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ENTEROBACTERIAS

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PRUEBAS BIOQUÍMICAS

INDOL
Introducción
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido
triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y
amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la
identificación de muchas especies de m.o.

Principio
La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando
el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído.
Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito más adelante. El
medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Medios y reactivos
Caldo triptofano
Peptona o digerido pancreático de caseína 2g

Cloruro de sodio 0,5 g

Agua destilada 100 ml

Reactivo de Kovacs
Alcohol amílico o isoamílico 150 ml

p-dimetilaminobenzaldehído 10 g

HCl conc. 50 ml
Procedimiento
Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35°C durante
18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo por la
pared interior del tubo.

Interpretación
El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo,
segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y un
resultado de la prueba positiva.

Controles

Escherichia coli: positivo

Klebsiella pneumoniae: negativo (mayoría de las cepas)

ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP)

Principio
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los
diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción
de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la
glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentación ácido-mixta y la
fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman
fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2.
En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y
succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0

(amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos
por la vía de fermentación ácido mixta.

El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la

producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la
acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol
dando un color rojo-fucsia

Medios y reactivos
Caldo RM/VP
Peptona 7g
Glucosa 5g

Fosfato dipotásico 5 g

Agua destilada 1L

pH = 6,9 ± 0,1

Indicador de pH rojo de metilo

Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95°

Agua destilada 200 ml

Revelador VP
alfa-naftol (solución al 5% en etanol 95°)

Solución de KOH al 40% en agua destilada

Procedimiento
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del m.o.
en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo
de incubación transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo
restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo.
Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de
KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno
atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos.

Interpretación
La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica
que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador
y el m.o. fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado,
intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15

minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la
acetoína.

Controles

RM positivo, VP negativo: Escherichia coli

RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

UTILIZACIÓN DE CITRATO
Introducción
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en
la identificación de enterobacterias.

Principio
La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un
medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el
crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza
con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Medios y reactivos
Medio de Simmons
Fosfato diácido de amonio 1g

Fosfato dipotásico 1g

Cloruro de sodio 5g

Citrato de sodio 2g

Sulfato de magnesio 0,2 g

Agar 15 g

Azul de bromotimol 0,08 g

Agua destilada c.s.p. 1L

pH = 6,9

Procedimiento
Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estría en el pico.
Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar
medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por
crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante
4 días.

Interpretación
El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría,
acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Controles

Positivo: Klebsiella spp.

Negativo: E.coli

DESCARBOXILACIÓN DE LISINA Y ORNITINA

Introducción
La descarboxilación de aminoácidos es llevada a cabo por descarboxilasas y
se forman aminas y CO2. Cada descarboxilasa es específica para un
aminoácido y la reacción es completa e irreversible. Los aminoácidos
ensayados habitualmente para la identificación son lisina, ornitina y
arginina.

Principio
El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base más comúnmente
usado para la determinación de las descarboxilasas en enterobacterias. Se
prepara un tubo con el medio conteniendo el aminoácido a ensayar y un
tubo control con medio base sin aminoácido. Se cubren con una capa de
aceite mineral (vaselina líquida) para hacer el medio anaerobio de manera
que ocurra la fermentación de la glucosa que contiene. Durante las primeras
etapas de la incubación en ambos tubos se observará viraje del indicador
de pH del medio al ácido, por la fermentación de la glucosa. Luego, si el
aminoácido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno
al color original del medio o un viraje al alcalino.

Medios y reactivos
Base de Moeller
Peptona 5g

Extracto de carne 5g

Glucosa 0,5 g

Piridoxal 0,005 g

Púrpura de Bromocresol 0,01 g

Rojo de cresol 0,005 g

Agua destilada c.s.p. 1L

pH final = 6,0

Caldo Lisina o Ornitina de Moeller: Preparar igual al medio base y agregar 10

g del aminoácido (1% de concentración final de la forma levo, utilizar el
doble si se usa la forma dl del aminoácido ya que solo la levo es activa).
Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor.

