Fermentacin Alcohlica

Introduccin:
Los organismos han desarrollado otro proceso que le sigue a la gliclisis, el cul es ms eficiente, no produce sustancias finales txicas y produce CO2 como producto final. Este proceso es la respiracin celular aerbica. La respiracin celular tiene en adicin, la ventaja de aprovechar el oxgeno producido en la fotosntesis, con lo cual fotosntesis, gliclisis y respiracin celular forman un ciclo, en el cual los tomos de carbono circulan por los seres vivos y atmsfera. Cuando el aceptor final de electrones es el oxgeno molecular el proceso se denomina respiracin aerbica. Sin embargo en la respiracin anaerbica la energa se obtiene de las molculas orgnicas sin utilizar oxgeno. En este proceso la degradacin de la glucosa es incompleta y se producen compuestos intermedios, algunos fragmentos de molculas quedan oxidados o reducidos. La fermentacin es una forma de respiracin anaerbica, llamada tambin respiracin intramolecular. Es un proceso que genera ATP, en el cual las sustancias orgnicas actan como dadores y aceptores de electrones. La fermentacin tambin puede darse en ausencia de CO2. El trmino fermentacin generalmente se reserva para la actividad de algunos microorganismos, como ciertos hongos y bacterias. Los productos de fermentacin son muy variados, segn el sustrato, el microorganismo y los factores que gobiernan el proceso. La fermentacin alcohlica se efecta en ausencia de oxgeno molecular; es un proceso muy conocido. El primer paso en el proceso de fermentacin, la gluclisis, tiene lugar en igual forma que en la respiracin aerbica. En vez de que el cido pirvico formado entre en el ciclo de Krebs y sea oxidado completamente, en la fermentacin alcohlica ocurre una descarboxilacin de ese cido, formndose acetaldehdo; esta sustancia sirve luego, el lugar del oxgeno gaseoso del aire como aceptor del hidrgeno y se forma alcohol etlico, como ejemplo la levadura Saccharomyces Cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado dado su importancia en la industria panadera y vitivincola, as como por su amplia capacidad de producir alcohol. Este Microorganismo muestra cinco fases de crecimiento bien definidos cuando es cultivado en medios lquidos con glucosa. Utiliza monosacridos, como la glucosa, fructosa y manosa, disacridos como la maltosa y sacarosa, y trisacridos como la rafinosa. Adems de la fermentacin alcohlica, existe la fermentacin lctica la cual consiste en la formacin de lactato a partir de glucosa. En primer lugar la lactosa se hidroliza en glucosa y galactosa y sta ltima se isomeriza a glucosa; se produce la gluclisis y se forman dos piruvatos por cada glucosa, finalmente el piruvato se reduce a lactato, un ejemplo de esta fermentacin son las bacterias Streptococcus y Lactobacillus .Tambin existe la fermentacin butrica.

Objetivos
Llevar a cabo la fermentacin alcohlica de diferentes carbohidratos por medio de la levadura Saccharomyces cerevisiae para analizar el efecto que tiene la misma a diferentes condiciones experimentales.

Metodologa
"La indicada en el manual de Bioqumica Metablica, correspondiente a la prctica 3, pgina 39".

Resultados
TABLA 1.0 Fermentacin de glucosa y demostracin con la prueba de Benedict MUESTRA Glucosa Levadura 30 min 60 min 90 min 120 min PRUEBA DE BENEDICT Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva Negativa

Imagen 1.0 fermentacin de glucosa con prueba de Benedict a diferentes tiempos

TABLA 2.0 Fermentacin con diferentes carbohidratos Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30 Agua 0.3 cm X X X X X Glucosa x x x x x x Fructuosa 0.1 cm x x x x x Sacarosa x x x x x x Galactosa 0.5 cm x x x x 0.3 cm

Imagen 2.0 fermentacin de la Saccharomyces cerevisiae con agua, glucosa, sacarosa, fructosa y galactosa.

TABLA 3.0 Fermentacin a diferentes temperaturas Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30 A (0C) Volumen desplazado x x x x x x B (37C) Volumen desplazado 0.2 cm 0.5 cm 0.5 cm 0.7 cm 0.7 cm 0.7 cm

TABLA 4.0 Efecto del NaF sobre la fermentacin Tiempo (min) 5 10 15 20 25 30 Notacin: x= Sin cambio C (sin NaF) Volumen desplazado 0.2 cm 0.5 cm 0.5 cm 1.0 cm 1.0 cm 1.0 cm D(con NaF) Volumen desplazado x x x x x x

Imagen 3.0 levadura utilizada para la realizacin de la prctica.

