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Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 37
Entrevista
Biotecnologia: modernas tcnicas de engenharia gentica unem setores em prol do desenvolvimento nacional
Fernanda Diniz
Jornalista
Plantas e animais transgnicos utilizados como biofbricas agregam valor a diversos produtos e integram vrios setores de produo
Teias de aranha produzidas em laboratrio, vacas que produzem medicamentos no leite e plantas de soja usadas na luta contra a AIDS poderiam at parecer filme de fico cientfica h alguns anos. Mas hoje representam uma realidade bem mais prxima do que se pode imaginar, pois esto sendo desenvolvidas dentro de laboratrios brasileiros. Mais especificamente na Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, uma das 41 unidades de pesquisa da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Embrapa, em Braslia, DF. Um dos responsveis por tudo isso o engenheiro agrnomo Elbio Rech, que desde o incio da dcada de 80, aposta nas tcnicas de engenharia gentica como solues para problemas que afetam a agropecuria brasileira, como por exemplo, pragas, doenas e estresses ambientais. Mas a biotecnologia um caminho amplo e promissor e, com o tempo e o domnio das tcnicas de transformao gentica de plantas, Rech e sua equipe foram descobrindo que possvel ainda ir muito alm dessas expectativas, e com a participao de parceiros nacionais e internacionais, inmeras bifurcaes foram se abrindo nesse percurso. O domnio das tcnicas em biotecnologia mostrou, ento, que as solues podem beneficiar tambm os setores de sade, indstria e alimentao, alm de agregar valor aos produtos agropecurios, unindo o agronegcio ao setor farmacutico e a indstria, por exemplo. E para aqueles que ainda se assustam com a palavra transgenia, importante frisar que essa tecnologia nada mais do que uma ferramenta de melhoramento gentico mais avanada, j que transpe barreiras e permite o cruzamento entre diferentes espcies vegetais, animais e de microrganismos. E mais: todas essas inovaes tecnolgicas no so captulos de filmes de fico ou de super heris, mas sim produto dos avanos conquistados por pesquisadores genuinamente brasileiros. Para conhecer melhor as importantes pesquisas biotecnolgicas que esto sendo desenvolvidas na Embrapa-Genargen, e suas aplicaes para os diversos setores da sociedade brasileira, a revista Biotecnologia, Cincia & Desenvolvimento entrevistou o pesquisador Elbio Rech, que falou sobre os principais resultados que o Brasil vem alcanando nesse fascinante campo da cincia. Confiram:
BC&D Como o senhor avalia a posio do Brasil hoje em dia, na rea de biotecnologia vegetal, em relao ao cenrio mundial? Rech Em termos de tecnologia e de nvel de especializao dos cientistas, o Brasil no deixa nada a dever aos pases de Primeiro Mundo. Infelizmente por causa de questes ideolgicas e jurdicas, que durante alguns anos prejudicaram o andamento das pesquisas em biotecnologia, ainda no temos muitos produtos resultantes dessas tcnicas no mercado hoje. Mas, agora, com a retomada das pesquisas e com a maior confiana da sociedade, as pesquisas esto avanando muito bem e os resultados so promissores. A Embrapa j tm vrias plantas transgnicas sendo testadas no campo, dentro das condies exigidas pela Lei de Biossegurana e que, em breve, sero oferecidas aos produtores e consumidores brasileiros. BC&D Quais so essas plantas e que benefcios podem trazer para a sociedade? Rech Primeiro, gostaria de destacar o feijo transgnico resistente ao vrus do mosaico dourado, projeto coordenado pelos pesquisadores Francisco Arago e Josias Faria, que a pior ameaa para essa cultura hoje no Brasil. As plantas j esto sendo testadas com bons resultados em outra unidade da Embrapa, a Embrapa Arroz e Feijo, em Goinia, e quando chegarem ao mercado sero os primeiros produtos transgnicos totalmente desenvolvidos por instituies pblicas de pesquisa. O vrus do mosaico dourado o pior inimigo do feijoeiro na Amrica do Sul. No Brasil, a doena est presente em todas as regies e, se atingir a plantao ainda na fase inicial pode causar perdas de at 100% na produo. As plantas que esto sendo testadas no campo foram modificadas geneticamente por uma nova estratgia de transformao de feijo, atravs da interferncia de RNA. A grande vantagem dessa nova tcnica que no h introduo de protenas nas plantas, o que exclue a necessidade de realizao de testes de alergenicidade e toxicologia. Alm disso, a tecnologia de
RNA pode causar resistncia de mltiplos espectros, tornando a planta resistente a outros vrus que atacam o feijo e a vrias estirpes do mesmo vrus. BC&D E as outras plantas? Rech Temos tambm plantas transgnicas de batata, coordenado pelos pesquisadores Eduardo Romano, Damares de Castro e Andr Dusi, e de mamo, coordenado por Manoel Tei-
xeira, sendo testadas no campo, tambm para resistncia a viroses. As variedades transgnicas de batata so resistentes aos vrus Y (PVY) e PLRV, ou vrus do enrolamento das folhas, como so mais conhecidos. Elas foram desenvolvidas em parceria entre a Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, Embrapa Hortalias, Universidade Federal de Pelotas, o Instituto de Ingeniera Gentica Y Biotecnologia (INGEBI Argentina), e o Centro Brasileiro-Argentino de Biotecnologia. Diferenas parte, j que o primeiro vrus causa o enrugamento das folhas e mosaico e o segundo o enrolamento, como j diz o nome, ambos tm como sintomas a reduo do porte da planta e do tamanho das folhas e, quando esto juntos, so capazes de cau-
sar 100% de perdas na produo. As plantas foram transformadas pela introduo do gene da capa protica do vrus Y nas variedades de batata, de modo a torn-las resistentes. Grosso modo, essa tcnica pode ser comparada a uma espcie de vacina gentica. Essas plantas j esto sendo testadas no campo da Embrapa Hortalias, unidade da Embrapa, tambm localizada aqui em Braslia. J as plantas transgnicas de mamo foram desenvolvidas em parceria entre a Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia e a Embrapa Mandioca e Fruticultura para resistncia ao vrus da mancha anelar. Esse vrus o pior inimigo da cultura de mamo em nvel mundial. Alm de reduzir o tamanho das folhas, ele diminui tambm a capacidade de fotossntese das plantas, levando reduo de seu crescimento e, conseqentemente, a perdas significativas na produo. No Brasil, o vrus da mancha anelar vem comprometendo seriamente a produo de mamo, especialmente das variedades mais consumidas em nvel mundial: papaya e formosa, j que atinge as duas principais regies produtoras do pas: sul da Bahia e norte do Esprito Santo, responsveis por 80% da produo nacional. As plantas foram transformadas pela introduo do gene da capa protica do prprio vrus, como foi feito com a batata, e j esto sendo testadas no campo da Embrapa Mandioca e Fruticultura, em Cruz das Almas, na Bahia. BC&D Alm de resistncia a pragas e doenas agrcolas, que outros benefcios as plantas transgnicas podem trazer para a cincia e a sociedade brasileira? Rech Sem dvida nenhuma, uma das principais aplicaes para as plantas transgnicas a sua utilizao como biofbricas para a produo de medicamentos. BC&D E que pesquisas o senhor destacaria nessa rea, hoje em dia, aqui no Brasil? Rech Em primeiro lugar, gostaria de destacar a pesquisa que visa desenBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 37 3
volver plantas e animais transgnicos capazes de produzir o Fator IX, uma protena responsvel pela coagulao do sangue. Os hemoflicos no produzem essa protena e, por isso, quando se machucam, tm velocidade de coagulao muito mais lenta e so muito mais suscetveis a hemorragias. Essa pesquisa est sendo desenvolvida em parceria entre a Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, Universidade de Braslia UnB, Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de So Paulo Unifesp/EPM e o Hospital de Apoio ao Hemoflico de Braslia e pode representar uma esperana de melhor qualidade de vida para os portadores dessa doena. A pesquisa tem como objetivo utilizar plantas de soja e animais como biofbricas para produo do Fator IX em larga escala e custo mais reduzido. Atualmente, os hemoflicos controlam a ausncia do Fator IX com medicamentos, mas se a pesquisa da Embrapa der certo, daqui a aproximadamente 10 anos, eles podero contar com produtos muito mais baratos, j que sero produzidos diretamente no leite dos animais ou em plantas de soja. A pesquisa com animais a que est em fase mais avanada. At o momento est sendo realizada com camundongos, como modelo para experimentos cientficos, mas o objetivo desenvolver vacas transgnicas que produzam o fator IX diretamente no leite. importante lembrar que esse produto no ser disponibilizado sociedade como alimento e sim como medicamento, j que tem que ser tomado nas doses e quantidades corretas. Mesmo assim, ser muito mais acessvel e barato, pois o objetivo produzi-lo em sistemas que utilizam plantas e animais. Existem evidncias de que a utilizao de plantas e animais transgnicos como biofbricas poder reduzir os custos de produo de protenas recombinantes em at 50 vezes. As plantas de soja contendo o fator IX j foram transformadas geneticamente, mas ainda no foram testadas. O leite dos camundongos transgnicos contendo fator IX j est sendo avaliado pela equipe da Dra. Jussara Almeida, coordenadora do Centro de Tratamento de Coagulopatia do Hos4
pital de Apoio de Braslia, com o mesmo equipamento utilizado para testar os medicamentos existentes no mercado, e os resultados tm sido positivos. O prximo passo testar o leite no sangue de pacientes portadores de hemofilia para avaliar o efeito de coagulao e compara-lo aos produtos comercializados hoje. BC&D E quando o senhor acredita que essa tecnologia chegar ao mercado?
Sem dvida nenhuma, uma das principais aplicaes para as plantas transgnicas a sua utilizao como biofbricas para a produo de medicamentos.
Rech Atualmente existe a expectativa de que a gerao de animais transgnicos de mdio (cabras) ou grande porte (bezerras) sejam desenvolvidas no pas nos prximos anos. Mas o que importante enfatizar que o domnio dessa tecnologia representa uma esperana no apenas para os hemoflicos, mas para a sociedade de forma geral. J esto sendo desenvolvidas tambm plantas de soja com anticorpos anticncer de mama, que vo auxiliar na preveno e diagnstico dessa doena; alface com gene para combater a diarria infantil e soja com gene do hormnio de crescimento. E isso apenas o comeo, j que a utilizao de plantas e animais como biofbricas uma plataforma tecnolgica que vai permitir expressar muitas molculas de alto valor agregado.
Alm de se constituir em um importante instrumento para a produo de frmacos que podero ser usados na preveno e cura de inmeras doenas que afligem a humanidade, essa tecnologia poder ser muito importante tambm para o estudo de funes de molculas oriundas da biodiversidade brasileira. Aqui na Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, desenvolvido um trabalho sistemtico de coleta de genes da nossa fauna e flora e muitos desses genes possuem bom potencial de utilizao nas reas de agricultura e sade, por exemplo, por suas propriedades medicinais. A tecnologia permitir descobrir as funes desses genes com maior rapidez e eficincia. A tecnologia de utilizao de biofbricas para produo de frmacos valoriza ainda mais o agronegcio brasileiro, j que permite a agregao de valor a produtos agropecurios, como plantas e animais. Alm disso, favorece a integrao entre o mercado agrcola e o setor farmacutico e quem mais ganha com isso a populao brasileira, que vai poder contar com produtos mais econmicos e saudveis. BC&D - O senhor falou de outros benefcios para a rea de sade, como o cncer de mama, que a maior causa de mortalidade atual da populao feminina no Brasil. Poderia explicar melhor essa pesquisa? Rech Essa pesquisa est sendo desenvolvida pela Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, em parceria com a Universidade de Campinas (Unicamp); a Universidade de Braslia (UnB) e a Universidade de Montevidu, no Uruguai, e tem como objetivo desenvolver variedades de soja transgnica com anticorpos anticncer contra o cncer de mama. Essas variedades sero utilizadas para produo de frmacos que atuaro na preveno e diagnstico da doena e tero tambm potencial teraputico, mesmo com o cncer em estgio avanado. importante salientar mais uma vez que elas no sero usadas na cadeia alimentar, mas apenas como me-
dicamentos. Os anticorpos monoclonais para uso clnico movimentam mais de US$ 1 bilho nos EUA. No Brasil, a utilizao desses anticorpos na rea mdica ainda pequena. O principal anticorpo monoclonal usado clinicamente o anti-CD3, que atua na preveno da rejeio decorrente de transplantes de rgos. O Instituto Butant, de So Paulo, produz e distribui esse medicamento no Brasil. Os mtodos e estratgias para produo de novos anticorpos evoluram, incorporando a manipulao gentica, e a flexibilidade nessa manipulao fez desses anticorpos produtos de alto valor econmico e com grandes perspectivas de utilizao, especialmente para a preveno e tratamento de algumas enfermidades. BC&D - Que outras doenas esto na mira das instituies brasileiras de pesquisa a partir de tcnicas biotecnolgicas? Rech Estamos obtendo resultados interessantssimos com tcnicas biotecnolgicas para combater uma das doenas que mais aflige a sociedade atual, a AIDS. Essa mais uma prova de que a tecnologia dos transgnicos no usada apenas para aumentar a produtividade das lavouras. Organismos geneticamente modificados j so amplamente utilizados em vacinas humanas e, no momento, estamos avanando rapidamente no uso desses organismos para combater a AIDS. A pesquisa ainda est em fase de testes e se baseia na introduo da cianovirina (protena presente em algas) em plantas de soja, milho e tabaco para a sua produo em larga escala. Esta protena capaz de impedir a multiplicao do vrus no corpo humano. Os estudos esto sendo desenvolvidos em consrcio com a participao do Instituto Nacional de Sade dos Estados Unidos, Universidade de Londres (Inglaterra), Embrapa e um grupo sul-africano. A inteno produzir o produto em gel (com propriedades germicidas) para que as mulheres apliquem na vagina antes do relacionamento sexual. um mtodo paliativo at que a va-
cina contra essa doena esteja pronta. As estratgias adicionais so importantes aliadas no combate AIDS. Entre essas, destaca-se o uso de preservativos que tem demonstrado grande eficcia na preveno da transmisso do HIV. Entretanto, preservativos continuam a ser controlados quase que exclusivamente pelo parceiro masculino e em muitas sociedades a mulher no pode negociar a utilizao do preservativo. Por isso, um mtodo de preveno feito exclusivamente para o uso feminino altamente desejvel. Tambm j sabemos que os sistemas de plantas transgnicas oferecerem muitas vantagens para a produo de cianovirina que pode ser largamente escalonada at a quantidade adequada. Aliado a esse fato est o benefcio do baixo custo do investimento requerido. Sementes de soja, milho e tabaco so candidatos potencialmente interessantes como biorreatores, mas por enquanto ainda no sabemos qual das trs espcies produz o maior teor de protenas pelo menor custo. Somente o desenvolvimento das pesquisas poder indicar o melhor caminho. BC&D Voltando a um ponto levantado pelo senhor, que a questo da coleta de genes na biodiversidade brasileira: isso significa que muitas respostas para desafios atuais podem estar no estudo gentico das enormes potencialidades da flora e da fauna brasileira. Para encerrar nossa entrevista, gostaria que nos falasse um pouco mais sobre esse assunto. Rech Sem dvida. A biotecnologia e a biodiversidade andam de mos dadas em prol da cincia e do progresso no Brasil. Um exemplo claro disso uma pesquisa que comeou com a coleta de aranhas da biodiversidade brasileira e que hoje est em fase avanada e pode beneficiar diversos setores da indstria. A manipulao das protenas encontradas nas teias de espcies de aranhas da biodiversidade brasileira coletadas em trs diferentes biomas: mata atlntica, Amaznia e cerrado mostrou que a fibra da teia de aranha um dos fios mais resistentes e flexveis da natureza, capaz de agentar o
peso da prpria aranha a 80 quilmetros de altura. De posse desse conhecimento, a Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, a Universidade de So Paulo (USP) e o Instituto Butant se uniram para isolar os genes dessas aranhas e investir em tcnicas de engenharia gentica que permitam aproveitar essas caractersticas em prol do desenvolvimento industrial . A pesquisa envolve vrias etapas e a primeira consistiu no isolamento dos genes de interesse dessas aranhas para depois, em uma segunda fase, transferi-los para plantas de algodo visando produo de fios mais resistentes. O objetivo conseguir que a protena da teia de aranha seja incorporada fibra do algodo, tornando-a mais resistente. Os avanos da indstria txtil levaram ao desenvolvimento de mquinas muito rpidas, eos fios do algodo no resistem a essa rapidez e se quebram. Por isso, so necessrios fios mais resistentes e, acima de tudo, mais flexveis, e o que interessa de fato indstria conseguir reunir resistncia e flexibilidade. O novo tecido, resultante do desenvolvimento dessa pesquisa, pode ter aplicao direta para a confeco de roupas esportivas e equipamentos de segurana, por exemplo. Por isso, despertou o interesse do Ministrio da Defesa e hoje o Centro de Tecnologia do Exrcito brasileiro um dos parceiros no desenvolvimento dos estudos, alm da Universidade de Wyoming (EUA). Mas a transferncia de genes para plantas de algodo apenas uma das aplicaes para essa tecnologia. Pretendemos tambm desenvolver plantas de soja transgnicas com genes das aranhas e utilizar animais como biofbricas para produo do polmero no leite. Em 2007, conseguimos desenvolver as primeiras protenas das teias em laboratrio nas folhas e sementes de soja. Estamos tentando tambm produzi-las no leite de animais transgnicos, para avaliar qual sistema transgnico ser mais eficiente para a produo em larga escala e custo mais reduzido dos biopolmeros. Alm de resultar em inmeras aplicaes e benefcios para o desenvolvimento de diversos setores da economia brasileira, o fato de os estudos serem baseados em aranhas brasileiras permite agregar valor nossa biodiversidade, o que muito positivo.
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Colaboraram nesta edio:
Adelaide Maria de Souza Antunes Adriana Campos Moreira Brito Alexander Machado Cardoso Aline da Silva Turque Antonio Amilton Chaves Antonio Baslio de Miranda Boutros Fouad Sarrouh Cynthia Barbosa da Silveira
BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento KL3 Publicaes Ltda. Fundador Henrique da Silva Castro Direo Geral e Edio Ana Lcia de Almeida E-mail biotecnologia@biotecnologia.com.br Portal www.biotecnologia.com.br Departamento Comercial, Redao e Edio:
Elbio Rech Ftima de Carvalho Guilherme Muricy Hlia Harumi Sato Juan Daniel Rivaldi Luciana Francisco Fleuri Marcos Catanho Maria Rosa Machado Prado Maysa Mandeta Clementino Orlando Bonifcio Martins Paola Gomes Passaglia Queli Cruz Bastos Ricardo Pilz Vieira Roberta Mrcia Marques dos Santos Rodolfo Fiorilo Rogrio Saad Vaz Slvia Ligrio Fialho Silvio Silvrio da Silva
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Vadim R. Viviani
Os artigos assinados so de inteira responsabilidade de seus autores. ISSN 1414-6347 Nota: A Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento indexada na AGROBASE (Base Nacional de Dados da Agricultura Brasileira) BINAGRI - Biblioteca Nacional de Agricultura - MAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento.), no AGRIS (International Information system for the Agricultural Sciences and Technology) da FAO e atende a obrigatoriedade de Depsito Legal na Biblioteca Nacional do Rio de janeiro- Fundao Biblioteca Nacional.
Conselho Cientfico
Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Dr. Aluzio Borm - Gentica e Melhoramento Vegetal Ivan Rud de Moraes - Sade - Toxicologia; Joo de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal; Maao Tadano - Agricultura; Naftale Katz - Sade; Pedro Jurberg - Cincias; Srgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Gentica de Microorganismos; William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi Dr. Lus Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia Fundao Dalmo Catauli Giacometti Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Gentica; Dr. Jos Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biolgico; Dra. Marisa de Goes - Recursos Genticos Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares - IPEN Dr. Jos Roberto Rogero Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA Dr. Digenes Santiago Santos - UFRGS Dr. Jos Luiz Lima Filho - UFPE Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ
ENTREVIST A ENTREVISTA ELBIO RECH PESQUISA LUCIFERASES DE VAGALUMES ANLISE COMPARATIVA DE GENOMAS PROCARITICOS SEXAGEM DE EMBRIES BOVINOS BIOTECNOLOGIA NA INDSTRIA FARMACUTICA -1,3 GLUCANASE GLICEROL DE BIODIESEL NANOPARTCULAS PATENTES DE COMPOSTOS QUMICO-FARMACUTICOS MICRORGANISMOS ASSOCIADOS A PORFEROS AVALIAO DE MORTE PROGRAMADA DE CLULAS CARACTERIZAO MORFOLGICA E FISIOLGICA EM ACESSOS DE AGARICUS BLAZEI E A. SYLVATICUS
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LUCIFERASES DE VAGALUMES
I. INTRODUO bioluminescncia a emisso de luz fria e visvel por organismos vivos. Ela ocorre entre as bactrias, fungos, algas, celenterados, moluscos, artrpodes, aneldeos, equinodermas e peixes; (Herring, 1987). A bioluminescncia um tipo especial de quimioluminescncia, biologicamente funcional, catalizada por enzimas, resultante de oxidaes altamente exergnicas nas quais a energia liberada preferencialmente na forma de luz. Qualquer clula viva produz quimioluminescncia ultrafraca, como subproduto do metabolismo oxidativo, aparentemente sem funo biolgica (Lee, 1989). Na bioluminescncia a emisso de luz visvel, assumindo importantes funes comunicativas intra- e inter-especficas, dentre as quais destacam-se a atrao sexual, defesa, camuflagem e atrao de presas. Basicamente uma reao bioluminescente envolve a oxidao por oxignio de compostos genericamente conhecidos por luciferinas. Estas reaes so catalisadas por enzimas denominadas de luciferases. O sistema bioluminescente de fungos o nico no qual a luminescncia aparentemente no catalisada por enzimas (Wilson and Hastings, 1998). Durante a oxigenao das luciferinas, so formados intermedirios peroxdicos altamente instveis e ricos em energia, cuja clivagem trmica gera produtos carbonlicos, um dos quais no estado excitado singlete que se desativa emitindo fluorescncia (Wilson, 1995). Os rendimentos qunticos de bioluminescncia (nmero de ftons emitidos por molcula de luciferina oxidada) so em geral elevados devido aos stios ativos das luciferases que catalisam eficientemente a oxidao das luciferinas e fornecem microambientes altamente protetivos para o produto excitado, evitando que este se desative por outros processos noradiativos As luciferases constituem portanto casos especiais de oxigenases otimizadas para a emisso de luz. Luciferina + O2 Intermedirio peroxdico Oxiluciferina*s Oxiluciferina + h
ESTRUTURA, FUNO E APLICAO EM BIOANLISE E BIOIMAGEAMENTO
Vadim R. Viviani - Prof. Dr. Prof. Adjunto - Bioqumica Laboratrio de Bioluminescncia e Biotecnologia-UNISO Universidade Federal de So Carlos Campus de Sorocaba, SP, Brasil viviani@ufscar.br bioluxgen@hotmail.com
Figura 1. Besouros bioluminescentes da fauna brasileira: (A) vagalume lampirdeo; (B) larva trenzinho (Phengodidae) e (C) vagalume elaterdeo (Fotos V.Viviani)
Biodiversidade de insetos bioluminescentes. A bioluminescncia ocorre predominantemente no ambiente marinho. No ambiente terrestre, a bioluminescncia encontrada pincipalmente na classe dos insetos, que a mais rica em espcies
bioluminescentes. A bioluminescncia encontrada em ca de 2000 espcies nas ordens Diptera, Collembola e principalmente Coleoptera (Lloyd, 1983). Na ordem Collembola foram descritas espcies luminescentes nos generos Lipura e Neanura, entretanto as funes biolgicas e a natureza qumica da bioluminescncia permanecem completamente obscuras (Harvey, 1952). Os fulgordeos, da ordem Homoptera, tambm foram includos, entretanto a presena de luminescncia prpria neste grupo ainda incerta (Lloyd,1978). Recentemente espcies luminescentes form descritas em Blattodea (Zompro and Fritzsche, 1999). Entre os colepteros, a superfamlia Elateroidea inclue as principais famlias de insetos luminescentes (Lawrence and Newton, 1995): Lampyridae, Phengodidae, Homalisidae, Telegeusidae, Elateridae. As famlias mais numerosas em espcies luminescentes so Lampyridae, Elateridae e Phengodidae (Lloyd, 1978) (Fig.1). Foram descobertas tambm espcies bioluminescentes na famlia Staphylinidae (Costa et al., 1986). Lampyridae. A famlia Lampyridae inclue os vagalumes propriamente chamados, com ca de 1800 espcies descritas no mundo e possivelmente o mesmo nmero ainda para ser descrito na regio Neotropical (Lloyd, 1971). Os lampirdeos so coletivamente conhecidos por vagalumes e na fase adulta emitem luz pela regio ventral dos ltimos segmentos abdominais por meio de lampejos para finalidade de atrao sexual (Lloyd, 1978). As larvas tambm so luminescentes. A funo da luminescncia na fase larval ainda controvertida, possivelmente estando associada a defesa (aposematismo, alarme e distrao; Sivinsky, 1981). Elateridae. A famlia dos elaterdeos inclui ca de 9000 espcies descritas, das quais apenas ca de 200, pertencentes as subfamlias Agrypinae e Campyloxeninae possuem espcies luminescentes (Costa et al., 1988). Na fase adulta as lanternas esto localizadas na forma de duas vesculas ovaladas sobre o protrax que emitem luz contnua na regio do verde, e uma lanterna abdominal que ativada somente durante o vo, que tambm emite luz contnua, mas em geral de cromaticidade deslocada para o vermelho em relao as lanternas torcicas (Bechara, 1988). A luminescncia nesta famlia tambm est associada com a atrao sexual, entretanto o sistema de comunicao aparentemente mais simples do que nos lampirdeos (Lloyd, 1971), mas permanece pouco estudado. As lanternas torcicas tambem podem ter importante funo defensiva.
Figura 2. Luciferina e seus produtos de oxidao

Phengodidae. Os fengoddeos constituem uma famlia pequena, com ca de 170 especies descritas, a maioria se no todas luminescente. No Brasil foram descritas 50 espcies dentro da subfamlia Phengodinae, a maioria dentro da tribo Mastinocerini, mas um nmero maior de espcies ainda est para ser descrito. Anteriormente descobrimos 3 espcies novas de fengodideos (Wittmer, 1993, 1996) na regio Central do Brasil. Nesta ltima tribo os machos adultos possuem luminescncia na forma de lanternas puntiformes laterais nos segmentos abdominais e torcicos, enquanto que as fmeas e larvas possuem pares de lanternas puntiformes laterais ao longo do corpo inteiro, e uma ou duas lanternas ceflicas que emitem luz na faixa do verde-amarelado ao vermelho (Viviani and Bechara, 1993, 1997) (Fig. 1). A larva trenzinho de Phrixotrix, alm de apresentar lanternas verde ao longo do corpo, so as nicas a apresentarem bioluminescncia vermelha. A Bioqumica da bioluminescncia dos vagalumes O sistema luciferina-luciferase de colepteros um dos sistemas bioluminescentes mais conhecidos. A primeira luciferina e luciferase de insetos a serem purificadas foram as do lampirdeo norte-americano Photinus pyralis (Green & McElroy, 1956; Bitler & McElroy, 1957). O progresso alcanado na elucidao das propriedades do sistema luciferinaluciferase de colepteros se deve principalmente ao estudo do sistema desta espcie, abundante nos EUA. A luciferina de lampirdeos um composto benzotiazlico (Fig. 2) de peso molecular 280 Da. Foi sintetizada pela primeira vez por White e colaboradores (1961, 1963), juntamente com a desidroluciferina (Fig. 2), seu produto de autooxidao. As luciferinas de outras espcies de lampirdeos, bem como as dos elaterdeos (Colepicolo et al., 1986) e fengoddeos (Viviani and Bechara, 1993) so essencialmente idnticas. A luciferase de vagalumes catalisa a oxidao da luciferina por oxignio, ativada por MgATP. So enzimas bifuncionais. Na primeira etapa da catlise enzimtica, a luciferase atua como adenil-transferase, adenilando a luciferina a partir de ATP e liberando pirofosfato (Fig.3). Esta etapa essencialmente semelhante a reao de ativao de cidos graxos e outros cidos carboxlicos aromticos catalizado pelas acyl CoA:sintetases (DeLuca and McElroy, 1978), com as quais compartilham elevado grau de homologia (Wood, 1995). Em seguida a luciferase atua como oxigenase, removendo o prton do carbono alfa a carbonila, tornando-o suscetvel ao ataque por oxignio molecular, com a produo do intermedirio dioxetannico (Fig.4; Wannalund, 1978), cuja clivagem produz dixido de carbono e oxiluciferina excitada. De acordo com DeLuca & McElroy (1974), a abstrao do prton 4 do anel tiaznico constitui a etapa limitante da reao catalisada pela luciferase.