Procedimiento
Inocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moeller con el
aminoácido a estudiar (lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin
aminoácido). Incubar a 35°C durante 18 a 24 horas.
Interpretación
El ensayo puede ser leído si en el tubo control se observa crecimiento y
viraje del indicador al amarillo indicando que se dio la fermentación de la
glucosa y un descenso de pH que permite la activación de las
descarboxilasas. El retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el
aminoácido indica una reacción positiva debida a la liberación de aminas
por descarboxilación.

Controles

Descarboxilación de lisina positiva: Enterobacter aerogenes

Descarboxilación de lisina negativa: Enterobacter cloacae

Descarboxilación de ornitina positiva: Serratia spp
Descarboxilación de ornitina negativa: Klebsiella spp.

FENILALANINA DESAMINASA
Introducción
La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación oxidativa forma un
cetoácido, el ácido fenilpirúvico. Sólo los géneros Proteus y Providencia
poseen la fenilalanina desaminasa, lo que permite diferenciarlas del resto de
las Enterobacterias.

Principio
La prueba de la fenilalanina se basa en la detección del ácido fenilpirúvico
luego del desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para
eso se agrega cloruro férrico que forma un complejo de color verde con el
ácido fenilpirúvico. El medio de cultivo no puede contener extractos de
carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina.

Medios y reactivos
Agar fenilalanina
DL fenilalanina 2g

Extracto de levadura 3g

Cloruro de sodio 5g

Fosfato de sodio 1g

Agar 12 g
Agua destilada c.s.p. 1L

pH = 7,3

Cloruro férrico

Cloruro férrico 10 g

HCl concetrado 2,5 g

Agua destilada c.s.p. 100 ml

Procedimiento
Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar
a 35°C durante 18-24 horas. Luego de transcurrido el período de incubación,
agregar 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro férrico, directamente sobre la
superficie del agar.

Interpretación
La aparición inmediata de un color verde intenso indica la presencia de
ácido fenilpirúvico y una prueba positiva.

Controles

Positivo: Proteus

Negativo: Escherichia coli

TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

Introducción
El agar triple azúcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite
estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa,
sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la detección de la
producción de H2S. Es un medio útil para la identificación de
enterobacterias.
Principio
El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto
determina que existan dos cámaras de reacción dentro
del mismo tubo. La porción inclinada (pico) expuesta
en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción
inferior (fondo) está protegida del aire y es
relativamente anaerobia.

Al crecer un m.o. en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color rojo por
el rojo fenol) por la producción de aminas, debido a la utilización aerobia de
las peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxígeno- la degradación de
peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden
detectar la producción de pequeñas cantidades de ácido (color amarillo por
el rojo fenol). Si se inoculan m.o. no fermentadores no se formarán ácidos,
pero por la producción de aminas en el pico, todo el medio quedará rojo.

La glucosa en el TSI está en una proporción 10 veces menor que la lactosa y

la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa
pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido producida por
fermentación será baja (porque la cantidad de glucosa inicial es baja). En las
primeras horas (10 a 16 hs) de incubación se producirá viraje del indicador
al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubación, el
pico del tubo retornará al rojo por la producción de aminas debida a la
degradación aerobia de las peptonas antes descrita.

Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de

estos azúcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producirá gran
cantidad de ácido (que no puede ser neutralizado por la producción de
aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virará al
color amarillo (ácido).

La producción de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por

precipitación del sulfuro ferroso (negro). Como esta reacción se da
preferencialmente en medio ácido, un ennegrecimiento del fondo del tubo
(que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se
lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además
puede observarse la producción de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en
el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la
superficie.

Medios y reactivos
TSI
Extracto de carne 3 g

Extracto de levadura 3g

Peptona 15 g

Proteosa peptona 5 g

Lactosa 10 g

Sacarosa 10 g

Glucosa 1g

Cloruro de sodio 5g

Sulfato ferroso 0,2 g

Tiosulfato de sodio 0,3 g

Agar 12 g

Rojo fenol 0,024 g

Agua destilada 1L

pH = 7,4 ± 0,2

Procedimiento
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la
punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo,
estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 °C
durante 18-24 hs, pero no más de 24 hs..

