ESCUELA POLITCNICA DEL EJERCITO

DEPARTAMENTO: CIENCIAS DE LA VIDA ASIGNATURA: ALGAS EN BIOTECNOLOGA

PRCTICA N 1
Colecta de muestras. Identificacin y aislamiento de microorganismos fotosintticos a partir de muestras de aguas y suelos.
Introduccin: Esta gua presenta las instrucciones sobre metodologas de muestreos en diferentes ambientes naturales, de aislamiento y de cultivos iniciales a fin de abordar estudios ecolgicos, taxonmicos, fisiolgicos y de biotecnologa de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintticas en condiciones de laboratorio. Se consideran estrategias metodolgicas para comenzar con el monitoreo de identificacin de microorganismos observados y tomando en cuenta el orden de abundancia y variacin de la poblacin conforme va pasando el tiempo de colecta y segn la adicin de diferentes medios de cultivos, que tambin influencian la diversidad y poblacin de microalgas y cianobacterias especialmente. El procesamiento de las muestras tanto de aguas, como de sedimentos o de suelos puede depender de la procedencia de las mismas. Bien se si se tratan de muestras obtenidas en lagunas, embalses, aguas termales, medios hipersalinos, aguas residuales, de superficies rocosas, de suelos, etc. En este sentido, el uso de los primeros medios de cultivos y de su concentracin. As como, de la intensidad luminosa y fotoperodo, temperatura, aireacin, son variables ambientales, esenciales que se deben tomar en cuenta a fin de preservar o dar comienzo al proceso de adaptacin de las diferentes cepas de microorganismos fotosintticos en el laboratorio.

De acuerdo a las fases de trabajo en el laboratorio para el aislamiento y posterior cultivo o de manera simultnea de las cepas de estos microorganismos, se requiere el entrenamiento para la colecta de las muestras, caracterizacin de las mismas, su observacin al microscopio y seguimiento de la variabilidad de las diferentes taxas, mtodos de aislamiento y de purificacin de cada una de estas y su posterior estudio sobre el efecto de diferentes medios de cultivo para su crecimiento. Es importante destacar que, los procedimientos pueden variar de acuerdo a las caractersticas de cada especie, del tipo de muestra y de los medios e instrumentos que cada operador tiene a su disposicin. Objetivos: 1. Considerar las tcnicas de colecta de muestras y segn las condiciones ambientales y aspectos geogrficos del hbitat a monitorear.

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DEPARTAMENTO: CIENCIAS DE LA VIDA ASIGNATURA: ALGAS EN BIOTECNOLOGA 2. Valorar las metodologas para el procesamiento de las muestras en el laboratorio, a fin de obtener una mayor eficiencia de la supervivencia de los microorganismos fotosintticos mantenidos en las muestras. 3. Seleccionar segn el grupo de microorganismos fotosintticos, los medios de cultivos ms adecuados y selectivos, que contribuyan a incrementar el crecimiento de los mismos, para su posterior aislamiento. 4. Comparar las metodologas de aislamiento y de purificacin para la toma de decisiones al momento de mejorar dichos procesos. 5. Estimar la diversidad, dominancia y abundancia de los taxas de este grupo de microorganismos en cada muestra para estudios ecolgicos y fisiolgicos. 6. Determinar segn las tcnicas de aislamiento, el nmero de especies aisladas en comparacin al nmero observado al inicio de la presente actividad prctica. I: Colecta de muestras La metodologa para proceder al aislamiento y cultivo de bacterias fotosintticas, cianobacterias y microalgas, conlleva a la seleccin previa de sitios de muestreos con la finalidad de dar inicio al procesamiento de muestras, bien sea, tomadas de cuerpos de aguas, sedimentos costeros o de lagunas, suelos e inclusive de ambientes extremfilos. Entre los hbitats que podemos tomar en cuenta para tales actividades son las siguientes: I.1-Sitios a ser considerados para muestreos: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Ambientes hipersalinos: lagunas saladas, salmueras. Humedales naturales o artificiales. Ros, lagos, costas marinas, pozos de agua, lagunas, charcos temporales. Ambientes termfilos. Suelos inundados, arrozales, manglares. Superficies rocosas, de concreto, vidrio, pintura. Lechos de tuberas, alcantarillados, escorrentas. Aguas residuales urbanas, industriales, agropecuarias, caseras Embalses, reservorios, tanques de agua para consumo humano Lagunas destinas a actividades de acuicultura.

