que sean capaces de perturbar el ecosistema natural. En realidad, tambin puede aparecer la resistencia al herbicida por mutacin aleatoria despus de la aplicacin repetida de un mismo herbicida. Esto se sabe desde hace cincuenta aos y se ha comprobado que no ha tenido efectos ecolgicos indeseables. Si la tolerancia al herbicida limita las prdidas en los cultivos, debera ser bienvenida. Sin embargo, la falta de confianza en las grandes compaas suscita dudas. En el aspecto econmico, se argumenta que los avances benefician sobre todo a las grandes empresas, al condenar a los agricultores a la dependencia de determinadas variedades de semillas y los herbicidas que stas pueden resistir. Las tcnicas de ingeniera gentica, por tanto, no son intrnsecamente peligrosas ni fundamentalmente diferentes de las que pone en prctica la naturaleza misma o la tcnica clsica en agricultura, de seleccin de especies.

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Y por ltimo est, el problema de la acumulacin de poder en unas pocas empresas que dominen el sector y en manos de los gobiernos est el imponer reglamentaciones antimonopolio y oponerse a cualquier explotacin deshonesta. La transferencia de los recursos de pases pobres a pases ricos no es nada nuevo, pero la biotecnologa lo ha potenciado ms todava. La distribucin global de semillas transgnicas, por ejemplo, reduce la diversidad de los alimentos producidos en el mundo, incrementa los costes para los agricultores y har que todos dependamos de unas pocas empresas para obtener estos productos bsicos. El uso de plantas patentadas implica que los agricultores tienen que pagar los derechos a los propietarios de las patentes, o que la prctica tradicional de reservar parte de la cosecha de un ao como simiente para el prximo, sin coste adicional, ya no resulte posible, pues la semilla de muchos cultivos hbridos no se pueden plantar, y el agricultor se ve obligado a comprar una nueva provisin de semillas patentadas cada ao, junto con los compuestos qumicos de los que dependen. La evaluacin de riesgos es, en parte, cuestin de datos, pero tambin se ve afectada por la familiaridad. Tendemos a estar ms dispuestos a convivir con riesgos conocidos que con otros sin conocer, sean cuales sean los peligros respectivos; y frente a una nueva tecnologa, como en el caso de la ingeniera gentica, de la disponemos poca o ninguna experiencia personal en cuanto a riesgos y beneficios, es ms probable que los primeros ocupen nuestra imaginacin. Esta incertidumbre es tambin producto de nuestra propia ignorancia, ya que, estas tcnicas son muy nuevas y avanzan a gran velocidad. Dentro de veinte o treinta aos nuestros conocimientos se habrn incrementado, con la paralela disminucin de nuestra incertidumbre sobre algunas materias. Ello, por supuesto, no sirve de consuelo a los que estn convencidos de que las consecuencias de la biotecnologa sern probablemente perjudiciales. Analizando la situacin desde un punto de vista cientfico, hoy por hoy, existe escasa evidencia de que la modificacin gentica aplicada a las plantas haya tenido consecuencias adversas para el medio ambiente o la salud de las personas y animales. Ha habido fallos y contratiempos, pero no organismos mutantes fuera de control, ni epidemias, ni catstrofes ecolgicas. Por otra parte, como ya hemos relatado los beneficios que se pueden conseguir son muy importantes.

4.1.2.- BIOTECNOLOGA EN LA GANADERIA: INTRODUCCIN

Desde la aparicin de la ganadera hace aproximadamente unos 10.000 aos, el hombre ha venido manipulando, consciente o inconscientemente, el material gentico de muchas especies animales con objeto de obtener de ellas el mximo rendimiento. Pero, al igual que en la agricultura, desde el desarrollo de la Gentica como disciplina cientfica, se puede hablar de "manipulacin gentica". Por lo que respecta a los animales los objetivos de la biotecnologa son la mejora de la productividad (calidad de la carne, huevos, leche, lana..) y la produccin de animales ms sanos y que crezcan ms deprisa. Tambin, se persigue disear organismos para utilizarlos como biorreactores de frmacos (protenas de inters) y para utilizarlos en investigacin cientfica (ensayos de medicamentos, estudios de expresin gnica...). Algunas de las tcnicas de ingeniera gentica, utilizadas en medicina se emplean tambin para desarrollar vacunas, mtodos diagnsticos y dotar de resistencia a los
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animales, mientras que las nuevas tecnologas reproductivas permiten a los granjeros y ganaderos obtener una mayor descendencia de animales seleccionados. La manipulacin gentica de los animales ofrece dos niveles de actuacin: El primero de ellos, lo constituyen las tcnicas de manipulacin cromosmica que, modifican la dotacin gentica normal de los seres vivos (diploide). En este contexto habra que considerar la induccin artificial de animales poliploides, especialmente triploides; y las tcnicas que permiten la obtencin de animales clnicos (con igual informacin gentica) por transplante de ncleos a ovocitos enucleados. El segundo nivel de actuacin se centrara, en la manipulacin directa del ADN, objetivos primordial de la ingeniera gentica. Como tal se pueden definir, un conjunto de tcnicas que permiten la introduccin de fragmentos de ADN con genes de inters, en cultivos celulares o en organismos completos.

4.1.2.1.- MANIPULACIN CROMOSMICA EN ANIMALES Se denomina manipulacin cromosmica, a un conjunto de tcnicas que permiten cambiar el genoma completo de una clula y entroncan claramente con lo que en la actualidad se ha llamado "nuevas tecnologas reproductivas". En este mbito figuran todos aquellos organismos obtenidos tras la manipulacin directa del conjunto de ADN contenido en una clula sexual (caso de los poliploides) o bien en una clula somtica (caso del clonaje de animales). Exceptuando la obtencin de clnicos cuyo inters potencial en la mejora animal est an sin decidir, las dems tcnicas ofrecen claras perspectivas de aplicacin para mejoradores y empresarios en general. De hecho, ya son utilizadas con relativa frecuencia en pases como Estados Unidos, Noruega, Inglaterra, Japn, Francia y Espaa.
A.- Poliploida

La variacin cromosmica numrica puede introducirse artificialmente, siendo los organismos acuticos donde esta manipulacin ha alcanzado mayor xito. Si bien en ellos se han conseguido progenies tanto triploides como tetraploides, han sido las primeras las que, desde el punto de vista aplicado, mayor inters han despertado. Tanto en peces (especialmente salmones, carpas, truchas y lenguados), como en moluscos, la induccin a la poliploida se lleva a cabo mediante choques trmicos, choques de presin y tratamientos qumicos diversos. Algunos de estos mtodos actan a nivel de las divisiones meiticas impidiendo la extrusin de uno de los corpsculos polares y originndose as individuos triploides; otros bloquean la primera divisin cigtica que tiene lugar tras la fecundacin dando lugar a individuos tetraploides. En los peces, el choque trmico es el mtodo ms utilizado. Se han podido obtener descendencias de truchas, salmones y carpas compuestas por un 98% de individuos triploides (3n), donde la supervivencia se mantena entre lmites aceptables (50-80%). En el caso de los moluscos como la ostra y la vieira, los choques trmicos ofrecen menor efectividad y son los tratamientos con agentes qumicos los ms empleados, especialmente las disoluciones con citocalasina B, obteniendose en este caso porcentajes de triploida cercanos al 85%.
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La viabilidad de la progenie sometida a estos tratamientos, depende de la especie, pero despus de la madurez sexual, la supervivencia de los triploides supera a la de los individuos normales. La primera consecuencia derivada de la triploida es la esterilidad causada por el mal emparejamiento de los cromosomas homlogos durante la meiosis. Si embargo, la principal aportacin que la triploida ofrece a la mejora animal es esta ausencia de madurez sexual. Este fenmeno hace que las tasas de crecimiento durante esta etapa sean sensiblemente mayores en los triploides pudindose alcanzar pesos hasta un 40% superiores respecto a los organismos diploides. Adicionalmente, la esterilidad ofrece dos ventajas como son la ausencia de mortalidad post-freza y la mayor calidad de la carne, ya que la maduracin sexual conlleva la movilidad de las grasas teniendo como destino final el desarrollo de las gnadas. Tambin, se ha detectado una mayor estabilidad en los hbridos interespecficos e intergenricos triploides respecto a los hbridos diploides, lo cual facilita reunir en un mismo individuo las caractersticas favorables deseadas de dos especies diferentes.