Origem dos sistemas bioluminescentes de insetos. Uma das questes mais intrigantes concernentes a bioluminescncia como este processo pode ter se originado ao longo da evoluo. Embora o mecanismo bsico de toda a bioluminescncia envolva a oxigenao de uma luciferina gerando um intermedirio peroxdico, a natureza qumica das luciferinas, luciferases e cofatores participantes difere consideravelmente de um grupo de seres vivos para outro, o que levou desde cedo concluso de que a bioluminescncia possa ter se originado muitas vezes independentemente no decorrer da evoluo (SeliBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 37 9
ger & McElroy, 1965; Hastings, 1995). Em insetos, dados morfolgicos e bioqumicos sugerem que pelo menos trs sistemas diferentes (um em colepteros e dois em dpteros) so encontrados (Viviani, 2002). Entretanto, a falta de estudos sobre outros grupos, sugere a existncia de novos sistemas. A origem e possvel funo priFigura 3. Mecanismo mitiva da luciferina permaneenzimtico da cem obscuras. Estudos de marcao isotpica sugerem que bioluminescncia a luciferina se origina da fucatalisado pelas so do amino-cido cistena luciferases de com benzoquinonas. Composvagalumes tos benzotiazlicos so comuns em pigmentos (Wood, 1995). A luciferina de besouros foi encontrada unicamente em espcies luminescentes, no havendo indcios em espcies noluminescentes de famlias filogeneticamenentre s (Wood, et al., 1989; Viviani et te prximas como Cantardae (Viviani, tese al., 1999b). Nosso grupo clonou e dede doutorado). Foi sugerido que a lucifeterminou as sequncias das luciferases rina de colepteros poderia originalmende 3 fengodideos (Viviani et al., 1999a; te ter papel antioxidante. Entretanto, a Ohmiya et al., 2000) (Fig.4, 5) e de um ocorrncia limitada a apenas espcies luelaterdeo (Viviani et al., 1999b) que minescentes argumenta contra esta possiemitem na faixa do verde ao vermelho. bilidade. possvel que a luciferina posAs luciferases de fengoddeos so polisa originalmente ter sido um intermedipeptdeos de 543-546 resduos, apresenrio da biossntese de pigmentos (Viviani, tam 56-71% de identidade entre s (Gru2008 no prelo). ber et al., 1996; Viviani et al., 1999a; Ohmiya et al., 2000) e 46-50% de idenAS LUCIFERASES DE tidade com as demais luciferases de lamCOLEPTEROS pirdeos e elaterdeos. A analogia entre as reaes de adenilaAs luciferases de vagalumes so mono das luciferases de colepteros e meros cataliticamente ativos de ca 60 kDa aminoacyl-tRNA sintetases e acylCoA (DeWet et al., 1985). A ca de 20 anos o sintetases foi desde cedo reconhecida cDNA para a luciferase do vagalume ame(DeLuca and McElroy, 1968). Com o ricano Photinus pyralis foi clonado, seadvento da biologia molecular descoqunciado e a estrutura primaria da probriu-se que muitas as acyl CoA sintetatena foi deduzida (DeWet et al., 1985). O ses e outras ligases so homlogas s cDNA da luciferase de Photinus pyralis luciferases. um fragmento de ca 1.6 kb que codifica um polipeptdeo de 550 resduos de amiEstrutura tridimensional da nocidos. A luciferase possui uma sequluciferase de vagalumes ncia sinalizadora Ser-Lys-Leu que a diriA estrutura tridimensional da luciferase ge aps a traduo para peroxissomas, as de Photinus pyralis foi originalmente reorganelas s quais est associada nos fosolvida por cristalografia de raios X na tcitos (Gould et al., 1967). Desde ento, ausncia dos substratos, mostrando uma os cDNAs que codificam uma variedade grande domnio N-terminal e uma pede luciferases, a maioria oriundos da faqueno domnio C-terminal que provamlia Lampyridae (Tatsumi et al., 1989; velmente se aproximam para envolver Kajiyama & Nakano, 1991; Devine et al., os substratos durante a catlise (Fig. 6) 1993; Sala-Newby et al., 1993; Ohmiya et (Conti et al., 1996). A determinao da al., 1995; Liu et al., 1996) foram clonados estrutura tridimensional de outras AMPe sequnciados. As luciferases de lampiligases mostrou que o domnio C-terrdeos so polipeptdeos de 546-550 resminal pode assumir diferentes graus de duos, apresentam propriedades semelhanrotao em relao ao domnio N-tertes e preservam entre s de 67 a 94% de minal dependendo da enzima (May et identidade a nvel de estrutura primria al., 2002; Gulick et al., 2003). Evidnci(Wood, 1995). As luciferases de elaterdeas sugerem que os dois domnios assuos so polipeptdeos de 542-543 resduos mem uma conformao similar em die compartilham entre 82-99% identidade
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ferentes enzimas durante a etapa de adenilao, ao passo que nas etapas subsequentes os dois domnios podem apresentar diferentes graus de rotao dependendo da enzima (Gulick et al., 2003). Mais recentemente, a estrutura cristalogrfica da luciferase do lampirdeo japons, Lucola cruciata, foi resolvida na presena do anlogo DLSA e dos produtos oxiluciferina e AMP, mostrando algumas diferenas com os modelos propostos (Nakatsu et al., 2006) (Fig.6). O stio-ativo. O stio ativo est localizado num bolso no interior do domnio N-terminal, que faz face para o domnio C-terminal, sendo que vrios resduos conservados se encontram nas interfaces destes dois domnios. Estudos de comparao de sequencias, modelagem e mutagnese stio-dirigida mostraram as regies e resduos do stio de ligao do ATP(Conti et al., 1997; Franks et al., 1998; Branchini et al., 1998; Sandalova e Ugarova, 1999) . Os mdulos I [(198SSGSTGLPKG207), II (340YGLTE344) e III (418LHSGD422)] so particularmente conservados nestas enzimas, sugerindo que estejam envolvidos com a funo de ligao de ATP e de adenilao (Morozov and Ugarova, 1997). O modulo I, consiste em um loop altamente flexvel que separa o stio de ligao do ATP do stio de ligao para o substrato carboxlico (May et al., 2002), que varivel, e est envolvido com a liberao de pirofosfato durante a adenilao. Em algumas ligases os resduos que correspondem Gly315 e Arg437 nas luciferases de vagalumes podem estar envolvidos com a adenilao. O resduo conservado Lys 529 importante para o posicionamento e estabilizao do grupo carboxila da luciferina e dos fosfatos do ATP nas luciferases (Branchini et al., 2000). Foi especulada tambm a existncia de um stio de ligao para Coenzima A (CoA) na luciferase, visto que a muito tempo sabido que o CoA afeta a cintica da reao bioluminescente (Wood, 1995). Estudos recentes mostram que a CoA importante para remoo dos inibidores L-luciferina e desidroluciferina, e tambm no processo de epimerizao da L-luciferina em D-luciferina, o substrato real da bioluminescncia. Na estrutura tridimensional da acyl CoA sintetase, a CoA aparece localizada na superfcie da protena entre os domnios N e C-terminal, com a poro
fosfopanteteina posicionada prvermelha e a forma enlica emite xima ao stio de ligao do AMP luz verde-amarela), entretanto, re(Gulick et al., 2003). Evidncias centemente experimentos com o sugerem que a ligao da CoA adenilato do 5,5 dimetil-anlogo promova a rotao do domnio da luciferina mostraram que a forC-terminal. ma cetnica pode emitir tanto luz Estudos de modelagem (Branchiverde-amarela como vermelha, torni et al., 1998; Sandalova e Uganando a hiptese da tautomerirova, 1999), mutagnese stio-dizao improvvel (Branchini et rigida e mais recentemente a real., 2002); (3) a rotao dos anis soluo da estrutura tridimensiotiaznicos da oxiluciferina em tornal da luciferase na presena do no da ligao C2-C2', que est em anlogo DLSA revelou a identifuno da geometria do stio ativo (McCapra et al.,1994) (Fig.6). dade dos resduos do stio de ligao da luciferina (Fig.6). A foMais recentemente foi proposto que a delocalizao de cargas na tooxidao com um anlogo de luciferina e estudos de mutagforma ceto-aninica constitue fator determinante para os especnese mostraram que o peptdeo 244HHFG245 est em proximidatros de bioluminescncia (Branchini et al., 2004). Estudos teride da luciferina (Branchini et al., 1997). Evidncias indiretas tamcos apoiam parcialmente esta ltima hiptese, sugerindo que o bm foram obtidas baseadas nas estruturas tridimensionais da fecontrole exercido pelo microambiente da luciferase no grau de nilalanina sintetase com ATP e fenilalanina (Conti et al., 1997) e da polarizao dos grupos fenolato e ceto-enol determina os especluciferase de Photinus pyralis em presena do inibidor competititros de bioluminescncia (Orlova et al., 2004). Atravs de deconvovo da luciferina, bromofrmio (Franks et al., 1998). Baseados luo espectral, Ugarova e col. (2005) sugeriu a existncia de trs nestas informaes dois modelos de stio ativo foram proposespcies emissoras que contribuiriam nos espectros de bioluminestos. Estes modelos em geral concncia das luciferases de lampircordam entre s, embora algumas Figura 4. (Painel superior) Larva trenzinho deos: (ceto-fenolato) que emitiria diferenas importantes sejam eviPhrixotrix hirtus, (Painel inferior) colnias de luz vermelha; (enol/fenolato) dentes. De acordo com um dos bactrias E. Coli tornadas bioluminescentes emissor de luz laranja e (enolamodelos, o resduo Arg218 apaaps transformao com plasmdeos contendo to/fenolato) o emissor de luz verrentemente importante para a esde. Estudos com a quimioluminestabilizao do fenolato da lucios cDNAs clonados das luciferases emissoras cncia de adenilato de luciferina ferina (Branchini et al., 1998), ende luz verde e vermelha de Phrixotrix. em meio aquoso e na presena quanto que no outro modelo, o de soroalbumina bovina sugerem resduo Arg337 est mais prxique a bioluminescncia vermelha remo do fenolato para fazer esta interade pH, aumento de temperatura e conquer um microambiente menos estruo (Sandalova e Ugarova, 1999). A recentrao de ctions (Seliger and McElturado que a bioluminescncia verde soluo da estrutura tridimensional da roy, 1964) e (II) luciferases pH-insensi(Viviani e Ohmiya, 2006). luciferase de Lucola cruciata na pretivas que incluem as luciferases de fensena de DLSA e de oxilucifeina com goddeos e elaterdeos, que no sofrem AMP mostrou que a isoleucina 288 est As luciferases de lampirdeos. A maideslocamento batocrmico mediante diprxima do grupo fenolato do anel benoria dos estudos de estrutura e funo minuio do pH, aumento da concentem utilizado principalmente as lucifezotiazlico, criando um microambiente trao de ctions de metais pesados dihidrofbico e rgido, apropriado para a rases de lampirdeos. A construo de valentes ou aumento de temperatura (Viquimeras entre as luciferases de lampiemisso de luz verde (Nakatsu et al., viani and Bechara, 1995). 2006). rdeos revelou que a regio entre os Mecanismos de modulao de cores resduos 209-318 determinante das de bioluminescncia. Em princpio as cores nas luciferases de lampirdeos Determinantes estruturais dos cores da bioluminescncia so gover(Ohmiya et al., 1986). Entretanto, a muespectros de bioluminescncia nadas a nvel de stio ativo das luciferatao de vrios resduos isolados ao lonses por tres fatores estruturais (Fig. 7): go da estrutura primria das luciferases A variedade de cores da biolumines(1) efeitos no-especficos como polade lamprideos afeta drasticamente a cor cncia encontrada nos besouros atriridade (DeLuca, 1969) e polarizao orida bioluminescncia, em geral resultanbuvel essencialmente s diferentes luentada do stio ativo (Ugarova, 2000), do em mutantes vermelhos (Kajiyama ciferases, desde que as luciferinas so determinada pela natureza dos resdu& Nakano, 1991). A mutao de vrios idnticas nas trs famlias. As luciferaos que o compem; (2) efeitos especresduos conservados do stio-ativo, ses de colepteros elateroides dividemficos de interao de resduos cidoentre os quais R218, H245, T343, tamse em dois grupos de acordo com a bsicos no stio ativo das luciferases bm teve efeitos dramticos nos especsensibilidade espectral ao pH (Viviani com a oxiluciferina (White & Branchitros de bioluminescncia das luciferaand Bechara, 1995): (I) as luciferases ni, 1975). O processo de tautomerizases de lampirdeos (Branchini et al., pH-sensitivas que incluem as luciferao da oxiluciferina excitada na presen1998,2000, 2003). ses de lampirdeos, sofrem deslocamena de resduos bsicos foi originalmenAs luciferases pH-insensitivas. As luto batocrmico mediante abaixamento te proposto (a forma cetnica emite luz
ciferases de elaterdeos e fengoddeos so muito menos propensas a mudanas de cor mediante mutaes. Poucas mutaes afetam os espectros de emisso das luciferases emissoras de luz verde, e um nmero muito menor tem um efeito dramtico. A construo de quimeras com as isoenzimas do elaterdeo Pyrophorus plagiophthalamus sugere que a regio entre os resduos 220247 deve ter papel determinante para a cor da bioluminescncia nas luciferases de elaterideos (Wood et al., 1990). Estudos de mutagnese stio-dirigida da luciferase de Pyrearinus termitilluminans mostram que o espectro desta luciferase mais resistente a mudanas estruturais do que as luciferases de fengoddeos, embora ambas sejam pH-insensitivas (Viviani et al., 2001, 2002). As luciferases de fengoddeos. Nas luciferases de fengoddeos emissoras de luz verde, poucas mutaes tiveram efeito dramtico no espectro. A construo de quimras com as luciferases emissoras de luz verde e vermelha sugere que a conformao da regio entre os residuos 220 e 344 tem importante influncia na cor da bioluminescncia em fengoddeos (Viviani and Ohmiya, 2000). Identificamos Arg215 como um resduo importante para a emisso de luz verde. Entretanto ainda no est claro se o papel deste resduo est relacionado com a estabilizao do enolato que emite luz verde, como sugerido por Branchini e col (1998), ou com interaes importantes para a manuteno da estrutura do stio ativo ou os dois processos (Viviani and Ohmiya, 2000). Outro resduo cuja substituio tem efeito dramtico nos espectros da luciferases de fengoddeos emissoras de luz verde ou amarela o resduo T226. Foi proposto que Arg215 e Thr226 poderiam interagir direta ou indiretamente para manter uma conformao apropriada do stio ativo para a emisso de luz verde (Viviani et. Al., 2002). Notavelmente, embora a substituio destes resduos afete dramaticamente os espectros das luciferases verde e amarela, elas no tem efeito na luciferase vermelhas, mostrando que R215 e T226 so funcionais apenas para emisso de luz verde/amarela (Viviani et al., 2007). Estudos extensivos de mutagnese stio-dirigida tambm mostraram que, com a exceo dos resduos R215, Y224 e T226, a substituio de vrios outros resduos ao longo da estrutura primria da luciferase verde, inclusive de resduos invariveis do stio-ativo, no afetam ou afetam apenas moderadamente os espectros de bioluminescncia desta luciferase, enquanto nenhuma substituio at agora afetou os espectros da luciferase vermelha (Viviani et al.,
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Figura 5. Sequencias de amino-cidos das luciferases emissoras de luz vermelha (PxRE) e verde (PxGR) clonadas a partir das larvas trenzinho Phrixotrix spp (Viviani et al., 1999)
2006, 2007). No conjunto estes resultados sugerem que a estrutura do stio ativo da luciferase verde seja mais estabilizada do que aquela da luciferase vermelha, e que a explicao para estas diferenas de espectros de bioluminescncia esteja mais relacionada a mudanas conformacionais durante a etapa de emisso, do que na composio de resduos do stio-ativo. A sensibilidade ao pH. Aps a clonagem de vrias luciferases de fengoddeos e de elaterdeos (Viviani et al., 1999a,b; 2000), identificamos um conjunto de resduos conservados que diferem entre as luciferases pHdependentes e as luciferase pH-independentes, que poderiam estar envolvidos com o efeito pH (Fig. 5) (Viviani et al., 1999b). Entre estes o resduo 226 (Thr em elaterdeos e fengoddeos e Asn nas luciferases de lampirdeos) constitue um resduo-chave para emisso de luz verde-amarela (Viviani et al., 2001). O resduo Gly247 em luciferases pHdependentes e o respectivo Ala243 nas pH-independentes afetam sensivelmente a sensibilidade ao pH, provavelmente por interferirem com a flexibilidade de segmentos importantes no stio ativo das luciferases (Viviani et al., 2002). Entretanto, at pouco tempo, nenhum resduo transformou uma luciferase pH-insensitiva em pH-sensitiva. Nossos resul-
tados sugerem que o stio ativo das luciferases pH-independentes mais rgido graas a estabilizao por foras hidrofbicas gerando apenas uma espcie emissora. O stio-ativo das luciferases de lampirdeos mais flexvel e hidroflico podendo originar duas espcies emissoras dependendo de sua conformao (Viviani et. al., 2001). Mais recentemente, com a clonagem de duas luciferases pH-sensitivas de vagalumes brasileiros, inclusive a luciferase de Macrolampis que naturalmente apresenta um espectro bimodal, identificamos que a substituio E354N determina o aparecimento do ombro no vermelho no espectro (Viviani et al., 2005). A partir de estudos de modelagem e mutagnese stio-dirigida, comeamos a identificar os resduos que participam na determinao da sensibilidade ao pH. Identificamos uma rede de resduos que interagem entre s por pontes de hidrognio e pontes salinas que nas luciferases pH-sensitivas atuaria como uma comporta para o stio-ativo (Viviani et al., 2008) (Fig.9). Em especial, verificamos que vrios resduos que afetam os espectros de emisso esto localizados no loop entre os resduos 223235 (Viviani et al., 2007) (Fig.8). Este loop atua como uma presilha que fixa partes do stio de ligao da luciferina, atravs das ligaes de hidrognio dos re-
sduos Y227 e N229 (Fig.9). A ruptura das interaes destes resduos atravs de mutagnese, tem efeito dramtico nos espectros de ambos os grupos de luciferases, resultando em espectros que variam temporalmente e que afetam a sensibilidade ao pH (Viviani et al., 2007). Estes resultados indicam que a mobilidade deste loop tem um papel crucial na determinao dos espectros de bioluminescncia e da sensibilidade ao pH (Viviani et al., 2007). Mudanas de pH poderiam afetar a entrada de agua no stio ativo, tornando-o mais polar e deslocando o espectro de emisso para o vermelho (Viviani et al., 2007, 2008).
Origem e evoluo molecular Embora as luciferases sejam funcionalmente classificadas como oxigenases, estas enzimas no apresentam homologia indicando que as luciferases no se originaram a partir de oxigenases, como havia sido proposto originalmente (Rees et al., 1998). mais provvel que a funo oxigensica das luciferases tenha sido aperfeioada aps a origem do fentipo luminescente, tendo sido a bioluminescncia que dirigiu a evoluo de novas oxigenases e no o contrrio (Rees, et al., 1998). No caso dos colepteros, as luciferases provavelmente se originaram a partir de uma AMP-ligase (Schroeder, 1989; Suzuki et al., 1990; Toh, 1990; Scholten et al., 1991) com alguma funo metablica por duplicao gnica (Fig.10). Enzimas tipo-luciferases com a capacidade de emitir quimioluminescncia fraca na presena de luciferina e ATP foram encontradas em larvas de besou-
Figura 6. Estrutura tridimensional da luciferase de vagalumes, mostrando o stio de ligao da luciferina

ros no-luminescentes de Tenebrio molitor e outras larvas de colepteros (Viviani and Bechara, 1996). Estas ligases podem ser enzimas parlogas s luciferases muito semelhantes s protoluciferases que deram origem s luciferases de colepteros. Estas ligases poderiam catalisar a formao do adenilato de luciferina, que espontneamente quimioluminescente em meio aquoso alcalino, embora com baixo rendimento (Seliger and McElroy, 1962). Embora o rendimento luminoso destas ligases seja muito baixo para que a luminescncia tenha sido selecionada com base na sua visibilidade, possvel que a luminescncia da protoluciferase original fosse mais alta do que nas enzimas tipo-luciferases encontradas em outros besouros. De fato, recentemente demonstramos que protenas como BSA, que tem stios hidrofbicos para compostos aromticos, aumentam consideravelmente o rendimento de quimioluminescncia vermelha do adenilato de luciferina em sistema aquoso (Viviani e Ohmiya, 2006). Alternativamente, a luminescncia original poderia desempenhar algum outro papel desconhecido. Em bactrias por exemplo, evidncias recentes suportam um papel importante da luminescncia no processo de fotoreativao do DNA (Czys et al., 2003). Uma vez selecionada com base na luminescncia, a estrutura da luciferase evoluiu para a otimizao da emisso de luz de diferentes cores para diferentes finalidades.
Aplicaes biotecnolgicas das luciferases de colepteros Luciferina-luciferase como reagentes bioanalticos. Aps a purificao da primeira luciferina e luciferase de vagalumes na dcada de 50, inmeras aplicaes envolvendo a quantificao de ATP para fins analticos e clnicos apareceram. Entre estas aplicaes destacaram-se a monitorao de biomassa (Schram et al, 1989), avaliao da contaminao microbiolgica de alimentos, bebidas, guas e fludos biolgicos
Figura 7. Mecanismos de determinao das cores de bioluminescncia pelo stio-ativo das luciferases de besouros (de acordo com V.Viviani et al., 2008)
utilizados como marcadores sensveis de clulas cancergenas, auxiliando no estudo de metastatizao e no desenvolvimento de novas terapias. A bioluminescncia o nico mtodo com sensibilidade suficiente para detectar metstases em sua fase inicial. Entretanto, por ser uma tcnica nova, seu uso permanece limitado a modelos animais. A derivao de genes teraputicos tambm tem sido feita com marcao bioluminescente (Contag et al., 1995; 1996 and 1998). Aplicao em biosensores. Os genes de luciferases esto sendo usados tambm em biosensores ambientais para deteco de bioavaliabilidade de ctions de metais pesados como mercrio e arsnio ou agrotxicos e outros disruptores ambientais em guas contaminadas (Tauriainen et al., 1999). Juntamente com a GFP (green fluorescent protein) e seus derivados, as luciferases esto se tornando os genes reprteres mais utilizados para estas finalidades. Uma das mais recentes aplicaes na rea de protemica envolve o uso de luciferase e GFPs em ensaios BRET (Bioluminescence Ressonance Energy Transfer), onde interaes protena-protena so avaliadas pela alterao do espectro de emisso mediante transferncia de energia do emissor primrio (luciferase-luciferina) para a GFP. Luciferases de espcies brasileiras ampliando a gama de aplicaes. Os genes de luciferase de insetos utilisados at o recentemente codificavam somente luciferases que emitem luz na regio verde-amarelada do espectro, limitando consideravelmente suas aplicaes, desde que muitos tecidos biolgicos so consideravelmente opacos nesta regio. Com a clonagem da luciferase emissora de luz vermelha de Phrixotrix e seus aliados produzidos por engenharia gentica, a gama de aplicaes foi ampliada, com o uso destas em clulas de mamferos e em sistemas reprter mltiplos que utilizam simultaneamente vrias luciferases emissoras de diferentes comprimentos de onda para a anlise simultnea de mltiplos eventos celulares (Nakajima et al., 2004; Viviani and Ohmiya, 2006). A luciferase de Pyrearinus termitilluminans, devido a sua estabilidade e cintica de emisso, tambm vem sendo utilizada como importante marcador bioluminescente para imageamento de clulas e tecidos. A luciferase do vagalume Macrolampis, devido ao espectro bimodal sensvel ao pH, pode ser utilizada em biosensores intracelulares de mudanas de pH e outros fatores. Recentemente comeamos a desenvolver biosensores
Figura 8. Multialinhamento da regio dos loops entre os resduos 223-235 e 352-359 das luciferases de besouros, mostrando resduos-chave para a modulao dos espectros de bioluminescncia
(Stanley, 1989; Lundin et al., 1989); avaliao da viabilidade celular (Comhaire et al., 1989); ensaio de atividades enzimticas envolvendo o consumo ou formao de ATP; testes de citotoxicidade, entre outros. Hoje em dia existem kits especficos comercializados para estas finalidades. DNA da luciferase como marcador de expresso gnica . A clonagem do gene da luciferase de vagalumes tornou possvel toda uma nova gama de aplicaes envolvendo o uso deste gene como marcador altamente sensvel da expresso gnica em clulas e tecidos (Gould and Subramani, 1988; Naylor, 2000). O gene das luciferases de vagalumes tem sido utilizados como gene reprter em bacrias, leveduras, vegetais, insetos e mamferos, em anlises da funo de promotores associados com desenvolvimento e controle circadiano. DNA da luciferase como marcador para bioimageamento de clulas e tecidos. Mais recentemente, com o desenvolvimentos de equipamentos de fotodeteco e imageamento mais sensveis, os genes das luciferases esto sendo empregados para marcao e visualizao in vivo em tempo real de clulas e tecidos (Viviani and Ohmiya, 2006). So utilizados para marcao e estudos de disseminao de microrganismos patognicos em plantas e animais, auxiliando na rpida seleo de drogas antimicrobicidas. Tambm esto sendo
Figura 9. Rede de pontes de hidrognio do loop entre os resduos 223-235 e o sensor de pH em luciferase de Phrixotrix spp (Viviani et al., 2005)
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Figura 10. Reaes catalizadas pelas AMP/CoA-ligases e destino dos adenilatos e steres de coenzima A produzidos por estas enzimas nos organismos
bacterianos bioluminescentes para bioprospeco de drogas microbicidas e agentes txicos. Atualmente, nosso laboratrio, em cooperao com a microempresa incubada BIOLUXGEN, est desenvolvendo biosensores bioluminescentes para bioprospeco e anlise de toxicidade ambiental, fazendo uso das luciferases clonadas e desenvolvidas em nosso laboratrio. Engenharia e desenvolvimento de novas luciferases. Alm das novas luciferases clonadas, a engenharia destas enzimas tem amplo potencial para desenvolvimento de novas formas mais estabilizadas para uso em clulas de mamferos, ou com diferentes comprimentos de onda para diferentes aplicaes. A modificao do padro de uso de cdons tem sido modificado para a luciferase de Phrixotrix, incrementando sua expresso em clulas de mamferos (Nakajima et al., 2004). Durante os ltimos anos, nosso laboratrio criou um banco de luciferases com mais de 30 formas variantes, algumas das quais com propriedades espectrais desejveis (Viviani and Ohmiya, 2006). Portanto, uma melhor compreenso sobre a relao entre estrutura e funo destas luciferases essencial para o futuro desenvolvimento de enzimas para finalidades prticas. Agradecimentos Este trabalho com luciferases foi financiado com recursos da FAPESP e CNPq. Aos meus colaboradores, em especial Frederico Arnoldi (UNESP), A.J. Silva Neto (UNESP), Prof. Y. Ohmiya (AIST, Osaka, Japo), J.A. Barbosa (LNLS, Campinas) que muito contribuiram para o desenvolvimento destes estudos nos ltimos 5 anos. Ao laboratrio Nacional de Luz Sncrotron (LNLS, Campinas) por disponibilizar suas facilidades.
Figura 11. Efeito da temperatura nos espectro de bioluminescncia de bactrias transformadas com o gene da luciferase pH-sensitiva de Macrolampis sp2
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Pesquisa Pesquisa
Anlise Comparativa de Genomas Procariticos

Ilustraes cedidas pelos autores
POR QUE, COMO E O QUE COMPARAR?