I.2.-Materiales necesarios para la colecta de muestras: a.-Frascos de vidrio con tapa de diferentes tamao. b.-Esptulas de diferentes tamao. c.-Red de fitoplancton (colecta de volmenes de agua en lagunas, embalses). d.-Guantes e.-Botella o envase con agua potable. f.-Marcador de vidrio g.-balde o recipiente (colecta de agua a orillas de cuerpos de aguas).

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DEPARTAMENTO: CIENCIAS DE LA VIDA ASIGNATURA: ALGAS EN BIOTECNOLOGA h.-Bolsas plsticas (muestras de microalgas filamentosas o de cianobacterias sobre sedimentos). i.-Envase de poliestireno (traslado y preservacin de muestras). j.-pHmetro y termmetro ambientales. I.3.- Materiales para procesamiento de muestras: a.- Cajas Petri b.-Pipetas Pasteur plsticas y de vidrio. c.-Medios de cultivos para microalgas y cianobacterias (BG11, ALGAL, BBM, Fertilizante foliar) d.-Microscopio, cubreobjeto y portaobjeto. e.-Lmpara fluorescente. f.-Tubos de ensayo con tapa y gradilla. g.-Cilindro graduado de 100, 250 y 500ml. h.-Papel filtro.

II: Procesamiento de las muestras: Una vez colectadas las muestras y trasladadas al laboratorio se procede a colocarla bajo iluminacin y posteriormente observar al microscopio la presencia de los microorganismos para ese momento. En este caso se debe elaborar un registro de las mismas, tanto de las identificadas como de las desconocidas. Posteriormente, se recomienda distribuir la muestra, bien sea de agua, sedimentos, lodos o suelos a cajas Petri, o frascos pequeos de vidrio para adicionarles medios de cultivos diludos (entre 10 a 50%) y dejar otras muestras sin nutrientes. Cuando se observan abundante euglenofitas, cianobacterias con heterocistos o bacterias fotosintticas, se recomienda utilizar medios de cultivos selectivos para estos grupos a fin de proceder a su aislamiento lo ms pronto. Para aquellas muestras con presencia de depredadores de microorganismos fotosintticos de tamao mayor de las microalgas, se recomienda eliminarlos mediante filtrado a travs de un tamiz con una luz de malla apropiada y proceder al aislamiento en un corto perodo de tiempo. Para el estudio de variacin de la poblacin de microalgas y de cianobacterias en funcin del tiempo y de acuerdo a las condiciones establecidas de iluminacin, fotoperiodo, nutrientes y temperatura; se procede a cubrir informacin para cada muestra inicial y luego segn el tipo de medio de cultivo aadido a cada submuestra en caja Petri, tubo de ensayo o frasco y de acuerdo a los siguientes ejemplos de una Tabla (1) para informacin inicial de cada muestra y de otra Tabla (2) de registro de presencia de microalgas y cianobacterias, segn medio de cultivo utilizado en funcin del tiempo.