B.- Clonacin animal

Un paso ms en la manipulacin cromosmica es la clonacin de genomas completos que dar lugar a individuos genticamente iguales. Se trata de introducir todo el genoma de un individuo en un clula reproductora, a la cual previamente se la ha eliminado el ncleo. De esta forma se obtiene un individuo genticamente idntico al donador, lo que se llama un clon. La clonacin es un fenmeno ampliamente extendido en la naturaleza. Es un proceso muy frecuente en los organismos ms primitivos, y es mucho ms raro a medida que se avanza en la escala evolutiva. Las bacterias se dividen originando, si no hay mutacin o procesos de transferencia gentica, clones de la clula inicial. Las plantas se reproducen frecuentemente por mutiplicacin vegetativa o asexual, produciendo clones de la planta original. Tambin los animales ms sencillos, en algn momento de su ciclo vital se reproducen de forma asexual, produciendo individuos genticamente igual a su progenitor. Incluso en los organismos ms complejos y evolutivamente avanzados, incluidos los seres humanos, se producen de forma natural, aunque excepcionalmente. La clonacin. es el caso de los gemelos monocigticos o univitelinos, que proceden de un nico zigoto, que se divide accidentalmente en dos embriones, que son viables y se desarrollan como dos individuos genticamente idnticos. Pero es importante sealar, que "individuos genticamente idnticos no significa necesariamente que sean fenotpicamente idnticos" .Todos los factores ambientales, fsicos y qumicos, la alimentacin, las condiciones del desarrollo prenatal, el nacimiento, el aprendizaje, la educacin...configuran al individuo y dan un formato nico a la informacin contenida en la clula inicial.

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a) Mtodos para la clonacin Para conseguir clones de animales se pueden usar dos mtodos: 1.- Disgregacin de clulas embrionarias: los investigadores separan las clulas de un embrin en diferentes estados de desarrollo, desde el estado de 2 clulas hasta el estado de mrula. Cada clula separada puede funcionar como un zigoto independiente 2.- Transferencia nuclear: Para ello se toman clulas embrionarias en fase de mrula o blstula por disgregacin, se cultivan in vitro, y a continuacin se transfieren a ovocitos sin ncleo. Se provoca la fusin de las dos clulas animales, pudiendo funcionar como un zigoto. Cuanto ms diferenciadas estn las clulas donantes del material gentico, ms dificil es conseguir la reprogramacin de dicho material para que la nueva clula se comporte como un zigoto.

Figura 6: Produccin de clones de bvidos por transferencia nuclear.

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b) Historia de la clonacin En 1902 Hans Spemann, un cientfico interesado en los procesos del desarrollo embrionario, cre experimentalmente los primeros clones de individuos. Logr partir un embrin de salamandra de manera que indujo la formacin de dos clones gemelos, utilizando un cabello para estrangular en dos un embrin temprano. Aos ms tarde, en 1928, logr tambin la primera transferencia de un ncleo de embrin a una clula enucleada tambin embrionaria, que posteriormente desarrollo un clon del embrin donante del ncleo. Son muchos los experimentos realizados desde entonces en esta lnea para obtener individuos clonicos, a partir de la trasferencia de ncleos a ovocitos fertilizados y enucleados experimentalmente, y, sin embargo, pocos los xitos obtenidos. En 1952, Briggs y King, lograron clonar ranas. Transfirieron el ncleo de una clula de la blstula (estadio del embrion con 8-16 clulas), a un huevo fertilizado al cual previamente haban eliminado el ncleo. Sin embargo, cuando intentaron transferir ncleos de clulas en estadios ms avanzados del embrin, los renacuajos crecieron anormalmente, de forma que concluyeron que era imposible clonar a partir de clulas adultas. En 1958, Steward, logr obtener una planta adulta a partir de clulas adultas totalmente diferenciadas de zanahoria. Esto demostraba que no era imposible la vuelta atrs de un ncleo totalmente diferenciado, por lo menos en los vegetales. El ncleo tena todos los genes y poda reprogramarse y actuar de nuevo como el ncleo de un zigoto. El 1984 se logra la clonacin de un mamfero. Fue el cientfico dans, Steen Willadsen, que consigui clonar una oveja, transfiriendo el ncleo de una clula embrionaria a un huevo fertilizado. Posteriormente, el mismo Willadsen y otros cientficos, lograron clonar otros mamferos, incluso utilizando ncleos procedentes de embriones que ya cumplan una semana, es decir, relativamente diferenciados. En 1995, un grupo de cientficos del Instituto Roslin de Escocia, dirigidos por Ian Wilmut y Keith Campbell, logran clonar dos ovejas, Megan y Morag, a partir de clulas diferenciadas de embriones. Sin embargo, es en 1997 cuando estos mismos investigadores saltan a la fama y su obra es el animal con nombre propio ms famoso, y sin duda ms fotografiado de la historia: Dolly. Dolly naci en Julio de 1996 y es el primer organismo clonado a partir de una clula adulta totalmente diferenciada. La clula que donaba el ncleo fue una clula de ubre de oveja, que se mantuvo en cultivo y en unas condiciones de ayuno que le hicieron entrar en un periodo llamado G0 o de quiescencia. Tras largos aos de experimentacin previa, descubrieron que ste era el paso crucial para el xito del experimento, reproduciendo as lo que ocurre cuando el espermatozoide entra en el ovocito y los dos ncleos se sincronizan antes de fundirse en uno. Despus la clula de la ubre se aproxima a un ovocito previamente enucleado y por medio de una corriente elctrica, se induce la fusin de las dos clulas y se activa el inicio del desarrollo embrionario. De las 277 clulas de ubre con las que se intent slo 29 llegaron a producir embriones, y nicamente una lleg a completar el desarrollo embrionario para dar lugar a Dolly. El anuncio de ste experimento en febrero de 1997 produjo una autentica revolucin en la comunidad cientfica que hasta este momento consideraba que no era posible la