iniciativa pioneira do Departamento de Energia NorteAmericano (DOE) de obter uma seqncia genmica humana de referncia que pudesse atender melhor os seus propsitos de compreender os riscos potenciais para a sade e para o meio ambiente decorrentes da produo e do uso de novas fontes de energia e novas tecnologias, culminou no lanamento do Projeto Genoma Humano, em 1990; mais tarde, os recursos tecnolgicos gerados por este projeto estimularam o desenvolvimento de muitos outros projetos genoma, tanto por setores pblicos quanto por
setores privados (HGP 2001) (Figura 1). Desde a dcada de 1990, portanto, os esforos internacionais no sentido de obter seqncias genmicas completas levaram determinao de todo o cdigo gentico de mais de 700 organismos, entre estes, procariotos, leveduras, protozorios, plantas, invertebrados e vertebrados, incluindo o prprio Homo sapiens; atualmente, aproximadamente 3.000 outros projetos genoma esto em andamento, representando interesses mdicos, comerciais, ambientais e industriais, ou contemplando organismosmodelos importantes para o desenvol-
Marcos Catanho, MSc Doutorando em Biologia Celular e Molecular Laboratrio de Genmica Funcional e Bioinformtica Instituto Oswaldo Cruz - Fiocruz Rio de Janeiro RJ mcatanho@fiocruz.br Wim Degrave, PhD Pesquisador Titular Laboratrio de Genmica Funcional e Bioinformtica Instituto Oswaldo Cruz - Fiocruz Rio de Janeiro - RJ wdegrave@fiocruz.br
Antonio Baslio de Miranda, PhD Pesquisador Associado Laboratrio de Genmica Funcional e Bioinformtica Instituto Oswaldo Cruz - Fiocruz Rio de Janeiro RJ antonio@fiocruz.br http://www.dbbm.fiocruz.br/labwim/ bioinfoteam/
Figura 1. Evoluo do nmero (cumulativo) de genomas eucariticos e procariticos completamente seqenciados e depositados em bancos de dados pblicos desde 1995 at 2007 (grfico de barras) e a distribuio dos projetos genoma segundo suas reas de interesse (grfico de pizza): biomedicina, evoluo, meio ambiente, biotecnologia e agricultura. Observe que h uma ntida preferncia pelo seqenciamento de genomas bacterianos (de menor tamanho em relao aos genomas eucariticos e, portanto, mais fceis de serem analisados) e genomas com importncia biomdica (42%) ou biotecnolgica (28%). Fonte: Genomes Online Database (GOLD 2008)
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vimento de pesquisas cientficas (GOLD 2008) (Figura 1). Ao mesmo tempo, a obteno e anlise de seqncias genmicas completas de inmeros organismos ( genmica ) (Carraro & Kitajima 2002), juntamente com dados de expresso gnica e protica de clulas, tecidos e rgos inteiros, gerados por outras tecnologias de alto desempenho como a transcriptmica (Passos et al 2000) e a protemica (Sousa et al 1999; Ciero & Bellato 2002), aliados ao vertiginoso avano da computao e desenvolvimento de algoritmos mais eficientes, por sua vez resultantes do surgimento e consolidao de cincias como a Computao, a Bioinformtica e a Biologia Computacional nas ltimas dcadas (Binneck 2004; Prosdocimi et al 2002), tem permitido comunidade cientfica o uso de abordagens holsticas e ao mesmo tempo inovadoras no estudo da estrutura, organizao e evoluo de genomas (Abby & Daubin 2007), no estudo da expresso diferencial de genes e protenas (Patterson & Aebersold 2003), na anlise da estrutura tridimensional de protenas (Ginalski 2006), no processo de reconstruo metablica e na predio e classificao funcional de genes (Galperin & Koonin 2000; Stein 2001; Gabaldon & Huynen 2004; Francke et al 2005; Lee et al 2007; Skrabanek et al 2008). Dentre estas abordagens destaca-se a anlise comparativa de genomas (tambm conhecida como genmica comparativa ou comparao de genomas), que consiste na anlise e comparao do material gentico de diferentes espcies ou cepas, com o propsito de estudar a estrutura, organizao e evoluo dos genomas (e das espcies correspondentes) e tambm as funes dos genes e regies no codificantes nestes genomas. Nesta reviso, apresentamos um resumo das diferentes abordagens utilizadas na anlise comparativa de genomas, ressaltando, atravs de exemplos, sua importncia e algumas contribuies para o desenvolvimento da Biologia. Enfocamos nossa reviso em um grupo particular de organismos unicelulares: os procariotos. Pertencentes aos reinos Archaea e Bacteria, estes seres representam quase a totalidade dos genomas seqenciados at o momento (Figura 1) e dos projetos genoma em andamento (GOLD 2008); alm disso, estas espcies renem caractersticas fascinantes, tais como uma enorme (e insuspeitada) diversidade gentica (at mesmo entre espcies e populaes), a capacidade de sobreviver e
prosperar em virtualmente todos os ecossistemas terrestres (refletida na incrvel diversidade morfolgica, fisiolgica e metablica destes microrganismos), mantendo populaes de tamanho muito variado (desde muito pequeno at incrivelmente grande), e a capacidade de adquirirem e usarem freqentemente material gentico de organismos muito distantes (Coenye et al 2005; Binnewies et al 2006; Abby & Daubin 2007), oferecendo, por tudo isto, um campo frtil para o desenvolvimento de pesquisas em diferentes reas como a microbiologia, a gentica, a bioqumica, a evoluo e a taxonomia destes microrganismos. Por que comparar? Seqncias genmicas completas constituem uma fonte de dados singular porque, em princpio, elas representam tudo o que necessrio para criar um organismo, juntamente com fatores epigenticos e sua interao com os mesmos (Figura 2). Mas o que fazer com toda esta informao? Acredita-se que o genoma de um nico organismo, visto isoladamente, fora de seu contexto evolutivo, no capaz de nos revelar muito sobre si mesmo e que para tanto os genomas de diferentes espcies ou cepas devem ser estudados comparati-
vamente (Clark 1999). De fato, anlises comparativas entre as seqncias genmicas de diferentes microrganismos tm contribudo enormemente para a elucidao de aspectos fundamentais da gentica, da bioqumica e da evoluo de inmeras espcies (Galperin & Koonin 1999; Kondrashov 1999; Fraser et al 2000; Galperin & Koonin 2000; Koonin et al 2000; Wei et al 2002; Huynen et al 2005; Abby & Daubin 2007). Por exemplo, desde o seqenciamento dos primeiros genomas bacterianos em 1995, anlises comparativas de genomas procariticos tm nos revelado cada vez mais a natureza complexa da estrutura e organizao destes genomas e a enorme diversidade gentica entre estes organismos, muito acima daquela esperada, mesmo entre isolados de uma mesma espcie, levando a questionamentos importantes sobre os mecanismos pelos quais estes microrganismos evoluem e como devem ser classificados taxonomicamente (Coenye et al 2005; Binnewies et al 2006; Abby & Daubin 2007). As foras que moldam a estrutura, composio e organizao dos genomas destes microrganismos como, por exemplo, a eficincia nos processos de replicao, transcrio e regulao da expresso gnica - e aquelas responsveis pela gerao de variabilidade e da capacidade de adaptao destas espcies aos mais diversos nichos ecolgicos em nosso planeta tais como eventos de duplicao gnica, transferncia lateral de genes, desfuncionalizao de genes (formao de pseudogenes), eliminao (deleo) de genes e rearranjos cromossmicos , tm sido pouco a pouco desvendadas e intensamente estudadas (Ochman & Davalos 2006; Abby & Daubin 2007). A reconstruo da histria evolutiva dos seres vivos - baseada em mtodos matemticos para inferir o passado a partir de caractersticas presentes nas espcies contemporneas - tambm tem se beneficiado com o seqenciamento e a anlise comparativa de um nmero cada vez maior de genomas, envolvendo os trs domnios da vida - Archaea, Bacteria e Eukarya. Por exemplo, novas abordagens para anlises filogenticas, baseadas na comparao e alinhamento de seqncias primrias de mltiplos genes de inmeras espcies ou, ainda, na comparao de caractersticas associadas aos genomas inteiros de dezenas ou centenas de organismos, como o repertrio completo de genes ou a ordem (localizao) dos mesmos nos genomas, tm sido desenvolvidas (Delsuc et al 2005; Dutilh et al 2007), assim como novos mtodos para calcular a distncia entre os genomas
Figura 2. Representao esquemtica do processamento da informao gentica e epigentica (adaptado de Strohman 1997)
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de distintas espcies tm sido propostos (Otu & Sayood 2003; Henz et al 2005; Kunin et al 2005a e referncias contidas neste trabalho; Kunin et al 2005b; Tekaia et al 2005), resultando em melhorias na resoluo da rvore da vida e na superao de problemas antigos e comuns aos mtodos tradicionais de anlise filogentica, como por exemplo, a escolha de marcadores evolutivos apropriados, a saturao de determinadas posies nos cdons e desvios nas anlises provocados por estes fatores (Delsuc et al 2005). Outro exemplo importante refere-se ao estudo da variabilidade metablica e da conservao de funes enzimticas nas diversas vias bioqumicas entre os organismos. Comparaes entre as vias bioqumicas preditas a partir da anlise de genomas completamente seqenciados tm revelado a existncia de vias incompletas ou mesmo ausentes em vrias espcies analisadas (Cordwell 1999; Galperin & Koonin 1999;
Huynen et al 1999; Morett et al 2003; Peregrin-Alvarez et al 2003). Em algumas situaes, isto poderia representar o resultado de adaptaes a diferentes nichos ecolgicos, como, por exemplo, em bactrias estritamente simbiontes, as quais codificam um nmero menor de enzimas e vias metablicas em comparao com seus parentes de vida livre, uma vez que o hospedeiro oferece um ambiente constante e rico em metablitos (nutrientes e compostos qumicos intermedirios) essenciais ao desenvolvimento destes microrganismos (Galperin & Koonin 1999; Huynen et al 1999; Ochman & Moran 2001; Moran 2002; Moya et al 2008). Em muitos casos, entretanto, as enzimas desaparecidas foram substitudas por protenas funcionalmente equivalentes, ou seja, capazes de catalisar as mesmas reaes, mas exibindo virtualmente nenhuma similaridade ao nvel de suas seqncias primrias (de aminocidos) e tampouco ao nvel de suas estruturas tercirias (tridimensionais) (Galperin et
al 1998; Huynen et al 1999; Morett et al 2003). Estas formas alternativas, conhecidas como protenas anlogas (Fitch 1970, 2000) (Figura 3), originam-se a partir de processos evolutivos independentes, convergindo para uma mesma funo biolgica (neste caso para uma mesma atividade enzimtica), e podem estar associadas a diferentes linhagens filogenticas e/ou possuir distintos mecanismos de catlise (Galperin et al 1998). Alguns trabalhos sugerem que a frao de atividades enzimticas nas quais ocorreram mltiplos eventos de origem independente pode ser substancial (Morett et al 2003), somando-se a outras evidncias, tambm oriundas de anlises comparativas de genomas, que apontam a importncia (muito maior do que se supunha) do papel desempenhado pelo que se pode chamar de homologia funcional na evoluo dos seres vivos; um bom exemplo a indicao de que o nmero total de genes homlogos compartilhados entre as espcies atualmente conhecidas (genes
Figura 3. Homologia versus analogia. O esquema representa os processos evolutivos que levam formao de genes homlogos (genes A1, A2, B1 e B2 nas espcies X1 e X2; genes C1 e C2 nas espcies Y1 e Y2) e anlogos (B2 e C1), atravs da evoluo independente de dois genes hipotticos pertencentes a duas linhagens distintas (adaptado de Jensen 2001). Na linhagem X a evoluo do gene ancestral hipottico ocorreu atravs de dois eventos seqenciais, resultando na formao de genes divergentes, porm relacionados a um ancestral evolutivo comum (homlogos): primeiro atravs de uma duplicao gnica (descendncia horizontal), gerando os genes homlogos A e B na prpria espcie ancestral X0; em seguida, atravs de um evento de especiao (descendncia vertical), que deu origem s espcies X1 e X2 e aos pares de genes homlogos A1 e A2 (descendentes do gene A) e B1 e B2 (descendentes do gene B) nestas espcies. Na linhagem Y, o gene ancestral hipottico pertencente espcie ancestral Y0 evoluiu atravs de um nico evento de especiao, que originou as espcies Y1 e Y2 e o par de genes homlogos C1 e C2 (descendentes diretos do gene ancestral desta linhagem) nestas espcies. Os pares de genes homlogos A e B (na espcie ancestral X0), assim como os pares A1 e B1 (na espcie X1) e A2 e B2 (na espcie X2) so denominados parlogos, uma vez que o evento responsvel pela origem de todos eles, a partir do gene ancestral comum mais prximo entre os mesmos, foi uma duplicao gnica (Fitch 1970, 2000); j os pares de genes A1 e A2 (entre as espcies X1 e X2), A2 e B2 (tambm entre as espcies X1 e X2) e C1 e C2 (entre as espcies Y1 e Y2) so denominados ortlogos, uma vez que estes pares de genes homlogos foram originados, a partir de seus respectivos genes ancestrais comuns mais prximos, atravs de um evento de especiao (Fitch 1970, 2000). Os genes B2 e C1, pertencentes s espcies X2 e Y1, respectivamente, so denominados anlogos, isto , genes originados a partir de genes ancestrais no relacionados entre si (pertencentes a linhagens distintas) que, entretanto, convergiram para uma mesma funo biolgica (Fitch 1970, 2000)
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ubquos) inferior a 100, envolvendo principalmente os genes responsveis pelos processos de traduo (na grande maioria), transcrio e replicao/ reparo do DNA (Koonin 2003). Este nmero incrivelmente pequeno de genes presumidamente compartilhados entre os diversos organismos sugere que inmeras funes essenciais (e tambm no-essenciais) - que obviamente variam de acordo com as condies nas quais uma dada espcie ou populao tem de sobreviver (estilo de vida e nicho ecolgico) - so desempenhadas por genes que mantm entre si relaes de parentesco distante (parlogos originados por duplicaes ancestrais ou que evoluram muito rapidamente, muitas vezes divergindo ao ponto de no poderem mais ser reconhecidos como tais) ou que no dividem ancestralidade alguma (anlogos) (Koonin et al 1996), ou ainda por genes taxonomicamente restritos, isto , exclusivos de uma espcie, famlia ou linhagem em particular (genes nicos). De um ponto de vista aplicado, tecnologias de alto desempenho (genmica, transcriptmica e protemica) possibilitam que pesquisadores, atravs de anlises e minerao criteriosas de dados, aumentem no somente nosso conhecimento sobre a biologia dos seres vivos, mas tambm sejam capazes de desenvolver novos mtodos de diagnstico, vacinas mais eficazes, novas drogas, novos marcadores prognsticos e uma variedade de aplicaes biotecnolgicas. No que se refere aos microrganismos patognicos, por exemplo, e s micobactrias em especial, vrias aplicaes potenciais da anlise comparativa de genomas tm sido reportadas, visando sobretudo preveno (atravs do desenvolvimento de vacinas mais eficazes), o tratamento (pelo desenvolvimento de novas drogas) e o diagnstico (atravs da criao de mtodos mais rpidos, sensveis e especficos) da tuberculose e outras doenas causadas por micobactrias. Algumas dessas aplicaes incluem: a identificao de genes nicos de uma espcie em particular, a identificao de fatores de virulncia e a reconstruo metablica (Gordon et al 2002); a caracterizao de patgenos, a identificao de novos alvos para diagnstico e para procedimentos teraputicos (Fitzgerald & Musser 2001); a investigao sobre a origem molecular da patognese, do espectro de hospedeiros e das diferenas fenotpicas entre isolados clnicos e populaes naturais de patgenos (Behr et al 1999; Brosch et al 2001; Cole 2002; Kato-Maeda et al 2001) e a investigao dos fundamentos genticos da viruln-
cia e da resistncia a drogas de micobactrias causadoras de tuberculose (Randhawa & Bishai 2002). Como comparar? A anlise comparativa de genomas consiste na anlise e comparao entre todo ou grande parte do material gentico de diferentes espcies ou cepas. Por tratar-se de uma abordagem holstica, em larga escala, exige mtodos computacionais para sua realizao. Apesar de ser uma abordagem relativamente recente, tendo incio com o seqenciamento dos primeiros genomas na dcada de 1990, suas ferramentas mais importantes tm origem nas tcnicas clssicas de anlise computacional de seqncias: (i) algoritmos de alinhamento global e local de pares ou de mltiplas seqncias, (ii) mtodos de anlise filogentica e (iii) as implementaes destes mtodos e algoritmos (Needleman & Wunsch 1970; Smith & Waterman 1981; Felsenstein 1981, 1989; Lipman & Pearson 1985; Pearson & Lipman 1988; Feng & Doolittle 1987; Altschul et al 1990, 1997; Thompson et al 1994). De fato, ela se beneficia no somente de ferramentas desenvolvidas no passado, mas tambm da criao de novas ferramentas e do aperfeioamento de ferramentas j existentes, ambos estimulados pela imensa, diversificada e complexa quantidade de dados produzida com os projetos de seqenciamento em larga escala. Sendo os genomas basicamente longas seqncias de DNA, poder-se-ia analislos alinhando-os como se fossem seqncias comuns, utilizando um dos algoritmos de anlise de seqncias citados anteriormente. No entanto, isto s pode ser feito com genomas de espcies ou cepas muito prximas, uma vez que mudanas na organizao do genoma (inseres, delees, inverses, rearranjos, trocas e duplicaes) ocorrem com uma taxa muito elevada. Alm disto, por tratar-se de seqncias de tamanho extremo, torna-se computacionalmente invivel a anlise de mais de um par de genomas de uma s vez, mesmo com o uso de algoritmos e programas eficazes, especialmente desenvolvidos para esta finalidade (Morgenstern et al 1998, 1999, 2002; Jareborg et al 1999; Delcher et al 1999, 2002; Kent & Zahler 2000; Batzoglou et al 2000; Ma et al 2002; Bray et al 2003, 2004; Schwartz et al 2003; Brudno et al 2003a, 2003b; Kurtz et al 2004) (para uma reviso abrangente sobre este assunto, consulte Blanchette 2007). Portanto, na maioria das vezes as anlises compara-
tivas entre genomas so feitas em um nvel de abordagem mais modular, tomando-se as partes que compem tais seqncias, como por exemplo, o conjunto completo de genes codificados pelas espcies em estudo. Entre os mtodos mais comumente empregados nestas anlises est a busca por similaridades entre seqncias. A etapa crucial deste tipo de anlise determinar se as seqncias comparadas so ou no homlogas, ou seja, se descendem ou no de uma seqncia ancestral comum, estabelecendo-se equivalncia entre as partes comparadas. O resultado obtido permite, entre outras coisas, a predio de funo, j que presumido que seqncias homlogas tendem a ter funes similares e tambm determinar quais os genes correspondentes (ortlogos) entre pares ou grupos de genomas analisados (Rigden & Mello 2002; Lee et al 2007). Esta tarefa nada trivial feita comparando-se uma ou mais seqncias de entrada ( query sequences), com outras inmeras seqncias depositadas em um banco de dados (subject sequences), atravs do alinhamento consecutivo de cada seqncia de entrada com cada seqncia depositada no banco, com a utilizao de um algoritmo de alinhamento local (Smith & Waterman 1981; Pearson & Lipman 1988; Altschul et al 1997). Para cada alinhamento, calcula-se o nmero de pontos obtidos (score), com base em uma matriz de substituio (PAM ou BLOSUM normalmente) e em valores arbitrados de penalidade para a abertura e extenso de espaos nas seqncias alinhadas ( gap opening/ extension penalties), e o nmero de alinhamentos esperados ao acaso com pontuao igual ou superior ao do alinhamento em questo ( Evalue), a partir da pontuao normalizada (bitscore) e do tamanho e composio do banco de dados. A homologia inferida com base nos valores calculados dos diferentes parmetros do alinhamento, alguns deles j mencionados: pontuao, pontuao normalizada, nmero de alinhamentos esperados ao acaso com pontuao igual ou superior ao do alinhamento em questo, percentual de identidade, percentual da extenso de cada seqncia no par alinhado que contribui para o alinhamento, diferena de tamanho entre as seqncias alinhadas etc. A existncia de domnios - mdulos que constituem unidades distintas do ponto de vista evolutivo, funcional e
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estrutural - em protenas um fator complicador nestas anlises, que deve ser tratado com ateno. Atualmente, inmeros bancos de dados e ferramentas computacionais para anlise comparativa de genomas procariticos esto disponveis atravs da internet como servios on-line e/ou programas independentes para uso local, abrangendo uma variedade de propsitos e funcionalidades (Catanho et al 2007). A Tabela 1 apresenta um resu-
mo de tais recursos computacionais. O que comparar? Anlises comparativas de genomas podem envolver diferentes tipos de abordagem, oferecendo mltiplas perspectivas acerca dos organismos estudados (revisto por Wei et al 2002). Entre as anlises capazes de contribuir significativamente para a compreenso de problemas biolgicos, ressaltando similaridades e diferenas importantes entre os
genomas e organismos comparados, destacam-se: (i) comparaes envolvendo a estrutura genmica global, (ii) comparaes entre regies codificantes identificadas em diversos genomas e (iii) comparaes envolvendo regies no codificantes de diferentes genomas (Figura 4). Comparaes envolvendo a estrutura genmica global Pesquisas envolvendo a organizao
Tabela 1. Bancos de dados e ferramentas computacionais para anlise comparativa de genomas procariticos
Fonte: Catanho et al 2007.

(tais como genes, operons , grupos [clusters] gnicos, elementos de insero, repeties etc.), determinando, por exemplo, a distribuio assimtrica dos genes entre as fitas de DNA (chamadas leading e lagging ) e em relao aos pontos de origem e trmino da replicao, a diferena de composio de bases entre as fitas leading e lagging e a formao de gradientes ao longo da cadeia de DNA, representados por desvios na composio de bases e nas taxas mutacionais nas proximidades do ponto de trmino da replicao (revisto por Rocha 2004a). Comparaes entre regies codificantes Outra abordagem comumente empregada para comparar os genomas de diferentes organismos procariticos considera estes seres (de forma alegrica) como sendo sacos de genes, orientando as anlises somente para o contedo codificante de seus genomas: genes e seus produtos (protenas especificamente). As possibilidades oferecidas por este tipo de abordagem so inmeras, incluindo a aquisio de informaes sobre a organizao e evoluo destes genomas, a identificao de caractersticas nicas nos mesmos, aplicao direta em processos de reconstruo metablica e em processos de predio e classificao funcional de genes (Galperin & Koonin 2000; Stein 2001; Gabaldon & Huynen 2004; Francke et al 2005; Lee et al 2007; Abby & Daubin 2007; Skrabanek et al 2008). Tais estudos abrangem normalmente (i) a identificao de regies codificantes, (ii) a comparao dos contedos gnico e protico, (iii) a identificao/anlise da conservao de famlias de genes ortlogos e parlogos entre os genomas comparados, (iv) a anlise da conservao de grupos gnicos e da conservao da ordem (localizao) dos genes entre as diferentes espcies estudadas, (v) a identificao/anlise de eventos de fuso/fisso gnica e da ocorrncia de ligao funcional entre genes nas espcies analisadas. Recentemente, anlises deste tipo levaram a uma das mais importantes descobertas da era genmica. Atravs de comparaes entre o repertrio de genes codificados pelos genomas de mltiplos isolados patognicos de bactrias da espcie Streptococcus agalactiae (principal causa de infeco neonatal em humanos), Tettelin e colaboradores (2005) demonstraram que esta espcie pode ser descrita por um pan-genoma, constitudo por um conjunto de genes compartilhados por todos os isolados (genoma central) e por um segundo conjunto de
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Figura 4. Anlise comparativa de genomas. O esquema representa genericamente os trs nveis de abordagem da genmica comparativa de procariotos (e tambm de eucariotos) e algumas anlises comumente realizadas. Uma vez que seqncias genmicas completas so obtidas atravs do seqenciamento em larga escala dos genomas de diferentes espcies, anlises comparativas envolvendo (i) a estrutura genmica, (ii) as regies codificantes e (iii) as regies no codificantes entre estes genomas podem ser realizadas, oferecendo mltiplas perspectivas acerca dos organismos estudados. Neste painel, segmentos genmicos sintnicos entre os genomas hipotticos A, B e C so representados por barras horizontais de cores idnticas (Estrutura genmica). De maneira similar, regies codificantes ortlogas (entre diferentes genomas) e parlogas (dentro de um mesmo genoma) so representadas por crculos de cores idnticas (Regies codificantes). A presena de elementos regulatrios ou de pseudogenes, dentro de regies no codificantes, conservados entre os genomas hipotticos A, B e C so representadas por crculos pontilhados (Regies no codificantes)
cromossmica de procariotos receberam pouca ateno no passado em relao a estudos similares em eucariotos. Este quadro vem se modificando, graas aos resultados obtidos com o seqenciamento em larga escala dos genomas de inmeros representantes destes seres vivos (Rocha 2004a). Comparaes envolvendo a estrutura global de genomas procariticos completamente seqenciados possibilitam a obteno de informaes sobre a organizao e evoluo destes genomas e tambm a identificao de caractersticas nicas nos mesmos, permitindo revelar e compreender as foras atuantes nestes processos, muitas vezes relacionadas a atividades celulares fundamentais como a expresso gnica coordenada, a replicao cromossmica e a diviso celular (Rocha 2004b). Estas pesquisas incluem tipicamente (i) a descri-
o de caractersticas estruturais do DNA (como por exemplo, tamanho do genoma, contedo GC [guanina+citosina] global, variaes do contedo GC ao longo do genoma, freqncias de mono- e oligonucleotdeos, desvios na utilizao de cdons e de aminocidos, entre outros) (ii) a anlise do contedo e distribuio de repeties e outras regies de baixa complexidade, (iii) a identificao de regies sintnicas conservadas e de eventos de rearranjo genmico e (iv) a anlise de regies limtrofes entre regies sintnicas vizinhas (breakpoints). Atravs de anlises como estas foi possvel, por exemplo, demonstrar que o processo de replicao cromossmica um dos principais responsveis pela organizao e pela inter-relao entre muitos dos elementos que constituem a organizao genmica em procariotos
genes formado por genes parcialmente compartilhados e genes cepa-especficos (genoma dispensvel), ou seja, constitudo pela soma dos genes que representam a essncia (centrais) e a diversidade (dispensveis) desta espcie. Resultados similares foram obtidos analisando-se isolados provenientes de outras espcies ( Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis , Escherichia coli e Haloquadratum walsbyi ) e modelos matemticos baseados nos dados obtidos para os diferentes grupos analisados mostraram que, enquanto para algumas espcies (Bacillus anthracis) o pan-genoma pode ser completamente descrito com o seqenciamento dos genomas de apenas alguns poucos representantes, em outras espcies (Streptococcus pyogenes, Escherichia coli e Haloquadratum walsbyi ), genes novos continuaro a emergir mesmo aps o seqenciamento dos genomas de centenas ou milhares de cepas, sugerindo que o pool de genes disponveis no universo microbiano muito maior do que se imaginava (Tettelin et al 2005; Medini et al 2005; Chen et al 2006; Legault et al 2006). Embora o significado do pangenoma ainda no seja bem compreendido (uma possibilidade seria a de que ele estaria envolvido na adaptao a diferentes nichos ecolgicos), estes estudos demonstram claramente a necessidade de se analisar genomas de mltiplos isolados, e no apenas um ou dois representantes de cada espcie, para que se tenha uma compreenso global da complexidade das espcies bacterianas. Comparaes envolvendo regies no codificantes O processo de regulao transcricional um importante mecanismo de adaptao em procariotos, no qual protenas regulatrias e sinais regulatrios localizados nas regies extra-gnicas so elementos-chaves envolvidos. Neste sentido, comparaes entre regies no codificantes de genomas de diferentes espcies procariticas tm auxiliado grandemente a identificao e caracterizao de segmentos genmicos com papis regulatrios (Pareja et al 2006), contribuindo para a elucidao dos circuitos genticos de regulao transcricional nestes organismos. Estas abordagens baseiam-se na suposio de que regies funcionalmente importantes encontram-se sob presso seletiva e, portanto, tendem a evoluir com uma taxa menor do que regies sem nenhum papel funcional (Wei et al 2002). Por outro lado, comparaes entre protenas j caracterizadas e regies no
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codificantes em inmeras espcies de procariotos tm sido usadas na identificao e caracterizao de cpias obsoletas de genes ou, em outras palavras, fsseis moleculares chamados pseudogenes (Liu et al 2004; Lerat & Ochman 2005). Tais seqncias podem ser reconhecidas por apresentarem rupturas em seus marcos de leitura provocadas por mudanas de fase e por cdons de parada prematuros (Lerat & Ochman 2005). Por possurem um genoma muito compacto, rico em genes e contendo muito pouco DNA no codificante, acreditava-se que a formao de pseudogenes em microrganismos procariticos era mnima (com algumas raras excees bem conhecidas). Entretanto, atualmente, pseudogenes so reconhecidos como um atributo normal de genomas procariticos, encontrados em virtualmente todos os genomas procariticos j analisados, particularmente em bactrias patognicas que surgiram recentemente, nas quais a presena destes fsseis moleculares ocorre em grande nmero (Lerat & Ochman 2005; Ochman & Davalos 2006). Estudos envolvendo a identificao e a caracterizao da origem e funo primitiva de genes extintos so muito importantes para a compreenso da evoluo do proteoma e da natureza e dinmica dos genomas procariticos (Ochman & Davalos 2006). Concluses e perspectivas para o futuro A anlise comparativa de genomas possui variadas aplicaes em diferentes campos do conhecimento, desde a anlise da estrutura, organizao e evoluo dos genomas at o desenvolvimento de mtodos mais eficientes de preveno, tratamento e diagnstico de doenas parasitrias, por exemplo. Alm disso, por envolver anlises em larga escala, exigindo, portanto, mtodos computacionais para sua realizao, os desafios impostos pela necessidade de se comparar grandes, diversificados e complexos volumes de dados, oriundos dos inmeros projetos genoma, tm estimulado o desenvolvimento de novos mtodos, algoritmos e ferramentas computacionais e tambm o aprimoramento de tcnicas j existentes. Sem dvida, a anlise comparativa de genomas constitui um campo frtil para pesquisas envolvendo diversos aspectos da biologia dos organismos procariticos (e tambm eucariticos), como a gentica, a bioqumica, a evoluo e, ainda, os mecanismos moleculares da patognese, do espectro de hospedeiros e das diferenas
fenotpicas entre alguns de seus representantes. Neste sentido, diferentes abordagens tm sido desenvolvidas e empregadas na comparao de seqncias genmicas, oferecendo assim mltiplas perspectivas acerca dos organismos estudados. Com o constante aprimoramento dos mtodos de seqenciamento em larga escala ocorrido nos ltimos anos, aumentando substancialmente a rapidez e a eficincia com que genomas inteiros so seqenciados (Shendure et al 2008), e a recente possibilidade de se obter seqncias genmicas (completas ou parciais) de comunidades inteiras de microrganismos diretamente de amostras ambientais (metagenmica), novas e importantes descobertas cientficas e avanos tecnolgicos podem ser antecipados para o futuro. Referncias bibliogrficas Abby S, Daubin V. Comparative genomics and the evolution of prokaryotes. Trends Microbiol 2007 March;15(3):135-141. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990 Oct 5;215(3):403-10. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1997 Sep 1;25(17):3389-402. Batzoglou S, Pachter L, Mesirov JP, Berger B, Lander ES. Human and mouse gene structure: comparative analysis and application to exon prediction. Genome Res 2000 Jul;10(7):950-8. Behr MA, Wilson MA, Gill WP, Salamon H, Schoolnik GK, Rane S, et al. Comparative genomics of BCG vaccines by wholegenome DNA microarray. Science 1999 May 28;284(5419):1520-3. Binneck E. As micas: integrando a bioinformao - O papel da bioinformtica em expanso. Biotecnol Cinc Des 2004 Janeiro/Junho;32:28-37. Binnewies TT, Motro Y, Hallin PF, Lund O, Dunn D, La T, Hampson DJ, Bellgard M, Wassenaar TM, Ussery DW. Ten years of bacterial genome sequencing: comparativegenomics-based discoveries. Funct Integr Genomics 2006 July;6(3):165-185. Blanchette M. Computation and Analysis of Genomic Multi-Sequence Alignments. Annual Review of Genomics and Human Genetics 2007 September 24;8(1):193-213. Bray N, Dubchak I, Pachter L. AVID: A global alignment program. Genome Res 2003 Jan;13(1):97-102. Bray N, Pachter L. MAVID: constrained ancestral alignment of multiple sequences. Genome Res 2004 Apr;14(4):693-9. Brosch R, Pym AS, Gordon SV, Cole ST. The
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GLOSSRIO Algoritmo. Procedimento organizado (passos e instrues) para executar um determinado tipo de clculo ou solucionar um determinado tipo de problema. Alinhamento de seqncias. Processo de alinhar (colocar lado a lado) duas ou mais seqncias do mesmo tipo (nucleotdicas ou proticas) de forma a obter o mximo de identidade entre elas com o propsito de determinar o grau de similaridade. Alinhamento global. Alinhamento de pares de seqncias nucleotdicas ou proticas ao longo de toda a extenso das mesmas. Alinhamento local. Alinhamento de uma ou mais partes de duas seqncias nucleotdicas ou proticas. Anlise filogentica. Anlise filogentica ou filogenia consiste no estudo das relaes evolutivas (ou seja, na reconstruo da histria evolutiva) entre grupos de organismos ou outras entidades que se acredita possurem um ancestral comum, como por exemplo, espcies, populaes e genes. Analogia. Relao entre dois caracteres quaisquer que descendem, por convergncia, de caracteres ancestrais no relacionados entre si (Fitch 1970, 2000). Bioinformtica e Biologia Computacional. Em 17 de julho de 2000, o National Institutes of Health (NIH), uma das agncias do departamento de sade norteamericano com reconhecimento internacional na rea de pesquisa biomdica, divulgou sua definio de trabalho para Bioinformtica e para Biologia Computacional, elaborada pelo Biomedical Information Science and Technology Initiative Consortium (BISTIC) Definition Committee. De acordo com este documento A bioinformtica e a biologia computacional tm suas razes nas cincias da vida bem como nas cincias da computao e informao e na tecnologia. Ambas estas abordagens interdisciplinares se beneficiam de disciplinas especficas, tais como a matemtica, a fsica, as cincias da computao e a engenharia, a biologia e as cincias do comportamento. Cada uma delas mantm interaes muito estreitas com as cincias da vida para concretizar todo o seu potencial. A bioinformtica aplica princpios das cincias da informao e da tecnologia para tornar os vastos, diversificados e complexos dados produzidos pelas cincias da vida mais compreensveis e teis. A biologia computacional usa abordagens matemticas e computacionais para resolver questes tericas e experimentais na biologia. Embora a bioinformtica e a biologia computacional sejam distintas, h significativa sobreposio e atividade em suas interfaces. (...) Bioinformtica: pesquisa, desenvolvimento ou aplicao de ferramentas e abordagens computacionais para ampliar o uso de dados de origem biolgica, mdica, comportamental ou de sade, incluindo adquirir, armazenar, organizar, arquivar, analisar ou visualizar tais dados. Biologia Computacional: desenvolvimento e aplicao de mtodos analticos e tericos de dados e tcnicas de modelagem matemtica e simulao computacional para o estudo de sistemas biolgicos, comportamentais e sociais. (BISTIC Definition Committee, 2000). [Traduo livre do autor]. DNA. Sigla em ingls para deoxyribonucleic acid, ou cido desoxirribonuclico. cido nuclico constitudo por desoxirribose, fosfato e pelas bases nitrogenadas adenina, guanina, citosina e timina. Contm as instrues genticas usadas no desenvolvimento e funcionamento de todos os seres vivos. Fatores epigenticos. Fatores (no genticos) responsveis pelo controle temporal e espacial da atividade de todos os genes necessrios para o desenvolvimento de um organismo complexo desde o zigoto at a fase adulta (citado por Strohman 1997). Fuso/Fisso gnica. Foi observado que determinados pares de protenas funcionalmente relacionadas entre si, presentes em certos organismos, tm homlogos em outros organismos fundidos em uma nica cadeia protica (Marcotte et al 1999; Enright et al 1999). O processo de formao destas protenas chamado de fuso gnica (quando h a adio de genes ou seqncias funcionais em uma cadeia de DNA) ou fisso gnica (quando h a perda de genes ou seqncias funcionais em uma cadeia de DNA). Eventos de
fuso/fisso gnica so fenmenos naturais reconhecidos como uma das principais foras evolutivas na criao de protenas de mltiplos domnios. Genes. Genes so as unidades hereditrias em todos os organismos vivos, formando componentes essenciais do genoma (o conjunto completo de informao gentica) destes organismos, sendo responsveis pelo desenvolvimento fsico, pelo metabolismo e tambm, at certo ponto, seu comportamento. Alguns genes produzem molculas de RNA enquanto outros desempenham importantes papis regulatrios ou estruturais. A maioria dos genes codifica protenas, grandes molculas compostas de longas cadeias de aminocidos, que respondem pela maioria das reaes qumicas desempenhadas pela clula. Genoma. Termo criado, em 1920, por Hans Winkler, professor de Botnica na Universidade de Hamburgo. Designa toda a informao hereditria de um organismo que est codificada no seu DNA (ou, em alguns vrus, no RNA). Isto inclui tanto os genes como as seqncias no codificadoras (conhecidas como DNA-lixo). Genmica. Anlise (em larga escala) do genoma completo de um organismo. Homologia. Relao entre dois caracteres (traos genticos, estruturais ou funcionais de um organismo) quaisquer que descendem de um caractere ancestral comum, normalmente com divergncia (Fitch 1970, 2000). Matriz de substituio. Matriz que representa todas as possveis trocas entre aminocidos, nas quais um valor atribudo a cada uma destas trocas. Estes valores so proporcionais probabilidade de ocorrncia de cada troca, tomandose como base um determinado modelo evolutivo. PAM Percent Accepted Mutation (Dayhoff et al 1978). BLOSUM - BLOcks SUbstitution Matrix (Henikoff & Henikoff 1992). Metagenmica. Tambm conhecida como genmica ambiental, ecogenmica, ou ainda genmica de comunidades, consiste na anlise do material gentico obtido diretamente de amostras ambientais, permitindo o estudo de organismos que no podem ser facilmente cultivados em laboratrio, bem como o estudo de organismos em seus ambientes naturais (Metagenomics 2008). Micobactrias. O gnero Mycobacterium (familia Mycobacteriaceae, ordem Actinomycetales), um dos mais antigos e bem conhecidos gneros de bactria, foi introduzido por Lehmann e Neumann em 1896, para incluir os agentes causadores da hansenase e da tuberculose, bactrias que haviam sido anteriormente classificadas como Bacterium leprae e Bacterium tuberculosis, respectivamente (Goodfellow & Minnikin, 1984). Os organismos pertencentes a este gnero so aerbios, imveis e no formam endsporos ou esporos; tm forma de bastonetes delgados, retos ou ligeiramente encurvados, com raras formas ramificadas. Seu DNA rico em guanina (G) e citosina (C) (de 62 a 70% G+C, com exceo de Mycobacterium leprae que tem 57.8% de GC). As micobactrias possuem ainda caractersticas peculiares como lcool-cido resistncia (uma vez coradas por corantes bsicos, resistem descolorao por solues lcool-cidas sendo, portanto, denominadas bacilos lcool-cido resistentes) e resistncia incomum dessecao e a agentes qumicos. Ortlogos. Genes homlogos em espcies diferentes originados de um gene ancestral comum, durante a especiao (Fitch 1970, 2000). peron. Grupo de genes funcionalmente relacionados entre si, regulados (em conjunto) por um mesmo operador. Parlogos. Genes homlogos em uma espcie em particular originados por duplicao (Fitch 1970, 2000). Protenas. Molculas compostas por aminocidos ligados entre si em uma ordem particular, especificada pelas seqncias de DNA dos genes
que as codificam. So componentes essenciais dos organismos, participando de todos os processos celulares (catlise enzimtica, sinalizao celular, resposta imune, adeso celular, ciclo celular etc.) e tambm como componentes estruturais e mecnicos. Protemica. Anlise (em larga escala) do conjunto completo de protenas expressas por uma clula, tecido ou organismo, em um dado momento e sob certas circunstncias ambientais. Regies sintnicas. Sintenia foi um termo originalmente cunhado para designar a presena de dois ou mais loci gnicos (prximos ou no) no mesmo cromossomo. Atualmente, refere-se tambm a duas regies de genomas distintos que mostram considervel grau de similaridade de seqncia entre si e algum grau de conservao da ordem dos genes nestas regies e que, portanto, tm probabilidade de descender de um ancestral comum. Regies de baixa complexidade. Regies em cidos nuclicos ou protenas com desvios na composio de seus resduos (nucleotdeos ou aminocidos), incluindo tratos homopolimricos (longas seqncias formadas pelo mesmo resduo), repeties com curtos espaos entre si e sobre-representaes mais sutis de alguns resduos. Seqncia genmica. Toda ou parte da cadeia de DNA que compe um genoma. Simbiontes. Organismos que vivem em simbiose, isto , dois organismos distintos que mantm ntima e longa associao entre si, na qual um ou ambos se beneficiam desta relao. Esta associao inclui relaes nas quais uma das partes vive sobre (ectobiose) ou dentro (endobiose) da outra, podendo ser obrigatria, ou seja, necessria sobrevivncia de pelo menos um dos organismos envolvidos, ou facultativa, na qual a associao benfica, porm no essencial sobrevivncia dos organismos. As categorias de simbiose incluem o mutualismo (quando ambos se beneficiam), o comensalismo (quando apenas um se beneficia e o outro no significativamente lesado ou beneficiado) e o parasitismo (quando apenas um se beneficia e o outro lesado pela relao) (Symbiosis 2008). Transcriptmica. Anlise (em larga escala) do conjunto de todos os RNA mensageiros (transcritos) de uma clula, tecido ou organismo, em um dado momento e sob certas circunstncias ambientais. Referncias bibliogrficas BISTIC Definition Committee. NIH working definition of bioinformatics and computational biology. 2000. Disponvel em: <http://www.bisti.nih.gov/ CompuBioDef.pdf> Acesso em: 26 mar. 2008. Dayhoff MO, Schwartz RM, Orcutt BC. A model of evolutionary change in proteins. In: Dayhoff MO, ed. Atlas of Protein Sequence and Structure. Washington DC: National Biomedical Research Foundation; 1978. v.5. Suppl.3. p.345-352. Enright AJ, Iliopoulos I, Kyrpides NC, Ouzounis CA. Protein interaction maps for complete genomes based on gene fusion events. Nature 1999 Nov 4;402(6757):8690. Fitch WM. Distinguishing homologous from analogous proteins. Syst Zool 1970 Jun;19(2):99-113. Fitch WM. Homology a personal view on some of the problems. Trends Genet 2000 May;16(5):227-31. Goodfellow M, Minnikin DE. Circunscription of the genus. In: Kubica GP, Wayne LG, eds. The Mycobacteria: A Source Book. New York: Marcel Dekker; 1984. p.1-24. Henikoff S, Henikoff JG. Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc Natl Acad Sci U S A 1992 Nov 15;89(22):10915-9. Marcotte EM, Pellegrini M, Ng HL, Rice DW, Yeates TO, Eisenberg D. Detecting protein function and proteinprotein interactions from genome sequences. Science 1999 Jul 30;285(5428):751-3. Metagenomics. In Wikipedia: The Free Encyclopedia. Wikimedia Foundation Inc. Encyclopedia on-line. Disponvel em: <http://en.wikipedia.org/wiki/Metagenomics> Acesso em: 26 mar. 2008. Strohman RC. The coming Kuhnian revolution in biology. Nat Biotechnol 1997 Mar;15(3):194-200. Symbiosis. In Wikipedia: The Free Encyclopedia. Wikimedia Foundation Inc. Encyclopedia on-line. Disponvel em: <http://en.wikipedia.org/wiki/Symbiosis> Acesso em: 26 mar. 2008.