Interpretación y Controles
Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico,
fondo, producción de gas y H2S.

Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-)

No hay fermentación de azúcares. Característica de bacterias no
fermentadoras como Ej. Pseudomonas sp

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S-)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción
de gas ni de H2S.

Ej. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo ácido (Alc/A/gas-/ H2S+)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay producción

de gas, si de H2S.

Ej. Salmmonella typhi.

Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de gas

y producción de ácido sulfhídrico. Ej. Salmonella spp. (la mayoría de las
especies de Salmonella).

Pico ácido/fondo ácido (A/A)

Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no.

E.coli (A/A/H2S -)

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas. Ej.

A/A/gas+/H2S-.
LIA (LYSINE IRON AGAR)
Introducción
Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilación o
desaminación de la lisina. Se puede detectar además la producción de H2S.
Es muy utilizado en las técnicas de búsqueda de Salmonella, principalmente
para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los
medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.

Principio
Durante las primeras etapas de la incubación el fondo virará el indicador de
pH del medio al ácido (amarillo) por la fermentación de glucosa. Luego, si el
aminoácido es descarboxilado se formarán aminas que provocan un retorno
al color original del medio o hacia un viraje al básico (color violeta).

En la desaminación se produce un ácido carboxílico y NH3 y se visualiza en

la superficie la aparición de un color rojo intenso. La producción de H2S a
partir de tiosulfato se visualiza por la precipitación de sulfuro ferroso de
color negro.

Medios y reactivos
Peptona 5g

Extracto de levadura 3g

Glucosa 1g

L-lisina HCl 10 g

Citrato férrico amónico 0,5 g

Tiosulfato de sodio 0,04 g

Púrpura de bromocresol 0,02 g

Agar 15 g

Agua destilida 1L

pH = 6,7 ± 0,2

Interpretación y controles
pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilación de lisina positiva. Ej.:
Salmonella choleraesuis.

pico rojo/fondo ácido/H2S-, desaminación de lisina positiva, descarboxilación

de lisina negativa. Ej.: Proteus mirabilis.
pico alcalino/fondo ácido/H2S- descarboxilación de lisina negativa. Ej. E. coli

pico alcalino/fondo ácido/H2S+ descarboxilación de lisina negativa,

producción de H2S. Ej. Citrobacter freundii.

PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS PARA PSEUDOMONAS SP.

Introducción
La capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluoresceína) y
piocianina es una característica importante para la identificación de
especies de Pseudomonas. Algunas de ellas elaboran sólo fluoresceína (ej.
Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa). La piocianina
solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de
esta especie la producen. Se han diseñado medios de cultivo que potencian
la elaboración de uno de los pigmentos e inhiben la formación del otro.

Principio
El medio King A (o Pseudomonas Agar P) potencia la elaboración de
piocianina mientras que el King B (o Pseudomonas Agar F) potencia la
elaboración de fluoresceína e inhibe parcialmente la de piocianina. Estos
pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es un
pigmento azul-verde mientras que la fluoresceína es amarillo-verdoso y
fluoresce cuando es expuesto a la luz UV (λ=254 nm). Existen pigmentos
amarillo-verdosos producidos por algunas especies de Pseudomonas que no
fluorescen.

Medios y reactivos
King A King B
Peptona 20 g Proteosa Peptona 20 g

Glicerol 10 g Glicerol 10 g

K2SO4 10 g K2HPO4 1,5 g

MgCl2 1,4 g MgSO4.7H2O 1,5 g

Agar 15 g Agar 15 g

Agua 1L Agua 1L
Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a 121ºC durante 15 minutos
y se dejan solidificar inclinados.

Procedimiento
Inocular los tubos por estrías. Incubar a 35ºC durante 24 hs.