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clonacin a partir de clulas adultas totalmente diferenciadas; y una autentica consternacin social que desencaden un debate pblico sobre la tica y el futuro de la clonacin humana. En Julio de 1997, Wilmut y Campbell producen la primera oveja transgnica a la que llamaron Polly. Fue creada a partir del ncleo de una clula epitelial a la cual se le haba incorporado un gen humano, el gen del factor IX, protena necesaria para la coagulacin sangunea y utilizada en el tratamiento de la hemofilia B. Polly producira esta protena en su leche y se convertira en el primer biorreactor de un frmaco destinado a tratar una enfermedad humana. En Marzo de 1997, en respuesta a un amplio y profundo debate sobre la tica de la clonacin, el entonces presidente de los EE.UU Clinton impone una moratoria de 5 aos para todos los experimentos de clonacin con humanos que sean financiados con fondos federales o particulares. En Julio de 1998, un grupo de investigadores de la Universidad de Hawai, dirigidos por Yanagimachi y Wakayama, anuncian que han obtenido 50 ratones de clulas adultas y que obteniendo clones de clones tienen ya tres generaciones de ratones genticamente iguales. La nueva tcnica, conocida como tcnica de Honolulu, es ligeramente diferente y ha demostrado ser ms efectiva ya que tienen xito en una de cada cien, frente a una de cada 300 conseguidos con la tcnica de Roslin. Se utiliz el ncleo de clulas del folculo del ovario y adems, el ncleo fue extrado con un microtubo y transferido a un vulo sin ncleo; en lugar de fundir las dos clulas. En el ao 2002, un gineclogo italiano, Severino Antinori, ha anunciado que esta el proceso de gestacin un clon humano. Pero todas sus investigaciones se realizan en secreto y en Arabia Saud, porque la clonacin humana esta prohibida en toda Europa y EE.UU. As esta las cosas actualmente, se prohibe la clonacin reproductiva por la polmica tica que conlleva, pero en algunos pases entre los que se encuentra el Reino Unido est permitida la clonacin de embriones humanos con fines teraputicos. La llamada clonacin teraputica consiste en crear embriones clnicos de un paciente y utilizar sus clulas madre, que son clulas todava sin diferenciar (clulas totipotentes o pluripotenciales), para regenerar el tejido que ese paciente tuviera daado. El nuevo tejido tendra las mismas caractersticas genticas e inmunolgicas que las del rgano daado, por lo tanto no se producira rechazo. Con esta tcnica se podran llegar a curar muchas enfermedades degenerativas como la diabetes, el Parkinson, el Alzheimer, infartos de miocardio etc... La decisin de Gran Bretaa de permitir las investigaciones con embriones humanos, ha obligado a otros gobiernos occidentales a revisar sus leyes que prohiben clonar embriones humanos. El primero en reaccionar ha sido EE.UU, donde hasta ahora slo se clonaba en unos pocos laboratorios privados, y se autoriz la utilizacin de embriones humanos clonados en centros de investigacin pblicos, la nica condicin por ahora es que los embriones congelados procedan de clnicas de fertilizacin in vitro y vayan a ser desechados. De ellos se obtendrn las deseadas clulas madre, a partir de las cuales se podrn desarrollar muchos tejidos y rganos de nuestro cuerpo en un futuro no muy lejano. En Espaa, la ley de reproduccin asistida, del 88, prohibe estas manipulaciones con multas de hasta 100 millones de pesetas y el Cdigo Penal castiga la creacin de seres humanos idnticos por clonacin, con una pena de hasta seis aos de crcel.

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c) Aplicaciones de la clonacin En seres humanos, parece que todo el mundo coincide que la clonacin reproductiva no tiene mucho sentido. Pero en animales es muy diferente y entre las distintas aplicaciones destacan las siguientes. En primer lugar, los clnicos realizados en animales de laboratorio pueden ser de gran utilidad para experimentacin biolgica, puesto que si tenemos dos individuos genticamente exactos podremos ensayar distintos frmacos con ellos sin que la constitucin gentica influya en los resultados, etc.. Tambin podran ser muy tiles para estudios de embriognesis e inmunolgicos. En segundo lugar, algunos organismos transgnicos pueden presentar una produccin muy difcil, pero si se producen clnicos a partir de clulas de un transgnico se podrn multiplicar el nmero de estos individuos. En tercer lugar, estara la clonacin para producir tejidos u rganos para trasplantes, como se ha explicado anteriormente. 4.1.2.2.- MANIPULACIN DIRECTA DEL ADN La manipulacin del material gentico en animales puede ser de dos tipos:
A.- Clonado de genes en cultivos de clulas de mamfero.

Consiste en la integracin de ADN forneo en el genoma de las clulas de mamfero de forma aleatoria. Este fenmeno de llama transfeccin. La frecuencia de integracin es todava muy baja, resultando ser de slo una clula por cada 10.000 transfectadas. En funcin de cmo se realice la transfeccin, sta puede ser: transitoria y permanente. En la transfeccin transitoria el ADN, una vez introducido, permanece en forma de plsmido en el citoplasma celular expresndose, pero se pierde al cabo de varias generaciones al no permitirse por igual a las clulas hijas. En la transfeccin permanente, la integracin del ADN en el genoma de las clulas receptoras asegura la perpetuidad de las secuencias introducidas. Las tcnicas de transfeccin son muy variadas: 1.- Permeabilizacin qumica de las membranas con fosfato clcico: se cree que el ADN transfectado entra en el citoplasma de la clula por endocitosis y luego penetra en el ncleo. Dependiendo del tipo de clulas, hasta un 20% de las clulas de un cultivo pueden ser transfectadas por este mtodo, por ello es uno de los ms utilizados. 2.- Electroporacin: la aplicacin de impulsos elctricos breves y de alto voltaje a clulas de mamfero produce la apertura de pequeos poros en la membrana plasmtica. El ADN penetra directamente al citoplasma celular. La redistribucin de los componentes de la membrana cierra ms tarde esos poros. 3.- Liposomas: son vesculas de membranas artificiales. El ADN es encapsulado dentro de los lpidos que forman la vescula e introducidos en la clula por fusin con la membrana plasmtica.
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4.- Vectores: existe una gran gama de vrus eucariticos manipulados genticamente (por ejemplo: SV40, retrovirus..) para as obtener una gran cantidad del producto clonado; y vectores mixtos, que son plsmidos diseados por ingeniera gentica. Estas tcnicas de transfeccin son muy tiles para: 1.- Comprender mejor los mecanismos de la expresin gnica 2.- Para estudiar y perfeccionar la introduccin de genes, para terapia gnica 3.- Para obtener lneas celulares alteradas, capaces de producir protenas de inters farmacolgico. Se estan utilizando clulas de mamfero recombinantes para obtener por ejemplo: protenas de la sangre humana, como el activador tisular de plasmingeno y el factor de coagulacin VIII; la pre-proencefalina, un factor de crecimiento nervioso y determinados antgenos para la produccin de vacunas, como la de la hepatitis C. El tipo de clulas ms idneas para la produccin de molculas de inters farmacolgico, las clulas de mieloma, presentan ciertas ventajas porque segregan el producto clonado. Tambin se utilizan bacterias recombinantes para producir protenas de mamfero de gran inters, pero el tamao y complejidad de algunas protenas importantes presentan dificultades insuperables al intentar su produccin en bacterias. Muchas de estas protenas sufren modificaciones postraduccionales in vivo, que incluyen la ruptura proteoltica, la asociacin de subunidades o diversas reacciones de adicin como la glicosilacin, la metilacin, la fosforilacin o la acetilacin; y con frecuencia estos cambios son necesarios para la expresin biolgica de las protenas. Adems el aparato de Golgi en las clulas eucariotas permite la secrecin de las protenas al medio que las rodea y la extraccin del producto puede hacerse directamente del lquido extracelular, lo que es mucho ms sencillo que la extraccin del lisado de clulas bacterianas.

B.- Transgnesis en animales. Fabricacin de animales transgnicos.