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DEPARTAMENTO: CIENCIAS DE LA VIDA ASIGNATURA: ALGAS EN BIOTECNOLOGA De igual manera se presenta la Tabla 3, correspondiente a valorar las microalgas o cianobacterias que puedan predominar segn las condiciones de mantenimiento en el laboratorio: Tabla 1: Informacin inicial de cada muestra colectada: Nmero o cdigo de cada Muestra/Fecha 1 2 3 4 5 6 7 8 Variables Procedencia Tipo de muestra color olor pH Temperatura Volumen/peso Microalgas Cianobacterias Protozooarios

Tabla 2: Microorganismos fotosintticos en submuestras, medio de cultivo y fecha de observacin. Muestra Caja Petri/frasco/Tubo de ensayo N/ cdigo Con o sin medio de cultivo: BG11/ALGAL/Fertilizante/Bristol/BBM, etc Fecha de observacin Fecha: Fecha: Fecha: Fecha: Fecha: Fecha: 1 2 3 4

Fecha:

Tabla 3: Orden de abundancia, segn muestra, medio de cultivo y tiempo de incubacin. Muestra Caja Petri/frasco/Tubo de ensayo N/ cdigo Con o sin medio de cultivo: BG11/ALGAL/Fertilizante/Bristol/BBM, etc 0 da 5 das 10 das 15 das 20 das 25 das 30 das 1 C1>C2>C3 C3>C5>C8 C2>C4>C5 2 C4>C2>C3 3 4 Nota: registrar el nmero de cepas (C1, C2, C3.) y la abundancia estimada en cada tiempo de observacin. No todas las taxas que se presentan al inicio del monitoreo sern observadas durante todo el perodo de observacin.

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DEPARTAMENTO: CIENCIAS DE LA VIDA ASIGNATURA: ALGAS EN BIOTECNOLOGA III: Aislamiento La finalidad de aislar microalgas es la de obtener cultivos monoespecficos o monoalgales (cuando se trata de una sola especie o un solo tipo de microalga o cianobacteria). Para el caso de los cultivos monoclonales es cuando se obtienen cultivos monoespecficos a partir de una clula, filamento, hormogonio, acineto o quiste). Es de indicar que ambos tipos de cultivos contienen bacterias asociadas a estas cepas aisladas y que le son beneficiosas, en virtud de que muchas de ellas establecen una relacin de simbiosis o de interaccin positiva con la microalga o cianobacteria. Los mtodos de aislamiento dependern de las dimensiones, movilidad y morfologa; siendo los ms utilizados el de la micropipeta, placas de agar, diluciones sucesivas y el uso de medios de cultivos selectivos. No obstante, es recomendable combinar dos o ms de estas tcnicas, para una mayor eficiencia y obtencin ms rpida del microorganismo aislado. En muchas ocasiones existen una interaccin muy significativa entre dos o ms microalgas o entre cianobacterias; lo cual ocasiona inversin de tiempo y de estrategias para poder lograr la separacin entre las cepas. Pero, el uso simultneo de tcnicas de aislamiento y de medios selectivos puede contribuir al xito en cuanto al aislamiento. En este caso, si las cepas van a ser utilizadas para estudios de fertilizacin de suelos, uso de consorcios en biorremediacin, se pueden mantener dichos consorcios y en funcin de las condiciones de cultivos se podr evidenciar la competencia, dominio o en algunos casos aislamiento de algunos de las cepas fuertemente asociadas. En todos los casos, los aislamientos se realizan verificando los resultados de la secuencia de operaciones con la ayuda de un microscopio. a.- Aislamiento con pipeta: Este mtodo se utiliza para separar microalgas mayores a 10 m de dimetro en f orma de quistes, clulas vegetativas, dinoflagelados, formas coloniales o filamentosas (Hoshaw y Rosowski, 1973; Matsuoka y Fukuyo, 2000; Andersen y Kawachi, 2005). El mtodo consiste en aislar una microalga con la ayuda de una pipeta Pasteur con punta reducida y/o con un capilar. Una gota que proviene de una muestra de fitoplancton se coloca en un portaobjeto (laminilla) y se observa al microscopio, bajo el cual las clulas de inters se succionan por capilaridad en la micropipeta y se transfieren a un portaobjetos limpio o a una lmina excavada con una gota de agua de mar estril. El procedimiento se repite, lavando la clula en medio o agua estril hasta cuando no se observan contaminantes y la gota contiene un solo tipo de clulas, que requiere generalmente al menos cinco transferencias sucesivas.