Interpretación
Observar al UV, la producción de pigmento azul-verdoso en el medio King A
y la de pigmento amarillo-verdoso, en el King B

Controles

Pseudomonas aeruginosa: King A +

P. fluorescens: King A -

P. fluorescens: King B +

P. stutzeri: King B -

DNASA - DESOXIRRIBONUCLEASA
Introducción
La actividad desoxirribonucleasa (DNAsa) se ha demostrado
fundamentalmente en los géneros Staphylococcus y Serratia y consiste en
la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menor peso molecular.
Esta característica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia
marcescens y Staphylococcus aureus. Weckman y Catlin demostraron la
estrecha correlación entre la producción de DNAsa de los cultivos de
Staphylococcus aureus con la producción de coagulasa.

Principio
Los m.o. DNAsa positivos degradan el DNA cuando son incubados en un
medio que lo contiene. Esto puede ser visualizado de diferentes maneras:
ya sea inundando las placas crecidas con HCl 0,1 N y observando zonas
transparentes alrededor de las estrías o incorporando al medio indicadores
como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es
positivo).
Medios y reactivos
DNAsa agar
Triptosa 20 g

ADN 2g

NaCl 5g

Agar 15 g

Azul de toluidina* 0,1 g

Agua c.s.p. 1L

* o verde de metilo
Procedimiento
Estriar la superficie de la placa e incubar a 35°C durante 18-24 horas.
Observar el viraje del indicador a rosado alrededor de las estrías.

Interpretación
Un resultado positivo está dado por el viraje del indicador en la zona de la
estría a rosado.

Controles
Positivo: S.aureus y Serratia marcescens

Negativo: S.epidermidis:

COAGULASA
Introducción
La coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la
protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la
formación de un coágulo visible en un sistema analítico adecuado. Se cree
que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de
infección estafilocóccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza
más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa
positivo) de otros Staphylococcus.

Principio
La coagulasa se halla presente en dos formas, “libre” y “fija”, cada una de
las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas de
determinación diferentes:

Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija está unida a la

pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las células
suspendidas en plasma (que contiene fibrinógeno) provocan su aglutinación,
indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos.

Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima

extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una
suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes
iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un coágulo visible como
consecuencia de la utilización de los factores de coagulación del plasma de
manera similar a cuando se añade trombina.
Medios y reactivos

Plasma coagulasa (Difco, o BBL)

Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo

nutriente.

Procedimiento
Prueba en portaobjetos
Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos

Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de

manera de obtener una suspensión cargada homogénea. Agregar una gota
de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensión del m.o. Mezclar
bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando
la formación inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos.

Prueba en tubo
Colocar asépticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un
tubo estéril.

Añadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensión en suero fisiológico de un

cultivo en placa).

Mezclar por rotación el tubo, evitando remover o agitar el contenido.

Colocar en baño de agua a 37°C y observar cada hora hasta 4 horas y luego
a las 24 horas, la formación de un coágulo visible.

Interpretación
Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta usualmente en 15
a 20 segundos por la aparición de un precipitado granular. La prueba se
considera negativa si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos. Esta
prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos
o positivos tardíos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que
algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija.
Prueba en tubos:

1+: pequeños coágulos no organizados.

2+: pequeños coágulos organizados.

3+: gran coágulo organizado.

4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte

el tubo.

Se consideran positivos los grados 3+ y 4+

Controles
Positivo: S.aureus

Negativo: S.epidermidis:

PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA

Introducción
La prueba de la bilis-esculina está basada en la capacidad de ciertas
bacterias, particularmente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la
esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es, químicamente, un
derivado de la cumarina (6-b-glucósido-7-hidroxicumarina), que por su
estructura pertenece a los glucósidos. Por definición, éstos están
constituídos por dos restos unidos por un puente de oxígeno. En el caso de
la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7-hidroxicumarina
(que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona).
Principio
Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y también hidrolizar esculina,
producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y ésta puede
visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formación de un
complejo marrón oscuro o negro.

Algunos medios bilis-esculina incluyen también azida sódica para inhibir el

desarrollo de organismos Gram negativos, transformándose en selectivos
para estreptococos.