La transgnesis se puede definir como la integracin de ADN forneo en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las clulas del organismo. Los organismos que llevan genes ajenos, introducidos y que son capaces de transmitirlos a las generaciones sucesivas reciben el nombre de transgnicos y el gen introducido, se conoce como un transgn. La introduccin de un gen forneo en un organismo puede tener nicamente una finalidad experimental para estudiar este gen: conocer su funcin, cmo est regulado, en qu clulas se expresa y en qu momento del desarrollo etc. Aunque algunas de estas cuestiones se podran analizar en clulas en cultivo, para otras es absolutamente necesario recurrir al organismo completo. Por ejemplo para conocer el papel que juega un determinado gen se puede introducir distintas versiones del gen y analizar el efecto que produce en el organismo. Alternativamente, la modificacin gentica de organismos superiores puede perseguir una mejora del organismo, con el fin de mejorar su productividad o utilizarlos
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como biorreactores para la produccin de protenas con inters farmacolgico, que en este caso iran "empaquetadas" para el consumidor en la leche o en los huevos de estos animales. Los mtodos para la obtencin de animales transgnicos son dos principalmente: 1.- Microinyeccin de ADN en ovocitos: consiste en la introduccin de ADN con el gen o genes que se desean insertar en uno de los dos proncleos del huevo recin fertilizado. Uno de los requisitos para estos experimentos es tener suficiente cantidad de huevos fertilizados, para ello se somete a las hembras a un tratamiento hormonal para provocar una superovulacin. La fertilizacin se puede realizar in vitro o in vivo, en este segundo caso, las hembras recin emparejadas con machos son sacrificadas para recoger los huevos fertilizados. Los zigotos son manipulados uno a uno en el microinyector. El ovocito se sujeta con la punta de una micropipeta que realiza una ligera succin para inmovilizarlo, y se inyecta con una microaguja, que tiene un dimetro aproximado de 1m y que contiene una solucin con el ADN a una concentracin aproximada de 1g/ml. Esta microaguja debe atravesar la zona pelcida y penetrar la membrana nuclear de uno de los proncleos, sin tocar el nucleolo ni daar ninguna estructura. Los ovocitos se dejan en el incubador hasta que alcanzan el estado de dos clulas. Esto permite seleccionar los huevos que no han sido daados y que todava son viables. Posteriormente, estos embriones seleccionados en el estado de dos clulas son reimplantados en el oviducto de hembras pseudopreadas. Estas hembras han sido apareadas previamente con machos infrtiles. Cuando el embarazo llega a su trmino correctamente, la progenie debe ser analizada para comprobar los individuos transgnicos. Esto es muy fcil si el trasgn produce un efecto fenotpico visible (color de la piel, ojos tamao...). En caso contrario, su presencia debe ser verificada a nivel molecular. Se analiza el ADN genmico, aislado de una muestra de sangre, por PCR o con una sonda del gen. Si el trasgn se incorpora al genoma antes de la primera divisin, estar presente en todas las clulas, incluidas las germinales, y tendremos un organismo transgnico. Si embargo, si la integracin del trasgn en los cromosomas se retrasa y ocurre despus de la primera divisin celular, se obtendr una quimera transgnica, es decir, un individuo con lneas celulares con el trasgn y otras que no. La microinyeccin de ovocitos es un mtodo que muy utilizado a nivel experimental pero tiene muchos inconvenientes, sobre todo a la hora de trabajar con animales de inters comercial. El rendimiento de todo el proceso es muy bajo, se necesita tener un nmero demasiado elevado de vulos y es demasiado lento, ya que se inyectan los ovocitos uno a uno.

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Figura 7: Generacin de animales transgnicos mediante microinyeccin de embriones de una sola clula.

2.- Transgnesis por manipulacin de clulas embrionarias: es otro mtodo alternativo y consiste en la introduccin de ADN exgeno en clulas troncales embrionarias mediante la manipulacin del blastocisto. En este mtodo, se aslan unas cuantas clulas de embriones muy jvenes en estado de blastocisto. Son clulas todava totipotentes (no diferenciadas).Estas clulas se cultivan en una placa y se les introduce el ADN exgeno, con diferentes mtodos, microinyeccin, electroporacin o transfeccin con virus.... Estas clulas manipuladas genticamente, se insertan de nuevo en un blastocisto y ste se reimplanta en una hembra pseudopreada. Este mtodo, producir siempre quimeras transgnicas, ya que solamente las clulas derivadas de las clulas manipuladas llevarn el trasgn. Sin embargo, si las clulas de la lnea germinal lo incorporaron se obtendrn transgnicos en la siguiente generacin.
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Figura 8: Generacin de animales transgnicos mediante manipulacin de clulas ES.

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5. MAPA CONCEPTUAL DE LA UNIDAD

Biotecnolog

Biotecnologa en
la Agricultura

Biotecnologa ganaderia

en

la

Tcnicas de manipulac in gentica

Plantas transgnicas :

Riesgos

Manipulac in
Cromosmi

Manipulacin directa del ADN

Aplicaciones de las plantas transgnicas

Poliploid a

Clonacin animal

1.

Mejorar procesos en la planta 2. Fabricacin metabolitos 3. Conservacin de especies 4. Mejora de calidad nutricional 5. Resistencia a plagas 6. Identificacin patgenos 7. Resistencia herbicidas 8. Tolerancia al estrs 9. Modificaciones en el desarrollo de la planta 10. Produccin de plsticos biodegradables 11. Biorremediacin

Clonado de genes en clulas de mamfero

Fabricaci n de animales

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6. PRUEBAS DE EVALUACIN

6.1 ACTIVIDADES DE RECAPITULACIN

1.- En qu consiste la micropropagacin? Qu es un explante y un callo? 2.- Qu inters cientfico tiene el poder utilizar plantas haploides para experimentos? 3.- Explica en qu consiste la tcnica de transferecia de genes en plantas que utiliza una bacteria muy especial, la Agrobacterium tumefaciens. 4.- Comenta brevemente las tcnicas de transferencia directa de genes en plantas. 5.- Qu es un protoplasto? Por qu la fusin de protoplastos de vegetales de diferente especie puede ser una tcnica muy importante en la biotecnologa? 6.- Explica en qu consisten las diferentes aplicaciones de las plantas transgnicas 7.- Cmo sera posible crear una planta que fuera resistente a un determinado herbicida? 8.- Imagina que eres un cientfico al que se le encarga que procure que no desaparezca un especie de planta en peligro de extincin. Qu estrategias utilizaras? 9.- Cmo se obtienen animales clnicos por transferencia nuclear? 10.- Cules son las principales aplicaciones de la clonacin? 11.- Qu diferencia hay entre clonacin reproductiva y clonacin teraputica? 12.- Qu es un animal transgnico? 13.- Qu etapas se deben seguir para obtener un animal transgnico por microinyeccin de ovocitos? 14.- Qu diferencia existe entre un animal transgnico y un quimrico? 15.- Explica en qu consisten las diferentes aplicaciones de los animales transgnicos.

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6.2 TEXTOS RELACIONADOS CON LA UNIDAD

Agricultura, Biotecnologa y futuro Nuevos alimentos transgnicos

La biotecnologa ofrece un enorme abanico de posibilidades; algunas, como la obtencin de nuevos frmacos o productos agrcolas, ya son una realidad; otras lo sern en muy poco tiempo. Los cientficos tienen en sus manos una herramienta extraordinaria para mejorar la calidad de vida de todos los seres humanos. Los numerosos interrogantes de carcter tico que se plantean entorno al futuro de esta nueva ciencia y, en concreto, dnde deben situarse los lmites de la experimentacin biotecnolcica constituyen, sin embargo, el reverso de la moneda. Uno de los debates ms apasionantes que se han suscitado en relacin con este tema se refiere al consumo humano de seres vivos transgnicos o de productos derivados de ellos. La biotecnologa aplicada a los vegetales se asienta en dos tecnologas esenciales: el cultivo de tejidos y la manipulacin gentica. El cultivo de tejidos, o cultivo in vitro, permite aislar tejidos o clulas individuales para que crezcan fuera de las plantas de las que proceden. Cada una de las clulas del cultivo puede originar una planta completa. Se considera, adems, que un cultivo de tejido puede contener varios millones de clulas, por lo que el nmero de plantones nuevos que se pueden obtener es muy elevado. Por otra parte la utilizacin de esta tcnica reduce considerablemente el tiempo necesario para desarrollar nuevas variedades de plantas en comparacin con las tcnicas tradicionales de cruzamiento. El xito de la tcnica se debe fundamentalmente a que mediante el cultivo de tejidos en periodos concretos del ciclo celular resulta ms fcil la manipulacin gentica de estas clulas, de modo que las plantas que se obtienen a partir de ellas ya son variedades nuevas. La introduccin de genes deseables en las plantas sigue dos estrategias bsicas: - Introduccin de las caractersticas deseadas a travs de la bacteria Agrobacterium - Introduccin directa del ADN en el ncleo de la clula vegetal por microinyeccin o microbombardeo con micropartculas de oro o tungsteno. En los prximos aos ser relativamente frecuente encontrar en los supermercados uvas con bajo contenido en azcar, frutas ricas en vitaminas o tomates u hortalizas con un aspecto extraordinariamente fresco, aunque lleven tiempo separados de sus rboles o matas. Tambin se podr lograr que las plantas fabriquen cualquier sustancia producida por cualquier organismo. Ya se dispone de neurotransmisores producidos en plantas de soja y se est en vas de conseguir que produzcan vacunas. Actualmente se comercializan varios tipos de vegetales transgnicos para el consumo humano. Un estudio reciente llevado a cabo en el Instituto Rowett de Aberdeen ha puesto de manifiesto que el consumo de una variedad de patata transgnica por animales 128