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Pesquisa
SEXAGEM DE EMBRIES BOVINOS
Atualidades sobre a aplicao da tcnica de Sexagem aliada ao PCR (Polymerase Chain Reaction), desde o campo at a comercializao de embries sexados.
Fotografias e ilustraes cedidas pelos autores
sexagem de embries por anlise de DNA, agregada produo in vitro, constituem ferramentas importantes que permitem intensificar e acelerar o melhoramento gentico de animais de alto valor zootcnico. Atravs destas tecnologias o criador pode escolher o sexo desejado ainda na fase embrionria,
estudadas h mais de 25 anos e a reao em cadeia da polimerase (PCR) reproduz artificialmente a forma como o DNA replicado na natureza (HASLER et al, 2002). Apresentada comunidade cientfica em 1984, a PCR foi adotada como uma ferramenta de pesquisa essencial dado potencialidade de utilizao na rea de biologia molecular (OLIVEIRA; HENKES, 2002). A sexagem de Embries Bovinos pela tcnica de PCR (do ingls Polymerase Chain Reaction) uma biotecnologia relacionada transferncia de embries (REICHENBACH et al., 2001), que contribui diretamente na otimizao da eficincia reprodutiva para a melhora da performance produtiva e da lucratividade dos rebanhos bovinos (SCARCELLI et al, 2004). COLHEITA DE OCITOS O primeiro passo a colheita in vitro de ocitos, geralmente efetuada por puno folicular, utilizando agulha acoplada a uma seringa ou bomba a vcuo, guiada por ultrasonografia transvaginal (GONALVES et al., 2002), este mtodo de colheita por ser no-cirrgico tem mostrado praticidade na utilizao repetida da mesma doadora (HAFEZ, 1995). A puno folicular transvaginal contribui para reduzir o intervalo entre geraes, para acelerar o melhoramento gentico, bem como pode ser repetida em vrias oportunidades num mesmo animal sem prejuzo de sua capacidade reprodutiva
Figura 1: Colheita de ocitos Fonte: Gonalves, 2001
PAOLA GOMES PASSAGLIA BILOGA CENTRO DE ENSINO SUPERIOR DE UBERABA paolapassaglia@hotmail.com ANTONIO HAMILTON CHAVES DOUTOR EM ZOOTECNIA PROFESSOR DO CENTRO FEDERAL DE EDUCAO TECNOLGICA DE UBERABA ahchaves@terra.com.br
diminuindo custos com receptoras, tratamentos hormonais para sincronizao, manejo e locao de espao na propriedade. O Brasil tem se destacado como um dos pases que mais aplica comercialmente e em larga escala as diversas biotecnologias utilizadas na reproduo animal. As tcnicas para a determinao do sexo em embries bovinos tm sido
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ocito e melhora o posterior desenvolvimento embrionrio. Alm do meio, outros fatores relacionados com o ambiente de cultivo celular devem ser considerados como fundamentais. Geralmente, a maturao de ocitos bovino realizada a 37,8oC por 24 horas em atmosfera de 5% de CO2 em ar e umidade saturada (GONALVES; 2002). FECUNDAO IN VITRO A FIV tambm uma tcnica fundamental para o uso de todas as novas biotcnicas da reproduo animal, pois atravs dela possvel produzir embries pr-sexados e embries ou zigotos em vrios estgios de desenvolvimento, para os estudos de transgnese e clonagem. Recentemente, tambm tem sido sugerido o uso da FIV para avaliar o potencial reprodutivo de touros, avaliando com mais preciso a fertilidade de um reprodutor (DODE, 2000). As tcnicas mais utilizadas para separao de espermatozides vivos dos demais componentes do smen e dos crioprotetores so o swim up, o gradiente de percoll e o lavado espermtico. A tcnica ideal para separao espermtica deve ser rpida, simples, de baixo custo, capaz de recuperar a maioria dos espermatozides mveis, no resultar em alteraes espermticas, remover espermatozides mortos e outras clulas, incluindo mi-
Figura 2: ocito maturado Fonte: Folheto de divulgao do Congresso Brasileiro de Reproduo Animal, 2006
(PIETERSE et al., 1991). Com o desenvolvimento de tcnicas de reproduo assistida em animais, ocorreu um grande avano na otimizao e multiplicao de fmeas de interesse para a produo animal. A aspirao de ovcitos imaturos por puno folicular, associada maturao e fecundao in vitro dos mesmos, e ao cultivo in vitro dos embries, permite que sejam produzidas, em mdia, 36 crias/ano de uma nica fmea. (RUMPF, 2006). MATURAO IN VITRO A maturao dos ocitos (Figura 2), envolve as transformaes nuclear e citoplasmtica, e est ligada a uma srie de mudanas estruturais e bioqumicas que tornam o gameta feminino apto a ser fecundado e ter desenvolvimento embrionrio subseqente.. O ocito presente no folculo primordial, uma vez ativado, deve crescer e sofrer vrias modificaes de ordem ultra-estrutural, citoplasmtica e bioqumica com a finalidade de se tornar competente para reiniciar e completar
a maturao (GONALVES et al, 2002). Tambm usual a utilizao do LH, ou do hormnio folculo estimulante (FSH) ou ainda a combinao dessas gonadotrofinas. A maioria dos resultados publicados demonstra que a adio de gonadotrofinas ao meio de maturao de ocitos bovinos, aumenta a capacidade de fecundao do
Figura 3: Clulas (em estgio de clivagem) de embries bovinos cultivados .in vitro. Foto de divulgao do curso de Fecundao in vitro da Universidade Federal de Pelotas, 2006
Figura 4: Sistema de micromanipulao composto por microscpio invertido, 2 microseringas para a aspirao e 2 micromanipuladores mecnicos (GARCIA; UVO, 2002)
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crorganismos, remover substncias txicas e bioativas, permitir o processamento de grandes volumes de smen, alm de permitir o controle da concentrao e volume final da suspenso espermtica (GONALVES et al., 2002). A composio qumica dos meios para o cultivo in vitro de embries foi determinada pela avaliao de suas necessidades metablicas. A maioria dos meios consiste de solues salinas acrescidas de um componente macromolecular, podendo ser preparadas em laboratrios prprios, ou adquiridas comercialmente (MATTOS et al, 1991). CULTIVO O cultivo de clulas in vitro (Figura 3) requer o uso de substncias com propriedades especiais como, presena de protenas, propriedades sulfarctantes e ausncia de toxinas, para um bom desenvolvimento celular (SOLANO & PILAR, 1984). A composio qumica dos meios para o cultivo in vitro de embries foi determinada pela avaliao de suas necessidades metablicas. A maioria dos meios consiste de solues salinas acrescidas de um componente macromolecular, podendo ser preparadas em laboratrios prprios, ou adquiridas comercialmente (MATTOS et al, 1991). MICROASPIRAO DO DNA (BIPSIA) Para realizar a bipsia de embries utiliza-se um micromanipulador Leitz (Figura 4). Uma placa acoplada e montada em um dos lados do micromanipulador. Antes da biopsia, os embries so individualmente lavados atravs de trs microgotas (100 l) de protenalivre PBS em uma placa de petri de 100 mm2 . Os embries so aderidos ao fundo da placa de petri e so visualizados a uma amplificao de 100 vezes e alinhados ao centro. Uma pequena poro ideal de 6 a 10 clulas do blastocisto removida pelo movimento direto da lmina (Figura 5), geralmente na borda do embrio. Depois que cada embrio biopsiado, a lmina descartada.
Figura 5: Etapas do processo de micromanipulao para a retirada de bipsia embrionria por aspirao (GARCIA; UVO, 2002)
Para facilitar a liberao dos embries biopsiados do fundo da placa de petri, adicionado a cada microgota contendo embrio biopsiados, 50l de Sur-
factant Fluramic a 0,4% ou 50l de lcool polivinil a 1% (HASLER et al, 2002). Segundo Ardais et al (2005); os embries geralmente so biopsia-
Figura 6. Diagrama ilustrando as diferentes etapas durante a amplificao de DNA utilizando a tcnica de PCR (OLIVEIRA; HENKES, 2002)
Figura 7: Ilustrao de resultado da PCR em bipsia de embries bovinos com eletroforese em gel de agarose corado com Brometo de Etdio (ALONSO, 2006)
Embries analisados como machos Embries presumveis fmeas Total de embries biopsiados
N de Embries Testados 79 31 110
ResultadosConfirmadosPor US ou Nascimento 74 25 99
Taxa de Acerto 93.7% 80.5% 90.0%
Tabela 1: Resultados gerais de sexagem por PCR obtidos entre abril de 1999 e maro de 2001, para embries j transferidos e com resultado de sexagem por ultra-sonografia (GARCIA e UVO, 2002).Nos ltimos anos, o Brasil apresentou uma demanda crescente do uso desta tecnologia em animais de gentica superior, utilizando a aspirao, a amplificao da regio repetitiva Y especfica do cromossomo, seguida da eletroforese, protocolos estes recentemente mais utilizados comercialmente (GARCIA e UVO, 2002)
dos no 6 dia de cultivo, mediante microaspirao utilizando um micromanipulador mecnico. POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR) Esta tcnica utilizada para amplificar e detectar DNA especfico do cromossomo Y (Fig. 6), presente somente nas clulas dos embries do sexo masculino. As clulas biopsiadas so submetidas lise com proteinase K, segundo Luz et al (2000); Almodim et al (2005) e Ardais (2005). O DNA sintetizado em um ciclo inicial e passa a ser o molde para a sntese posterior de DNA dos ciclos subseqentes. Aps aproximadamente 30 ciclos de sntese os produtos de PCR devero incluir, alm do DNA original, aproximadamente 105 cpias da seqncia alvo. A reao envolve ci-
clos seqenciais completos compreendendo trs etapas bsicas: desnaturao, anelamento e sntese do DNA (OLIVEIRA e HENKES, 2002) e extenso dos .primers. (PEREIRA, 1996). a) Desnaturao: Compreende a dissociao das ligaes que mantm unida a dupla fita de DNA. Isso obtido tipicamente pela utilizao de temperaturas entre 93-95C; b) Anelamento: Ligao das seqncias iniciadoras com a seqncia alvo. Esse passo normalmente utiliza temperaturas entre 50 e 70C dependendo da Tm ou temperatura de dissociao (do ingls temperature of milting) calculada. Temperaturas de anelamento mais elevadas aumentam a especificidade da reao. c) Sntese do DNA: A partir dos iniciadores j ligados seqncia alvo, comea a sntese de uma nova seqncia complementar. As temperaturas
que conferem maior eficincia nessa etapa esto entre 70-75C (OLIVEIRA e HENKES, 2002). d) Extenso dos primers: Esta etapa feita a 72C, que a temperatura tima para a enzima Taq DNA polimerase, que durante esta fase utiliza-se dos nucleotdeos includos entre os reagentes para a reao de PCR e completa a fita sintetizada, de acordo com a fita original, a partir dos .primers. . Ao final desta etapa, repetem-se novamente os ciclos por aproximadamente 30 vezes, o que faz com que a seqncia alvo seja amplificada 1 bilho de vezes (PEREIRA, 1996). Segundo Oliveira e Henkes (2002), Essa quantidade de material pode ser facilmente visualizada como bandas de tamanho especfico quando submetida
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eletroforese em gel de agarose (Figura 7). Ardais (2005), Almodim (2005) e Alonso (2006), ressaltam que, duas bandas representam machos, podendo ser visualizados os cromossomos X e Y, e nas fmeas apenas a visualizao do cromossomo X. A separao de molculas de cidos nuclicos em laboratrios de biologia molecular realizada com o auxlio da tcnica de eletroforese em gel de agarose. Os gis de agarose so, geralmente, corados com solues de brometo de etdio (EtBr), uma substncia intercalante de alta toxicidade e mutagenicidade, que revela os cidos nuclicos ao fluorescer sob luz ultravioleta (AZEVEDO et al., 2003). O USO COMERCIAL DA SEXAGEM DE EMBRIES Todos os setores da indstria do gado derivam do benefcio econmico da habilidade de determinar o sexo de embries antes que a prenhez esteja estabelecida. Os benefcios maximizados pela sexagem de embries durante a transferncia rotineira e superovulao das doadoras, esto sendo realizados agora em uma variedade de aplicaes comerciais. Os embries sexados podem ser congelados com sucesso, contudo realando a utilidade comercial do procedimento da biopsia como uma ferramenta rotineira da produo (HEER; REED, 1991). A atual situao econmica da pecuria mundial exige dos produtores mxima eficincia para garantia de retorno econmico. Desta forma, elevados ndices de produo, associados alta eficincia reprodutiva devem se constituir em metas para tcnicos e os criadores alcanares melhor produtividade e satisfatrio retorno econmico (SCARCELLI et al, 2004). Segundo Bredbacka; Kankaanp; Peippo (1995) e Shea (1999) a sexagem de embries bovinos baseada na metodologia
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de PCR tm se tornado mais comum para fins comerciais, onde se observa uma eficincia (proporo de amostras diagnosticadas) de 90-95% e acurcia de 93-98%, conforme dados coletados por Garcia e Uvo (2002) publicado no jornal o Embrio, da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embries (Tabela 1). Nos ltimos anos, o Brasil apresentou uma demanda crescente do uso desta tecnologia em animais de gentica superior, utilizando a aspirao, a amplificao da regio repetitiva Y especfica do cromossomo, seguida da eletroforese, protocolos estes recentemente mais utilizados comercialmente (GARCIA e UVO, 2002). CONSIDERAES FINAIS A sexagem de embries bovinos pela tcnica de PCR uma biotcnica, bastante utilizada atualmente; todavia, complexa que requer equipamentos, experincia e habilidade profissional para a sua execuo, alm disso, uma tcnica que indicada somente para a produo de crias geneticamente privilegiadas e com alto valor de Mercado. No Brasil, a sexagem j tem relevncia comercial, visto que vrios profissionais e empresas de biotecnologia da reproduo oferecem servios para a realizao da sexagem de embries a nvel comercial. A estreita relao da sexagem e transferncia de embries com a produo animal tm alterado o comrcio tradicional de reprodutores, elevando substancialmente o valor das fmeas geneticamente superiores. BIBLIOGRAFIA 1. ALMODIN, C. G. A bovine protocol for training professionals in preimplantation genetic diagnosis using polimerase chain reaction. Fertility and Sterility, V.84, no 4, p. 895 . 900, 2005. 2. ALONSO, R.V.; WEPPERT, M.; GARCIA, J.F.; REICHENBACH, H.D. Effect of biopsy by peizo-micromanipulation on development capacity of in vitro produced bovine morulae and blastocysts. Acta Scientiae Veterinari-
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Pesquisa
BIOTECNOLOGIA NA INDSTRIA FARMACUTICA

Reviso dos principais processos
indstria farmacutica necessita de processos biotecnolgicos para obteno de vrios produtos importantes para a sade humana e animal. A histria da biotecnologia moderna comea inclusive com o desenvolvimento de um medicamento, a penicilina, na primeira metade do sculo XX. A partir de ento, processos biotecnolgicos so utilizados na produo de vitaminas, hormnios, antibiticos, vacinas e enzimas. Este trabalho apresenta as caractersticas gerais desses processos. Na biotecnologia industrial o reator o elemento central, pois nele que se desenvolvem as transformaes de interesse; embora fundamental, no o mais importante do processo. Dois conjuntos de operaes devem ser considerados: 1) Os tratamentos iniciais (Upstream processes)- antecedem a operao. 2) Os tratamentos finais (downstream processes)- englobam a separao e a purificao dos produtos e tratamentos dos residuos (Borzani et al,2001) O sucesso de um dado processo fermentativo depende muito de uma correta definio de 4 pontos bsicos: microrganismo, meio de cultura, a forma de conduo do processo fermentativo e as etapas de recuperao do produto (Schmidell et al., 2001). Os trs primeiros itens fazem parte dos upstream processes enquanto o ltimo do downstream processes. Na verdade, esses quatro pilares de um processo fermentativo interagem enormemente, sendo necessrio buscar defin-los de forma conjunta, levando em considerao aspectos biolgicos e econmicos. O desempenho de um dado microrganismo depende muito da composio do meio de cultura em que este colocado. A seguir, sero abordados cada um destes pilares. 1- TIPOS DE MICRORGANISMOS So divididos em vrus, procariontes (bactrias e cianofceas) e eucariontes (fungos, protozorios, algas, cultura de tecidos animais e vegetais). Os vrus patognicos apresentam interesse para vacinas, enquanto que vrus bacterifagos so importantes para estudos genticos ( para mapeamento da posio dos genes e para construo de novas cepas por transduo ou recombinao. Na recombinao, fagos so usados como vetores para introduzir DNA estranho na clula (Moo-Young). Bactrias e fungos so os microrganismos responsveis pela maioria dos processos biotecnolgicos farmacuticos. As categorias de produtos da fermentao bacteriana so: - single cell protein ou biomassa - produtos finais (ex: solventes e cidos) - metablitos primrios (ex: aa., enzimas e nucletideos) - metabolitos secundrios (ex: anticorpos, pigmentos e polisacardeos) A composio do meio pode influenciar o metabolismo das clulas diretamente atravs da nutrio ou indiretamente e pela alterao da forma do crescimento como a eficincia da aerao- particular e importante quando h crescimento de organismos filamentosos (Moo-Young). A cultura de tecidos de clulas animais (rpteis, peixes, aves, anfbios, insetos) e vegetais cultivadas em larga escala para produo de vacinas, para acmulo de metablitos celulares e para bioconverso de substratos como esterides e alcalides. A cultura de tecidos de clulas vegetais para produo de agentes farmacologicamente ativos uma rea promissora. A obteno desses microrganismos pode ser feita de vrias maneiras: isolamento a partir de recursos naturais; compra em colees de culturas; obteno de mutantes naturais; obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais; obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de engenharia gentica. Para uma aplicao industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes caractersticas gerais: - apresentar elevada eficincia na converso do substrato em produto; - permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentrao do produto no caldo fermentado; - no produzir substncias incompatveis com o produto; - apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico; - no ser patognico; - no exigir condies de processo muito complexas; - no exigir meios de cultura dispendiosos;
Rogrio Saad Vaz, BMD, Ph.D., Coordenador do curso de Biomedicina da Faculdade Pequeno Prncipe Pesquisador do Instituto Pel Pequeno Prncipe rogeriovaz@fpp.edu.br Maria Rosa Machado Prado, M.Sc. , Professora Adjunta do curso de Farmcia da Universidade Positivo maria.rosamachado@up.edu.br Ftima de Carvalho, M.Sc., Professora Adjunta do curso de Farmcia da Universidade Positivo fatimadecarvalho@up.edu.br
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- permitir a rpida liberao do produto para o meio. 2. MEIOS DE CULTURA A formulao de um meio de cultivo deve levar em conta as caractersticas nutricionais do microrganismo a ser cultivado, de forma que no existe uma formulao nica para o desenvolvimento de microrganismos em condies artificiais. No caso de cultivo de clulas vegetais e animais in vitro, monocamadas de culturas celulares animais so indispensveis para o cultivo de clulas o isolamento e identificao de viroses. A produo de vacinas virais e de interferon so os principais processos comerciais usando clulas animais (MOOYONG). As linhagens celulares so extremamente teis na pesquisa celular, como fonte de grandes quantidades de clulas de um tipo uniforme, especialmente por poderem ser estocadas em nitrognio lquido a 196 C, por um perodo de tempo indefinido (ALBERT, 1997). Essas linhagens celulares imortalizadas podem se desenvolver ancoradas em uma superfcie plstica como monocamadas, ou prescindir da necessidade de contato e crescer em suspenso dentro de frascos nos quais o meio de cultivo levemente agitado (MOO-YOUNG). Os meios de cultivo para clulas animais so complexos, contendo solues tamponantes de sais minerais, glucose, vitaminas, aminocidos, fatores de crescimento, extratos fetais e soro. Antibiticos so usualmente incorporados nesses meios para evitar contaminao bacteriana., embora muitas vezes interfiram no isolamento e purificao do produto metablico. Independente do fato das linhagens celulares serem derivadas de diferentes mamferos ou de diferentes rgos ou do mesmo hospedeiro, elas se desenvolveram todas no mesmo tipo bsico de meio de cultivo. O cultivo celular de clulas vegetais pode ser feito em meios slidos ou em suspenso. As tcnicas e o meio usado para crescimento de plantas so similares aqueles para clulas animais, exceto que a luz essencial e extratos fetais e soro devem ser de origem vegetal. Carboidratos devem ser adicionados ao meio desde que o processo de fotossntese realizado por clulas em cultura pouco eficiente. Os reatores para crescimento de plantas no requerem altas taxas de oxigenao, embora a agitao seja importante para prevenir sedimentao celular (MOO-YOUNG). Os fatores que influem nesses cultivos so a temperatura, o pH, teor de oxignio, agitao, teor de umidade 3. BIORREATORES A engenharia da fermentao um ramo da tecnologia que estuda o desenho, desenvolvimento, construo e operao da planta e equipamentos utilizados nos pro-
cessos biolgicos em escala industrial. Nos processo de fermentao, o biorreator fornece o ambiente para o crescimento e para a atividade microbiana. Durante o perodo, previne a liberao da biomassa interna para o ambiente, assim como, impede a entrada de substncias estranhas para dentro do meio de reaes. O meio ambiente do biorreator leva em considerao os aspectos biolgicos, qumicos e fsicos (WINKLER, 1986). a) meio biolgico: favorvel quando somente o organismo que contribui ao processo est presente, sendo denominado um sistema assptico. Isto se consegue pela esterilizao do ambiente e posterior introduo do microrganismo desejado (inoculao); b) meio qumico: est relacionado com o meio de crescimento microbiano, com as concentraes adequadas de substratos ou nutrientes microbiolgicos, assim como precursores sintticos, livres de substncias inibidoras e mantidas ao pH adequado. Enquanto os nutrientes solveis so adicionados ao meio, a manuteno da oxigenao feita continuamente. Nos processos anaerbicos, deve-se em alguns casos, dispor de dispositivos para eliminar o oxignio continuamente. Outros parmetros devem ser observados, e dizem respeito baixa atividade do meio aquoso (baixa concentrao do soluto) assim como fora inica (substncias inicas em soluo precedente de sais); c) meio fsico: se refere principalmente temperatura do sistema, que para seu controle leva em conta o desenho do fermentador. Este controle, bem como a necessidade em manter-se a uniformidade das condies durante o processo, est relacionado com uma boa agitao, o que por sua vez, provoca a ruptura de estruturas do organismo (cisalhamento). 3.1 Tipos de biorreatores Vrios tipos de biorreatores podem ser utilizados e o grau de sofisticao (desenho, construo e funcionamento) dependem da sensibilidade do processo ao ambiente mantido no recipiente (WINKLER, 1986). O material utilizado na construo dos biorreatores deve ser atxico, resistente presso e corroso qumica. Os biorreatores em processos farmacuticos podem ser Qumicos ou Biolgicos: -Biorreatores Qumicos nos quais as reaes ocorrem na ausncia de clulas vivas, ou seja, so tipicamente os reatores enzimticos. -Biorreatores Biolgicos nos quais as reaes se processam na presena de clulas. Os biorreatores biolgicos so amplamente conhecidos e mais utilizados, sendo empregados desde a dcada de 40 para produo industrial. Possuem uma grande diversidade de aplicao, como produo de enzimas, antibiticos, vitaminas, cidos orgnicos, solventes, bebidas e tratamento de resduos orgnicos industriais ou domsticos.
Na classificao dos biorreatores, ainda so levados em considerao: tipo de biocatalisador: clulas ou enzimas; a configurao do biocatalisador: clulas ou enzimas livres ou imobilizadas; forma de se agitar o lquido no reator. Assim sendo, os biorreatores classificam-se em dois grupos: sistema de cultivo disperso e sistema de cultivo imobilizado. 3.2. Modo de operao A classificao Mista de Kleinstreuer a mais utilizada: 1. Reatores em fase aquosa (fermentao submersa) a. Clulas e enzimas livres: a.1) Reatores agitados mecanicamente (STR - stirred tank reactor) a.2) Reatores agitados pneumaticamente - Coluna de bolhas (bubble column) - Reatores air-lift a.3) Reatores de fluxo pistonado (plugflow) 2. Reatores em fase no-aquosa (fermentao semi-slida) b) Clulas/enzimas imobilizadas em suportes: b.1) Reatores em leito fixo b.2) Reatores com leito fluidizado c) Clulas/enzimas confinadas entre membranas: c.1) Reatores com membranas planas c.2) Reatores de fibra oca (hollow-fiber) 3. Reatores estticos (reatores com bandejas) 4. Reatores com agitao (tambor rotativo) 5. Reatores com leito fixo 6. Reatores com leito fluidizado gs-slido Os biorreatores mais amplamente empregados so os Reatores Agitados Mecanicamente (STR), constituindo cerca de 90% do total de reatores utilizados industrialmente. 3.3 Tamanho da unidade de produo A capacidade total da planta de fermentao ser obtida utilizando-se pequenas unidades ou um nmero pequeno de unidades maiores. O tamanho da unidade pode ser influenciado por: - facilidade para transporte; - espao disponvel; - custo de produo: unidade grandes acarretam menores custos que as pequenas, principalmente se forem com instrumentao sofisticada; - recipientes pequenos so adequados quando se necessita uma variedade de produtos e quando existe perigo de rompimentos.