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DEPARTAMENTO: CIENCIAS DE LA VIDA ASIGNATURA: ALGAS EN BIOTECNOLOGA Una vez realizadas las transferencias, la clula aislada se puede colocar en una placa con pocillos mltiples o en un tubo de ensaye con 2 - 5 mL de medio de cultivo estril. Esta tcnica se recomienda para microorganismos que no sean sensibles a la manipulacin. b.- Diluciones seriadas: Este mtodo se utiliza cuando la microalga que se desea aislar tiene un tamao inferior a 10 m de dimetro y es muy til para aislar las especies que son ms abundantes en la muestra (Guillard, 1973; Andersen y Kawachi, 2005). Antes de iniciar las operaciones de aislamiento, es necesario estimar la concentracin celular de la especie de inters, con el fin de calcular el nmero de diluciones necesario para reducir la concentracin a unas pocas clulas/mL. Generalmente se toma 1 mL de la muestra original y se agrega a un tubo de ensayo que contiene 9 mL de medio de cultivo estril. El nmero de diluciones depender de la densidad celular de la microalga o del nmero de filamentos de cianobacterias, si es el caso, que contenga la muestra que se desea aislar y el intervalo de dilucin que se utiliza normalmente es de 10-3 a 10-6, dependiendo de la densidad poblacional. Cuando las poblaciones son bajas, se recomienda utilizar placas con pocillos mltiples con capacidad de 250 L, y diluciones sucesivas de 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000. Las transferencias se van realizando en cada una de las diluciones, y al mismo tiempo se pueden ir observando los resultados en el microscopio invertido y/o estereoscopio. c.-Aislamiento en medio slido: Esta tcnica es una de las ms utilizadas desde el inicio del proceso de aislamiento porque permite la separacin gradual de especies, bien sean unicelulares o filamentosas. Es decir, se irn reaislando a medida que se van pasando a otros medios con agar. Este mtodo tambin se emplea para purificar cultivos contaminados con otros microorganismos. No todas las especies se pueden mantener en medio slido, especialmente especies flageladas y algunas diatomeas, pero esta tcnica suele dar buenos resultados con especies bentnicas, clorofitas y cianobacterias. Procedimiento: 1.- El agar a una relacin de 1.5-2.0 % (w/v) disuelto en el medio nutritivo, para microalgas (ALGAL, F/2, BRISTOL, fertilizante, BBM) o para cianobacterias (BG11o para las fijadoras de nitrgeno o BG11 completo para las no fijadoras). 2.-Se inoculan una o dos gotas, en las cajas con medio slido, que se esparcen con un asa para bacteriologa o con una varilla de vidrio doblada, previamente esterilizadas.

