MTODOS DE IDENTIFICACIN

CLAUDIA CONSTANZA PEREZ RUBIANO

1. METODOS DIRECTOS

RECUENTO EN PLACA

Econmico Se visualizan

RECUENTO EN CAMARA
PETROFF HAUSER HOWARD

Recuento de levaduras No diferencia clulas viables de no viables Coloracin supravital Azul de metileno Cerveza, licor y jugos

Recuento de hifas de hongos Determina calidad de materias primas Industria de salsa de tomate y jugos Se diluye a 8 grados Brix.

HEMOCITMETRO O CMARA CUENTA

GLBULOS

Este sistema tiene 2 reas de conteo separadas, cada una debe contener de 0.1 mm3 de muestra cuando se cubre con un cubre objetos especial.
reas de conteo

CUBRE OBJETOS ESPECIAL

Un cubreobjetos especial, grueso se monta sobre dos barras de cristal y esto forma las dos cmaras. Bar

Bar

CUADRCULAS DE CONTEO
Lneas finas en el piso de la cmara ayudan con el conteo celular.

El # clulas por ml = Promedio del # de clulas de los cuadros de las esquinas x 104.

LA TRANSFERENCIA DE LA SUSPENSIN
CELULAR SE HACE POR CAPILARIDAD
Llene la cmara con la suspensin celular utilizando una pipeta con punta fina aplicndola sobre el rea escavada de la cmara

Deje la suspensin entrar por capilaridad No ejercer presin durante el llenado con presin

CMARA CUENTA HONGOS DE HOWARD

Fue diseada especialmente para contar hongos y levaduras en un volumen dado de alimento. La estructura es similar a la del hemocitmetro pero no tiene cuadrcula en el piso de la cmara. Un disco ocular de Howard en el ocular del microscopio se usa para facilitar el conteo.

HOWARD

RECUENTO EN PLACA
RECUENTO EN PROFUNDIDAD RECUENTO EN SUPERFICIE RECUENTO EN SANDWICH Menor contaminacin Medios opacos Detecta menor de 10 UFC/ml

Menor Mayor posibilidad contaminacin de contaminacin Medios transparentes Medios opacos Detecta menor de 10 Detecta a partir de UFC/ml de 100 UFC/ml

Bacterias mesfilas

Adicin de yema de Bacterias lipolticashuevo. Bacterias agar tributirina Psicrtrofas Reveladores: cloruro frrico, sulfato ferroso

FILTRACION POR MEMBRANA

Muestra lquida no viscosa, licores, jugos agua Alta sensibilidad Muy costoso Bomba de vacio Filtros de nitrocelulosa (o.45, 0.22um)

Filtra mnimo 100 ml y maximo 300 ml Mesfilos, coliformes, Pseudomonas, E. coli

PETRIFILM

Mesfilos aerobios Recuento rpido de coliformes en productos lcteos Recuento de Staphylococcus aureus Enterobacterias Mohos y levaduras E. coli

EPIFLUORESCENCIA

SIMPLATE

Se toma la muestra y colorante de fluorescencia (naranja de acridina) que tie microorganismos viables y se visualiza en microscopio Visualiza poblaciones

Recuento Total de Bacterias, Recuento de Coliformes Totales y E.coli, Recuento de mohos y levaduras y Recuento de Campylobacter.

SIMPLATE

2. METODOS INDIRECTOS

Se observan cambios en el medio, turbidez, gas, cambio de color, etc. No se ve cantidad de microorganismos. Identificar caractersticas metablicas en el medio de cultivo.

PRUEBA DE TRAM (prueba de tiempo de reduccin de azul de metileno

Basado en la reduccin de 10 ml de leche y 1 ml de azul- 35-37 C(bano maria) colorante Azul de metileno TIEMPO CALIDAD El tiempo transcurrido <30 min Mala calidad para que tenga lugar la 30-1 hora Regular reduccin del colorante es calidad inversamente 1-4 hora Buena calidad proporcional al nmero de >4 Excelente microorganismos calidad En industria lctea como indicador de leche cruda

TECNICA DEL NMP

Usos Coliformes: Caldo brilla. Fermentan lactosa S. aureus: Giolliti cantoni (reduccin de telurito a teluro metlico Clostridium: Medio caldo carne cocido, protelisis y produccin de H2S por aminocidos azufrados

Mide caractersticas de microorganismo sobre el medio Tcnica estadstica que se distribuye bajo la curva de Poisson Mas sensible que el recuento en placa.