Anlisis de resultados
Las pruebas, Benedict y el volumen generado de CO2 en la experimentacin pueden ser utilizadas para el seguimiento de la fermentacin. La prueba de Benedict sirve para caracterizar carbohidratos, estos tienen en su estructura el grupo funcional carbonilo, en su forma ceto o aldehdo. El reactivo de Benedict ([Cu(C3H5O(COO)3)2]4- en medio alcalino se emplea para detectar sustancias reductoras, como los aldehdos, que reducen al Cu+2 a Cu+1 en forma de xido cuproso; el color del precipitado puede ser amarillo o rojo dependiendo de la naturaleza y cantidad del agente reductor (Miranda Ruvalcaba et al. 2008); en una prueba negaiva el color azul del reactivo permanece. En la primera seccin "fermentacin de glucosa y demostracin con la prueba de Benedict" se puso de manifiesto el carcter reductor de la glucosa, pues dio positivo a la prueba, mostrando un precipitado rojo ladrillo luego de ser calentado en agua hirviendo (imagen 1). La misma prueba se realiz a la levadura dando un resultado negativo descartndose as la presencia de cualquier azcar reductor en la levadura que pudiese interferir con los posteriores experimentos, asegurando slo la presencia del hongo ascomiceto. La prueba de Benedict se utiliz para seguir el proceso de fermentacin realizado por Saccaromyces cerevisiae sobre la solucin de glucosa al 2%, el fundamento de este procedimiento es que como ya se mencion anteriormente la glucosa es un azcar reductor y por tanto da positivo a la prueba con el reactivo de Benedict, por lo tanto es de esperarse que conforme avance el proceso de fermentacin el poder reductor de la solucin de glucosa al 2% vaya decreciendo hasta desaparecer en el momento en que toda o la mayora de la glucosa sea transformada en etanol y CO2. As pues la prueba de Benedict se realiz en a tres tiempos (30, 60 y 90 minutos) incubando a 37C,en ningn momento se obtuvo una prueba negativa que confirmara que el proceso de fermentacin hubiera llegado a trmino, pero como el color del precipitado puede ser amarillo o rojo dependiendo de la naturaleza y cantidad del agente reductor (Miranda Ruvalcaba et al. 2008) si puede apreciarse una disminucin en la tonalidad roja que tiende haca el color amarillo que es indicativo de la que la fermentacin se esta llevando a cabo, si bien no a una buena velocidad,utilizndose dicha temperatura debido a que el metabolismo del microorganismo estudiado se lleva a cabo de manera ptima. Siendo un resultado desfavorable, debido a que se esperaba la desaparicin gradual de glucosa conforme avanzara el tiempo, es