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3.- La caja se cubre con su tapa, se le recubre con una cinta de parafilm, se invierte y se coloca en un ambiente con temperatura y luz controladas. 4.-Se incuba durante unas semana o ms, dependiendo de la velocidad de crecimiento del microorganismo y de las condiciones ambientales. 5.-Posteriormente se observa al microscopio invertido y/o estereoscopio y con la ayuda del asa se seleccionan las colonias libres de otros microorganismos, que se transfieren a otra caja de Petri. 6.- Pueden transferirse a medios lquidos en subcultivos sucesivos para su purificacin, de tal manera que en cada dilucin se reduzca el nmero de organismos en una gota. Esta tcnica es recomendable combinarla con la de diluciones y con la de transferencia en placa de agar o tubo inclinado para obtener cultivos clonales (a partir de una sola colonia o clula) y poder establecer el cultivo monoespecfico. 7.-Esta tarea se realiza las veces que sea necesario hasta asegurar el xito del aislamiento de un solo tipo de microalga y para lograrlo con mayor seguridad se recomienda utilizar esta tcnica en combinacin con la de diluciones seriadas que se indic anteriormente. IV: Mtodos de Purificacin de Microorganismos fotosintticos previamente aislados. Estos mtodos se utilizan para eliminar o por lo menos diluir otros microorganismosgeneralmente bacterias, presentes en la muestra o en las cepas ya aisladas. La forma ms sencilla es mediante la separacin de las clulas algales y de las bacterias por medio de centrifugacin. Es recomendable probar este mtodo antes de utilizar otras tcnicas, que son ms susceptibles de causar daos celulares. 1.- Lavado por centrifugacin: Se llena un tubo estril con un cultivo en crecimiento exponencial. Se centrifuga a 2000rpm/45-90 seg. El tiempo y la velocidad de centrifugacin pueden variar dependiendo de la especie y del organismo contaminante. La centrifugacin debe permitir que sedimente una parte de las clulas ms pesadas (microalgas). Mientras que, las clulas de menor peso (bacterias) permanecen en suspensin (Guillard, 2005). Se elimina el sobrenadante y las algas se resuspenden en agua o medio estril. 2.-Uso de Antibiticos: Se han utilizado varios antibiticos y mezclas de ellos para la purificacin de cultivos algales (Tabla 4). Se sugiere probar diferentes concentraciones con el fin de verificar cual es la concentracin mnima efectiva, ya que tambin las microalgas y cianobacterias, pueden resultar susceptibles a este tipo de tratamiento. Despus de incubar los cultivos entre 24 a 48 h, bajo condiciones

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DEPARTAMENTO: CIENCIAS DE LA VIDA ASIGNATURA: ALGAS EN BIOTECNOLOGA adecuadas, se transfiere aspticamente a medio de cultivo estril y sin antibiticos y se observan los cultivos. Tabla 4. Antibiticos para purificacin de cultivos de microalgas. ANTIBITICOS mg/ L MICROALGAS REFERENCIAS Penicilina G Sulfato de dihidrostreptomicina Sulfato de gentamicina Eritromicina Neomicina 100 25 25 Tolerado por varias especies Guillard, 2005

700 5

Penicilina

0.1 2.0

Chlorella Chlamydomonas Nostoc Scenedesmus Anabaena variabilis Microcystis A. variabilis Chlamydomonas Nitzschia

Tomisek et al., 1957 Foter et al., 1953

Estreptomicina

Penicilina Estreptomicina G Penicilina Estreptomicina

0.1 10 2-4 47 23 0.166 0.050

Galloway y Kraus, 1959 Palmer y Maloney, 1955 Galloway y Kraus, 1959 Foter et al., 1953 Leal, 1990

Castellvi, 1971

3.-Ejemplo de aislamiento y separacin de microorganismos hetertrofos y fotosintticos empleando diferentes mtodos, tales como, antibiticos, centrifugacin, lisis osmtica y radiacin UV. Caso: Separacin de bacterias halofticas, cianobacterias y de la microalga Dunaliella sp., a partir de una muestra de agua colectada en una laguna hipersalina. Este ejemplo ilustra el uso de diferentes mtodos de aislamiento cuando en una muestra con una diversidad microbiana, se requiere obtener cada una de las cepas aisladas para estudios posteriores. En este caso a partir de un consorcio conformado por las cianobacterias: Aphanothece halophytica, Spirulina subsalsa; la microalga, Dunaliella y las bacterias halofticas: Halobacterium halobium, Halobacterium spp., Stephanoptera gracilies y Vibrio spp.