Medios y reactivos
Medio bilis-esculina
Peptona 5g

Extracto de carne 3 g

Bilis de buey 40 g

Esculina 1g

Citrato férrico 0,5 g

Agar 15 g

Agua destilada 1L

Procedimiento
Se estría el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del
medio bilis-esculina. Se incuba a 37°C durante 24 horas.

Interpretación
La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La
reacción es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un
halo marrón oscuro o negro alrededor de las colonias en placa.

Controles

Positivo: streptococo del grupo D

Negativo: estreptococo no del grupo D

UREASA
Introducción
La urea es una diamida del ácido carbónico que puede ser hidrolizada con
liberación de amoníaco y dióxido de carbono.

Principio
La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden
hidrolizar urea de acuerdo a la siguiente reacción química:

Urea + 2H2O CO2 + H2O + 2NH3

El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio,

produciéndose alcalinización y aumento de pH del medio.

Medios y reactivos
El caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas
comúnmente usados en los laboratorios para la detección de la ureasa de
m.o.
Caldo de Stuart
Extracto de levadura 0,1 g

Fosfato monopotásico 9,1 g

Fosfato disódico 9,5 g

Urea 20 g

Rojo fenol 0,01 g

Agua 1L

pH = 6,8

Agar urea de Christensen

Peptona 1g

Glucosa 1g

Cloruro de sodio 5g

Fosfato monopotásico 2g

Urea 20 g

Rojo fenol 0,012 g

Agar 15 g

Agua 1L

pH = 6,8

Procedimiento
Inocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o
estriar la superficie del agar. Incubar a 35°C durante 24 hs.

Interpretación
Los m.o. que hidrolizan urea rápidamente pueden producir reacciones
positivas en 1 a 3 hs. Las especies mas lentas pueden requerir 3 o mas días.

Caldo: una coloración rojiza indica alcalinazación e hidrólisis de urea

Agar: una coloración rojiza en el medio indica hidrólisis de urea positiva. Los
degradadores lentos producen coloración parcial (generalmente el pico), los
rápidos producen coloración en todo el tubo. Si no hay hidrólisis el medio
permanece con el colo original (amarillo) y se observa crecimiento.

Controles

Positivo: Proteus sp

Negativo: Escherichia coli

Introducción
Las pruebas bioquímicas
consisten en distintos test
químicos aplicados a
medios biológicos, los cuales,
conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via
metabólica a partir
de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o
no.
Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben
aplicar de acuerdo a
las exigencias del microorganismo en estudio.
De la amplia variedad de pruebas bioquímicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10,
aplicados a 5 especies
de microorganisos.
Además estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados
experimentales entre los
distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.
Objetivos
Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar −aplicando éste método− distintos
microorganismos.
•
Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioquímcas es o son el (los)
adecuado(s)
de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar.
•
• Entender los principios bioquimicos de las pruebas.
• Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioquímias
• Conocer el uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos
Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder
reconocer
en que partes del procedimiento se cometió el o los errores, para así, mediante el desarrollo
experimental conocer mas profundamente las pruebas bioquímicas.

Internet:
• http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html
• http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html
• http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html
• http://edicion−micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html