de experimentacin ha provocado en stos un retraso en el crecimiento y un descenso en la eficacia de su sistema inmunolgico. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por otro equipo alemn, del Instituto de Gentica de Colonia. Estos investigadores han comprobado en ratas que el ADN utilizado para modificar genticamente un alimento no se digiere por completo en el intestino, tal como se crea, sino que parte puede ser transmitido por las ratas gestantes a sus descendientes. El profesor Walter Doefler, miembro del equipo, ha comentado lo siguiente: no sabemos las consecuencias de esta trnasferencia gentica de ADN a las clulas de animales, pero no cuesta mucho imaginar que pueda tener efectos nocivos. La polmica respecto al consumo de alimentos transgnicao es fruto, en gran medida, de los intereses comerciales que giran en torno a las industria biotecnolgicas, lo que ha llevado a permitir, en muchos casos, el consumo humano de estos productos antes de verificar y garantizar su inocuidad. El profesor Puztai, del equipo de Adberdeen, Ha comentado: no estoy en contra de la biotecnologa, pero s de la prisa. No debemos olvidar la importancia econmica de la biotecnologa aplicada a la agricultura. Por citar un ejemplo, en 1991 el mercado de los productos obtenidos mediante biorecnologa ascenda a 5 billones de pesetas, de los cuales 3 billones correspondan a productos agrcolas. En Espaa ya se comercializa soja transgnica, a pesar de que se ha comprobado que origina alteraciones en los animales alimentados con ella, como el incremento de grasa en la leche. Tambin se est cultivando un maz transgnico que contiene unos genes de resistencia a antibiticos. Los investigadores del instituto Pasteur han alertado sobre las consecuencias que pueden derivarse de la introduccin en la poblacin humana de este tipo de resistencia a los antibiticos, ya que podra provocar un dficit de recursos a la hora de combatir bacterias patgenas. Cada vez son ms numerosas las empresas biotecnolgicas dedicadas a la produccin de semillas manipuladas genticamente o a otros aspectos relacionados con la mejora de cultivos por medios biotecnolgicos. Se trata, en resumen, de optimizar de forma controlada los recursos alimentarios del planeta. Ahora bien, dicho control debe incluir unas garantas mnimas para el consumidor, avaladas por estudios rigurosos y detallados sobre las posibles consecuencias que pueden tener para las personas y para la propia vida en el planeta. Los intereses comerciales de las grandes multinacionales de la biotecnologa no deben prevalecer, en ningn caso, sobre la seguridad y el sentido comn.

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Transgnicos Mejores productos?

Fuente: M. Ruiz de Elvira. El Pais, 19 de febrero de 1999, p 29 La informacin a los ciudadanos es la gran olvidada de un sector de extraordinaria pujanza. Qu dara la industria agroalimentaria por poder servir melones en su punto justo de maduracin y sabor en cualquier da del ao y en cualquier lugar? Y por disponer de tomates con textura interior de Ketchup? El inters de las grandes empresas agroalimentarias por los cultivos transgnicos, que consideran decisivos para el futuro del sector, es extraordinario. Y, en consecuencia, los intereses comerciales han jugado tan fuertemente en la llegada al mercado de los primeros productos transgnicos que el consumidor se siente desorientado, olvidado e incluso engaado. El tomate al que se inactiva un gen para retrasar su maduracin fue uno de los primeros productos con futuro comercial fruto del boom de la biotecnologa, aquel fenmeno estadounidense de los aos ochenta basado en las nuevas posibilidades de manipulacin gentica. Entonces surgieron como setas las pequeas empresas que vendian sobre todo deas. Menos de quince aos despus, el tomate se comercializa en el Reino Unido, aunque slo como pasta o pur, y es un buen ejemplo de cmo madura y se estructura la biotecnologa al apostar por ella las grandes multinacionales estadounidenses y cmo estas empresas deciden el desarrollo del sector al buscar la rentabilidad, dentro y fuera de sus fronteras, de sus aos fuertes inversiones. Al tomate le siguieron en aquellos aos productos que parecian elegidos ms por los intereses de la empresa que los del consumidor y que todava hoy son discutidos, como los cereales modificados para hacerlos resistentes a herbicidas que fabrica la misma empresa. Se trata de una combinacin de intereses y conocimiento, matiza a este respecto Emilio Muoz, experto en biotecnologa. Igual que se conoca la enzima de la maduracin del tomate y fue relativamente fcil inactivar el gen correspondiente, los genes de la resistencia son los que mejor se conocen. Con estos cereales se utiliza menos herbicida, alega la empresa fabricante, pero tambin sta gana mercado, ya que slo se utiliza su herbicida. Estos cultivos han sido bien recibidos en los pases donde se han establecido, como EE.UU y Argentina, dicen las empresas, lo que prueba su potencial. Luego lleg una vuelta de tuerca que quiz sea un grave error tctico. Dado que los hbridos de cereales que se cultivan normalmente son estriles y los transgnicos no, por qu no introducir un gen que los haga estriles, lo que obliga a los agricultores a comprar semillas todos los aos? Este gen es llamado terminator. Cuando las investigaciones estuvieron maduras, Estados Unidos tomo una decisin fundamental; los productos transgnicos son iguales a los dems y, por tanto, deben regularse por las normas aplicables a cada sector, sean de salud, cosmtica o agralimentacin. Y como son iguales no tienen por qu etiquetarse Recientemente han surgido dudas sobre el posible salto de genes hacia otras especies. Creo que la biotecnologa debe ser considerada caso por caso opina

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Muoz analizando los riesgos y ventajas de cada producto. En Europa, donde el desarrollo ha sido mucho menor la falta de regulacin Esta regulacin bast para abrir el mercado comunitario, y por la va rpida, de la soja y el maz transgnicos de EE.UU. en 1996, mezclados con lo normales y, por tanto, indetectables. La

empez a hacerse insostenible, y la Comisin Europea aprob en 1990 dos directivas para estimular el desarrollo de la industria biotecnolgica. Partir de ese momento, y mientras van llegando nuevos productos y cultivos, ha empezado un debate que va en aumento, aunque en Espaa apenas ha prendido.

Los gobiernos tienen que encargar estudios independientes sobre los transgnicos
ENRIC BANDA: SECRETARIO GENERAL DE LA FUNDACIN EUROPEA DE LA CIENCIA

Fuente: El Pas, 5 de Junio de 2000, p 38.

Javier Sampedro, Madrid. La Fundacin Europea de la Ciencia, con sede en Estrasburgo, es el ms influyente organismo consultivo cientfico europeo independiente de las instituciones comunitarias. Agrupa a 67 entidades cientficas, incluyendo a todas las grandes instituciones estatales de los pases de la UE (el Max Planck, el Medical Research Council britnico, el Consejo Superior de Investigaciones Cientficas espaol etc). Su secretario general, el fsico Enric Banda, est decidido a promover una poltica europea sobre los alimentos transgnicos basada en la racionalidad cientfica, y no en las consignas radicales de los grupos ecologistas ni en los intereses econmicos de la industria, que han esterilizado el debate en dos postura irreconciliables. Banda (Girona, 1948), que fue secretario de Estado de Universidades e Investigacin en la ltima etapa socialista, charlo ayer en madrid sobre el Impacto sanitario y medioambiental de los productos transgnicos, invitado por la Fundacin de Ciencias de la Salud. Pregunta. La gran controversia social sobre los transgnicos refleja un debate cientfico de fondo? Respuesta. No. El debate no es cientfico. En parte es tico, porque con esta tecnologa se producen unas combinaciones genticas que no se daran en la naturaleza, y hay quien opina que esto es un transgresin de las leyes naturales, una forma de jugar a ser Dios. Y tambin hay un debate sobre las consecuencias de esta tecnologa, sean para la salud humana o para el medio ambiente. P. En este asunto, la sociedad parece ms preocupada por el medio ambiente que por la salud humana, no?.