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A capacidade dos biorreatores em fase aquosa varia conforme a necessidade. Assim, em escala de produo industrial: - At 1-2 m3: cultivo de microrganismos patognicos, clulas animais ou vegetais, em geral produtos ligados sade; - Intermediria at 100-200 m3 : para produo de enzimas, antibiticos e vitaminas; - Milhares de m3 : fermentao alcolica ou tratamento biolgico de resduos, sem assepsia. 3.4 Fornecimento de oxignio nos biorreatores O suprimento adequado de oxignio indispensvel para microrganismos aerbios, e o efeito levar a um maior ou menor rendimento da cultura. Para alguns microrganismos facultativos, que podem desenvolver-se sem oxignio, o aporte deficiente, alm de influenciar no rendimento, provoca diferenas na velocidade do crescimento e nos produtos sintetizados a partir da atividade do microrganismo (STURZA, 1995). O principal problema no fornecimento de oxignio diz respeito ao fato de ser ligeiramente solvel, o que faz com que deva ser fornecido de forma contnua, inclusive em fermentaes do tipo interrompido ou em batelada (por cargas, batch). Assim, devese colocar o gs em contato com o lquido, dissolve-lo no meio, e transferir o gs dissolvido na fase gs-lquido aos organismos. A administrao rpida de oxignio necessita, portanto, de grandes superfcies de contacto entre o gs e o lquido, para facilitar a dissoluo. Isto faz com que a administrao de oxignio e a agitao sejam prticas inseparveis em um sistema aerado (WINKLER, 1986). 3.4.1. Aerao e agitao dos biorreatores para fermentao lquida Alm de proporcionar oxignio, a aerao tambm importante para limpar o cultivo de produtos metablicos volteis e indesejveis. A agitao, direta ou como efeito secundrio da aerao, necessria pelas seguintes razes: - aumentar a velocidade de transferncia de oxignio das borbulhas de ar ao meio lquido, uma vez que os microrganismos necessitam de oxignio dissolvido; - aumentar a velocidade de transferncia de oxignio e nutrientes do meio para as clulas, evitando-se que surjam reas com baixo nvel de oxignio e nutrientes; - impedir a formao de grupos de clulas ou agregados de miclio; - aumentar a velocidade de transferncia de produtos metablicos de clulas ao meio; - aumentar a taxa ou eficincia de transferncia de calor entre o meio e as superfcies de refrigerao do fermentador. Por outro lado, a turbulncia da agitao promove: - disperso de ar em pequenas bolhas; - impedir a coalescncia das bolhas;
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- diminuir a extenso limitante da pelcula de lquido na interfase gs/lquido; - retardar a perda de gs durante o cultivo, fazendo com que as bolhas demorem mais para chegar superfcie. Alguns aspectos so extremamente importantes, uma vez que afetam o fornecimento de oxignio para o cultivo, como a geometria do sistema, sua velocidade, a altura total do lquido no fermentador, tipo de difusor e vazo de ar. Em fermentao, necessita-se das duas aes, o bombeamento e o cisalhamento. Estes efeitos so conseguidos utilizando-se turbinas e hlices. Existem modelos como a turbina com ps inclinadas, que proporcionam as duas aes ao mesmo tempo. O cisalhamento est diretamente relacionado velocidade do agitador. Assim, determinados organismos so sensveis a este efeito, e se adaptam melhor a reatores que utilizam sistema sem agitador. Durante o processo fermentativo possvel ocorrerem alteraes significativas no caldo, que pode passar condio de lquido nonewtoniano, como no caso de processos envolvendo o cultivo de fungos filamentosos. A tenso de cisalhamento varia em funo do gradiente de velocidade (dv/dr). A constante de proporcionalidade entre a tenso de cisalhamento e o gradiente de velocidade definida como a viscosidade do lquido. Assim sendo, esta viscosidade influencia o processo, e pode mudar durante a fermentao. 3.4.2 Aerao dos biorreatores para fermentao no estado slido Quando se trabalha com fermentao em estado slido, a agitao comanda pelo tipo de processo, tipo de reator e o produto desejado. Existe a fermentao com agitao ocasional ou com agitao contnua. Alguns produtos, como aflatoxina e ocratoxinas, so produzidos em sistemas agitados, e a esporulao pode ser reprimida com a agitao. Tambm a agitao pode ter efeitos adversos sobre a porosidade do substrato, provocando a compactao das partculas, impedindo a fixao do microrganismo ao slido e ocasionando o rompimento do miclio, por exemplo. A aerao do substrato facilitada em funo dos espaos vazios existentes entre as partculas slidas. 3.5 INSTRUMENTAO E CONTROLE EM BIOPROCESSSOS O sucesso de um processo fermentativo depende da existncia de condies adequadas para a produo de biomassa e formao da produto. A temperatura, pH, grau de agitao, concentrao de oxignio no meio de cultivo e outros fatores devem ser mantidos constante durante todo o processo. A manuteno dessas condies necessita um monitoramento cuidadoso da fermentao atravs de um sistema de controle pelo qual as condies timas podem
ser mantidas. O monitoramento do processo fornece importantes informaes quanto ao progresso da fermentao, essas indicam casos de contaminao, morte celular ou fermentaes que ocorrem de maneira fora do esperado.O avano dos processos fermentativos totalmente automatizados depende da existncia de sensores que produzam sinais significativos de controle. 3.5.1 CONTROLE DE PROCESSO Existem trs possveis objetivos para o controle do processo: 1) Manter uma varivel constante ao longo de tempo 2) Forar uma varivel a seguir o caminho pr-determinado ao longo do tempo 3) Otimizar algumas funes das variveis do sistema O primeiro se consegue pela regulao, o segundo por mecanismos auxiliares, o terceiro por controladores timos. Todos os aparelhos de instrumentao so geralmente conhecidos como controladores automticos. Em um sistema de controle se tem quatro classes de variveis: 1) Variveis controladas: a varivel de sada que desejamos controlar. 2) Varivel manipulada: a varivel de entrada com a que se controla . 3) Varivel de distrbio: varivel de entrada que afeta a varivel controlada. 4) Variveis de referncia: o valor desejado da varivel controlada. Os parmetros que podem ser medidos em processos fermentativos: 1) PARMETROS FSICOS: - Temperatura - Presso - Consumo de potncia - Viscosidade - Fluxo de aerao e de meio - Turbidez - Peso do fermentador 2) PARMETROS QUMICOS: - pH - Oxignio dissolvido - Oxignio e gs carbnico nos gases de sada - Potencial de redox - Concentrao de substrato - Concentrao de produto - Fora inica 3) PARMETROS BIOLGICOS: - Produtos biologicamente ativos - Atividade enzimtica - Contedo de DNA e RNA - Contedo de NADH2 e ATP - Contedo em protena 1) Parmetros Fsicos: A TEMPERATURA A taxa do crescimento microbiano , como todas as outras reaes qumicas, uma funo da temperatura. Normalmente, os microrganismos crescem em temperaturas que variam de 25 a 30C. Existem, quanto temperatura
de crescimento, quatro grupos de microrganismos: Psicrfilos: 14-20 C Mesfilos: 30-36 C Termfilos: 50-60 C Extremo termfilos: 60-80 C A temperatura tambm afeta a eficincia da converso do substrato (fonte de carbono energia) em massa celular. O rendimento mximo de converso ocorre a temperatura menor que a temperatura tima de crescimento. Este ponto particularmente importante na otimizao do processo quando se espera um mximo rendimento, mas no taxa de crescimento. As reaes simultneas que ocorrem no interior das clulas, influenciam no crescimento e formao de protenas enzimticas, que apresentam rpidas variaes de acordo com a faixa de temperatura. Para cada microrganismo, existe um temperatura tima de crescimento e de formao de produto, em um substrato adequado; para uma otimizao eficiente necessrio um controle de temperatura de 0,5 C. Os sensores de temperatura mais utilizados so: - Termmetro: Utilizado somente em pequenos fermentadores devido a sua fragilidade. Em fermentadores maiores h a necessidade de inserir o termmetro dentro de um local prprio dentro de fermentador; apenas indicativo e no automatizado. - Termstor: So semicondutores feitos de misturas de xidos de ferro, nquel e outros metais; a principal caracterstica a grande variao da resistncia em funo de uma pequena variao de temperatura. - Termmetro bimetlico: Consiste de uma bobina bimetlica helicoidal protegida por um tubo, pode ser colocado na extremidade uma caneta para o registro de variaes de temperatura. So menos suscetveis a quebras porm custam mais caro. - Termmetro de bulbo de presso: um medidor de presso conectado a um pequeno tubo, preenchido com gs ou lquido apropriado sob presso. Uma caneta conectada na extremidade livre para o registro de sinais eltricos ou pneumticos. - Termopares: So dois filamentos de dois metais diferentes que so mantidos em diferentes temperaturas, ligados em um circuito eltrico. A corrente produzida pode ser medida no ponto comum da temperatura dos dois metais. - Termmetros de resistncia eltrica: Baseia-se nas diferenas de resistncia eltrica dos metais com a variao de temperatura. B Presso O monitoramento da presso importante durante a esterilizao e a manuteno de uma presso positiva no reator (aproximadamente 1,2 absoluto) pode auxiliar a manuteno da assepsia; mas a razo mais importante a segurana. Equipamentos industriais e de laboratrio so projetados para suportar uma presso especfica para a fermentao e mais um fator de segurana.
Em fermentadores, medidores de diafragma so utilizados para o monitoramento da presso. Esses medidores produzem um sinal pneumtico que pode ser transformado, se necessrio, em um sinal eltrico. importante que o sensor indique, registre e controle a presso. Para minimizar o risco de contaminao utiliza-se uma sobre presso de 0,2-0,5 bar. A presso hidrosttica tambm deve ser considerada nos grandes fermentadores uma vez que influencia na solubilidade do oxignio e gs carbnico no meio de cultura. C Potncia Diferentes tipos de medies podem ser feitas para monitorar a potncia necessria para fermentadores com agitao mecnica, normalmente mede-se a energia total consumida pelo agitador. A desvantagem deste mtodo porm, que ele considera tambm as perdas observadas quando se aumenta a velocidade de agitao (ocorre aproximadamente 30% de perda de energia, utilizada pelo motor). Medidas diretas da energia dentro do meio de cultivo podem ser conseguidas utilizando medidores dentro do reator. D Viscosidade A viscosidade e outras propriedades reolgicas do meio de cultivo podem ser medidas, atravs da energia consumida em diferentes velocidades de agitao. Outro mtodo utilizado, o monitoramento da potncia durante e aps um rpido desligamento da agitao (menos de 30 segundos). Fludos Newtonianos e no Newtonianos tambm respondem diferentemente a agitao. E Velocidade de fluxo (Ar/Lquido) A aerao tambm pode ser controlada de diferentes maneiras, tanto o ar de entrada como o ar de sada. O aparelho mais simples, rotmetro, fornece leitura visual ou pulsos eltricos. O monitoramento da taxa de aerao muito importante para os clculos de balano de material nos processos fermentativos. Para o controle da velocidade de fluxo de lquido, em escala laboratorial, so utilizadas bombas de fluxo bem calibradas, que abastecem o fermentador com quantidades conhecidas do lquido. Controles de processos mais longos, podem ser feitos por pesagens contnuas. Um sensor de nvel de meio pode ser utilizado j que detecta tambm o nvel de espuma. 2) Parmetros Qumicos: A Sondas de pH O pH externo apresenta pouca influncia sobre o pH interno das clulas microbianas, mas o rompimento dos substratos , seu transporte pela parede celular e a secreo dos produtos celulares, so todos afetados pelo valor do pH do ambiente. O pH do meio tem um efeito sobre a estrutura e permeabilidade da membrana externa.
O pH uma medida da atividade dos ons hidrognio e sua determinao se da dependendo da temperatura. Porm, o sinal da sonda mudar com a temperatura; importante compensar o efeito da temperatura no circuito . Com a exigncia de esterilidade , as sondas esterilizveis esto ganhando aceitao. B O2 e CO2: Um procedimento normal determinar no ar que entra e sai o O2 e o CO2 separadamente pelas propriedades paramagnticas do O2 e o espectro de absoro de infravermelho do CO2. Os sensores para medir esses gases esto bem desenvolvidos e funcionam com poucas interrupes . O N2, NH3, metanol e etanol, podem ser medidos pelo espectrmetro de massas e tambm pode medir informao qualitativa e quantitativa sobre o intercmbio de O2 e CO2. Mediante o uso de membranas permeveis aos gases, possvel medir os gases dissolvidos no meio nutritivo. Existem instrumentos que podem analisar at 8 gases simultaneamente na fermentao. C Oxignio dissolvido (OD): O papel crtico que joga o oxignio dissolvido (OD) num processo de fermentao muito importante; as sondas de OD consistem em uma camisa de ao inox ou cristal que contm eletrodos e um eletrlito adequado. Existem interessantes novidades no campo de eletrodos enzimticos, denominados biosensores. 4. Recuperao do Produto Final a etapa mais difcil, e um processo difcil e caro, chegando a representar de 80% - 90% do custo total do processo. Os procedimentos utilizados podem ser : fsicos/ qumicos e biolgicos (graus de variao). . Filtrao , centrifugao e flotao ( separao de clulas do lquido) . Rompimento de clulas (caso produto seja intracelular). . Extrao com solvente especfico . Cromatografia . Filtrao por membranas . Adsoro .Cristalizao .Secagem Os autores dedicam este artigo memria do Professor Walter Borzani REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BORZANI,et al,2001.Biotecnologia Industrial-fundamentos v.1, 1 Ed. Edgard Blucher ltda-SP. SCHMIDELL,et al.2001. Biotecnologia Industrial-Engenharia Bioqumica v.2, 1 Ed. Edgard Blucher ltda-SP REHM,et al,.Biotechnology Biological Fundamentals, v.1, 2 Ed. VCH Weinheim MOO-YOUNG,M.Comprehensive Biotechnology. The Principles of Biotechnology: Scientific Fundamentals.V.1, Ed. Pergamon Press-Oxford.
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Pesquisa
-1,3 GLUCANASE
PRODUO E PURIFICAO DE -1,3 GLUCANASE
Ilustraes cedidas pelas autoras
RESUMO O presente trabalho visou o estudo da produo e purificao da -1,3 glucanase da linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191. Em fermentador de 5 L, a maior produo de -1,3 glucanase utilizando 1,5 vvm e 3 vvm, foi respectivamente 0,32 U/mL e 0,72 U/mL, aps 24 h de fermentao a 30 o C; enquanto que em frascos aletados agitados a produo de -1,3 glucanase foi de 1,12 U/mL aps 24 h a 30 o C. A -1,3 glucanase (45 KDa) foi purificada 11,92 vezes com rendimento de 25% em resina de troca inica DEAE-Sephadex A50. Palavras-chave: -1,3 glucanase, Cellulosimicrobium cellulans 191, produo, purificao. SUMMARY The aim of this work was to study the production and purification of -1,3 glucanases from Cellulosimicrobium cellulans 191 strain. In a 5 L fermenter, the highest production of -1,3 glucanase with 1.5 vvm and 3.0 vvm were 0.32 U/mL and 0.72 U/mL respectively, after 24 h of fermentation at 30 oC; while in shaken flasks was produced 1.12 U/mL after 24 h at 30 o C. The -1,3
glucanase (45 KDa) was purified 11.92 times with a yield of 25% using a DEAE-Sephadex A50 ionexchange resin. Key-words: -1,3 glucanase, Cellulosimicrobium cellulans 191, production, purification. INTRODUO A -1,3 glucana o componente encontrado em maior quantidade na parede celular de leveduras (Kim, et al . 2004), correspondendo juntamente com a -1,6 glucana, 48 a 60% da estrutura (Klis, 1994). A camada de -glucana corresponde camada interna da parede celular de leveduras e pode ser hidrolisada por -1,3 glucanases para diferentes finalidades. Uma grande quantidade de produtos podem ser isolados e purificados da clula microbiana com o auxlio da lise enzimtica como, por exemplo: peptdeos, polissacardeos, protenas recombinantes, cidos nuclicos, pigmentos, enzimas, lipdeos, entre outros. Alm do potencial de aplicao na preparao de protoplastos, fuso celular e transformao de leveduras, ressalta-se sua aplicao na preparao do polissacardeo glucana, pr-tratamento para lise mecnica de clulas em Dyno-Mill, produo de extrato de levedura e lise de microrganismos (Fleuri e Sato, 2005). As -1,3 glucanases, podem ser produzidas por diferentes microrganismos. Rowley e Bull (1977) estudaram a produo do complexo enzimtico extracelular contento -1,3 glucanase produzido pelo microrganismo Arthrobacter sp. Ferro (2002) estudou a produo de -1,3 glucanase pela linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191, assim como Soares (2002) e Fleuri (2003 e 2006). Beshai et al. (2003) descreveram a produo de -1,3 glucanase de Bacillus sp. utilizando uma linhagem de Escherichia coli recombinante em fermentador. As preparaes enzimticas de -1,3 glucanases obtidas por microrganismos so encontradas na forma bruta e na forma parcialmente purificada. Enzimas em estado impuro podem ser aplicadas para finalidades especficas e em muitos casos so requeridas por serem de fcil obteno e de baixo custo. As enzimas purificadas apresentam a vantagem de estarem livres de outras enzimas e substncias que interferem nos substratos desviando as reaes especficas. Alm disso, comercialmente so muito mais valorizadas. Muitas -1,3 glucanases, obtidas por fermentao de microrganismos, tm sido purificadas, entre elas: a -1,3 glucanase (27,19 KDa) de Oer-
Luciana Francisco Fleuri Dra. em Cincia de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas e Profa. da Universidade Metodista de Piracicaba luciana@fea.unicamp.br Hlia Harumi Sato Profa. Titular da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas
Figura 1. Estudo da produo de -1,3 glucanase em fermentador de 5 L, em meio de cultivo contendo 1% de parede celular de levedura em tampo fosfato 0,2 M, pH 7,5 a 30oC, 200 rpm e 1,5 vvm
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skovia xanthineolytica LL-G109 (Andrews e Asenjo, 1987); -1,3 glucanase (12 KDa) de Oerskovia xanthineolytica LL-G109 (Ventom e Asenjo, 1990); -1,3 glucanase (82 KDa) ltica de Rarobacter faecitabidus (Shimoi et al., 1991); -1,3 glucanase (40 KDa) de Oerskovia xanthineolytica TK-1 (Saeki et al., 1994); -1,3 glucanase de Oerskovia xanthineolytica LL-G109 (Parrado et al .,1996; Ferrer et al ., 1996); endo-1,3 glucanase (17 KDa) de Trichoderma harzanium (Thrane et al ., 1997); -1,3 glucanase (29 KDa) de Trichoderma harzianum (Noronha e Ulhoa, 2000); -1,3 glucanases (17,1 KDa e 57 KDa) da linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191 (Ferro, 2002; Soares, 2002); -1,3 glucanase alcalina (71 KDa) de Bacillus clausii NM1 (Miyanishi et al ., 2003); -1,3 glucanase (83,1 KDa) de Thichoderma asperellum (Bara et al. , 2003). O presente estudo visou a produo da -1,3 glucanase pela bactria Cellulosimicrobium cellulans 191 em frascos agitados e em fermentador e a purificao em coluna de troca inica. MATERIAL E MTODOS Produo de -1,3 glucanase em frascos agitados A -1,3 glucanase foi produzida, em frascos agitados, em meio de cultivo composto por 2,0 g/L de (NH 4 ) 2SO 4; 0,2 g/L de MgSO 4.7H 2O e 10 g/L de parede celular de levedura em tampo fosfato 0,2 M, pH 7,5. Os frascos foram incubados a 30 o C, 200 rpm durante 24 h. Para a preparao do pr-inculo, uma alada da cultura de 24 h do microrganismo em tubo inclinado de meio TYM foi inoculada separadamente em frascos Erlenmeyers aletados de 500 mL contendo 100 mL do meio de cultivo. Alquotas de 10 mL de pr-inculo foram transferidas assepticamente para frascos Erlenmeyers de 500 mL contendo 90 mL do mesmo meio de cultivo. Os frascos foram incubados a 30 o C, a 200 rpm durante 24 h. Aps incubao, o meio de cultivo foi centrifugado a 7.840 g durante 10 min a 5 oC e os sobrenadantes utilizados como preparao enzimtica bruta. Produo de -1,3 glucanase em fermentador de 5 L A produo de -1,3 glucanases pela linhagem C. cellulans 191 foi estudada em fermentador de 5 L no meio de cultivo descrito anteriormente; com 1,5 e 3 vvm de aerao. As condies de pH, temperatura e agitao para a produo de -1,3 glucanase foram respectivamente, 7,5; 30oC e 200 rpm. As amostras foram coletadas em diferentes tempos de fermentao. A alterao do pH do meio de cultivo foi determinada com o auxlio de potencimetro. O crescimento celular foi estimado indiretamente atravs da medida de absorbncia a 660 nm. Determinao da atividade de -1,3 glucanase A atividade de -1,3 glucanase foi determinada como descrito por Saeki et al . (1994) e Santos (2000). A mistura de 250 L de soluo enzim-
Figura 2. Estudo da produo de -1,3 glucanase em fermentador de 5 L, em meio de cultivo contendo 1% de parede celular de levedura em tampo fosfato 0,2 M, pH 7,5 a 30oC, 200 rpm e 3,0 vvm
tica e 250 L de soluo 1,0% de laminarina em tampo acetato de sdio 0,1 M, pH 5,5 foi incubada a 55oC por 30 min. A reao foi interrompida por aquecimento a 100 o C por 5 min. Os acares redutores foram determinados pelo mtodo de Somogyi (1952) utilizando glicose como acar padro. Para controle foram determinados os acares redutores presentes na soluo enzimtica utilizando gua destilada no lugar da soluo de laminarina. Para ajuste do espectrofotmetro foi preparado um tubo branco utilizando-se gua destilada no lugar da soluo de laminarina. Uma unidade de atividade foi definida como a liberao de um moL de glicose por minuto por mL de soluo enzimtica. Purificao parcial da -1,3 glucanase A preparao bruta (20 mL) de -1,3 glucanase (1,12 U/mL) foi aplicada em coluna de DEAE-Sephadex A50 de 2,5 cm de dimetro e 40 cm de comprimento, equilibrada em tampo fosfato de sdio 0,01 M, pH 6,5. As protenas adsorvidas foram eludas pela aplicao de 250 mL do mesmo tampo usando gradiente de sal (de 0 a 1 M de NaCl). As fraes de 5 mL foram coletadas a cada 12,5 min. O curso de eluio das protenas foi acompanhado pela medida da absorbncia a 280 nm. As fraes contendo atividade de -1,3 glucanase foram reunidas, dialisadas contra gua
Figura 3. Purificao da -1,3 glucanase atravs de cromatografia de troca inica em coluna de DEAE-Sephadex A50
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atividade enzimtica. No estudo com aerao de 1,5 vvm foi obtido 0,34 U/mL de -1,3 glucanase aps 24 h de fermentao do microrganismo C . cellulans 191, indicando uma produo aproximadamente 3,1 vezes maior que a obtida nos estudos descritos por Ferro (2002); enquanto que no estudo de produo com aerao de 3 vvm, foi obtida uma produo 5 vezes maior que a obtida por Ferro (2002). Nota-se tambm que a produo de -1,3 glucanase em frascos aletados foi superior 1,5 vezes quando comparada produo em fermentador. O tipo de agitao em frascos aletados e em fermentador so diferentes e parecem interferir diretamente na produo da enzima pela bactria C . cellulans 191. Resultados similares foram relatados por Beshay et al . (2003) que estudou a produo de -1,3 glucanase por Bacillus sp. utilizando uma linhagem de E . coli recombinante. Foi obtido uma produo enzimtica 1,03 vezes menor em fermentador de 3 L, quando comparado com o estudo de produo da enzima em frascos agitados.
Padres
-1,3 glucanase Padres: a- fosforilase b (94,0 KDa); b- albumina bovina (67,0 KDa); c- ovoalbumina (43,0 KDa); d- anidrase carbnica (30,0 KDa); e- inibidor de tripsina de soja (20,1 KDa); f- lactoalbumina (14,0 KDa)
Purificao parcial de -1,3 glucanase Em estudo preliminar foi testado o fracionamento enzimtico por precipitao com sulfato de amnio (40, 60 e 80% de saturao) da preparao bruta de - 1,3 glucanase obtida atravs do cultivo de C. cellulans 191 em frascos agitados aletados. Nesta etapa a atividade especfica da preparao enzimtica final foi inferior atividade especfica da preparao enzimtica inicial. Dessa forma, para a purificao da -1,3 glucanase o extrato enzimtico bruto foi aplicado diretamente na coluna de troca inica sem concentrao prvia com sal. A purificao da -1,3 glucanase da linhagem C. cellulans 191 foi conduzida em coluna de DEAESephadex A50 equilibrada em tampo fosfato 0,01 M, pH 6,5. A enzima foi eluda da resina utilizando tampo contendo 0,6 M de NaCl. Foi obtido um pico de -1,3 glucanase (Figura 3), a qual foi purificada 11,92 vezes com um rendimento de 25% (Tabela 1). Diferentes mtodos de purificao de -1,3 glucanases tm sido relatados. A -1,3 glucanase de Oerskovia xanthineolytica TK-1 foi purificada em coluna de DEAE-Sephacel, DEAE-Toyopearl 650M e Bio-Gel P-2. A enzima foi purificada 21 vezes e apresentou massa molecular estimada em 40 KDa (Saeki et al ., 1994). A -1,3 glucanase de Oerskovia xanthineolytica LL-G109 foi purificada em coluna HR 16/10 QSepharose FF. Em eletroforese em gel SDS, a enzima apresentou massa molecular de aproximadamente 27,19 KDa (Parrado et al ., 1996). Ferrer et al . (1996) prosseguiram os procedimentos de purificao desta enzima atravs de ultrafiltrao e duas colunas consecutivas de HR 16/10 Q-Sepharose FF em diferentes valores de pH (pH 8,5 e 5,0). Thrane et al . (1997) purificou uma endo- 1,3glucanase do filtrado de uma cultura de Trichoderma harzanium atravs de filtrao em gel utilizando coluna Sephacryl S-300R e
Figura 4. Eletroforese da -1,3 glucanase purificada em gel SDS-poliacrilamida

destilada e liofilizadas. A concentrao de protena das solues enzimticas foi determinada como descrito por Lowry et al . (1951), usando ovoalbumina como padro. A atividade de -1,3 glucanase foi determinada como descrito anteriormente. Eletroforese da -1,3 glucanase em gel SDS-poliacrilamida As fraes com atividade de -1,3 glucanase foram concentradas por liofilizao, ressuspendidas e aplicadas em gel de dodecil sulfato de sdio-poliacrilamida a 12% (SDS-PAGE), como descrito por Laemmli (1970). A eletroforese foi desenvolvida em duas etapas: a 80 V por aproximadamente 30 min e a 120 V por aproximadamente 2 h. Aps a corrida eletrofortica, os gis foram lavados trs vezes por 20 min com uma soluo fixadora de etanol (30%) e cido actico (10%) em gua destilada. Em seguida, o gel foi corado com Coomassie Blue R250. A mistura padro de protenas, utilizada como parmetro para determinar a massa molecular da 1,3 glucanase, continha fosforilase b (94,0 KDa), albumina bovina (67 KDa), ovoalbumina (43,0 KDa), anidrase carbnica (30,0 KDa), inibidor de tripsina de soja (20,1 KDa) e -lactoalbumina (14,0 KDa). RESULTADOS E DISCUSSO Produo de -1,3 glucanase em frascos agitados Foi obtido 1,12 U/mL de -1,3 glucanase atravs da fermentao da linhagem C. cellulans 191, em
frascos agitados aletados, em meio de cultivo em tampo fosfato 0,2 M, pH 7,5, a 30 o C e 200 rpm, aps 24 h de incubao. Produo de -1,3 glucanase em fermentador de 5 L, em diferentes condies de aerao A produo de -1,3 glucanase pela linhagem C. cellulans 191 em meio de cultivo contendo 1% de parede celular de levedura em tampo fosfato 0,2 M, pH 7,5, em fermentador de 5 L, foi estudada em diferentes tempos de fermentao; a 30 oC, 200 rpm e 1,5 e 3 vvm de aerao. Na fermentao da linhagem C. cellulans 191 em fermentador de 5 L com 1,5 vvm de aerao, foi obtido mxima produo de 1,3 glucanase aps 24 h de fermentao (0,34 U/mL). O pH do meio de cultivo praticamente no apresentou variao durante a fermentao. No cultivo do microrganismo em fermentador de 5 L com 3 vvm de aerao, a -1,3 glucanase foi produzida no final da fase exponencial de crescimento atingindo atividade mxima de 0,72 U/mL de -1,3 glucanase aps 24 h de fermentao. O pH do meio de cultivo tambm no apresentou variao significativa durante a fermentao. O presente estudo demonstra que maiores aeraes so favorveis para a produo da enzima. O aumento da aerao de 1,5 vvm para 3 vvm na produo de -1,3 glucanase pela linhagem C . cellulans 191 provocou um aumento de aproximadamente 2,12 vezes na
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Tabela 1. Purificao da -1,3 glucanase em coluna de DEAE-Sephadex A50 Extratos Bruto Purificado Volume (mL) 20 50 U/mL 1,12 0,112 U total 22,4 5,6 Protenas (mg/mL) 9,18 0,078 Protenas Atividade Especfica Totais (mg) (U/mg) 183,6 0,12 3,9 1,43 Rendimento (%) 100 25 Fator de Purificao 1 11,92
focalizao isoeltrica, sendo obtido fator de purificao de 12,5 vezes e rendimento de 13%. Em eletroforese em gel SDS, a enzima apresentou massa molecular em torno de 17 KDa. Noronha e Ulhoa (2000) purificaram uma -1,3 glucanase de Trichoderma harzianum atravs de vrias etapas cromatogrficas utilizando coluna Sephacryl S-200, coluna Fenil-Sepharose e coluna CM-Sepharose. A enzima foi purificada 65 vezes e foi obtido 0,32% de rendimento. Atravs de SDS-PAGE a massa molecular foi estimada em aproximadamente 29 KDa. Uma -1,3 glucanase da linhagem Cellulosimicrobium cellulans de 17,1 KDa foi purificada e caracterizada. A -1,3 glucanase foi purificada do sobrenadante do meio de cultivo atravs de ultrafiltrao e cromatografia em coluna de CM-Sepharose CL6B (purificao de 78,2 vezes e rendimento de 5,53%) (Ferro, 2002). Outra -1,3 glucanase de massa molecular de 57 KDa da linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191 foi purificada do sobrenadante do meio de cultivo atravs de ultrafiltrao (membrana de excluso de 10 KDa) e cromatografia de troca inica em coluna de DEAE-Sepharose equilibrada em pH 5,5. A enzima foi purificada 1,18 vezes quanto atividade de -1,3 glucanase e 5,1 vezes quanto atividade de liticase (Soares, 2002). A -1,3 glucanase alcalina produzida por Bacillus clausii NM1 foi purificada 124 vezes por precipitao com sulfato de amnio, cromatografia de troca inica com DEAESepharose FF e filtrao em gel com Sephacryl S-200HR com rendimento de 41,8%. A massa molecular da enzima purificada foi estimada em 71 KDa por eletroforese em gel de SDS-PAGE (Miyanishi et al ., 2003). Thichoderma asperellum produz pelo menos duas -1,3 glucanases extracelulares na presena de parede celular de Rhizoctonia solani como indutor. A -1,3 glucanase foi purificada por filtrao em gel em coluna Sephacryl S-100 e cromatografia de troca inica em coluna de Q-Sepharose Fast Flow, sendo obtido fator de purificao de 35,7 vezes e rendimento de 9,5%. A massa molecular da exo- -1,3 glucanase purificada foi estimada em 83,1 KDa utilizando eletroforese SDS-PAGE (Bara et al ., 2003). No presente estudo a -1,3 glucanase (45 KDa em SDS-PAGE) da linhagem C. cellulans 191 pde ser purificada atravs de uma nica etapa cromatogrfica, utilizando a coluna de troca inica DEAE-Sephadex A50. CONCLUSES A maior produo de -1,3 glucanase (1,12 U/ mL) foi obtida atravs do cultivo da bactria C . cellulans 191 em frascos agitados aletados, em
comparao com a produo em fermentador. Em fermentador a maior produo da enzima foi obtida com 3 vvm de aerao, em comparao com a produo utilizando 1,5 vvm. A -1,3 glucanase foi purificada 11,92 vezes em coluna de DEAE-Sephadex A50 com rendimento de 25% e apresentou massa molecular de 45 KDa em SDS-PAGE.
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Pesquisa
Glicerol de biodiesel
RESUMO A intensiva busca por fontes alternativas de energia e processos sustentveis visando a reduo da poluio ambiental e o aquecimento global do planeta tem estimulado o mercado mundial de combustveis limpos. Os biocombustveis, como o biodiesel, representam uma alternativa renovvel e ambientalmente segura aos combustveis fsseis. Sua produo encontra-se em crescimento acelerado, e como conseqncia, a quantidade de subprodutos gerados de sua produo, principalmente o glicerol bruto. Com o objetivo reduzir os futuros problemas ambientais por acumulao de glicerol e tornar a produo de biodiesel mais rentvel, a implementao de estratgias biotecnolgicas que utilizam o glicerol como nica fonte de carbono para obteno de produtos de maior valor agregado, vem sendo estudado como uma promissora alternativa e soluo. Este trabalho descreve estudos bem documentados sobre o mecanismo metablico de glicerol por microrganismos e pertinentes com a proposta de utilizao do glicerol em processos microbianos. Da mesma forma so apresentadas novas estratgias que podem ser exploradas visando o aproveitamento deste material e sua bioconverso em bioprodutos de alto valor agregado. Palavras-chave: glicerol, fermentao, bioproduto. Biotechnological strategies for glycerol utilization derived from biodiesel production ABSTRACT The claim for reducing environment pollution stimulates the world market of clean fuels. Biofuels as biodiesel, represents a renewable and environmentally safety alternative to fossil fuel. Nonetheless, its production is increasing considerably, and as a consequence, the amount of raw glycerol (byproduct) generated is growing exponentially. With the aim to reduce environment problems due to accumulation of glycerol, biotechnological strategies for its bioconversion in value-added products are being implementing. This work presents detailed arguments on the metabolic mechanisms of glycerol assimilation by microorganisms, as well as, a description of the most recent biotechnological processes applied to obtain bioproducts from glycerol. Keywords: glycerol; fermentation; bioproduct. INTRODUO A utilizao de fontes alternativas de energia umas das grandes prioridades atuais, que vem contribuir significativamente para contornar os graves problemas ocasionados pelo desenvolvimento tecnolgico. A preocupao atual pela reduo da poluio e a crise energtica tm estimulado o mercado mundial de biocombustveis. A economia global mantmse em crescimento e a demanda por energia limpa e recursos renovveis encontra-se em contnuo aumento (BILGEN et al., 2006). Neste sentido, a busca intensiva por combustveis alternativos ao petrleo, como o biodiesel, apresenta grande importncia principalmente para os pases emergentes, uma vez que sua produo auxilia conservao do meio ambiente, mediante a reduo dos gases responsveis pelo aquecimento global, e contribui para o desenvolvimento social mediante a gerao de empregos (OLIVEIRA et al., 2006). No Brasil, a produo e comercializao de biodiesel possui importantes vantagens devido grande disponibilidade de matria-prima para sua produo e ao crescimento contnuo da indstria de leos vegetais e etanol (OLIVEIRA et al. 2006, OISTI, 2006). A produo de biodiesel est significativamente acelerada, uma vez que o governo brasileiro estabeleceu a obrigatoriedade da adio de biodiesel ao combustvel de petrleo mediante a lei 11097/2005. No ano 2013, a quantidade de biodiesel a ser adicionado dever alcanar 5 % do volume total de diesel utilizado (ANP, 2007). O glicerol o principal subproduto gerado na produo de biodiesel, sendo que aproximadamente 10 % do volume total de biodiesel produzido correspondem a glicerol (DASARI et al., 2005). Estima-se que com o incremento do volume de biodiesel, o glicerol co-produzido aumentar de 83 para 330 milhes L/ano at o ano 2010 (MME, 2007). Com o intuito de evitar futuros problemas derivados da acumulao de glicerol e para tornar a produo de biodiesel mais competitiva, torna-se necessrio a busca de alternativas para o uso do glicerol bruto gerado nesta produo. Este subproduto, na forma pura, possui inmeras aplicaes industriais (aditivos para a indstria de alimentos, qumica e farmacutica). O glicerol obtido resultante da transesterificao de triglicerdios com lcool apresenta impurezas como gua, sais, steres, lcool e leo residual, que lhe conferem um baixo custo (OOI et al.,2004). A rentabilidade de vrios processos qumicos
Estratgias biotecnolgicas para o aproveitamento do glicerol gerado da produo de biodiesel

Ilustraes cedidas pelos autores
Juan Daniel Rivaldi* Engenheiro Qumico, Mestre em Biotecnologia Industrial Escola de Engenharia de Lorena (EEL), Universidade de So Paulo(USP) *Autor para correspondncia: danielrivaldi@gmail.com Boutros Fouad Sarrouh Licenciado em Qumica; Mestre em Anlise de Processos na Indstria Qumica; Doutor em Biotecnologia Industrial Escola de Engenharia de Lorena (EEL), Universidade de So Paulo (USP) Rodolfo Fiorilo Engenheiro Qumico Gerente Industrial DAFFER Qumica Ltda.