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4.- Axenizacin sin uso de antibiticos: En muchos casos la separacin de las bacterias asociadas a las microalgas o cianobacterias, no ameritan uso de antibitico, sino mediante procesos de aislamiento sucesivos en agar hasta comprobar su axenizacin. Una vez que la cepa este axenizada es inoculada en un medio organotrfico (Cid y col., 1992) conformado por: extracto de levadura (5.0 g/L), peptona (1.25 g/L) y glucosa (2.5 g/L). Esta prueba es rigurosa porque si hay presencia de bacterias, el medio se torna turbio como signo de crecimiento bacteriano y por lo tanto, las cepas que han sido axenizadas de microalgas, podrn mantenerse en dicho medio de una manera permanente. 5.-Uso de cicloheximida para aislar cianobacterias a partir de cultivos con presencia de eucariotas como protozooarios, El uso de este inhibidor consiste en causar efecto letal de todos los organismos eucariotas presentes en la muestra, a fin de mantener solo a las cianobacterias, en este caso. Su uso se recomienda a una concentracin de 100/L y debe manipularse con sumo cuidado por tener propiedades cancergenas. V: Resultados obtenidos con los diferentes mtodos de aislamiento.

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DEPARTAMENTO: CIENCIAS DE LA VIDA ASIGNATURA: ALGAS EN BIOTECNOLOGA Las estrategias de aislamiento a tomar en cuenta y a partir de las muestras procesadas dependern del grado de adaptacin, medios de cultivos genricos y selectivos utilizados, del crecimiento obtenido en medios slidos y del cumplimiento de los mtodos a seguir para obtener xito en el proceso de aislamiento. Al final de las actividades de laboratorio relacionadas con las tcnicas de aislamiento el estudiante debe registrar en una tabla de resultados (Tabla 5), los taxas de microorganismos observados al inicio de la fase de procesamiento de las muestras y comparar con los microorganismos aislados al culminar con los objetivos planteados en la prctica de aislamiento. En virtud de que no todas las microalgas y cianobacterias son fcilmente aisladas mediante las tcnicas utilizadas, tambin se registraran consorcios en los cuales permanecen fuertemente asociados microalga-microalga, microalga-cianobacteria o cianobacterias-cianobacteria. Tabla 5: Registro definitivo de microorganismos fotosintticos aislados. Muestra MOF observados MOF aislados en MOF (Nmero/cdigo) al inicio medio lquido aislados en (fecha) (fecha) medio slido (fecha)

MOF asociados en consorcios (fecha)

Referencias:
ABALDE, J., Cid, A., Fidalgo, P., Torres, E. y Herrero, C. (1995). Microalgas: Cultivo y Aplicaciones. Universidade da Corua. 210 pag. ALVAREZ,H. 1994. Folleto de Algas. CAPITULO III. Introduccin al Mtodo Ficolgi-co. Escuela Superior Politcnica del Litoral, Ecuador Band, C. 2000. Captulo 1: Aislamiento, purificacin y mantenimiento de cepasde microalgas. Mtodos y herramientas analticas en la evaluacin de la biomasa microalgal. Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste de Mxico-CIBNOR. GUILLARD, R.R.L. (2005). Purification Methods for Microalgae. En: Algal Culturing Techniques. Andersen, R.E. (ed.), Elsevier Academic Press, China, 117-132 pp. HOSHAW, R.W. y Rosowski, J.R. (1973). Methods for Microscopic Algae. En: Handbookof Phycological Methods: Culture Methods and Growth Measurements. Stein, J.R. (ed.), Cambridge University Press, UK, 5368 pp. GONZLEZ, M.A., Parra, O.O. y Cifuentes, A.S. (1995). Tcnicas de Cultivo de Microalgas en Laboratorio. En: Manual de Mtodos Ficolgicos. Alveal, K., Ferrario, M.E., Oliveira, E.C. y Sar, E. (eds.), Universidad de Concepcin, Chile. 219-250 pgs. STEIN, J.R. (ed.) (1973). Handbook of Phycological Methods: Culture Methods and Growth Measurements. Cambridge University Press, UK, 448 pp.