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R. La razn de esa paradoja es que los grupos que ms se han interesado por los transgnicos son asociaciones ecologistas. Hay que tener en cuenta que los transgnicos se han venido consumiendo durante los ltimos 10 o 15 aos, sobre todo en Estados Unidos, y no hay la menor evidencia de sus perjuicios para la salud. Sobre el medio ambiente, en cambio, existe la duda que los transgnicos puedan reducir la biodiversidad. No. Por la tecnologa de modificacin gentica en s misma, sino por la intensificacin de los cultivos. P. El pilar de la poltica europea sobre transgnicos es el principio de precaucin: prohibir en caso de duda, aunque no haya evidencias slidas de los riesgos. Sera este principio admisible, por ejemplo, con los telfonos mviles? R. En cualquier tecnologa el ciudadano evala la relacin entre el riesgo y el beneficio. Todo el mundo es consciente de los reportan los telfonos mviles, y por tanto los ciudadanos no se preocupan por el supuesto riesgo que les puede suponer meterse ondas electromagnticas por las orejas. En el caso de los transgnicos, en el que los riesgos tampoco estn demostrado, el problema es que los beneficios no se perciben por el ciudadano. ste es el debate que hay que racionalizar: no hay nada blanco o negro, sino toda una gama de grises que hay que evaluar caso por caso. Lo que no puede ser es que Europa no tenga una postura sobre los transgnicos. Hay que informar al ciudadano, involucrarle en el debate y luego adoptar una postura racional. P. Una crtica comn es que las investigaciones sobre los riesgos las hacen las propias empresas que los venden. R. No es siempre exacto, pero es cierto que las empresas han encargado estudios, Los grupos ecologistas tienen razn en que las decisiones polticas no se pueden basar en los estudios de una multinacional que tiene enormes intereses econmicos sobre sus resultados. Los gobiernos tienen que encargar al sector pblico que haga esos estudios independientes, no ligados a los intereses econmicos de las empresas, sobre los transgnicos. Todos los polticos europeos se llenan la boca con que la ciencia pblica tiene que ser til para la sociedad. Pues ah tienen un ejemplo perfecto. P. Una crtica comn es que casi todas las semillas transgnicas estn en manos de unas pocas multinacionales. R. Hay que dejar esa cuestin al mercado. Si llega a darse una situacin de monopolio, como ha ocurrido con Microsoft en otro sector, los propios competidores pondrn buen cuidado en detenerlo, si es preciso recurriendo a los tribunales. P. Es necesaria la tecnologa de los transgnicos para alimentar al Tercer Mundo? R. Actualmente, el hambre no es un problema tecnolgico, sino poltico: se podra paliar con las semillas tradicionales si existiera la voluntad poltica de hacerlo. El argumento de las multinacionales es un poco cnico en ese punto. Pero dentro de unos aos, con una poblacin mundial que sigue creciendo, y sin disponer de ms tierras cultivables ni de ms agua, llegar un momento en que estas tecnologas sern necesarias.

A partir de los conocimientos desarrollados en esta Unidad y, tras la lectura crtica de estos artculos, reflexiona sobre las siguientes cuestiones: 1.- Explica los efectos nocivos que pueden tener los alimentos transgnicos 2.- Se han evaluado las posibles repercusiones de la liberacin de las plantas transgnicas en la naturaleza? Y en la salud humana?

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3.- Puede ocurrir que el dominio de esta tecnologa en ciertos pases suponga la dependencia econmica para el resto? 4.- Resulta coherente el argumento de que las plantas transgnicas podrn paliar el hambre en el Tercer Mundo?

CLONACIN GENTICA Y BIOTECNOLOGA

Fuente: Ian Wilmut. Clonacin. Investigacin y Ciencia, Febrero 1999, p 25-29.

El nacimiento en el verano de 1995 de dos corderos en el Instituto Roslin, cerca de Edimburgo, anunciaba lo que en opinin de muchos habra de ser un perodo de oportunidades revolucionarias en biologa y medicina. Megan y Morag, gestados los dos por una madre subrogada (de alquiler), no resultaron de la unin de un espermatozoide y un vulo. Su material gentico proceda de cultivos de clulas extradas de un embrin de nueve das, lo que convirti a Megan y a Morag en copias genticas, en clnicos del embrin. Antes del caso de los corderos, los expertos saban ya cmo obtener ovejas, vacas y otros animales mediante la copia gentica de clulas extradas de embriones precoces. Constitua, sin embargo, una tarea laboriosa. Nuestro trabajo auguraba una clonacin ms cmoda, gracias a las propias condiciones de la manipulacin de las clulas en cultivo. Adems, segn quedaba evidenciado con Megan y Morag, no importa que las clulas se hallen parcialmente especializadas o diferenciadas, para que pueda reprogramarse su gentica y entonces funcionar como si se tratara de clulas de un embrin precoz. Una posibilidad en la que pocos bilogos hubieran credo. Dimos un paso ms y nos prestamos a clonar animales a partir de cultivos de clulas extradas de fetos de 26 das y de un oveja madura. De las clulas de la oveja surgi Dolly, el primer mamfero clonado a partir de un adulto. El anuncio del nacimiento de Dolly en febrero de 1997 despert el inters de todos los medios de comunicacin. Sobre todo porque sugera la posibilidad terica de clonacin de humanos, da que no me gustara ver nacer. Eso aparte, la consecucin de clnicos a partir de clulas en cultivo procedentes de tejido fcilmente obtenido habra de traer numerosos beneficios prcticos para la mejora animal y medicina, adems de resolver problemas biolgicos fundamentales. La clonacin se basa en la transferencia nuclear, la misma tcnica empleada desde hace varios aos para obtener animales idnticos a partir de clulas embrionarias. La transferencia nuclear requiere el concurso de dos clulas. La clula receptora suele ser un vulo sin fecundar y reciente. Esos vulos estn listos para empezar a desarrollarse en cuanto reciben el estmulo apropiado. La clula donante es la clula a copiar. Bajo un microscopio potente. El experto sostiene, mediante succin, el vulo receptor en el extremo de una pipeta fina; con una micropipeta sutilsima absorbe los cromosomas, esos corpsculos rechonchos que aportan el ADN de la clula. En esa etapa, los cromosomas no estn encerrados en un ncleo definido. Luego, lo normal es que la clula donante, con su ncleo desarrollado, se fusione con el vulo receptor. Algunas clulas fusionadas empiezan a desarrollarse como un embrin normal y producen descendencia si se implantan en el tero de una madre de alquiler. En los experimentos que realizamos con cultivos adoptamos medidas especiales, para hacer compatibles las clulas donante y receptora. De forma especial nos esforzamos por coordinar los ciclos de replicacin del ADN y los de produccin del ARN mensajero, molcula que se transcribe del ADN y que dirige la sntesis de protenas. Optamos por utilizar clulas donantes cuyo ADN no

