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La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld,
que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base
de gelatina.
Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño)
y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo
puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido.
En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación
con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar
(polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.
Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las
bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran
importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron
este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el
crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos
metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes
del medio.
I.- OBJETIVOS
II.- GENERALIDADES:
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión
de oxígenos adecuados, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio
de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe
estar exento de todo microorganismo contaminante.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y
no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y
amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el
crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto
de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad,
pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente
extendido en el laboratorio.
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero
los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en
una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos
microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias
(tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un
metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido
de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre
clasificándose en cuatro grupos:
Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la
exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de
anaerobiosis por los siguientes métodos:
5- Luz ambiental
6- pH
7- Temperatura
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios.
El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza
vapor de agua a presión como agente esterilizante)
Medios electivos
Medios selectivos
Otro importante método de separación de cultivos mixtos, es por medio del uso de
un medio selectivo. Este es un medio que ha sido modificado para incluir uno o más
agentes inhibitorios. La elección de un medio selectivo debe ser apropiada para el
aislamiento del organismo que interesa. Las sustancias inhibitorias pueden ser
colorantes, antibióticos, sales biliares y sustancias que afecten el metabolismo
enzimático de algunas especies. Los medios selectivos para especies Gram- , pueden
incluir cristal violeta el cual inhibe el crecimiento de muchas bacterias Gram+. La
penicilina con una concentración de 5,50 unidades/ml inhibe la mayoría de las
bacterias Gram+ y por lo tanto el medio se hace selectivo para bacterias Gram-
Los medios selectivos para bacterias Gram+, incluyen Telurito de Potasio, azida
sódica, etc. que inhiben el crecimiento de bacterias Gram-.
Medios diferenciales
Ej.: que tenga agregado un indicador de pH que haga variar el color del medio cuando
se encuentre frente a un microorganismo.
Medios enriquecidos
Procedimiento de enriquecimiento
Peptonas
Infusiones y extractos
Las infusiones y los extractos de carne y otros tejidos se usaron antes de conocerse
las peptonas, hoy se los sigue usando en menor medida.
Disolver 1gr. del material a examinar en 10,0 ml de agua purificada. Extender 0,01 ml
sobre un área de 1 cm2 de una lámina portaobjetos de vidrio, secada al aire, y colorear
por el método de Gram.
Examinar 10 campos con una lente de inmersión en aceite. No debe haber más de 50
microorganismos o grupos visibles en 10 campos.
Agentes solidificantes
Ventajas
Desventajas
La gelatina es poco usada ya que a temperaturas altas se disuelve y por otra parte
numerosos microorganismos lo digieren, se usa principalmente en microbiología de
suelos.
Otros componentes
Indicadores colorimétricos
Los indicadores pueden incluirse entre los medios. Los indicadores de pH más usados
son rojo fenol, azul bromotimol, púrpura de bromocresol y rojo neutro. Estos
indicadores se usan para demostrar la producción de ácido por un hidrato de carbono
contenido en el medio.
El azul de metileno y la resazurina son los indicadores de Eh (carga iónica) más
usados actualmente.
Algunos lotes de pH y Eh pueden ser tóxicos para algunos microorganismos y deben
probarse antes de usarlos.
Agentes selectivos
Agentes reductores
Preparación
Caldo nutriente
Se pesan los ingredientes y se calientan hasta que se disuelven. Una vez que se ha
enfriado, se ajusta el pH a 7-6. Se autoclava a 1 atmósfera durante 15 minutos para
precipitar los fosfatos. Se filtra y se reparte en tubos tapados con algodón o con
tapones a rosca (en esta último caso no se ajusta completamente las tapas). Se
esteriliza a 1 atmósfera durante 20 minutos. Ajustar las tapas a roscar antes de retirar
del autoclave.
IV. EXPERIMENTO
Siga cada uno de los pasos como lo indica su Profesor, Técnico o Instructor.
V.- RESULTADO
Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples
hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar
o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos
de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se
multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria
individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por
decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se
siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de
bacteria.
Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo
pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH
que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se
generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación,
generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo
cerrado. Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen
determinadas enzimas que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas
hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios
apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y
técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología de un hospital,
pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y
los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.
VI.- CONCLUSIONES
VII.- RECOMENDACIONES
No se puede meter las botellas en la jarra con las manos porque eso puede llevar
cultivos.
Rotular los tubos de ensayo indicando las sustancias que contienen estos.
La mesa del laboratorio debe estar libre para poder llevar acabo la practica.
A la hora de vaciar el cultivo en los tubos de ensayo hay que hacerlo de una
manera rápida, minuciosa y la tapa enroscada de dicho tubo debe estar la boca
No debemos acercar nuestra boca con los tubos de ensayo, ya que hay que
VIII.- CUESTIONARIO
Caldo de cultivo:
Micro aerofilas:
Medios selectivos:
Inhibir:
Detener o restringir el curso de algo o un proceso.
Vacunas:
Las vacunas son productos biológicos obtenidos a partir de gérmenes que pueden
producir enfermedades (bacterias o virus). Están compuestas por esos mismos
gérmenes vivos pero atenuados (debilitados), muertos o por algunas partes de ellos.
Además pueden contener otros componentes químicos o biológicos que faciliten su
conservación o aumenten su eficacia. En niños sanos no producen enfermedad, sino
que estimulan sus defensas naturales para protegerles de la infección.
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33.- ¿Cuáles son las condiciones físicas que se deben tener en cuenta para la
preparación de medio de cultivo con la finalidad del crecimiento de
microorganismos?
A la hora de diseñar un medio de cultivo no sólo hay que tener en cuenta los nutrientes
sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los
microorganismos.
2.- pH
Estos cambios pueden llegar a ser tan grandes que inhiban el crecimiento del
microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante
sistemas tampón. Uno de los más utilizados en microbiología es la combinación de
KH2PO4 y K2HPO4 tamponando el medio a un pH de aproximadamente 6,8.
Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido
de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre
clasificándose en cuatro grupos:
Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la
exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de
anaerobiosis por los siguientes métodos:
C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de
cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al
encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono.
Otras bacterias, como las aisladas en las fosas marinas, requieren presiones
superiores a las normales.
44.- ¿Para que, como se interpreta y de que esta compuesto los medios de mínimos
de Falkow y de Davis?
55.- ¿Qué son, para que sirven y como se interpretan los medios de cultivo de
enriquecimiento y en que caso se usa?
Se usa en los casos de que los requerimientos nutricionales de bacterias sean muy
exigentes.