• Prueba MIO (Motility−Indole−Ornitine ó Motilidad−Indol−Ornitina)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de
Indol a la
descarboxilación de la ornitina.
Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a
37° .
Interpretación y Resultados:
Reacción Interpretación
Enturbiamiento del
Agar.
Hay movilidad
Agar transparente de−
sarrollo solo en picada
No hay movilidad
Azul (alcalino) Descarboxila ornitina
Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila
Rojo (anillos) Indol (+)
Amarillo (anillos) Indol ( − )
• Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de
ácido y gas a
partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la
producción de
SH2.
Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia
Enterobacteriaceae, con
objetivo de diferenciar entre:
• bacterias fermentadoras de la glucosa
• bacterias fermentadoras de la lactosa
• bacterias fermentadoras de sacarosa
• bacterias aerogénicas
• bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas
• Prueba MIO (Motility−Indole−Ornitine ó Motilidad−Indol−Ornitina)
Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de
Indol a la
descarboxilación de la ornitina.
Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a
37° .
Interpretación y Resultados:
Reacción Interpretación
Enturbiamiento del
Agar.
Hay movilidad
Agar transparente de−
sarrollo solo en picada
No hay movilidad
Azul (alcalino) Descarboxila ornitina
Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila
Rojo (anillos) Indol (+)
Amarillo (anillos) Indol ( − )
• Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de
ácido y gas a
partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la
producción de
SH2.
Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia
Enterobacteriaceae, con
objetivo de diferenciar entre:
• bacterias fermentadoras de la glucosa
• bacterias fermentadoras de la lactosa
• bacterias fermentadoras de sacarosa
• bacterias aerogénicas
• bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.
Prodedimiento:
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5
mm. del fondo del
tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado.
Incubar a 35°
durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.
Resultados:
Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no
fermentadoras como Pseudomonas sp.
•
• Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.
4
alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de
ácido sulfhídrico. Salmonela spp.
•
Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o
no.
Escherichia coli.
•
A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.
• Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)
Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o
desaminación de la
lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la
detección de SH2.
Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.
Procedimiento:
Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por
24 horas a 37° .
Interpretación y Resultados:
Reacción Interpretación
Azul (alcalino) Hay movilidad
Rojo No hay movilidad
Engrecimiento Descarboxila ornitina
Ruptura del Agar No descarboxila
Fondo Amarillo y
Tendido púrpura
Descarboxilación de lisina
Pruebas Bioquímicas IMViC:
• Agar Citrato
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de
enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio
de cultivo con
citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio.
Este aumento de
pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Procedimiento:
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un
medio sólido y
cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por
crecimiento a partir
del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se
observa
crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados:
(+)Klebsiella spp.
( − ) Escherichia Coli
• Indol