Silvio Silvrio da Silva Engenheiro de Alimentos; Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos; Doutor em Tecnologia Bioqumico- Farmacutico Escola de Engenharia de Lorena (EEL), Universidade de So Paulo (USP)
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depende em parte, da venda dos subprodutos, permitindo a reduo dos custos de produo e conseqentemente, do preo final do produto. Dessa forma, existe um grande interesse na purificao do glicerol ou no seu reaproveitamento direto, sem tratamento, o que proporcionar viabilizao do processo de produo de biodiesel, permitindo que este se torne competitivo no crescente mercado de biocombustveis. Os processos para sua purificao incluem filtrao, destilao a vcuo, descolorao e troca de ons para a remoo principalmente de K+ e Na+ utilizados como catalisadores (YONG et al. 2001). No entanto, os tratamentos de purificao so de custo excessivamente elevados para pequenos e mdios produtores nacionais de biodiesel. Devido a este fato, uma maior quantidade de efluentes contendo glicerol poder ser descartada no meio ambiente sem nenhum tratamento, aumentando conseqentemente os problemas e riscos ambientais. A converso microbiana de glicerol por processos biotecnolgicos em produtos de maior valor agregado como biomassa e biomolculas, uma alternativa relevante para a maior valorizao da produo de biodiesel (ITO et al., 2005). Neste sentido, a biotecnologia moderna, com todo seu avano trar grandes contribuies e permitir a obteno de biomolculas e produtos com importantes propriedades. NATUREZA E CARACTERSTICAS DO GLICEROL Glicerol o nome comum do composto orgnico 1,2,3-propanotriol, descoberto por Carl W. Scheele em 1779 durante a separao de uma mistura aquecida de PbO preparada com leo de oliva. Os seus sinnimos so glicerina, trihidroxipropano, glicil lcool, gliceril e 1,2,3-trihidroxipropano. Na natureza, o glicerol existe em vegetais (soja, mamona, babau, girassol, palma, algodo, coco, dend, pinho manso) e animais em formas combinadas de glicerina com cidos graxos. O glicerol tambm um composto considerado fundamental dentro do sistema metablico de microrganismos; onde atua como precursor de numerosos compostos; e como regulador de vrios mecanismos bioqumicos intracelulares (LAGES, SILVA-GRAA, LUCAS, 1999). Em microrganismos eucariticos, o glicerol constitui o principal composto formado para regular as variaes de atividade de gua em ambientes altamente osmoflicos (WANG et al., 2001). Em humanos, o glicerol participa na termo-regulao do corpo, resistncia a altas temperaturas, na resistncia dos msculos em atividades fsicas e na resposta neural da variao da glicemia (YANG et al., 1999). O glicerol na sua forma pura apresenta-se como um lquido viscoso, incolor, inodoro e higroscpico, com sabor doce, solvel em gua e lcool, insolvel em ter e em clorofrmio. Devido s suas caractersticas fsicas e qu-
micas e ao fato de ser incuo, o glicerol puro apresenta diferentes aplicaes na indstria de cosmticos, farmacutica, detergentes, na fabricao de resinas e aditivos e na indstria de alimentos. Apesar de o glicerol apresentar estas aplicaes na forma pura, poucos estudos esto sendo direcionados para a utilizao de glicerol bruto na forma direta.
OBTENO E TRATAMENTO DO GLICEROL BRUTO Subproduto natural do processamento de leos e gorduras, o glicerol pode ser obtido mediante reao de saponificao de cidos graxos (leos, azeites ou sebo) com hidrxido de sdio ou hidrxido de potssio, como co-produto da fabricao de biodiesel e em menor proporo, mediante sntese microbiana. A produo sinttica de glicerina a partir de cloreto de alil via epicloridrina encontra-se em declnio devido ao excesso no mercado de glicerol do processo de biodiesel. Dentro deste contexto, o glicerol constitui o maior subproduto gerado no processo de produo do biodiesel via esterificao de cidos graxos vegetais ou gordura animal com lcool (metanol ou etanol) para produzir steres e glicerol na presena de catalisador (KOH ou NaOH) (DIECKELMANN e HEINZ, 1988) A equao global de transesterificao apresentada na Figura 1a, onde so necessrios trs moles de lcool por cada mol de triglicerdeo utilizado. Esta reao global conseqncia de um nmero de reaes reversveis e consecutivas mostradas na Figura 1b. A primeira consiste na converso de triglicerdeos em diglicerdeos, seguida da converso destes diglicerdeos em monoglicerdeos, e finalmente de glicerdeos a glicerol, rendendo uma molcula de s-
ter de lcool por cada glicerdeo em cada etapa da reao. No final da etapa de transesterificao, o glicerol e steres formam uma massa lquida de duas fases, que so facilmente separveis por decantao ou centrifugao. A fase superior, a mais leve ou menos densa, contm os steres metlicos ou etlicos constituintes do biodiesel. A fase inferior ou pesada encontra-se composta de glicerol bruto e impurezas. O valor do glicerol bruto obtido da produo de biodiesel encontra-se entre 0,2 a 0,4 R$/kg. Este baixo valor atribudo ao contedo de aproximadamente 30 % (p/p) de impurezas e ao grande volume deste co-produto gerado pelas indstrias. O glicerol bruto apresenta-se na forma de lquido viscoso pardo escuro, que contm quantidades variveis de sabo, lcool (metanol ou etanol), monoacilglicerol, diacilglicerol, oligmeros de glicerol, polmeros e gua (OOI et al., 2004). A porcentagem de glicerol na mistura varia entre 65 a 70 % (p/ p), sendo a maior parte das impurezas sabo formado pela reao dos cidos graxos livres com excesso de catalisador (saponificao). Dessa forma, o aspecto do glicerol bruto encontra-se estreitamente relacionado ao contedo de sabo, que proporciona aparncia de viscoso e escuro. Para reduzir o sabo gerado, recomenda-se conduzir a reao de transesterificao com matrias primas (triglicerdeos) com baixo contedo em cidos graxos livres e gua, ao mesmo tempo de reduzir a quantidade de catalisador (OOI et al., 2004). A mistura residual resultante submetido ao processo de acidulao com cido concentrado (HCl, H2SO4, ou H3PO4) para a separao de glicerol e cidos graxos do sabo (Figura 2a). No entanto, a maior parte dos processos de tratamento de glicerol conduzida utilizando HCl ou H2SO4, sendo
Figura 1. (a) Reao global e (b) Reaes consecutivas de transesterificao de triglicerdeos. R1, R2, R3 e R representam grupos alquilas
o H3PO4 restrito pelo alto custo. Durante a acidulao, forma-se certa quantidade de sal (reao do cido inorgnico com on do sabo) que se deposita na fase inferior de um lquido de trs fases, estando a fase superior constituda pelos cidos graxos livres, e a fase intermdia composta principalmente por glicerol e lcool (Figura 2b). O glicerol recuperado alcana concentraes superiores a 80 % (p/p), com quantidades variveis de gua, corantes e lcool. Posteriormente, o glicerol com excesso de cido neutralizado com soluo de NaOH e submetido a tratamento trmico (70oC) para eliminar os componentes volteis (recuperao de lcool)(OOI et al., 2004; FUKUDA, KONDO, NODA, 2001). Nesta forma, parcialmente livre de impurezas, o glicerol pode ser utilizado como substrato de fermentao por vrias espcies de microrganismos. As caractersticas fsicas, qumicas e nutricionais do glicerol bruto dependem do tipo de cido graxo (gordura animal ou leo vegetal) e do tipo de catlise empregada na produo de biodiesel. No entanto, a procura pela glicerina purificada muito maior, devida ao seu valor econmico. A
aplicao do glicerol na indstria est condicionada ao grau de pureza, que deve ser igual ou superior a 95%. Para obter grau de pureza superior a 95% (p/p)(grau alimentcio ou farmacutico), o glicerol deve ser submetido a destilao, mas sob custo elevado . Por outro lado, de acordo com a Tabela 2, o glicerol bruto contm elementos nutricionais, como, fsforo, enxofre, magnsio, clcio, nitrognio e sdio, e que so factveis de serem utilizados por microrganismos para o seu crescimento durante processos fermentativos (THOMPSON, HE, 2006). ASSIMILAO, METABOLISMO E CONVERSO MICROBIOLGICA DO GLICEROL. O glicerol considerado uma fonte de carbono altamente reduzida e assimilvel por bactrias e leveduras sob condies aerbicas e anaerbicas19 para a obteno de energia metablica, como regulador do potencial redox e para a reciclagem de fosfato inorgnico dentro da clula (DILLIS et al., 1980).
Vrios estudos foram desenvolvidos visando a utilizao de glicerol como fonte de carbono por microrganismos, especialmente por bactrias. Muitos deles apontam principalmente a mecanismos de assimilao de glicerol por estes microrganismos para a produo de compostos intermedirios de polmeros, resinas e aditivos para combustveis (PAPANIKOLAOU et al., 2002; ITO et al., 2005; CHENG et al 2007). O transporte do glicerol atravs da membrana celular constitui a primeira etapa para o seu metabolismo. De uma forma geral, a assimilao de glicerol por parte dos microrganismos envolve o transporte passivo (GANCEDO, GANCEDO, 1968) e transporte ativo (LAGES, SILVA-GRAA, LUCAS, 1999) atravs da membrana plasmtica. O transporte passivo inclui a difuso simples (permeao no especfica) e a difuso facilitada mediada por protenas localizadas nas camadas mais internas da membrana plasmtica (MIP), as permeases. A difuso simples, sendo ATP no dependente, requer um gradiente de concentrao para o transporte do substrato atravs da membrana. Conseqentemente, a concentrao do substrato no interior da clula no
Figura 2. (b)- Separao do glicerol aps tratamento com cido concentrado, a fase superior corresponde a cidos graxos, fase intermdia: glicerol, fase inferior: glicerol + sais
Figura 2. (a) - Fluxograma de produo de biodiesel e tratamento de purificao do glicerol
supera aquela encontrada no meio de cultura(MOAT, FOSTER, SPECTOR, 2002). Na levedura Saccharomyces cerevisiae, estudos desenvolvidos por Luyten et al. (1995), assinalaram a existncia de permeases FPS1, especficas para transporte de glicerol (Figura 3). O glicerol um dos poucos substratos que atravessa a membrana celular por difuso facilitada nas clulas procariticas. Em bactrias como Escherichia coli, a protena do
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tipo poro-canal-G1pF atua por sensibilidade mecnica sem gasto energtico na presena de glicerol. Este facilitador permite a assimilao, alm de glicerol, de pequenas molculas de polihidroxi lcoois, uria e glicina, mas exclui molculas carregadas como gliceraldedo-3-fosfato e dihidroxiacetona fosfato(HOLST et al., 2000). Em quanto aos mecanismos genticos, foram descritos trs genes responsveis pela assimilao e regulao do contedo intercelular de glicerol em Saccharomyces cerevisiae, o GUP1 e GUP2 (HOLST et al., 2000) e FPS1(LUYTEN et al.,1995) associados diretamente com o transporte facilitado e que so expressas conforme estmulos provocados nas clulas, como o estresse osmtico. Por outro lado, mecanismos de transporte ativo simporte glicerol/H+ e simporte glicerol/Na+ (dependentes de ATP) foram descritos em numerosas espcies de leveduras, entre elas Debaryomyces hansenii, Pichia sorbitophila, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces rouxii (LAGES, SILVA-GRAA, LUCAS, 1999). Tanto as acumulaes de glicerol por estresse, como a existncia de mecanismos ativos, so comuns em grande variedade de leveduras (LAGES, LUCAS, 1997). Aps a passagem do glicerol atravs da membrana plasmtica pelos possveis mecanismos, o glicerol pode ser catabolisado por vrias rotas metablicas independentes, apresentado na Figura 4. Uma das rotas, provavelmente a principal para a oxidao de glicerol por leveduras, consiste na fosforilao do glicerol pela enzima glicerol-quinase para formar glicerol3-fosfato, que reduzido a dihidroxiacetona fosfato pela enzima mitocondrial glicerol fosfo-ubiquinona oxidoreductase (FAD dependente)(GANCEDO, SERRANO, 1989).
Figura 3. Tipos de transporte para a assimilao de glicerol pela levedura Saccharomyces cerevisiae. FPS1 e YFLO54c so protenas de transporte, GUT1 e GUT2 so genes para expresso de enzimas de assimilao de glicerol. (Baseado em: NEVES, LAGES, LUCAS, 2004)
Estudos demonstraram que, os genes que controlam a sntese das enzimas glicerolquinase e fosfo-ubiquinona oxidoreductase so GUT1 e GUT2, respectivamente (GRAUSLUND, LOPES, RONNOW, 1999). A expresso dessas enzimas reprimida durante o crescimento celular em substratos fermentescveis como glicose, mas desregulado quando glicerol ou etanol utilizado como a principal fonte de carbono (GRAUSLUND, RONNOW, 2000).
Outra possvel via catablica do glicerol corresponde oxidao de glicerol e conseqente formao de dihidroxiacetona pela enzima glicerol desidrogenase. Aps, a dihidroxiacetona fosforilada a dihidroxiacetona fosfato pela enzima dihidroxiacetona quinase dependente de Adenosina Trifosfato (ATP). Gancedo e Gancedo (1968) reportaram que leveduras da espcie Schizosaccharomyces pombe, por exemplo, oxida glicerol mediante essa via sob condies de stress osmtico. A dihidroxiacetona fosfato considerada uma importante molcula intermediria para a gliconeognese (sntese de hexoses), assim como para a obteno de numerosos compostos atravs das vias oxidativas, incluindo, cido ctrico, cido succnico, cido actico, cido frmico, cido ltico, etanol e outros compostos de interesse comercial (MOAT, FOSTER, SPECTOR, 2002). O crescimento de microrganismos em fontes de carbono alternativas aos carboidratos, como L-malato, acetato, ou glicerol, requer a capacidade de sintetizar hexoses necessrias para a produo de mucopeptideos da parede celular, armazenagem de glicognio, e outros compostos derivados de hexoses, como as pentoses, envolvidos na biosntese de cidos nuclicos (MOAT, FOSTER, SPECTOR, 2002). Tambm, Hauge, King e Cheldelin (1955), fazem referncia sobre a capacidade de algumas bactrias, entre elas Acetobacter suboxydans, de oxidar a molcula de dihidroxiacetona fosfato pela via pentose-fosfato, incrementando o nmero de bioprodutos possveis de serem obtidos por via biotecnolgica a partir de glicerol. Em espcies de leveduras do gnero Yarrowia sp., e em bactrias como Klebsiella pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Clostridium butyricum, Enterobacter agglomerans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri and Bacillus welchii (ZHAO, CHEN, YAO, 2006; GONZLEZ PAJUELO et al., 2006; CHENG et al., 2007), observa-se que sob condies de anaerobiose, o glicerol sofre desidratao pela enzima glicerol desidratase para produzir 3-dihidroxipropionaldedo. Posteriormente, este intermedirio transformado pela enzima NADH dependente 1,3propanodiol oxido-reductase para gerar 1,3propanodiol, principal intermedirio para produo de polmeros, resinas e aditivos de importantes aplicaes industriais (GONZLEZ PAJUELO et al., 2006; CHENG et al., 2007). Uma vez que o glicerol assimilado no interior da clula, numerosos compostos so produzidos como conseqncia do seu metabolismo. BIOPRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO MICROBIANA DO GLICEROL A extraordinria expanso da indstria de biodiesel no Brasil e no mundo vem originando grandes volumes do principal co-produto, o glicerol. A superproduo de glicerol afeta negativamente o preo do biodiesel no mercado, tornando imperiosa a busca de novas
Tabela 1. Composio do glicerol bruto obtido durante a produo de biodiesel em funo de diferentes matrias prima. (Adaptado de: THOMPSON, HE ,2006)
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Figura 4. Vias metablicas de assimilao de glicerol por microrganismos e seus possveis produtos. (Adaptado de: GANCEDO, GANCEDO, 1968; HAUGE, KING, CHELDELIN, 1955; XIU et al., 2007)
aplicaes para este co-produto. Neste contexto, o glicerol vem sendo investigado como a futura fonte de carbono em processos microbianos para a obteno de bioprodutos de alto valor agregado. A continuao, detalham-se os recentes processos fermentativos aplicados nos laboratrios de pesquisa cientfica para a obteno de bioprodutos a partir do glicerol, independente do seu origem. 1,3-Propanodiol O propanodiol um composto intermedirio para a sntese de compostos cclicos e monmeros para polisteres, poliuretanos e polipropileno tereftalato. conhecido que os processos qumicos tradicionais de produo so altamente nocivos devido ao compostos txicos formados. As pesquisas mais importantes na utilizao biotecnolgica do glicerol bruto apontam principalmente produo do composto intermedirio 1,3propanodiol (GONZALEZ-PAJUELO et al., 2006; XIU et al., 2007). Atualmente, estes compostos so produzidos quase exclusivamente a partir de um derivado do petrleo, o xido de propileno, mediante processos qumicos convencionais (SULLIVAN, 2003). O campo de aplicao do composto 1,3propanodiol considerado amplamente
abrangente, diferentes setores comerciais, desde a produo de polimeros, tintas, resinas de polister, lubrificantes, anti-cogelante, at produo de cosmticos. Mediante fermentao de glicerol bruto por Klebsiella pneumoniae foram obtidos concentraes de at 56 g/L em escala de laboratrio. No entanto, a produo de 1,3-propanodiol a escala industrial encontra-se limitado devido a que os a maioria dos microrganismos produtores, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Propionibacterium and Anaerobiospirillum, so considerados patognicos e requerem de condies estritas de anaerobiose e nutrientes especficos para seu desenvolvimento (BARBIRATO et al., 1997). Uma soluo futura para o scale-up consistiria na utilizao de ferramentas da engenharia gentica para inserir genes que expressem enzimas geradoras de 1,3-propanodiol em microrganismos mais adaptados a condies industriais, como por exemplo, a bactria Escherichia coli (DHARMADI, MURARKA, GONZLEZ, 2006). Notoriamente, muitas espcies apresentam a capacidade de fermentar o glicerol produzindo 1,3propandiol, entre elas podem ser citadas Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Clostridium butyricum, Enterobacter agglomerans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri and Bacillus welchii (BARBIRATO et al., 1997; GONZALEZ-PAJUELO et al., 2006; XIU et al., 2007) . Atualmente, as bacterias Clostridium butyricum e Klebsiella pneumoniae so consideradas as de maior utilizao e provavelmente sejam as melhores produtoras deste composto (XIU et al., 2007). Recentemente, Gonzlez-Pajuelo et al. (2005) comparando uma espcie natural de Clostridium butyricum VPI 3266 com outra geneticamente modificada Clostridium acetobutylicum DG1(pSPD5) (contendo genes para produo de 1,3-propanodiol), observaram que no tempo de 47 h de fermentao em batelada alimentada, a cepa modificada alcanou maior produtividade (0,65 mol/mol de glicerol, 1,7 g/L h) que a cepa natural (0,69 mol/mol, 1,21 g/L.h). Em fermentao contnua de glicerol bruto e comercial (pureza: 80-90% ) em uma taxa de diluio (D) de 0,05 h-1 (pH 6,5; 35 oC) com a mesma cepa modificada, foram obtidos valores de rendimento e produtividade similares aos observados em batelada alimentada (0,61-0,64 mol/mol glicerol, 1,49-1,56 g/L.h). Os mesmos autores reportaram alta produtividade em 1,3-propanodiol (10,3 g/L.h) em cultivo contnuo da bactria Clostridium butyricum (GONZLEZ-PAJUELO, ANDRADE, VASCONCELOS, 2005). Outro aspecto considerado de importncia a imobilizao de clulas em diferentes polmeros para sua re-utilizao em fermentaes consecutivas. O encapsulamento de clulas de Klebsiella pneumoniae em celulose-sulfato de sdio e policloreto de metil dialil amnia desenvolvido por Zhao, Chen e Yao (2006), permitiu executar fermentaes em batelada repetida, batelada alimentada e processo contnuo para a obteno de 1,3propanodiol sob concentraes de glicerol to elevadas quanto 120 g/L. A quantidade de produto obtido foi de 63,1 g/L (5,7 g/L.h), 51,86 g/L(1,08 g/L.h) e 13,6 g/L (4,5 g/L h) para fermentao em batelada simples, batelada alimentada e fermentao contnua, respectivamente. Apesar dos valores de produtividade na fermentao por batelada alimentada serem menores que na batelada simples, os resultados sugerem a potencialidade da
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reutilizao de clulas imobilizadas, principalmente por fornecer um ambiente estvel para a clula frente a altas concentraes de substrato. A co-fermentao de glicerol e glicose foi avaliada por Xiu et al. (2007) para a produo de 1,3-propanodiol por Klebsiella pneumoniae DSM2026. Na relao glicose-glicerol igual a 0,2 e sob condies de microaerao foram alcanados valores de produtividade igual a 1,95 g/L.h. Os primeiros estudos tecnolgicos para o aumento de escala foram desenvolvidos por Cheng et al. (2007), utilizando reator em processo por batelada alimentada de 5000 L de volume total. Sob condies de baixo potencial de oxidao, alcanado mediante fluxo de nitrognio gs (0,15 vvm), foram fermentados 4000 L de meio contendo 40 g/L de glicerol a pH 6,8 ; 90 rpm e 37oC. A concentrao mxima de produto foi de 58,8 g/L, mas com uma produtividade ainda baixa de 0,92 g/L.h. Estes resultados iniciais demonstram a factibilidade da produo de 1,3propanodiol a escala piloto, mas novas tentativas devero ser conduzidas para a sua otimizao visando a projeo industrial. Etanol
indstria de alimentos e constituem importantes intermedirios para a indstria de polmeros e produo de compostos qumicos como o 1,2-butanodiol e 2,4-butanodiol. Papanikolaou et al. (2002) obtiveram considervel quantidade de cido ctrico, de ordem de 35 g/L, mediante fermentao de glicerol por Yarrowia lypolitica. Por sua parte, Rymowicz et al. (2006) publicaram estudos de assimilao de glicerol desenvolvidos com trs cepas mutantes de Yarrowia lypolitica, obtendo concentraes de at 124,5 g/L de cido ctrico. A produo de cido succnico e cido actico a partir de glicerol por Anaerobiospirillum succiniciproducens resultou em concentraes 6,5 vezes superiores a aquelas obtidas utilizando glicose como nica fonte de carbono (LEE et al., 2001). A sntese de cido propinico por clulas de Propionibacteria acidipropionici e Propionibacteria freudenreichii ssp. shermanii imobilizadas em alginato de clcio foi reportado por Bories et al. (2004). Sob condies de alta concentrao de glicerol obtiveram-se concentraes de cido propionico de at 42 g/L. Polihidroxialcanoatos
Ashby, Solaiman e Foglia (2005) utilizaram duas cepas, Pseudomonas oleovorans B-14682 e Pseudomonas corrugata 388 para a produo de PHA. Partindo de concentraes mximas de 50 g/L glicerol, as cepas P. oleovorans e P.corrugata produziram 0,97 g/L de Poli 3-hidroxibutirato (P3HB) e 0,67 g/L de acido hidroxidodecenico, respectivamente. De igual forma, foi observada a capacidade de produo de blend de P3HB and PHA em diferentes propores por cultura mista dos microrganismos estudados. cido graxo poliinsaturado mega-3 De conhecidas propriedades teraputicas contra numerosas enfermidades cardiovasculares, cncer e Alzheimer, os cidos graxos poliinsaturados mega-3 (AGPI -3) so geralmente obtido a partir de fontes naturais como leos vegetais ou de peixes. Recentemente foram desenvolvidos trabalhos para a produo de AGPI-3 a partir da microalga heterotrfica Schizochytrium limacinum que possui capacidade produzir altos nveis de cido docosahexaenico (DHA). Pyle e Wen (2007) observaram que aps 5 dias de crescimento em frascos Erlenmeyer (pH 8, 20 oC, 170 rpm), aproximadamente 18 g/L de clulas da microalga se formavam em meios independentes contendo glicose, glicerol puro e glicerol bruto na concentrao de 90 g/L. Foram analisados alguns parmetros cinticos como a velocidade especfica de crescimento , 0,685/ h; rendimento em biomassa, 0,284 g/g glicerol bruto; rendimento de DHA, 171,27 mg/g glicerol bruto e rendimento volumtrico de 3,08 g/L. Tambm, foi estudado o efeito de diferentes concentraes de glicerol bruto contendo sabo sobre o crescimento da microalga. Concentraes superiores a 40 g/L deste glicerol, influenciaram negativamente no crescimento da microalga, sendo que na concentrao de 90 g/L observou-se a morte das clulas aps 2 dias de cultivo. Estes resultados podem ser considerados timos, desde que no se necessitaria de uma etapa de prtratamento do glicerol para a separao do sabo, etapa geralmente longa e de custo elevado. O trabalho demonstra que um leque de oportunidades pode ser aberto com pesquisas utilizando exclusivamente algas heterotrficas e glicerol como fonte de carbono. Avanos tecnolgicos no aproveitamento do glicerol no Brasil Recentemente, no XVI Simpsio Nacional de Bioprocessos (SINAFERM 2007) foram apresentados numerosos trabalhos na busca de solues biotecnolgicas para a utilizao de glicerol originado da produo de biodiesel. Por exemplo, Meinicke, Vendruscolo e Ninow (2007) compararam diferentes meios contendo concentraes variveis de glicerol e glicose como fonte de carbono para a produo de corantes naturais pelo fungo filmamentoso Monascus ruber. A mxima produo de pigmentos vermelhos em frascos Erlenmeyer foi de 5,2 UDO480 nm (1 unidade UDO (Abs) corresponde a 15 mg/L de pigmento) e produtividade de (0,0596 UDO480nm./h) utili49
Etanol, butanol, e outros compostos so coproduzidos durante a fermentao de glicerol (DABROCK, BAHL, GOTTSCHALK, 1992). Ito et al. (2005) demonstraram a possibilidade de produzir etanol e hidrognio por Enterobacter aerogenes HU-101 utilizando efluentes da indstria de biodiesel contendo ate 41% (p/p) de glicerol. Convenientemente diludo (7,3 g/L), o efluente foi fermentado em forma descontnua em frascos anaerbicos e em forma contnua utilizando reator de coluna empacotada. Na fermentao descontnua, os rendimentos em hidrognio e etanol foram de 0,89 mol/mol de glicerol e 1 mol/mol glicerol, respectivamente. Rendimentos acima de 10 g/L foram obtidos em processo contnuo empregando cermica porosa como suporte de microrganismos. Neste processo, comparando meios contendo efluente de biodiesel e glicerol comercial, os mesmos autores observaram que produo de hidrognio foi maior naquele meio com glicerol parcialmente purificado (60 mmol/L.h) que utilizando efluente (30 mmol/L h). Aparentemente, as impurezas que acompanham o efluente aumentaram a fragilidade dos flocos de microrganismos, facilitando o wash- out das clulas do reator na mesma taxa de diluio. Em outros trabalhos, etanol e cido frmico foram os principais produtos da fermentao de glicerol pela bactria Klebsiella planticola, em concentraes equimolar acima de 2 g/L (JARVIS, MOORE, THIELE, 1997). Estes resultados estimulam a procura de novos microrganismos para a fermentao de glicerol visando a produo de etanol e hidrognio. cidos orgnicos Tambm, existem numerosos trabalhos direcionados para a produo de cido ctrico e cido succnico por fermentao de glicerol. Estes compostos so de ampla aplicao na
A preocupao pela reduo dos contaminantes ambientais vem acelerando novas pesquisas para a produo de polmeros biodegradveis. Espcies de Pseudomonas produzem naturalmente polihidroxialcanoatos (PHA), polisteres lineares de compatvel com uma ampla faixa de potenciais aplicaes devido a suas propriedades fsicas e biodegradabilidade (ASHBY, SOLAIMAN, FOGLIA, 2005). Muitos microrganismos acumulam PHA sob condies de estresse, principalmente quando submetidos falta de nitrognio, fsforo ou oxignio, e utilizam esse polmero quando a fonte externa de carbono limitada. Historicamente, os cidos graxos foram utilizados extensivamente para a sntese de PHA (ASHBY, SOLAIMAN, FOGLIA, 2005). Glicerol proveniente da produo de biodiesel apresenta-se como uma opo de substrato econmico para a produo deste tipo de biopolmeros. Borman e Roth (1999) utilizaram Methylobacterium rhodesianum para produzir polihidroxibutirato (PHB) na concentrao de 10,5 g/L em fermentao por batelada com meio contendo 5 g/L de glicerol e casena peptona. Koller et al. (2005) obtiveram polihidroxialcanoatos numa concentrao mxima de 16,2 g/L, mediante fermentao em batelada alimentada de soro de queijo e glicerol bruto por uma cepa selvagem de levedura. Para estressar as clulas, o cultivo foi conduzido sob tenso de oxignio (taxa de 10 mL/min) e sem outra fonte de fsforo alm daquela fornecida pelos 2,5 g/L de extrato de levedura. Um ponto interessante nesta pesquisa foi a capacidade da cepa selvagem de produzir simultaneamente 3-hidroxivalerato (8-10 % do total de PHA) sem necessidade dos precursores cido propinico ou cido valrico.