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se estaba replicando en el momento de la transferencia. Para ello, trabajamos con clulas que obligamos a permanecer inactivas mediante la concentracin de nutrientes en cultivo. Despus de la transferencia nuclear, aplicamos al vulo pulsos de corriente elctrica para inducir la fusin de las clulas e imitar la estimulacin que, en condiciones normales, proporciona el espermatozoide. Una vez demostrado con el nacimiento de Megan y Morag, que podamos producir una descendencia viable a partir de cultivos procedentes de embriones, registramos la patente. Avanzamos un poco ms y abordamos experimentos para comprobar si poda lograse descendencia a partir de cultivos cuyas clulas se hallaran en un nivel de diferenciacin ms acabado. En colaboracin con PPL Therapeutics, ensayamos con fibroblastos (clulas comunes del tejido conjuntivo) procedentes de fetos y clulas extradas de la ubre de una oveja en su tercer mes y medio de gestacin. Seleccionamos una adulta preada porque las clulas mamarias crecen con mucho vigor en esa fase de gestacin, indicio de que pueden prosperar en cultivo. Presentan, adems, cromosomas estables, lo que sugiere que conservan toda su informacin gentica. La clonacin satisfactoria de Dolly a partir de un cultivo de clulas mamarias y la clonacin de otros corderos a partir de fibroblastos cultivados revelaba que el protocolo de Roslin era slido y repetible. Segn caba esperar, toda la descendencia clnica de nuestros experimentos se pareca a la progenie de la oveja que aport el ncleo original, no a las madres subrogadas ni a las donantes del vulo. Las pruebas genticas demuestran ms all de toda duda que Dolly es clnica de un adulto. Lo ms probable es que procediera de una clula mamaria plenamente diferenciada, aunque es imposible afirmarlo con absoluta certeza, pues el cultivo contena tambin clulas no tan diferenciadas que hay en la glndula mamaria, aunque su nmero es escaso. De entonces ac otros laboratorios han empleado una tcnica similar para crear clnicos sanos de ganado y de ratn a partir de clulas de cultivo, entre ellas clulas procedentes de hembras sin prear. Que la clonacin mediante transferencia nuclear sea repetible no significa que carezca de contratiempos. Algunas vacas y ovejas clnicas son desmesuradamente grandes, efecto observado tambin cuando se cultivan embriones antes de avanzar la gestacin. Y lo que importa ms, la transferencia nuclear no alcanza todava un nivel satisfactorio de eficacia. Hace unos treinta aos, John B. Gurdon observ, cuando realizaba experimentos de transferencia nuclear con ranas, que el nmero de embriones que llegaban al estadio de renacuajo era menor si las clulas donantes procedan de animales en un estadio de desarrollo avanzado. Nuestros primeros resultados con mamferos reflejaron una pauta similar. Todos los estudios de clonacin descritos hasta ahora muestran un patrn continuo de muertes durante el desarrollo embrionario y fetal. Slo llegan a trmino entre el 1 y el 2 por ciento de los embriones. Por si fuera poco, algunos de los clones que sobreviven al parto mueren en breve plazo. Sigue sin conocerse la causa de esos fracasos, signo posible de la complejidad que rodea a la reprogramacin gentica necesaria para que nazca una descendencia sana. Basta con que un gen no se exprese bien o no consiga cifrar una protena decisiva en un punto decisivo para provocar un desastre. En la reprogramacin podra exigirse la regulacin de millares de genes, en un proceso con cierto margen de aleatoriedad. Las mejoras tcnicas, una de ellas el recurso a otras clulas donantes, podran traer un recorte de la mortalidad. La capacidad alcanzada de obtener descendencia a partir de clulas de cultivo facilita el camino que conduce a la modificacin gentica de los organismos, a los animales transgnicos. Adems de su inters objetivo en investigacin, esos individuos manipulados pueden fabricar protenas humanas de importancia clnica. La tcnica habitual para obtener animales transgnicos peca de una lentitud exasperante. Requiere la microinyeccin de un constructo gentico (una secuencia de ADN que incorpora el gen deseado) en un buen nmero de huevos fecundados. Algunos incorporan el ADN introducido y la descendencia resultante lo expresa. A continuacin, estos animales se cran para que transmitan el ADN del constructo.

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Frente a ello, basta un simple tratamiento qumico para convencer a las clulas en cultivo de que incorporen un constructo de ADN. Si estas clulas sirven luego de donantes en un transferencia nuclear, toda la decendencia clnica resultante portar dicho ADN. En el instituto Roslin y en PPL Therapeutic se ha aplicado la tcnica para obtener animales transgnicos con una eficacia mayor que la lograda a travs de microinyeccin. Hemos incorporado en ovejas el gen del factor IX humano, protena de la coagulacin sangunea utilizada para el tratamiento de la hemofilia B. En nuestro experimento junto con el gen del factor IX, transferimos a las clulas donantes un gen de resistencia contra antibiticos; al aadir al cultivo una dosis txica del antibitico neomicina, murieron todas las clulas que no haban incorporado el ADN aadido. Pese a esta alteracin gentica, la proporcin de embriones que se desarrollaron a trmino despus de la transferencia nuclear se mantena acorde con nuestros resultados anteriores. La primera oveja transgnica as obtenida, Polly, naci en el verano de 1997. Polly y otros clnicos transgnicos segregan la protena humana en su leche. De ello se desprende que una vez perfeccionadas las tcnicas de recuperacin de vulos de especies dispares, la clonacin permitir la introduccin de cambios genticos precisos en cualquier mamfero y la creacin de mltiples individuos portadores de la alteracin. Los cultivos de clulas de glndula mamaria podran ofrecer una ventaja aadida. Hasta hace poco, la nica forma prctica de evaluar si un contructo de ADN producira la secrecin de una protena en la leche consista en transferirlo a ratones hembra; luego, analizar la leche. Pero se ha de poder realizar la comprobacin directa en cultivos de clulas mamarias. Ser cuando podamos acelerar el proceso de localizacin de buenos constructos de ADN y de las clulas que los hayan incorporado, rindiendo una secrecin eficiente de la protena. La clonacin ofrece muchas ms posibilidades. As, la generacin de rganos animales sometidos a manipulacin gentica para acomodarlos a su transplante en humanos. Cada ao mueren por millares los pacientes que necesitan un nuevo corazn, un hgado o un rin de sustitucin. Un rgano de un cerdo normal trasplantado quedara de inmediato fuera de servicio por una reaccin inmunitaria hiperaguda. Esta reaccin viene desencadenada por protenas de las clulas del cerdo que han sido modificadas por la atfagalactosil transferasa, una enzima. Parece lgico, pues, que un rgano procedente de un cerdo al que se le ha sometido a manipulacin gentica para privarle de dicha enzima, podra ser bien tolerado, siempre que los mdicos dieran al receptor frmacos supresores de otras reacciones inmunitarias menos extremas. Prometedora resulta tambin la produccin rpida de animales portadores de defectos genticos que imiten la fibrosis qustica y otras enfermedades humanas. Cierta informacin se ha recabado de los ratones, pero stos y los humanos discrepan en la constitucin de los genes de la fibrosis qustica. Se espera que la ovejas aporten mayor provecho, habida cuente de que sus pulmones se parecen a los de los humanos. Adems, la esperanza de vida de la oveja es de aos, lo que posibilita una evaluacin a largo plazo de su respuesta ante el tratamiento. La creacin de animales con defectos genticos plantea cuestiones ticas espinosas. Existe una aceptacin social mayoritaria de la investigacin en animales, siempre que las enfermedades que se vayan a estudiar sean graves y se evite el ensaamiento o sufrimiento innecesario. La capacidad de la bioingeniera para producir animales con una constitucin gentica determinada podra aplicarse a terapias celulares de patologas hoy incurables. Pienso en la enfermedad de Parkinson, en la diabetes y la distrofia muscular, en que aparecen lesionadas poblaciones celulares especficas, incapaces de repararse o sustituirse a s mismas. Se estn explorando varios enfoque originales que proporcionaran clulas nuevas (procedentes del propio paciente y cultivadas, donadas por otros humanos o extradas de animales). Las clulas transferidas no debern transmitir enfermedades nuevas y habrn de adaptarse a las necesidades fisiolgicas del paciente. Cualquier respuesta inmunitaria que desencadenen deber ser conjurable. Los animales clnicos, con las modificaciones genticas precisas que reduzcan al