MINIKITS

Mini bioqumicas Grupo concreto de microorganismos Cdigos diagnsticos Huella dactilar metablica Bases de datos

Si cambia el color es porque degrada azcar y cambia pH rojo- amarillo

METODOS QUIMICOS
1. Bioluminiscencia

Todas las clulas vivas tienen ATP Mediante la enzima Luciferin luciferasa se cuantifica el ATP Luminmetro (unidad relativa de luz) Hisopo recoge muestra-este se introduce en lquido con la enzima.

Mucha luz-muchos microorganismos. Cuantifica cualquier ATP ya sea de microorganismos o de otras fuentes. Se utilizan protocolos para purificar ATP de microorganismos. Problema de cuantificacin: no discrimina Gen lux (Salmonella)

2. Mtodos fluorgenos y cromgenos

Reaccin qumica que permite evaluar el crecimiento de bacterias. Para identificar organismos patgenos: coliformes, E. coli, Salmonella, S. aureus.

Colillert LMX Rambach Petrifilm

En las ltimas dcadas la deteccin y cuantificacin directa (sin aislamiento) de organismos coliformes y E. coli utilizando medios de cultivo que contienen sustratos definidos ha sido amplia y rpidamente aceptada. Estos sustratos son utilizados por enzimas especficas del grupo de bacterias coliformes y E. coli. El mtodo se basa en el principio de unir estos compuestos a algn sustrato que se libere al medio al ocurrir la reaccin, produciendo un cambio de color perceptible o el desarrollo de fluorescencia. Por esta razn se conocen como compuestos cromognicos y fluorgenicos.

TIPOS DE SUSTRATO
SUSTRATO FLUOROGENO SUSTRATO CROMGENO

Lmpara UV Fluorescencia difusa Uso en medio de cultivo lquido o slido Autofuorescencia Pseudomonas

No Color limitado a la colonia Usos en medio lquido o slido Interferencia de color

Colilert (sustrato definido).

4 metil -umberiferil Dglucuronido. Gucoronidasa MUG: reactivo qumico produce fluorescencia o-nitrophenyl--Dgalactopyranosido ONPG:-galactosidasa: cromgeno. Produce cambio en coliformes.

Utilizan la -galactosidasa para metabolizar el nutriente indicador ONPG cambiando de incoloro a amarillo. E. coli utiliza la -glucuronidasa para metabolizar el MUG y crear fluorescencia. Como la mayora de los microorganismos no coliformes no poseen estas enzimas ,no pueden proliferar ni interferir. Los pocos grmenes no coliformes que poseen estas enzimas son suprimidos selectivamente por la matriz especficamente formulada de Colilert. Este enfoque reduce al mnimo los falsos positivos y negativos.

P/A

LMX

X gal: Para indicar si la bacteria expresa la galactosidasa -coliformes produciendo coloracin azul. MUG (fluorgeno) reacciona con glucoronidasa (enzima de E.coli y produce fluorescencia). Triptofanasa- triptfano: Si hay produccin de indol de E.coli.

RAMBACH (cromgeno) - Galactosidasa Salmonella reacciona con el cromgeno Coliformes crecen porque hay otras fuentes de carbono. El sustrato propilenglicol solo Salmonella lo puede degradar, cambia el pH

METODOS FISICOS
Impedancia
Cambios elctricos que produce un microorganismo cuando est en un medio de cultivo. La corriente es ms difcil de pasar cuando hay muchos microorganismos. Coliformes fecales, enterobacterias, enterococos. Emplean un medio de cultivo estable. No debe cambiar el pH. Impedancia cambia a 106

PRUEBAS BIOLOGICAS

Se utilizan para determinar la presencia de toxinas y/o su virulencia (microorganismos). Incluyen el uso de animales: cures, conejos, ratones. Estudios epidemiolgicos

PRUEBA DE LAL (lisado de amebocitos de Limulus).