zando fonte de carbono mista (5 g/L de glicose e 15 g/L de glicerol). Os autores observaram que variaes no valor de pH podem regular a proporo do tipo de pigmentos encontrado no meio. Valores de pH inferiores a 5,5 encontram-se associados formao de pigmentos amarelos, sendo que os valores superiores favorecem a produo de pigmentos vermelhos. Tambm, o glicerol resultante da transesterificao de leo de mamona demonstrou ser uma fonte de carbono apropriada para produo de biosurfactante ramnolipdeo (uma ou duas molculas de ramnose e cido graxo de cadeia longa) por Pseudomona aeruginosa59. A concentrao da fonte de nitrognio (NaCO3) representou ser um fator preponderante na produo do biosurfactante, comprovado pela reduo da tenso superficial da gua maior a 45,7 % e ndice emulsificao s 24 h superior a 56,1 % para os diferentes hidrocarbonetos testados (querosene, hexadecano e isso-octano). Prieto et al 2007 obtiveram resultados similares na produo de ramnolipdeos, comprovando a maior influncia do NaNO3 na produo de biosurfactante pela mesma espcie de microrganismo, seguido por NH4NO3, uria e NH4SO4. Recentemente, em trabalhos de pesquisa visando a seleo de leveduras aptas para a assimilao e crescimento em glicerol comercial, verificamos que algumas espcies, incluindo Kluyveromyces marxianus e Candida batistae, apresentaram elevada capacidade de crescimento neste substrato. Dentre as leveduras estudadas, Hansenula anomala e Candida tropicalis mostraram capacidade de produzir etanol em concentraes de 3,5 e 6,1 g/L, respectivamente61. Estes resultados, ainda preliminares, so promissores para produo de etanol a partir de glicerol por esses microrganismos. Por outro lado, Volpato et al (2007) isolaram de ambientes amaznicos diferentes cepas de Bacillus com capacidade de produzir lpases utilizando glicerol como fonte de carbono. A mxima atividade lipoltica em glicerol (24,3 U/L) foi obtida com o isolado BL74. Destaca-se tambm a possibilidade da fermentao de glicerol de biodiesel por Streptomyces clavuligerus para a produo de cido clavulnico, potente inibidor de betalactamases, que junto com a penicilina e cefalosporina so utilizados contra infecciones bacterianas. O trabalho desenvolvido por Gutierrez e Costa Arajo (2007) comparou a suplementao continua de meios de cultura contendo concentraes variveis de fonte de aminocidos e glicerol para a produo de cido clavulnico. Aps 120 h de fermentao, a mxima concentrao de cido clavulnico obtido foi de 60 mg/ L. Na busca de novas cepas fermentadoras de glicerol, Silva e Contiero (2007) isolaram a bactria GLC29 produtora de 10,8 g/L de 1,3-propanodiol a partir de 20 g/L de glicerol. Este estudo soma-se s numerosas pesquisas desenvolvidas em outros pases para a produo deste glicol com impor-
tantes aplicaes industriais (GONZALEZPAJUELO et al., 2006; XIU et al., 2007). Estes e outros estudos demonstraram a potencialidade da utilizao do glicerol, proveniente da produo de biodiesel, como fonte de carbono para a produo de compostos qumicos de interesse comercial. Embora, em etapas iniciais, novas linhas de pesquisas esto sendo definidas para obter compostos de maior valor agregado, que incluam principalmente molculas bioativas, como protenas e ribonucleotdeos, para a indstria alimentcia e farmacutica. A utilizao de biorefinarias para converso de glicerol bruto apresenta-se como uma estratgia promissora para evitar futuros problemas de acumulao deste subproduto, ao tempo de aumentar a rentabilidade da produo de biodiesel. Aspectos econmicos O excesso de glicerol proveniente da produo de biodiesel associado baixa demanda mundial (0,5 bilhes ton/ano) e baixo custo, projetam um desequilbrio econmico nas indstrias oleoqumicas e de refino de glicerol, ao tempo de pr em risco a sustentabilidade econmica de usinas de biodiesel no mundo (HGCA, 2007). No Brasil, a maioria das plantas industriais de biodiesel no valoriza efetivamente o glicerol. A projeo do volume de glicerol no pas para o ano 2013 de 488 milhes e as perspectivas, nesse sentido, no so auspiciosas, devido a que poucas apresentam planos futuros para sua converso em produtos de maior valor agregado. O uso intensivo deste co-produto essencial para a sustentabilidade econmica da indstria de biodiesel no pas. A queda brusca do preo do glicerol no cenrio internacional nos ltimos 5 anos tem obrigado paralisao da produo da glicerina sinttica a partir de propileno. O excesso de volume de glicerol, o alto preo do propileno e as vantagens de produzir compostos derivados da indstria petroqumica de maior valor, conspiraram para o severo declnio das indstrias de glicerina sinttica (HGCA, 2007). Nos Estados Unidos, o valor do glicerol diminuiu de 1048 R$/t em 2004 para aproximadamente 125 R$/t no ano 2006 (YAZDANI, GONZALEZ, 2007). No Brasil, atualmente o preo FOB (Free on Board) do glicerol bruto varia de 200 a 400 R$/t, sendo o valor do glicerol loiro (parcialmente tratado para remoo de impurezas) de 600 a 800 R$/t. Estimase que na prxima dcada, sempre que se mantenha a tendncia favorvel para o biodiesel, o preo do glicerol co-produzido poderia diminuir ainda mais. Considerando a situao e a projeo para os prximos anos, a utilizao do glicerol como substrato para fermentao poderia torna-se vantajoso em relao ao preo de outros resduos tradicionalmente utilizados como fonte de carbono para a obteno de bioprodutos. Por exemplo, o preo do melao de cana de acar no mercado internacional varia entre os 120 e 170
R$/t, outro exemplo corresponde ao valor do bagao de cana que oscila entre 9,5 e 24 R$/t. Neste ltimo caso, o bagao deve ser submetido a tratamentos fsicos, qumicos ou enzimticos para disponibilizar a glicose, o que elevaria o preo final do substrato. A produo industrial de biomolculas por fermentao de glicerol economizaria custos de processos tradicionais que requerem etapas de elevado consumo energtico para extrao e acondicionamento do substrato (sacarose de cana de acar ou glicose de amido de milho). O grande desafio no Brasil ser incentivar as pesquisas biotecnolgicas que, timidamente, vem sendo desenvolvidas no pas. Alem disso, facilitar a imediata transferncia tecnolgica dessas descobertas na prpria usina de biodiesel, permitindo reduzir custos de transporte para converter o biodiesel em um biocombustvel de alta rentabilidade econmica. CONCLUSO Desde que alguns governos estipularam normativas que obriga a adio de biodiesel ao combustvel de petrleo, grande quantidade de glicerol vem sendo gerada, tornando-se necessria a busca de alternativas para sua utilizao. Numerosas pesquisas esto sendo desenvolvidas nesse sentido, no entanto, os esforos ainda constituem uma soluo em longo prazo para a acumulao de glicerol. A biotecnologia apresenta alternativas para a obteno de produtos de alto valor agregado como bio-pesticidas, pigmentos, aromas, polmeros, antibiticos e protenas recombinantes. No entanto, preciso estudar com maior detalhe aspectos de engenharia bioqumica como agitao, aerao, cintica de crescimento e obteno de produtos, e transferncia de massa e energia. Estes parmetros so considerados essenciais para entender os mecanismos de utilizao de microrganismos assim como para a otimizao de processos, objetivando a futura ampliao de escala. Estratgias mais detalhadas para a utilizao biotecnolgica do glicerol so esperadas em poucos anos, de forma a reduzir os impactos ambientais e tornar o biodiesel um produto altamente competitivo no mercado mundial de biocombustveis. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro da CAPES e o CNPq para o desenvolvimento de projetos de pesquisas. REFERNCIA AHN, W.S.; PARK, S.J.; LEE, S.Y.; Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 3624 ANSELL, R.; GRANATH, K.; HOHMANN, S.; THEVELEIN, J.M.; ADLER, L.; EMBO J . 1997,16, 2179
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Pesquisa
NANOPARTCULAS
Uma alternativa para a administrao de biofrmacos
Palavras-chave: nanopartculas, biofrmacos, liberao controlada. 1. BIOFRMACOS Durante os anos de 1980 o termo biofrmacos tornou-se sinnimo de protenas teraputicas produzidas pela tecnologia de DNA recombinante, incluindo tambm os anticorpos monoclonais, obtidos pela tecnologia de hibridoma. Mais tarde, os medicamentos a base de cidos nuclicos usados para a proposta de terapia gnica e tecnologia de antisenso, foram adicionados ao grupo (WALSH, 2002). No entanto, os produtos baseados em protenas recombinantes podem ser considerados, atualmente, os principais representantes desse grupo. O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante, na dcada de 1970, marcou o incio da era da biotecnologia moderna. Alguns anos depois, em 1982, a insulina humana, desenvolvida pela empresa Genentech (EUA) chegou ao mercado, marcando de vez a aplicao industrial dessa tecnologia (BUCKEL, 1996). Desde ento, centenas de centros de pesquisa e empresas no mundo inteiro tm se empenhado na pesquisa, no desenvolvimento e na produo dos biofrmacos (DEMAIN, 2004). Nos Estados Unidos, dos novos medicamentos aprovados entre os anos de 2003 a 2006, 24% eram biofrmacos. O resultado desses trabalhos que h mais de 165 produtos aprovados em todo o mundo, com um mercado estimado, em 2004, em torno de 33 bilhes de dlares e projetado para cerca de 70 bilhes de dlares para o ano de 2010 (WALSH, 2006). Diferentes fatores contriburam para que as protenas recombinantes se tornassem substncias de grande interesse das indstrias farmacuticas. Primeiramente, destaca-se que a tecnologia de pro-
Roberta Mrcia Marques dos Santos Doutora em Bioqumica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais. Servio de Desenvolvimento Biotecnolgico, Diviso de Desenvolvimento Farmacotcnico e Biotecnolgico, Fundao Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brasil. roberta@funed.mg.gov.br * Slvia Ligrio Fialho Doutora em Cincias Farmacuticas pela Universidade Federal de Minas Gerais. Diviso de Desenvolvimento Farmacotcnico e Biotecnolgico, Fundao Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brasil. silvia.fialho@funed.mg.gov.br
duo dos biofrmacos permitia uma proviso de medicamentos que no poderiam ser produzidos pelas tecnologias convencionais, como por exemplo, a eritropoetina e o GCSF (fator estimulador de colnias de granulcitos). Esta tecnologia possibilitava, tambm, a produo de uma maior quantidade dos medicamentos que at ento estavam disponveis apenas em quantidades limitadas, como por exemplo, o hormnio do crescimento. A tcnica de desenvolvimento de protenas recombinantes permitia ainda, a produo de medicamentos mais seguros, livres de vrus patognicos humanos (BUCKEL, 1996). Uma substncia que exemplifica essa situao o hormnio do crescimento humano (hGH). Diferente da insulina, que era extrada de pncreas bovino e suno, o hormnio do crescimento espcie-especfico. Pacientes que sofrem de hipopituitarismo necessitam de tratamento de reposio desse hormnio. De 1960 a meados de 1980 o hormnio para esses pacientes era obtido da glndula pituitria de cadveres. Tal tratamento era considerado satisfatrio at que alguns pacientes, em decorrncia de uma infeco causada pelo tratamento, apresentaram a sndrome de Creutzfeld-Jacob (CAREY, 1987). Outro ponto positivo dessa tecnologia foi a possibilidade de utilizao de mais uma rota para encontrar tratamentos novos, mais seguros e eficazes para as doenas. Nos 25 anos de existncia dos biofrmacos no mercado, vrias doenas foram e continuam sendo o foco das atenes tanto no desenvolvimento quanto na produo dos medicamentos, sendo as principais o cncer, a hepatite, o diabetes, os distrbios do crescimento e a hemofilia (WALSH, 2006). Entre as protenas, os hormnios e as citocinas representam a maior categoria de produtos (ex. insulinas e gonadotrofinas). As citocinas aprovadas incluem uma variedade de fatores hematopoiticos recom-
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binantes, incluindo eritropoetinas, fatores estimuladores de colnia e produtos baseados nos interferons. Protenas teraputicas aprovadas relacionadas ao sangue incluem uma variedade de fatores da coagulao sangunea, trombolticos e anticoagulantes recombinantes. A tabela 1 apresenta uma viso geral das principais classes das protenas recombinantes teraputicas. Alm dessas, h ainda uma variedade de vacinas de subunidades e de produtos baseados nos anticorpos monoclonais, indicados para o tratamento ou deteco de vrios cnceres e para preveno de rejeio de transplante de rgo. Os biofrmacos podem ser produzidos em um dos vrios sistemas de expresso disponveis para a produo de protenas teraputicas, incluindo bactrias, leveduras, clulas de insetos e mamfe-
mercado, como o anticoagulante Hirudina (Refludan/Hoechst e Revasc / Canyon Pharmaceuticals) e alguns anlogos de insulina como, por exemplo, a insulina Aspart (Novolog/Novo Nordisk), ambos produzidos em Saccharomyces cerevisiae (GERNGROSS, 2004; WALSH, 2006). As clulas de mamferos, apesar de serem sistemas de produo industrial tecnicamente complexos, lentos, de baixa produtividade e de alto custo, continuam a ser os de escolha devido a sua similaridade com as clulas humanas em relao s modificaes ps-traducionais e padres de glicosilao. Cerca de 60 a 70% das protenas recombinantes teraputicas so produzidas em clulas de mamferos, principalmente nas clulas de ovrio de hamster chins (CHO). Avanos tm sido alcanados para aumentar a
Figura 1 Representao esquemtica de nanoesferas e nanocpsulas
ros. A escolha do melhor sistema envolve vrias questes, sendo que as principais so as intrnsecas estrutura da protena e aquelas relacionadas ao custo da produo. As bactrias como a Escherichia coli apresentam vantagens como uma produo rpida, com bons rendimentos e econmica. No entanto, dentre as desvantagens, esto a incapacidade de modificaes ps-traducionais, como a glicosilao, e a possibilidade de formao de corpos de incluso (JANA AND DEB, 2005). As leveduras e fungos tm a sua utilizao para a produo de protenas teraputicas para uso humano limitada devido ao perfil de glicosilao diferente daquele das clulas humanas. Ainda assim, h alguns produtos no
produtividade desse tipo de cultura. Atualmente, so obtidos rendimentos 100 vezes maiores do que a 20 anos atrs, quando da primeira utilizao de cultura de clulas de mamferos para produo industrial de protenas recombinantes (WURM, 2004; BROWNE AND AL-RUBEAI, 2007). As protenas teraputicas, inicialmente aprovadas para uso na medicina geral, eram simples protenas de reposio (ex. insulina recombinante e fatores sanguneos). Nos ltimos anos, tem-se observado um aumento proporcional dos biofrmacos desenvolvidos como protenas modificadas ou anlogos. O objetivo dessas modificaes alterar as caractersticas funcionais comercialmente importantes
para as protenas. Alguns autores consideram essas protenas modificadas como a segunda gerao dos biofrmacos, sendo de primeira gerao, as protenas recombinantes idnticas s que ocorrem em humanos (BUCKEL, 1996; WASH, 2004). As modificaes controladas de propriedades biofsicas especficas de protenas podem impactar potencialmente em uma variedade de caractersticas teraputicas. Para modulao das propriedades das protenas, tais como a eficcia, a estabilidade, a especificidade, a imunogenicidade e a farmacocintica, uma variedade de estratgias tm surgido, dentre elas, a manipulao da estrutura primria, a incorporao de modificaes qumicas e ps-traducionais e a utilizao de auxiliares de fuso (MARSHALL et al., 2003). A rota mais comum para otimizao a mutagnese stio-especfica. O desenvolvimento de um anlogo de insulina um excelente exemplo da abordagem das protenas modificadas. Devido s suas caractersticas intrnsecas, quando estocadas nas concentraes da dose teraputica, as molculas individuais de insulina interagem umas com as outras formando oligmeros (principalmente hexmeros). Aps a administrao subcutnea ou intramuscular, a sua ao na circulao sangnea retardada pela necessidade de deoligomerizao inicial. Atravs da mutao stioespecfica dos aminocidos envolvidos na auto-associao, tornou-se possvel alterar essa propriedade. Anlogos de insulina monomricas com um perfil de tempo de ao mais rpido do que a insulina humana esto no mercado, como por exemplo a Insulina Lispro (Eli Lilly), a Insulina Aspart (NovoRapid/Novo Nordisk) e a Glulisina (Apidra/Sanofi-Aventis). Como conseqncia prtica, essa insulina modificada pode ser administrada minutos antes das refeies, trazendo mais flexibilidade nos horrios de alimentao dos pacientes (FROKJAER AND OTZEN, 2005; COELHO, 1997; VAJO AND DUCKWORTH, 2000; WANNMACHER, 2005). Outra forma de insulina modificada a insulina glargina (Lantus e Opsulin) aprovada como um anlogo que apresenta um aumento significativo na durao da atividade. A mudana feita na seqncia de aminocidos aumentou o ponto isoeltrico da molcula de 5,4 para aproximadamente 7,0. Dessa forma, quando a insulina formulada, no pH cido, ela se encontra solvel e, aps a administrao, no pH fisiolgico, ocorre a formao de microprecipitados de insulina no local da injeo e as molculas individuais de insulina entram na circulao sangnea muito lentamente, com durao de 24 hoBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 37 53
Tabela 1 Classes de biofrmacos e seus principais representantes
Baseada em WALSH, 2003 e 2006
ras, permitindo uma nica injeo ao dia (WALSH, 2003; VAJO AND DUCKWORTH, 2000). Alteraes nas molculas tambm permitem melhorar a sua estabilida54
de. A utilizao de mtodos de otimizao racional permite que as protenas possam ser modificadas de forma que a sua estrutura e a sua atividade sejam mais robustas quando expostas
protease, ao estresse oxidativo e s mudanas na temperatura, no pH e nas condies da soluo. Mutaes dos aminocidos cistena por serina foram introduzidas com sucesso em vrias
protenas teraputicas como, por exemplo, com o interferon beta 1b (MARK et al., 1984; MARSHALL et al., 2003). Uma ferramenta que tem sido utilizada para alterar a farmacocintica de alguns biofrmacos a peguilao, um processo em que cadeias de polietilenoglicol so ligadas aos peptdeos e protenas. Em geral, a peguilao reduz a velocidade de clearance plasmtico por reduzir a degradao metablica e a captao mediada pelo receptor da protena da circulao sistmica. Esta tcnica tambm melhora o perfil de segurana das protenas por conferir uma proteo antignica e imunognica aos seus epitopos. Vrios biofrmacos esto no mercado na forma peguilada como o interferon alfa (PEGasys e PEG-Intron), o hormnio do crescimento (Somavert) e a asparaginase (Oncaspar ) (MARSHALL et al., 2003; FROKJAER AND OTZEN, 2005; HARRIS AND CHESS, 2003). 2. DIFICULDADES NA ADMINISTRAO DE BIOFRMACOS As protenas e peptdeos tm proporcionado um crescente interesse devido ao seu papel na fisiopatologia e ao seu progresso nas reas de biotecnologia e bioqumica. O uso dessas molculas em medicina, no entanto, tem sido limitado devido a sua baixa biodisponibilidade, a qual resulta da sua baixa estabilidade frente s enzimas proteolticas e degradao hidroltica, da baixa permeabilidade, e da curta meia-vida na circulao sistmica (REIS et al., 2006). Desde 1987, Carey j enfatizava que uma das principais limitaes na utilizao das protenas recombinantes na clnica era a questo da impossibilidade de administrao por via oral. Vinte anos depois, esse continua a ser, sem dvida, um ponto a ser totalmente solucionado. A via oral a rota de administrao de medicamentos preferida e mais amplamente utilizada. No entanto, ela geralmente no est disponvel para a liberao de macromolculas tais como protenas. A instabilidade inerente das protenas ao trato gastrintestinal, assim como a baixa permeabilidade atravs das membranas biolgicas devido alta massa molecular e superfcie polar caractersticas, implicam no tratamento pela via parenteral (FROKJAER AND OTZEN, 2005; JORGENSEN et al., 2006). No entanto, essa via apresenta alguns inconvenientes ao paciente, especial-
mente nos casos crnicos, o que diminui a adeso ao tratamento, comprometendo, assim, o resultado esperado. Muitos esforos de pesquisa esto sendo feitos para melhorar a adeso do paciente, seja atravs do emprego de vias alternativas de administrao ou por reduo da freqncia de injees. A maioria dos medicamentos a base de protenas formulada como suspenses ou solues aquosas prontas para o uso ou como p liofilizado para reconstituio do produto. A formulao de protenas depende do conhecimento das suas caractersticas fsico-quimicas e biolgicas, incluindo estabilidade qumica e fsica, imunogenicidade e propriedades farmacocinticas. A atividade teraputica de protenas altamente dependente da sua estrutura conformacional. No entanto, a estrutura da protena flexvel e sensvel a condies externas, o que significa que a sua produo, formulao e manipulao necessitem de ateno especial na otimizao da eficcia e da segurana, incluindo a minimizao da resposta imune (FROKJAER AND OTZEN, 2005). De uma perspectiva de formulao, as protenas so molculas complexas e desafiadoras para o desenvolvimento de sistemas de liberao de frmacos. O sucesso de uma formulao depende da capacidade da protena em manter sua estrutura nativa e atividade durante a preparao e a liberao no organismo, assim como durante o perodo de estocagem. Algumas protenas precisam de liberao sustentada, enquanto outras requerem uma liberao controlada, imediata ou pulsada. A liberao pode ser alcanada utilizando diferentes sistemas particulados de liberao de frmacos, tais como as micro e nanopartculas polimricas, os hidrogis, os lipossomas e as emulses (JORGENSEN et al., 2006 ). A demanda por melhores formas para a administrao de protenas tem resultado na pesquisa pelo desenvolvimento de tecnologias farmacuticas,e empresas focadas nos mtodos de liberao de frmacos tm crescido a cada ano. A maioria das protenas que esto no mercado podem ser consideradas como candidatas para os novos mtodos de liberao, uma vez que so facilmente liberadas pelas vias tradicionais como na forma de injees subcutneas (SC), intramusculares (IM) ou intravenosas (IV) e tm a sua farmacologia bem caracterizada. Devem ser considerados fatores como a competio de mercado, a convenincia, a adeso
do paciente, a necessidade de liberao tpica ou local, a toxicidade sistmica e as questes de segurana. Alguns mtodos esto sendo desenvolvidos e esto direcionados para a competio de mercado para os biofrmacos aprovados, como a insulina, o hormnio do crescimento humano, os interferons e a eritropoietina. Esses sistemas objetivam uma melhoria na adeso do paciente ao tratamento. Em muitos casos, a administrao tpica de protenas constitui uma via preferencial sistmica, pois esta ltima no promove nveis significativos no local da doena. Em determinadas situaes so necessrios elevados nveis sistmicos para alcanar efeito local nos tecidos alvo, o que muitas vezes causa efeitos txicos indesejveis. Devem ser ainda consideradas questes como o impacto dos processos de produo do sistema de liberao na integridade da protena, e tambm a integridade da protena aps sua liberao no local de administrao. A administrao de protenas degradadas pode representar alm dos efeitos colaterais, a perda da potncia. Para a administrao sistmica de protenas, a quantidade liberada na circulao dependente da eficincia do sistema de liberao e da biologia intrnseca da via de administrao (CLELAND et al., 2001). Quando so consideradas as novas opes para administrao de protenas, a via mais comumente abordada a parenteral, devido ao maior nmero de estudos em animais e aos testes clnicos que garantem uma maior segurana e eficcia. Os pulmes tm sido extensivamente estudados como uma via de administrao de protenas pela a sua grande rea de superfcie e por permitir uma rpida absoro devido ao contato prximo entre os alvolos e a circulao (GONDA, 2000; CLELAND et al., 2001). A insulina , sem dvida, o prottipo biofarmacutico, tendo sido o Exubera (Pfizer) a primeira formulao inalatria aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration), e que permite administrar uma forma de insulina em p seco. Cerca de 40% da protena chega ao pulmo profundo e 10% biodisponvel. O incio de ao da insulina inalada mais rpido do que a injetvel de ao rpida, o que permite a sua utilizao pr-prandial (MCMAHON AND ARKY, 2007). Estudos clnicos demonstraram uma equivalncia significativa comparativamente a vrias formas de insulina convencional. A insulina inalada apresentou-se efetiva, bem tolerada e melhor aceita em pacientes com diabetes tipo 1 e tipo 2 (HOLLANDER et al., 2004; WANNMACHER, 2005).
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O aumento do uso das protenas teraputicas na indstria farmacutica tem salientado questes como a sua estabilidade durante o perodo de estocagem e a liberao eficaz de forma a evitar a ocorrncia de efeitos adversos. Modificaes qumicas controladas tais como substituies, acilao e peguilao tm cumprido algumas, mas no todas as suas promessas, enquanto sistemas polimricos de liberao prolongada podem desempenhar um papel importante (FROKJAER AND OTZEN, 2005). Devido a suas propriedades de liberao sustentada e prolongada, ao pequeno tamanho e a biocompatibilidade com tecidos e clulas, as nanopartculas podem ser sistemas promissores para a administrao de protenas e peptdeos (RIEUX et al., 2006.). 3. NANOPARTCULAS A aplicao de materiais polimricos com finalidades teraputicas est crescendo muito rpido e tem sido evidenciada em diversos campos como engenharia de tecidos, implante de dispositivos mdicos e rgos artificiais, prteses, oftalmologia, odontologia, reparo sseo e outros (NAIR AND LAURENCIN, 2007). Os sistemas polimricos esto sendo amplamente estudados e utilizados, e no s permitem uma liberao lenta e gradual do frmaco, como tambm podem possibilitar o direcionamento a alvos especficos do organismo, como stios de inflamao ou tumor. Embora o conceito de sistemas de liberao de frmacos no seja novo, um grande progresso tem ocorrido no tratamento de uma variedade de doenas. O transporte de frmacos para o local de ao considerado o aspecto mais importante, e para que este consiga liberar uma dose eficaz do frmaco no local de ao so necessrios veculos adequados. As nanopartculas apresentam aplicaes potenciais na administrao de substncias teraputicas com o objetivo de aumentar a eficincia do transporte de frmacos e melhorar os perfis de liberao (KUMAR, 2000). A nanotecnologia pode ser definida como um campo cientfico multidisciplinar baseado no desenvolvimento, na caracterizao, na produo e na aplicao de estruturas, dispositivos e sistemas com forma e tamanho na escala nanomtrica. Atualmente h um investimento global na nanotecnologia em torno de U$ 7 bilhes e estima-se para 2011-2015 um investimento de cerca de U$ 1,5 trilho (STYLIOS et al., 2005).
Na nanomedicina, ou seja, no desenvolvimento de tratamentos efetivos baseados na nanotecnologia, ocorre a interseo de diferentes reas, entre elas a biologia, a qumica, a fsica, as engenharias qumica e mecnica, a cincia de materiais e a medicina clnica (FAROKHZAD AND LANGER, 2006). Os primeiros esforos na nanomedicina foram focados no aumento das propriedades das modalidades teraputicas e de diagnstico j disponveis. Recentemente, houve uma alocao de $144 milhes pelo Instituto Nacional do Cncer e $54 milhes pelo Instituto Nacional do Corao, Pulmo e Sangue nos Estados Unidos para a pesquisa em nanotecnologia nos anos de 2004 e 2005, respectivamente. Esses investimentos, juntamente como o grande aumento do nmero de patentes na rea nos ltimos cinco anos, ampliou significativamente o interesse dos pesquisadores pela nanomedicina (FAROKHZAD AND LANGER, 2006). A nanomedicina ainda se encontra nos estgios iniciais e este assunto ainda precisa ser amadurecido. O que se espera uma entrada contnua de novas plataformas de nanotecnologia que apresentaro um grande impacto positivo em diferentes nveis, incluindo: a deteco de alteraes moleculares causadoras de doenas, diagnstico e imagem de doenas, transporte de frmacos, sistemas multifuncionais para aplicaes teraputicas e de diagnstico, veculos que aumentem a eficcia in vivo de agentes teraputicos e tecnologias nanomtricas que acelerem a pesquisa cientfica (FAROKHZAD AND LANGER, 2006). No campo da nanotecnologia os sistemas de liberao controlada de frmacos se destacam e tm apresentado um crescente avano (EMERICH AND THANOS, 2006). Entre eles, as nanopartculas foram inicialmente desenvolvidas em meados dos anos 70 com o objetivo de transportar substncias nos organismos, tecidos ou at mesmo clulas, para melhorar a eficcia teraputica e diminuir o efeito txico das substncias nelas carreadas (MONTASSER et al., 2000; FATTAL et al., 2002). Elas foram inicialmente desenvolvidas como sistemas de transporte para vacinas e frmacos antineoplsicos. Visando aumentar a captao pelo tumor, a estratgia de transporte do frmaco para o local especfico foi empregada e o primeiro passo importante da pesquisa objetivou o desenvolvimento de mtodos para reduo da
captao das nanopartculas pelas clulas do sistema reticular endotelial. Simultaneamente, a utilizao das nanopartculas para diferentes vias de administrao tambm foi estudada (KUMAR, 2000). Nas ltimas quatro dcadas, a tecnologia polimrica de liberao controlada apresentou um impacto nas diferentes reas da medicina, sendo elas, principalmente, a oftalmologia, a pneumologia, a relacionada dor, a endocrinologia, a cardiologia, a ortopedia, a imunologia e a neurologia, com diferentes produtos j presentes na prtica clnica (FAROKHZAD AND LANGER, 2006). O mercado anual no mundo de sistemas polimricos de liberao controlada, incluindo os sistemas de liberao de frmacos, estimado em 60 bilhes de dlares e estes sistemas esto sendo utilizados por mais de 100 milhes de pessoas a cada ano. As nanopartculas so sistemas coloidais polimricos com tamanho entre 10 e 1000 nm (RIEUX et al., 2006), nos quais o frmaco pode se encontrar dissolvido, recoberto, encapsulado ou disperso. Elas so classificadas em duas categorias, as nanoesferas e as nanocpsulas, as quais diferem entre si segundo a composio e a organizao estrutural. As nanocpsulas so sistemas vesiculares em que o frmaco encontra-se no interior de uma cavidade aquosa ou oleosa circundada por uma membrana polimrica, ou podendo tambm ser encontrado adsorvido na membrana polimrica. As nanoesferas so formadas por uma matriz polimrica, onde o frmaco encontra-se disperso ou adsorvido (Figura 1) (ABDELWAHED et al., 2006). Estes sistemas podem promover um aumento da solubilidade do frmaco neles incorporado, proteger as substncias de degradao e modificar sua distribuio (LACOEUILLE et al., 2007; RIEUX et al., 2006; SCHAFFAZICK et al., 2003). Diferentes aplicaes teraputicas das nanopartculas tm sido estudadas, principalmente para administrao pelas vias parenteral e oral. Por meio da administrao parenteral, objetiva-se uma distribuio mais seletiva do frmaco, aumentando, assim, seu ndice teraputico. Com relao administrao oral, as pesquisas tm sido direcionadas principalmente diminuio dos efeitos adversos e proteo de frmacos passveis de degradao no trato gastrointestinal, tais como peptdeos e protenas, aumentando a biodisponibilidade dos mesmos (KUMAR, 2000; RIEUX et al., 2006; REIS et al., 2007). As vantagens da utilizao de nanopartculas incluem a liberao controlada e/ ou prolongada da substncia nelas en-
capsuladas, a reduo de efeitos adversos associados substncia, a proteo de compostos da inativao antes de atingirem o local de ao, o aumento da penetrao intracelular e o aumento da atividade farmacolgica (TEIXEIRA et al., 2005). Diferentes mtodos so encontrados para o preparo de nanopartculas, os quais permitem a modulao da sua estrutura, da sua composio e das suas propriedades fisiolgicas (RIEUX et al., 2006). A escolha do mtodo de preparo depende do polmero e da solubilidade do frmaco a ser encapsulado. Estes mtodos podem ser classificados em duas categorias principais, sendo elas a polimerizao de monmeros e a utilizao de polmeros prformados (REIS et al., 2006). Com exceo dos alquilcianoacrilatos e do malonato de poli-dialquilmetilideno, grande parte dos monmeros adequados para o processo de polimerizao micelar promovem uma formao de polmeros no biodegradveis ou que se degradam muito lentamente. Alm disso, as molculas residuais no meio de polimerizao podem ser mais ou menos txicas, o que requer a purificao do material. Para contornar as limitaes dos mtodos de polimerizao de monmeros, tm sido empregados os mtodos de preparo utilizando polmeros pr-formados. Entre os mtodos que utilizam polmeros pr-formados, a tcnica de disperso de polmeros pr-formados tem sido a mais empregada. Nela, o polmero disperso em um solvente orgnico imiscvel com gua como o diclorometano, o clorofrmio e o acetato de etila. A disperso formada emulsificada com uma fase aquosa contendo um emulsionante e a fase orgnica ento evaporada. Aps evaporao completa do solvente orgnico as nanopartculas so separadas por meio de centrifugao (RIEUX et al., 2006) e podem ser armazenadas como suspenso ou serem liofilizadas. 4. POLMEROS Para que um polmero seja caracterizado como biomaterial ele no deve ser causador de resposta inflamatria ou reaes txicas no local de aplicao, deve apresentar uma meia-vida adequada, o seu tempo de degradao deve ser compatvel como o processo de cicatrizao ou regenerao, deve apresentar propriedades mecnicas adequadas aplicao desejada, seus produtos de degradao no devem ser txicos, devem ser capazes de serem metabolizados e eliminados do organismo, e devem apresentar permeabilidade apropriada aplicao desejada.