•
Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioquímcas es o son el (los)
adecuado(s)
de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar.
•
• Entender los principios bioquimicos de las pruebas.
• Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioquímias
• Conocer el uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos
Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder
reconocer
en que partes del procedimiento se cometió el o los errores, para así, mediante el desarrollo
experimental conocer mas profundamente las pruebas bioquímicas.
•
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
FACULTAD TECNOLOGICA
TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
Microbiología
Pruebas Bioquímicas
Autor:
Lab N° 4
Cod. 06
1
Bibliografía
• Microbiología / Thomas D. Brock, Michael T. Madigan
2a. ed. en español, 1993. México ; Englewood Cliffs : Ed. Prentice Hall Hispanoamericana.
• Microbiología / Michael J. Pelczar, Jr., Roger D. Reid
2a. ed. en español., 1982. México : Ed. McGraw−Hill.
• Tratado de microbiología : con inclusión de inmunología y
genética molecular / Bernard D. Davis
2a. ed., 1978. Barcelona : Ed. Salvat.
Internet:
• http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html
• http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html
• http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html
• http://edicion−micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html
• Prueba de la Oxidasa
El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa.
Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e−. Este se
detecta utilizando el
tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado
por la
citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura.
Procedimiento:
Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del
tubo con la
bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30
segundos,
observamos si ha ocurrido algún cambio.
Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo.
Se considera positva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra.
Resultados:
(+) Pseudomonas aeruginosa
( − ) Escherichia coli
• Prueba de la Catalasa
2
El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa
El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser
éste un
compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa
(H2O2 −>
H2O + ½ O2).
Prodecimiento:
Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo
previamente
esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la
introducimos
por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liíquida de
peróxido de
hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.
La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.
Resultados:
(+) Staphylococcus aureus
( − ) Streptococcus spp.
• Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar
en factor de
aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se
utiliza para
diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.
Procedimiento:
Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de
conejo en un tubo
de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el
tubo de ensayo
con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la
muestra cada 15
minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.
Resultados:
Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:
1: pequeños coágulos no oganizados
2: pequeños coágulos oganizados
3: gran coágulo organizado
4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.
Se consideran positivos los niveles 3 y 4.
(+) Staphylococcus aureus
3
( − ) Staphylococcus epidermis.
• Prueba MIO (Motility−Indole−Ornitine ó Motilidad−Indol−Ornitina)
Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de
Indol a la
descarboxilación de la ornitina.
Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a
37° .
Interpretación y Resultados:
Reacción Interpretación
Enturbiamiento del
Agar.
Hay movilidad
Agar transparente de−
sarrollo solo en picada
No hay movilidad
Azul (alcalino) Descarboxila ornitina
Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila
Rojo (anillos) Indol (+)
Amarillo (anillos) Indol ( − )
• Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de
ácido y gas a
partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la
producción de
SH2.
Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia
Enterobacteriaceae, con
objetivo de diferenciar entre:
• bacterias fermentadoras de la glucosa
• bacterias fermentadoras de la lactosa
• bacterias fermentadoras de sacarosa
• bacterias aerogénicas
• bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.
Prodedimiento:
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5
mm. del fondo del
tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado.
Incubar a 35°
durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.
Resultados:
Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no
fermentadoras como Pseudomonas sp.
•
• Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.
4
Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción
de
ácido sulfhídrico. Salmonela spp.
•
Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o
no.
Escherichia coli.
•
A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.
• Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)
Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o
desaminación de la
lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la
detección de SH2.
Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.
Procedimiento:
Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por
24 horas a 37° .
Interpretación y Resultados:
Reacción Interpretación
Azul (alcalino) Hay movilidad
Rojo No hay movilidad
Engrecimiento Descarboxila ornitina
Ruptura del Agar No descarboxila
Fondo Amarillo y
Tendido púrpura
Descarboxilación de lisina
Pruebas Bioquímicas IMViC:
• Agar Citrato
La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de
enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio
de cultivo con
citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio.
Este aumento de
pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.
Procedimiento:
Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un
medio sólido y
cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por
crecimiento a partir
del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se
observa
crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.
Resultados:
(+)Klebsiella spp.
( − ) Escherichia Coli
• Indol
5
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las
bacterias que
poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de
indol, ácido
pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la
identificación de muchas
especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo
rojo cuando el
indol reacciona con el grupo aldehído del p−dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio
activo de los
reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
Procedimiento:
Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas.
Al finalizar
este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de
un vivo color
rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica
la presencia de
indol y una prueba positiva.
Resultados:
(+) Escherichia coli
( − ) Klebsiella pneumoniae
• Rojo Metilo
Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de
enterobacterias
lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la
fermentación de la
glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido−mixta y la fermentación del 2,3
butanodiol. En
la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además
de etanol, H2 y
CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los
principales
productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se
utiliza para
visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.
Procedimiento:
Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en
estudio.
Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas
gotas del reactivo
de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que
la producción
de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la
glucosa por la vía
de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado
como positivo.
Resultados:
(+) Escherichia coli
( − ) Enterobacter aerogenes
• Vogues Proskauer
En la prueba de Voges−Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta
en la prueba
de rojo de metilo. El acetil−metil−carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la
producción de
butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este
se revela en
presencia de alfa−naftol dando un color rojo−fucsia.
6
Procedimiento:
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en
estudio. Incubar a
35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo
RM/VP a un
tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa−naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo
cuidadosamente
para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El
desarrollo de un
color rojo−fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de
la acetoína y
por lo tanto una prueba VP positiva.
Resultados:
(+) Enterobacter aerogenes
(−)Escherichia coli
Diagrama de flujo realización de Pruebas Bioquímicas
RECOLECCIÓN DE MATERIALES A UTILIZAR EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS
PREPARACION DE MATERIAL DE LABORATORIO
REALIZACION DEL PROCEDIMINTO PARA PRUEBAS BIOQUIMICAS
INCUBACION DE MUESTRAS
ANOTAR RESULTADOS
ANALISIS DE RESULTADOS
9
COMPARACION DE RESULTADOS EXPERIMENTALES Y TEORICOS
EVALUACION Y RESULTADOS FINALES DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
10