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mnimo la respuesta inmunitaria podra constituir un reservorio de las clulas a suplir y producir incluso clulas con propiedades especiales. Pero no olvidemos que cualquier modificacin expondra al riesgo de aparicin de una reaccin inmunitaria ms vigorosa. A travs de la clonacin podran formarse rebaos de reses exentos del gen responsable de la sntesis de la protena del prin. Por culpa de dicho gen el ganado vacuno queda expuesto a la infeccin por priones, agentes de la encefalitis espongiforme bovina (EEB), o enfermedad de la vacas locas. Puesto que muchos medicamentos contienen gelatina u otros productos procedentes del ganado, existe el lgico temor de que los priones pasen a los humanos. La clonacin podra formar rebaos que, al carecer del gen de la protena prinica, seran una fuente de componentes medicamentosos sin contaminar. Adems, la tcnica podra cortar la transmisin de enfermedades genticas. Se investigan vas para complementar o sustituir genes defectuosos. Ello no impedir que los pacientes, incluido los beneficiados con el tratamiento, sigan transmitiendo los genes defectuosos a su descendencia. Pero si se pudiera tratar el embrin precoz, los ncleos de las clulas embrionarias modificadas podran transferirse a vulos de los que se desarrollaran nios exentos de una enfermedad determinada. Algunos de los proyectos ms ambiciosos prevn la produccin de clulas donantes humanas universales. A partir de embriones de ratn en estados muy precoces, podemos aislar clulas madre pluripotenciales indiferenciadas, capacitadas para intervenir en todos los tejidos de un adulto. Pueden obtenerse clulas equivalentes en otras especies, sin que los humanos tengan que ser una excepcin. Se empieza a dominar la diferenciacin in vitro de clulas madre pluripotenciales, para su plausible aplicacin en funciones reparadoras o reemplazadoras de un tejido deteriorado. En principio, podran fabricarse clulas pluripotenciales adaptadas a tal o cual paciente, creando un embrin por transferencia nuclear para ese propsito, mediante el empleo de una de las clulas del paciente como donante y un vulo humano como receptor. Se permitira que el embrin se desarrollara slo hasta la etapa necesaria para separar y cultivar las clulas pluripotenciales; en ese momento el embrin tiene unos pocos, centenares de clulas, que no han empezado a diferenciarse. En particular, el sistema nervioso no ha empezado a desarrollarse, por lo que el embrin no sufre dolor ni es sensible a los estmulos del medio. Las clulas extradas del mismo podran utilizarse para tratar diversas enfermedades graves causadas por lesin celular, quizs el sida, la enfermedad de Parkinson, la distrofia muscular y la diabetes. Estos marcos hipotticos en los que se precisa crecimiento de embriones humanos para conseguir las clulas resultan hondamente preocupantes para unos, pues los embriones poseen capacidad para devenir personas humanas. Deben respetarse los puntos de vista de quienes consideran inviolable la vida a partir de la concepcin. Un punto de vista que no comparto. Para mi, el embrin es un grupo de clulas que no adquiere sensibilidad hasta una etapa ulterior del desarrollo; en mi opinin, no es todava una persona. Crear un embrin para crear un paciente puede resultar caro. Ms prctico sera establecer lneas celulares pluripotenciales, estables y permanentes, a partir de embriones humanos clnicos. Luego, las clulas podran diferenciarse conforme fueran requeridas. Las clulas implantadas as obtenidas no seran idnticas desde el punto de vista gentico, si bien podra controlarse la reaccin inmunitaria. Quiz se logre algn da obtener, mediante desdiferenciacin directa, clulas madre pluripotenciales genticamente idnticas a las del paciente; es decir, que no deba mediar un embrin. Hay quien defiende, para algunos casos, la clonacin de personas completas. Se habla de un sustituto de un pariente moribundo. Pero, se objeta, el clnico nunca sera recibido como un individuo completo, sujeto siempre a lo que la familia esperara de l en funcin del conocimiento del gemelo gentico. Una postura familiar errnea, porque la personalidad humana est determinada slo en parte por los genes. El clnico de una persona extrovertida podra tener una conducta retrada. Los clnicos de deportistas, estrellas de cine, empresarios o cientficos podran elegir carreras diferentes.

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Hay quien aboga por la clonacin en parejas estriles. No parece una buena solucin, por las consecuencias que acarreara en el nio copia de uno pero no del otro componente de la pareja. Puesto que disponemos de otros mtodos para el tratamiento de todo los tipos conocidos de esterilidad, las vas teraputicas al uso parecen ms apropiadas. En mi opinin, ninguno de los usos sugeridos de la clonacin para la fabricacin de copias de personas es ticamente aceptable. Ni que decir tiene que me opongo energticamente a que se permita el desarrollo de embriones humanos clnicos para que puedan convertirse en donantes de tejidos. No obstante, la clonacin a partir de clulas cultivadas ofrecer importantes oportunidades mdicas. Las predicciones sobre nuevas tcnicas suelen equivocarse. Las actitudes sociales cambian y se producen avances inesperados. El tiempo lo dir.

Despus de leer detenidamente este texto contesta a las siguientes preguntas: 1.- Qu contratiempos tiene la clonacin? 2.- Qu tiene de especial la oveja Dolly? y la oveja Polly? 3.- Qu posibilidades ofrece la clonacin segn Ian Wilmut? Son todas ticamente aceptables?

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6.3 MODELOS DE PRUEBA DE EVALUACIN

Prueba N 1

1.- Qu es una planta transgnica ?Cules son las tcnicas utilizadas actualmente, para conseguir plantas transgnicas? 2.- Comenta brevemente los posibles riesgos y beneficios que se derivan de la fabricacin de plantas transgnicas. 3.- Qu es la clonacin y cules son sus principales aplicaciones? 4.- Qu es un animal transgnico y cules son sus principales aplicaciones? 5.- Cmo se obtiene un animal transgnico por manipulacin de clulas embrionarias?

Prueba N 2

1.- Explica, cmo se podra obtener una planta resistente a un determinado herbicida. 2.- El cultivo de este tipo de organismos genticamente modificados, puede representar un peligro para el media ambiente? Razona la respuesta. 3.- Cmo se obtienen animales clnicos por transferencia nuclear? 4.- Antes de la creacin de Dolly, ya se haban obtenido muchos animales clnicos, Cul fue la principal novedad de ese descubrimiento? 5.- Qu son las clulas madres? Cul sera su principal aplicacin? Qu problemas ticos plantea su utilizacin?

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7. BIBLIOGRAFA PARA EL PROFESOR Y PARA EL AULA

Para el profesor:
*Biologa Molecular y Biotecnologa. J.M. Walker y E.B. Gingold.

Ed.Acribia S.A. 1997 *Perspectivas en Gentica. Jos Oliver y Manuel Ruiz Rejn. Ed. Rueda, S.L. 1989 Para el aula:
*La Biotecnologa al desnudo: promesas y realidades. Eric. S. Grace. Ed.Anagrama. 1998. *"Los alimentos con OGM. estn exentos de peligro?". A. Chesson y P.

James. Mundo Cientfico, Marzo 2000. *"Fue la naturaleza la que empez!" . Conrad. P. Lichtenstein. Mundo Cientfico, Marzo 2000. *"Los genes que comemos". Daniel ramn. Algar editorial, Valencia 1999 *" La tercera revolucin verde". Francisco Garcia Olmedo. Temas de debate, Madrid 1998 *"Introduccin a la mejora vegetal". Jos Ignaci Cubero. Ediciones Mundi-prensa, Madrid 1999. *"Argumentos recombinantes sobre cultivos y alimentos transgnicos". Jorge Riechmann. Los libros de la Catarata, Madrid 1999. *"Cultivos y alimentos transgnicos. Guia crtica". Jorge Riechmann. Los libros de la Catarata, Madrid 2000.

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