probable que la levadura utilizada (imagen 3.0), se encontraba inhibida por la presencia de algn aditivo empleado en su fabricacin como monoesterato de sorbitn mencionado en el marbete,coadyuvantes a la fermentacin (amilasas,proteasas,glucoxidasas) o por que la levadura utilizada se encontraba resguardada (vieja) no nueva. En cuanto a la fermentacin con diferentes carbohidratos, se prepararon sistemas en los que el volumen producido de CO2 era medido cada 5 minutos para, determinar qu carbohidrato poda ser metabolizado con mayor eficacia por la levadura (saccaromyces cerevisiae) de esta forma puede ser medida cuantitativamente la actividad de fermentacin de la levadura, y puede hacerse un comparativo tambin de como vara la velocidad del proceso con cada diferente carbohidrato. Sin embargo, no se obtuvo ningn resultado, pues en ningn sistema se observ la produccin de CO2 (imagen 2.0). El problema pudo haberse debido, a la presencia de los aditivos ya mencionados en la levadura, por lo cual se realizara de manera terica el anlisis. Se utilizaron los siguientes carbohidratos: glucosa, fructosa, sacarosa y galactosa. Donde el que se metabolizara ms rpido, sera la glucosa por ser el sustrato preferido por Saccharomyces Cerevisiae debido a que la glucosa entra directamente a gluclisis para dar piruvato y seguir por la va de la fermentacin hasta dar etanol y CO2 , le sigue la fructosa, la fructosa est presente como azcar libre en muchas frutas, y se obtiene tambin de la hidrlisis de la sacarosa, la fosforilacin de la fructuosa en la mayor parte de los tejidos da lugar a fructosa-6-fosfaton un intermediario gucoltico, (Mathews & K. E., 2002) de esta forma la fructosa puede tambin ser aprovechada por Saccharomyces cerevisiae. Luego sigue la sacarosa, la sacarosa es un disacrido formado por una molcula de glucosa y una molcula de fructosa por lo tanto no es raro que la sacarosa pueda ser metabolizada por Saccharomyces cerevisiae y finalmente la galactosa, esta ltima ni siquiera sera metabolizada por la levadura. El rendimiento terico estequiomtrico para la transformacin de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1 g de glucosa. Este valor fue cuantificado por Gay Lussac. En la realidad es difcil lograr este rendimiento, porque como se seal anteriormente, la levadura utiliza la glucosa para la produccin de otros metabolitos. El rendimiento experimental vara entre 90% y 95% del terico, es decir, de 0.469 a 0.485 g/g. Los rendimientos en la industria varan entre 87 y 93% del rendimiento terico (Boudarel, 1984). Otro parmetro importante es la productividad (g/h/l), la cual se define como la cantidad de etanol producido por unidad de tiempo y de volumen. (Vzquez & Dacosta, 2007) En cuanto a la parte experimental de la fermentacin con diferentes carbohidratos, podemos decir que los resultados no fueron favorables ya que lo que se esperaba era un desplazamiento de la solucin contenida en cada pipeta debido a la formacin de CO2 como producto de la fermentacin; dependiendo del tipo de carbohidrato utilizado el volumen de lquido desplazado sera diferente, as para la glucosa se esperaba un mayor desplazamiento de lquido en la pipeta debido a que la glucosa es como ya se mencion antes la glucosa es el sustrato preferido por Saccharomyces cerevisiae. De manera paralela tambin se llev a cabo la fermentacin en presencia y ausencia de NaF en el sistema para analizar y observar el efecto que tiene sobre la fermentacin (vease tabla 4.0). En el tubo que contena NaF la fermentacin no se llev a cabo el proceso de fermentacin, esto se debe a que el in fluoruro acta como inhibidor de la enolasa (2-fosfo-D-gliceratohdirolasa; EC: 4.2.1.11) (UniProtKB, 2013). La enolasa est formada por 2 subunidades iguales y requiere al catin Mg+2 como cofactor debido a que este estabiliza al homodimero adems de que ayuda en la catlisis (UniProtKB, 2013) de la reaccin2-fosfo-D-glicerato= fosfoenolpiruvato + H2O. El papel que juega la enolasa es fundamental en el proceso de la glucolisis, pues es por medio de esa ruta metablica que se obtiene el piruvato que es el sustrato de partida para llevar a cabo el proceso de fermentacin alcohlica. Por lo tanto al inhibir a la 2-fosfo-D-gliceratohdirolasa se impide que se forme el

fosfoenolpiruvato en el paso nmero 9 de la glucolisis y por lo tanto ya no se forma piruvato. La forma en que el NaF inhibe a la enzima es por la formacin de un complejo del in F- con el Mg+2 de esta forma el homodmero de la enzima pierde estabilidad, su conformacin y por lo tanto su accin cataltica. Debido a esto no hay fermentacin.

Conclusin
Debido a la mala calidad de la levadura los datos experimentales no se obtuvieron de forma completa o confiable. De todas formas se realiz el anlisis de los resultados proporcionados por la profesora y de los que se obtuvieron de manera parcial. Se llev a cabo el proceso de fermentacin en glucosa de manera parcial por accin de Saccharomyces cerevisiae, se prob tambin que la levadura acta sobre fructosa y sacarosa, pero no as sobre galactosa. Quedo demostrado que NaF funciona como inhibidor en el proceso de fermentacin debido a la formacin de un complejo F-Mg que impide se lleve a cabo el noveno paso de glucolisis. No pudo demostrarse experimentalmente el final de la fermentacin por medio de la prueba de Benedict pero se hizo un estudio y anlisis terico de ello.

Referencias
Horton, R. (2008). Principios de bioqumica (4ta ed.). D.F., Mxico: Perarson. Koolman, J. (2004). Bioqumica Texto y Atlas. D.F.: Panamericana. Mathews, C., & K. E., van Holden. (2002). Bioqumica (3ra ed.). Marid: Pearson Educacin, S.A. Miranda Ruvalcaba, R., Godnez Hernndez, E., Garca Arellanes, J., & Aguilera Fuentes, J. L. (2008). Tcnicas bsicas para la experimentacin en qumica orgnica. Cuautitln Izcalli, Estado de Mxico, Mxico: Facultad de Estudios Superiores Cuautitln. UniProtKB. (24 de juio de 2013). UniProt. Obtenido de http://www.uniprot.org/uniprot/P00924 Vzquez, H., & Dacosta, O. (Oct/Dic de 2007). Fermentacin alcohlica: Una opcin para la produccin de energa renovable a partir de desechos agrcolas. Ingenierra, Investigacin Y tecnologa, 8(4).