LAL CROMOGENO

Limulus polyphemus Amebocitos Adicin de Ca Endotoxinas Los lipopolisacaridos resultan de la lisis de la pared (encefaleas, mialgias, escalofrios)

Lisado amebocitos+proenzima + muestra hidrlisis P- nitroalinina (espectofotmetro)

PRUEBA DE SERENY

Identifica E. coli y Shigella Capacidad invasora de clulas epiteliales del intestino delgado toxinas enteroinvasivas. Penetra clulas epiteliales (cobayos)

Evaluar si E. coli y Shigella producen enterotoxinas 106 microorganismos en ojos si se produce la toxina entra en la queratina de los ojos (capa blanca)

ASA LIGADA DE CONEJO

Para observar si se estn produciendo toxinas (enterotoxinas) de E. coli. Saca ilen. 10 cm de longitud (morcillitas). Cerrar, sacrificar.

Observar intestino delgado, cuando E. coli produce la toxina distensiona los fluidos, aumentando el tamao de la morcilla.(diarrea). Cultivo en solucin salina 18-24 horas Medir el volumen antes y despus.

RATON LACTANTE

Determinar toxinas de E. coli Separar ratn de su madre Administrar oralmente 0.05m/l 25C durante 2 h. Tiempo estable. Sacrificar Coeficiente peso intestino-peso corporal

PRUEBAS INMUNOLOGICAS
Identificar patgenos (Salmonella, Listeria, E. coli) Toxinas microbianas -Aglutinacin -Inmunoensayo -ELISA

AGLUTINACION

Microorganismo aislado Soporte de esferas de ltex cubiertas con Ac para toxina que se quiere determinar Enfrentar con la muestra, para probar si tienen Ag especficos

Coagulacin prueba (+) presencia de la toxina S. aureus, E. coli, B. cereus, C. perfingens

ELISA

RADIOINMUNOENSAYO

Inmunoenzimtica Detecta toxinas de hongos, S. aureus, Clostridium. Efecto de luz o cambio de color (colorimtrico). Adicionar enzima. Indirecta Ag- Ac

Muestra de sangre centrifugada (suero) Encontrar anticuerpos especficos Adicionar tecnecio o yodo (sustancias radioactivas) unidas a una sustancia especifica los Ag

ELISA

Se produce radioactividad y se observa por equipo especial Para toxinas de hongos y S. aureus 1-10ng/g

TCNICAS MOLECULARES
VENTAJAS DESVENTAJAS

48 horas desde el procesamiento Sensibilidad Permite identificar microorganismos incluso no cultivables como virus no encontrados

Personal capacitado, inversin en equipos. Reconoce contactos, pero no viabilidad (vivo o muerto el microorganismo). RFLP PCR PCR en tiempo real Sondas de hibridacin

PCR

Amplifica fragmentos especficos de RNA o DNA Se utiliza transcriptasa reversa para que el RNA se convierta en DNA Alta sensibilidad y especificidad Corto tiempo

Muestra: tratamiento previo para extraer el DNA Tac polimerasa y resistente a los 95C En 1977 se uso polimerasa termolbil de E. coli y se rompa por la alta temperatura

Etapas PCR

Hibridacin (92C). Separa hebras de DNA 15-20 sg Anillaje: pegarse los primers que se pegan al DNA si son complementarios, estos anillajes se dan a 55 o 65C. 20 sg Astringencia: entre ms alta la temperatura mas especfica es la tcnica

Elongacin: se coge el DNA con el primer complementario (ciclo duplicando una hebra, entre ms ciclos ms DNA) 20 sg Los primers hacen especfica a la tcnica de PCR porque el experimentador Decide que primers coloca secuencias de 20 a 40 pb. Se mandan fabricar y se debe tener la secuencia de lo que se quiere amplificar

Como visualizar la PCR

Con electroforesis Deben llevar un patrn de peso molecular Bromuro de etidio es el colorante que permite ver el DNA, este se intercala en el DNA y permite que fluoresca.

Se hace un corrido (2h) en agarosa que es el soporte.

PCR en tiempo real

Usa sondas con fluorometria No necesita electroforesis porque tiene combinados en los primers sondas fluorgenas y emite luz roja Tiene un control + y_

Para E. coli enterohemorrgica y Salmonella y L. monocytogenes Lo que da por el suelo de la grafica es _ y por encima que es +.

SONDAS DE HIBRIDACIN

Se encuentra fuera del mercado Campylobacter yeyuni, S. aureus.