Os sistemas de liberao de peptdeos e protenas so preparados, geralmente, a partir de polmeros biodegradveis. No entanto, o desenvolvimento de sistemas biodegradveis requer o controle de um maior nmero de variveis j que a cintica de degradao do polmero, in vivo, deve permanecer constante para que seja obtida uma liberao controlada da substncia. Portanto, fatores como o pH e a temperatura, que podem promover um aumento ou uma reduo na velocidade de degradao do sistema, devem ser avaliados durante o desenvolvimento (DASH AND CUDWORTH II, 1998). Tanto os polmeros sintticos quanto os naturais tm sido amplamente estudados como biomateriais. O processo de biodegradao envolve a clivagem hidroltica ou enzimtica das ligaes levando a eroso do material polimrico (NAIR AND LAURENCIN, 2007). Os polmeros naturais podem ser considerados como os primeiros biomateriais utilizados clinicamente. No entanto, apesar de apresentarem algumas vantagens, eles podem promover uma atividade antignica, a qual est associada ao seu processo de purificao, e tambm podem transmitir doenas. Como exemplos de polmeros naturais, destacam-se aqueles base de protenas como as albuminas bovina e humana, o colgeno e a gelatina. Os polmeros sintticos, geralmente, so biologicamente inertes, apresentam propriedades mais previsveis, maior uniformidade lote a lote, alm de outros fatores. Eles so representados pelas poliamidas, pelos poliaminocidos, pelos polialquilcianacrilatos, pelos polisteres, pelos poli (ortosteres), pelos poliuretanos e pelas poliacrilamidas. A natureza dos polmeros empregados em sistemas de liberao de frmacos influencia significativamente no tamanho e no perfil de liberao do sistema. Os polmeros biodegradveis sintticos tm apresentado crescente interesse na aplicao como sistemas de liberao, j que os naturais apresentam, geralmente, uma rpida liberao do frmaco. Os principais critrios na seleo de um polmero so, principalmente, a biodisponibilidade, a biocompatibilidade e a sua velocidade de degradao (RIEUX et al., 2006). O perfil e o mecanismo de liberao do frmaco dependem da natureza do polmero e tambm das propriedades fsico-qumicas da substncia nele in-
corporada. Alguns polmeros so menos sensveis s condies empregadas nos processos de preparao, o que pode ser devido sua composio qumica, sua massa molar e sua cristalinidade (RIEUX et al., 2006). Os polmeros biodegradveis mais utilizados atualmente so os polisteres, tais como a poli(-caprolactona), o poli(D,Lltico) (PLA) e os copolmeros derivados dos cidos ltico e gliclico (PLGA) (DASH AND CUDWORTH II, 1998). So polmeros termoplsticos e constituem a classe mais antiga e a mais estudada dos polmeros biodegradveis (NAIR AND LAURENCIN, 2007). Eles podem ser preparados a partir de uma variedade de monmeros pela abertura do anel e por vias de polimerizao dependendo da unidade monomrica. Os derivados dos cidos ltico e gliclico foram empregados como material de fios de sutura na dcada de 1960 e, desde ento, outros poli-steres alifticos foram desenvolvidos como polmeros biodegradveis e tm despertado bastante ateno devido a biocompatibilidade e aos perfis de degradao controlveis que apresentam. 5. ESTUDOS E PATENTES DA APLICAO DE NANOPARTCULAS PARA A ADMINISTRAO DE BIOFRMACOS Alguns estudos tm demonstrado que as nanopartculas podem prolongar a liberao e tambm aumentar a biodisponibilidade de peptdeos e protenas. Snchez e colaboradores (2003) desenvolveram micro e nanopartculas para administrao parenteral de interferon. Neste estudo, foi realizada uma comparao da taxa de encapsulamento e da liberao do peptdeo a partir de micro e nanopartculas preparadas por diferentes tcnicas de encapsulamento, utilizando o copolmero dos cidos ltico e gliclico (PLGA) como matriz e contendo poloxamer como agente estabilizante. Os resultados mostraram que o interferon pode ser eficientemente encapsulado em micro e nanopartculas. Os sistemas exibiram um perfil de liberao similar e a integridade e a bioatividade da substncia foram mantidas. A atividade antiproliferativa do interferon variou dependendo da formulao desenvolvida. Nanopartculas de polietilenoglicol e cido poli-ltico contendo um peptdeo neuroprotetor (peptdeo intestinal vasoativo) para administrao intranasal tambm foram estudadas (GAO et al., 2007). A biodistribuio, a liberao no crebro e o efeito neuroprotetor da formulao foram avaliados. Os resultados mostraram que
a formulao de nanopartculas promoveu uma maior concentrao do peptdeo no crebro de camundongos quando comparado formulao na forma de soluo. De acordo com os pesquisadores, as nanopartculas desenvolvidas podem ser carreadores promissores para peptdeos e protenas. Reis e colaboradores (2007) avaliaram nanoesferas de alginato-dextrano contendo insulina. As nanoesferas foram caracterizadas quanto ao tamanho e sua distribuio e quanto forma. A eficincia de encapsulamento e a liberao in vitro da insulina tambm foram determinadas. A bioatividade da protena foi avaliada in vitro e em ratos diabticos. Os resultados mostraram que as nanoesferas desenvolvidas, de 267 nm a 2760 nm, apresentaram uma eficincia de encapsulamento de 82,5 %. As nanopartculas impediram a liberao da insulina no meio cido e permitiram uma liberao sustentada do peptdeo em meio neutro. A insulina encapsulada foi bioativa, como demonstrado pelos estudos in vitro e in vivo. Algumas patentes tambm descrevem a utilizao de nanopartculas para administrao de peptdeos e protenas: - patente US 5,500,224 intitulada Composies farmacuticas de nanocpsulas descreve uma composio farmacutica na forma de suspenso coloidal de nanocpsulas preparadas com o polmero polialquilcianoacrilato (VRANCKX et al., 1996). Esta formulao adequada para a administrao oral de polipeptdeos e polissacardeos. - patente US 5,641,745 intitulada Liberao controlada de micro e nanoesferas biodegradveis contendo ciclosporina descreve uma formulao farmacutica de liberao controlada contendo ciclosporina encapsulada em microesferas ou nanoesferas biodegradveis (RAMTOOLA, 1997). A formulao apresenta propriedades de liberao lenta da ciclosporina e adequada para o transporte do peptdeo para o intestino quando administrada pela via oral. - patente US 20060033224 intitulada Microesferas/nanoesferas polimricas e encapsulamento de protenas descreve um processo de formulao de microesferas e nanoesferas e o encapsulamento de protenas com atividade teraputica e outras substncias (CASTOR, 2006). Os sistemas formados foram capazes de encapsular as protenas e promover uma liberao controlada destas substncias. - patente US 7,291,598, intitulada Nanopartculas para o transporte de protenas, descreve nanopartculas compos58
tas de quitosano, cido poli-glutmico e pelo menos uma substncia ativa e que apresentam uma superfcie carregada positivamente (SUNG et al 2007). As nanopartculas desenvolvidas so capazes de aumentar a permeabilidade da protena encapsulada por meio do transporte pela via paracelular. - patente US 20070009605 intitulada Encapsulamento de peptdeos hidrossolveis descreve um processo de preparo de microesferas ou nanoesferas biodegradveis por meio da tcnica de emulsificao leo em gua (IGNATIOUS, 2007). Estas formulaes so adequadas para a liberao controlada de peptdeos bioativos. 6. CONSIDERAES FINAIS Os gastos com pesquisa e desenvolvimento na rea biofarmacutica esto em torno de 19 a 20 bilhes de dlares nos ltimos trs ou quatro anos. Estima-se que aproximadamente 2.500 frmacos de base biotecnolgica estejam em fase de descoberta, 900 em triagem pr-clinica e 1.600 em testes clnicos (WALSH, 2006). Do ponto de vista tcnico, avanos na engenharia de protenas e nos sistemas de liberao iro garantir a aprovao de um nmero ainda maior de produtos modificados e de liberao controlada. A eficincia e a segurana da administrao de protenas teraputicas so a chave do sucesso comercial e, em alguns casos, a demonstrao da eficcia nos atuais e futuros produtos biotecnolgicos. Vrias empresas tm se dedicado busca por diferentes e mais eficientes mtodos de liberao de protenas. Para avaliar criticamente as opes, cada mtodo deve ser considerado em termos de quo fcil ele pode ser para a produo, para o impacto na qualidade da protena, para a biodisponibilidade e para a toxicidade. Em geral, os sistemas de liberao de protenas evoluram muito nos ltimos anos, mas, um grande esforo em pesquisa e desenvolvimento ainda necessrio para tornar a maioria desses sistemas viveis para a comercializao. Os sistemas nanoparticulados so uma oportunidade para melhorar a adeso do paciente ao tratamento e sua qualidade de vida por meio da reduo do nmero de injees. 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS Abdelwahed W, Degobert G, Fessi H. A pilot study of freeze drying of
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Pesquisa
PATENTES DE COMPOST OS COMPOSTOS QUMICO -F ARMACUTICOS QUMICO-F -FARMACUTICOS

A proteo de compostos qumicos-farmacuticos com frmulas Markush
INTRODUO A proteo de um composto qumico farmacutico por patentes dada por meio de reivindicaes, e pode ser caracterizada por sua estrutura qumica (frmula geral); por sua nomenclatura oficial da IUPAC; por suas propriedades fsicas; ou por suas propriedades fsico-qumicas. Quando um composto qumico caracterizado por sua frmula estrutural, surgem as chamadas frmulas Markush. As frmulas Markush so estruturas qumicas que apresentam diferentes radicais substituintes pertencentes a diferentes grupos qumicos. Assim, o termo frmula Markush tem sido empregado para designar qualquer estrutura qumica que contenha uma subestrutura requerida e um (ou mais) grupo(s) qumicos variveis ou opcionais (Simmons, 2003). A Figura 1 apresenta um exemplo tpico de uma estrutura Markush que, de acordo com Milne (1991), pode representar cerca de 1 967 324 000 estruturas distintas. Onde: A= NH ou CH; B = O, S, NR ou C=X; X = O ou S; n = 0 ou 1, onde n = 0 quando A = N; R = selecionado de H, halo, alquil, haloalquil,, nitro, amino, alquilami-
Queli Cruz Bastos Aluna de Doutorado do curso de PsGraduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Universidade Federal do Rio de Janeiro e Pesquisadora em Propriedade Industrial do Instituto Nacional de Propriedade Industrial/INPI queli@inpi.gov.br A matria abordada neste artigo parte integrante da tese de doutorado da autora. Portanto, as argumentaes e questionamentos expressos no refletem, necessariamente, o entendimento institucional do INPI sobre a questo. Adriana Campos Moreira Britto D.Sc., Especialista em Patentes da Coordenao de Gesto Tecnolgica da Fundao Oswaldo Cruz/GESTEC adriana@fiocruz.br Adelaide Maria de Souza Antunes D.Sc., Professora Titular do Departamento de Processos Orgnicos da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro adelaide@eq.ufrj.br
no, OH arilalcxi e alcxi. R1, R2, R3 = H, alquil, aralquil ou fenil (substitudo por um ou mais substituintes) R3 e R4 formam uma ligao dupla e R5 = H ou alquil quando A = N R4 e R5 formam uma ligao dupla e R3 forma uma dupla ligao com A quando A = C com a condio de que ao menos um dos R1 e R2 H ou alquil Este tipo de estrutura permite a eleio de um grande nmero de substituintes, os quais podem se ligar molcula em posies diversas, assim como atravs de diferentes arranjos dos mesmos. Como conseqncia, uma multiplicidade de compostos pode ser protegida a partir de uma nica estrutura de representao. Contudo, embora estes compostos sejam estatisticamente possveis, nem todos podero, necessariamente, ser concretizados. O termo Markush surgiu em 1923, quando o Dr. Eugene A. Markush depositou um pedido de patente nos Estados Unidos, o qual estava associado a um mtodo de preparar corantes de pirazolina. Porm, o tipo de reivindicao, depositado por Eugene Markush, foi considerado inespecfico pelo examinador de patente norte-americano. Todavia, depois de apelar Comisso de Patentes nos Estados Unidos, a patente foi concedida em 1924 como US 1,506,316.
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Markush no foi o primeiro inventor a tentar abranger mais de um composto em um nico pedido de patente. Quando comparada a reivindicaes anteriores, sua reivindicao foi relativamente simples, possuindo uma linguagem genrica e uma listagem curta de compostos especficos. Mas, os examinadores insistiam que uma reivindicao no poderia abranger compostos alternativos. Entretanto, aps a deciso na Comisso de Patentes FIGURA nos Estados Unidos, as reivindicaes Markush foram citadas por outros pedidos de patentes, e o nome grupo Markush foi vinculado a reivindicaes contendo fragmentos qumicos selecionados de grupos consistindo de uma lista de alternativas. Com o passar do tempo, o formato conhecido como uma reivindicao Markush tornou-se padro, significando uma estrutura qumica com substituintes variveis (Simmons, 1991). Uma das maiores preocupaes no somente por parte da indstria farmacutica, como tambm das universidades e Instituies de pesquisa que realizam pesquisas nessa rea e investem no desenvolvimento de novos compostos farmacuticos - justamente a proteo por patentes em virtude dos grandes gastos em P&D, pois o processo de inveno e desenvolvimento de um novo medicamento longo e complexo, sendo que de 5 mil a 10 mil molculas analisadas, apenas uma se transforma em um medicamento aprovado. Um medicamento pode levar mais de 15 anos para ser produzido (S, 2007). No entanto, surgem dvidas com relao ao escopo de proteo desses pedidos de patentes com frmulas Markush. E, neste sentido, prudente lembrar que as reivindicaes so as especificidades da inveno para as quais a proteo requerida, ou melhor, os aspectos particulares que os inventores consideram como novidade em relao ao esta-
do da tcnica existente at aquele momento. Desta maneira, elas delimitam e estabelecem os direitos do titular da patente sobre a mat-
1. Estrutura Markush
ria objeto de proteo. Enfim, as reivindicaes so, de fato, a inveno (Muller et al, 2001). Portanto, a preocupao em estabelecer critrios e limites de forma a satisfazer tanto o detentor da patente quanto ao usurio objeto de grande discusso, tendo em vista o forte impacto dessas patentes de medicamentos na sade pblica. Os crticos das patentes amplas frisam que as mesmas tendem a desencorajar a inovao subseqente por outros pesquisadores na rea geral da patente. Em contraste, os defensores de pedidos limitados destacam que estes incentivam outros a contornar a patente, proporcionando menos restries pesquisa afim conduzida por outrem. Estes tambm ressaltam que tais pedidos tendem a estabelecer direitos menos contestveis, ou seja, menos vulnerveis a aes judiciais. Uma vez que, o Acordo TRIPS (Acordo sobre Aspectos dos Direitos de Propriedade Intelectual) permite que os pases membros do WTO (World Trade Organization) adotem suas prprias definies de padres de patenteabilidade, ou seja, as invenes devem apresentar novidade, atividade inventiva e aplicao industrial, mas em nenhum momento determina qualquer especificao com relao ao critrio utilizado para definir a patenteabilidade, esta flexibilidade permite que diferentes critrios sejam adotados
em cada pas. Dessa forma, uma ampla reivindicao, como a de uma estrutura Markush pode ser analisada de diferentes maneiras, de acordo com os critrios adotados em cada pas membro da WTO. Portanto, dado os efeitos substanciais que uma patente pode ter na competio e, ento, sobre preos de medicamentos, os critrios que so aplicados para o exame e concesso da patente farmacutica so extremamente relevantes para a poltica da sade pblica. Para tal, o presente trabalho tem por objetivo mostrar caractersticas das reivindicaes de compostos qumico-farmacuticos com frmulas Markush, os problemas associados a elas e as solues propostas. PROBLEMAS ASSOCIADOS A REIVINDICAES MARKUSH Os problemas relacionados s reivindicaes Markush so decorrentes do fato destas serem caracterizadas por definies genricas, ou seja, um composto qumico definido por uma frmula estrutural que pode dar origem a milhes de compostos. Um dos primeiros problemas relacionados s reivindicaes Markush amplas a busca por anterioridades para se estabelecer o critrio de novidade; pois, em virtude dos milhes de compostos que podem ser pesquisados, esta se torna desestimulante. Esse fato ocorre devido aos programas utilizados para busca de compostos Markush serem laboriosos e, conseqentemente, consumirem considervel tempo para a preparao do banco de dados, o que torna a ocorrncia de erros freqente durante o processamento. Alm disso, pesquisas muito abrangentes podem levar a um grande nmero de falsos resultados, tornando o banco de dados muito caro e ineficaz (Ustinova & Chelisheva, 1996). Outro fator problemtico a avali-
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ao da suficincia descritiva, pois em reivindicaes Markush muito amplas, parte da reivindicao no suportada no relatrio descritivo pelo modo de executar a inveno. A insuficincia de exemplos experimentais com relao ao processo de preparao desses compostos, ou dados experimentais que comprovem suas atividades biolgicas, uma caracterstica desse tipo de patente. Sendo assim, um fator problemtico, uma vez que invivel fornecer esses dados experimentais para Markushs que originam milhes de compostos, ou seja, os exemplos no cobrem todas as classes de compostos descritas na reivindicao. O manual de procedimento de exame de patentes do escritrio japons bem enftico com relao falta de suficincia descritiva, e descreve que as reivindicaes Markush violam a Lei de Patentes do Japo quando o relatrio descritivo da patente no possui suficincia descritiva. Tal manual descreve o seguinte exemplo: Exemplo1: Quando uma reivindicao descreve um processo de pre-
on Guideline for Patent and Utility Model in Japan, Part. I, Cap. 1, p. 24, 2001). Devido falta de suficincia descritiva, uma patente com uma Markush muito ampla pode dar origem a novas patentes, ou seja, patentes de seleo, as quais selecionam compostos pertencentes a uma Markush principal, os quais no foram exemplificados quanto ao seu processo de preparao e demonstrao da sua atividade biolgica. Como exemplo, pode ser citada a patente EP 1 002 792, a qual deu origem a patente de seleo EP 0 627 406. A patente de seleo um tipo de proteo amplamente utilizado por detentores de patentes que querem estender seu prazo de proteo alm da expirao da patente original. Dessa forma, tem-se o chamado evergreening, atravs do qual as indstrias farmacuticas tentam aumentar o prazo de proteo patentria (onde uma mesma molcula pode gerar dezenas de patentes) e construir, dessa forma, uma barreira formada com relao ao mono-
es Markush. A unidade de inveno do pedido de patente de inveno se refere a uma nica inveno, ou a um nico grupo de invenes inter-relacionadas de maneira a compreenderem um nico conceito inventivo, ou seja, a resoluo de um nico problema tcnico. Portanto, a unidade de inveno de uma reivindicao Markush torna-se questionvel, medida que, quando se tem um nmero desproporcional de possveis compostos alternativos, no se pode predizer que todos estes pertencem ao mesmo grupo de invenes e possuem o mesmo objetivo proposto. A partir do dos problemas expostos acima se torna necessrio estabelecer critrios para avaliar o escopo de proteo de uma reivindicao Markush. SOLUES PROPOSTAS Tendo em vista os manuais de exame dos escritrios de patentes dos Estados Unidos (2001), Japo (2001) e EPO (2007), e com base nos requisitos de patenteabilidade das Leis de Patente, foram traadas algumas propostas para soluo das dificuldades encontradas quanto ao escopo de proteo de uma reivindicao Markush. Primeiramente, deve ser estabelecido o critrio da unidade de inveno que, de acordo com o presente trabalho, descreve reivindicaes Markush de compostos qumico-farmacuticos. Esse conceito pode ser visto da seguinte forma: a. Todos os compostos originados da frmula principal devem possuir propriedades em comum, alm de terem que ser utilizados para o mesmo fim, ou seja, conforme o exemplo de Markush na Figura 2, todos os compostos devem possuir o mesmo centro ativo com atividade analgsica. b. Todos os possveis compostos originados de uma Markush tero que apresentar uma estrutura principal comum a todos eles, ou seja, conforme demonstrado na
FIGURA 2: Frmula Markush, onde R = H ou alquila C1-4; R1 = OH ou alcxi C1-4
parao de para-nitro benzeno substitudo por nitrao, onde o grupo substituinte do benzeno (X) CH3, OH ou COOH. No relatrio descritivo o material inicial usado tolueno, onde X CH3. Em nenhum momento encontra-se descrito no relatrio descritivo exemplos onde o material cido benzico (para X=COOH). Portanto, tendo em vista a grande diferena entre CH3 e COOH, os exemplos no cobrem todas as classes de compostos descritas na reivindicao. (Examinati-
plio daquele produto. Entretanto, uma patente de seleo no necessariamente obtida pelo mesmo inventor da Markush principal, o que acaba dando margem a processos judiciais. Alm da suficincia descritiva, a unidade de inveno de uma patente tambm um requisito de patenteabilidade adotado no s pelo escritrio japons, como tambm pelos escritrios United States Patent Office (USPTO) e European Patent Office (EPO), para examinar reivindica-
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Figura 2, todos os compostos originados daquela Markush tero que possuir o centro ativo analgsico como estrutura principal. Quando uma reivindicao Markush no apresenta unidade de inveno, as buscas por anterioridades se tornam muito amplas e, consequentemente, devem ser realizadas com base nos compostos exemplificados no relatrio descritivo. Antes de dar prosseguimento ao exame, a requerente deve ser informada da falta de unidade de inveno e, dessa forma, determinar quais grupos de compostos devero ser examinados. Com relao falta de suficincia descritiva, esta pode ser uma razo para negar ou invalidar uma patente, principalmente na rea farmacutica, pois tal rea tem interesse particular nesse requerimento (no caso da necessidade de uma licena compulsria ou aps a patente expirar para a reproduo de medicamentos genricos). Portanto, os exemplos experimentais so requisitos essenciais para avaliar a suficincia descritiva de uma patente com reivindicao Markush. Os exemplos experimentais de processo de preparao ou de atividade biolgica dos compostos devem se estender a todas as classes de compostos alternativos da Markush, pois no se pode predizer ou extrapolar que diferentes classes de compostos, dos possveis substituintes, possam ser obtidas por uma mesma maneira de preparo, visto que a natureza das reaes diferente (vide exemplo 1). Seguindo a mesma linha de pensamento, no evidente para um tcnico no assunto que os compostos cujas classes de possveis substituintes - que no foram exemplificadas segundo sua ao - tenham a mesma atividade dos compostos exemplificados. Assim, devem estar exemplificados substituintes das diferentes classes, para que eles estejam revelados de forma clara e precisa. De forma anloga, no evidente para um tcnico no assunto que os
compostos, cujas classes de substituintes no foram exemplificadas, tenham as mesmas caractersticas fsico-qumicas dos compostos exemplificados (equivalentes bvios). Isto , no se pode afirmar que a atividade farmacolgica dos compostos, com substituintes pertencentes a classes distintas daquelas exemplificadas, seja uma decorrncia bvia a partir da observao da atividade farmacolgica dos compostos exemplificados. Ustinova e Chelisheva (1996) descrevem que no possvel obter o controle total nesse tipo de reivindicao, mas os dados experimentais seriam requerimentos necessrios para suportar as reivindicaes e controlar a complexidade de estruturas Markush. Correa (2006), em seu artigo, tambm descreve que os escritrios de patente deveriam exigir dos requerentes informaes tais como testes e experimentos que tornassem possvel a reproduo destes. De acordo com os problemas apresentados com relao a uma ampla proteo tal como de uma reivindicao Markush, e as solues propostas, a melhor opo seria estabelecer critrios mais consistentes com relao patenteabilidade desses compostos, exigindo que essas reivindicaes sejam menos amplas e devidamente suportadas por exemplos experimentais. Um outro fator relevante, para que uma reivindicao Markush esteja de forma clara e precisa, seria evitar termos que acarretam indefinio, tais como: aril, alquil, alquileno, etc, sem especificar o nmero de tomos de carbono. CONCLUSES Diante do exposto, vale ressaltar que, a partir de reivindicaes devidamente suportadas pelo relatrio descritivo, no somente o pesquisador - como tambm os examinadores de pedidos de patentes e programadores para busca por anterioridades teriam melhor clareza e preciso para a avaliao dessas reivindicaes. Estas caractersticas
tm que ser levadas em considerao quando do exame dos pedidos de patente de medicamentos, as quais afetam grandemente a sade pblica com relao ao acesso aos mesmos. Portanto, quando de tal exame, torna-se necessria a existncia de regras baseadas, tanto nos conceitos fundamentais da qumica e da farmacutica, como nas respectivas Leis de Patentes. REFERNCIAS Correa C. M. Pharmaceutical inventions: when is the granting of a patent justified?. Int. J. Intellectual Property Management, v. 1, n. 1/2, p. 4-21, 2006. Examination Guideline for Patent and Utility Model in Japan, Part. I, Cap. 1, 2001. Guidelines for Examination in the European Patent Office, Part C, Cap. III, 2007. Manual of Patent Examining Procedure (MPEP), 8 Edition, August 2001Latest Revision October 2005-, 800 Restriction in Applications Filed Under 35 U.S.C. 111; Double Patenting, 803.02 Markush Claims [R-3]. Milne G.W.A. Generic Formulation of Chemical Composition. World Patent Information, v. 13, n. 2, p. 7680, 1991. Muller A. C. A.; Pereira Jr. N.; Antunes A. M. S. Escopo das reivindicaes sua interpretao. Revista da ABPI, no 53, p. 26-30, 2001. S M. A aplicao da pesquisa qumica para o desenvolvimento de frmacos. Qumica Medicinal: Revista eletrnica do Departamento de Qumica da UFSC, Ano 4. Disponvel em: http:/ /www.qmcweb.org. Acesso em: 22 de setembro de 2007. Simmons S. E. Markush structure searching over the years. World Patent Information, v. 25, p. 195-202, 2003. Simmons, S. E. The Grammar of Markush Structure Searching: Vocabulary vs Syntax. J. Chem. Inf. Comput. Sci. v. 31, p. 45-53, 1991. Ustinova E.A.; Chelisheva O.V. Are Markush Structures Matters of Chemistry and Law or just Figments of the Imagination?. World Patent Information, v. 18, n. 1, p. 23-31, 1996.
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Pesquisa
Microrganismos Associados a Porferos

Potencial Biotecnolgico da Microbiota Associada s Esponjas Marinhas
1. Introduo Os Porferos, tambm conhecidos como esponjas, so invertebrados que filtram grandes quantidades de gua e adquirem seus nutrientes por fagocitose dos micrbios capturados durante a filtrao (Fig.1). Habitam os oceanos tropicais, temperados e polares, com algumas espcies encontradas em gua doce (Taylor et al., 2007). As esponjas formam uma das mais antigas radiaes dos metazorios, cuja origem data do Perodo Pr-Cambriano h cerca de 500 milhes de anos (Hentschel, 2004). So organismos ssseis (fixos no substrato) que apresentam uma alta biodiversidade, com uma estimativa de aproximadamente 15.000 espcies representadas em trs classes: Demospongiae, Calcarea e Hexactinellida (Fig.2), sendo a maioria pertencente ao primeiro grupo (Hooper e Van Soest, 2002). As esponjas so geralmente sustentadas por um esqueleto constitudo por espculas silicosas ou calcrias, que podem ser complementadas ou substitudas por calcrio macio (esponjas coralinas) ou por fibras de espongina, uma protena do tipo do colgeno (esponjas crneas). De uma forma simples elas podem ser definidas como: Animais filtradores e ssseis, que se utilizam de uma nica camada de clulas flageladas (coancitos) para bombear gua atravs de seu corpo (Bergquist, 1980) (Fig.3). Apesar de serem animais capazes de alcanar grande porte, com mais de 1 metro de altura, ou recobrir largas reas de substrato, alguns dos seus processos orgnicos so mais semelhantes aos encontrados nos Protozoa (animais unicelulares) do que nos Metazoa (animais multicelulares). Apresentam uma morfologia simples e um baixo grau de organizao, sem a formao de tecidos verdadeiros, e uma enorme diversidade de formas e cores. As esponjas possuem capacidade de
Fotos e ilustraes cedidas pelos autores
Aline da Silva Turque Bacharel em Cincias Biolgicas Universidade do Grande Rio Mestranda em Qumica Biolgica pelo Instituto de Bioqumica MdicaUFRJ turque@bioqmed.ufrj.br Cynthia Barbosa da Silveira Graduanda em Biologia Marinha pela Universidade Federal Fluminense-UFF cynthiabs@bioqmed.ufrj.br Ricardo Pilz Vieira Doutor em Biofsica Professor Visitante do Instituto de Bioqumica Mdica-UFRJ rpvieira7@hotmail.com Guilherme Muricy Doutor em Bioqumica Professor Adjunto do Departamento de Invertebrados - Museu NacionalUFRJ muricy@acd.ufrj.br Alexander Machado Cardoso Doutor em Qumica Biolgica Professor Adjunto do Centro Universitrio Estadual da Zona Oeste amcardoso@bioqmed.ufrj.br Maysa Mandeta Clementino Doutora em Qumica Biolgica Pesquisadora do Instituto Nacional de Controle da Qualidade em SadeINCQS maysa@incqs.fiocruz.br Orlando Bonifcio Martins Doutor em Biofsica Professor Adjunto do Instituto de Bioqumica Mdica-UFRJ omartins@bioqmed.ufrj.br
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Figura 1. Microscopia eletrnica de transmisso mostrando uma clula de esponja. Arquecito de Hymeniacidon heliophila fagocitando um procarioto () no mesohilo da esponja
Figura 2. O filo Porifera dividido em trs classes: Demospongiae (A) Oscarella sp. (D) Haliclona sp; Calcarea (B) Clathrina aurea (E) Paraleucilla magna e Hexactinellida (C) Esqueleto de Dactylocaulis pumiceus, (F) Hyalonema sp.
hospedar grandes comunidades de organismos, como archaeas, bactrias, fungos e algas, que podem compor at 50% do seu volume tecidual (Osinga, 2003). Alguns microrganismos so passados do vulo ao embrio e deste ao individuo adulto atravs da transmisso vertical, como aqueles encontrados em associao com embries do primeiro ao ltimo estgio de desenvolvimento na esponja Corticium candelabrum (Koty et al., 2007). Microrganismos no interior das esponjas foram inicialmente descritos em estudos de microscopia eletrnica por Lvi e Lvi (1965) e Vacelet e Donadey (1977). Esses estudos mostram que clulas procariticas encontram-se em ntima interao com a matriz do mesohilo desses invertebrados (Fig.4) (Turque et al., 2008). Atualmente vrios artigos descrevem o isolamento e a caracterizao de micrbios associados com as esponjas (Webster e Hill, 2001). Com a disponibilidade de ferramentas moleculares, trabalhos mais recentes vm utilizando tcnicas como construo de bibliotecas do gene ribossomal 16S rRNA, hibridizao in situ de sondas com fluorescncia (FISH) e eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE). Estas tcnicas so freqentemente utilizadas no estudo das comunidades microbianas. A aplicao desses mtodos tem revelado comunidades com alguns grupos comuns entre esponjas filogeneticamente diferentes (Hentschel et al., 2006). Um novo filo de bactrias tem sido proposto atravs da utilizao de
algumas dessas tcnicas, como a amplificao do gene 16S rRNA e a microscopia eletrnica. O candidato a filo Poribacteria, encontrado em associao com diferentes espcies de esponjas e de diferentes regies geogrficas, demonstrou ser bastante especfico e exclusivo das esponjas marinhas, no sendo encontrado em outros organismos, gua ou sedimento (Lars et al., 2004). O estudo dos grupos bacterianos associados com Hymeniacidon heliophila e Polymastia janeirensis demonstraram a presena de um novo grupo aqui denominado candidato a filo Spongebacter (Fig. 5), distinto do Poribacter descrito recentemente. Com exceo da archaea Cenarchaeum symbiosum que, em estudos recentes utilizando tcnicas de genmica, foi demonstrada mantendo uma associao simbitica bem estabelecida com a esponja Axinella mexicana (Hallam et al., 2006), a simbiose e o papel fisiolgico dos microrganismos associados s esponjas ainda no tm sido conclusivamente demonstrados. A natureza dessas relaes, se mutualsticas ou comensais, precisa ser melhor esclarecida. Por essa razo a simbiose nos porferos definida como uma associao consistente entre o micrbio e sua esponja hospedeira, independente da atribuio do benefcio (Enticknap et al., 2006). Especula-se que funes como aquisio de nutrientes, regulao metablica, mecanismos de defesa e fixao de nitrognio podem ser atribudas s interaes entre esponjas e microrganismos
(Hentschel et al., 2003). Um grande nmero de compostos de interesse biotecnolgico, como por exemplo, citotoxinas, agentes antifngicos, antibiticos, antivirais, e principalmente anticancergenos tem sido isolados de esponjas marinhas e microrganismos associados (Sipkema et al., 2005), e mais de 200 novos metablitos so descritos a cada ano (Blunt et al., 2006). Essa breve reviso tem como objetivo principal divulgar essa nova rea do conhecimento e ressaltar a enorme carncia de pesquisas cientficas voltadas para biotecnologia da microbiota de esponjas marinhas. 2. Produo de Metablitos Secundrios 2.1 Bactrias As esponjas permitem a formao de um microambiente dentro de seus tecidos, abrigando uma ampla diversidade bacteriana produtora de metablitos secundrios no caracterizados, representando um potencial cientfico ainda no explorado na busca por novos compostos de interesse biotecnolgico. Recentemente demonstrou-se que alguns metablitos descritos como originrios de invertebrados marinhos so, na verdade, sintetizados por bactrias (Mohapatra et al., 2002). Foi observado que bactrias em associao com porferos produzem compostos similares aos isolados anteriormente da esponja, como por exemplo, salicilihalamida A isola65
Compostos biologicamente ativos foram isolados das esponjas em diferentes ambientes, incluindo tropicais, subtropicais e temperados, com o interesse por novos produtos naturais (Holler et al., 1999). O composto qualificado para utilizao em terapia humana sorbicillactona A, um tipo de alcalide, foi isolado da esponja Ircinia fasciculata, mas na verdade sintetizado pelo fungo associado Penicillium chrysogenium. Communisina B e derivados foram isolados do fungo Penicillium sp. associado esponja Axinella verrucosa (Jadulco et al., 2003). 2.3 Archaeas Archaeas so microrganismos distintos de bactrias e eucariotos (Woese e Fox, 1977), sendo divididas em dois principais filos: Crenarchaeota e Euryarchaeota (Woese et al., 1990). Alguns grupos de archaeas so conhecidos por possurem adaptaes vida em ambientes extremos e apresentarem caractersticas hipertermoflicas (crescem em temperaturas mais altas que 70C at o limite mximo de 121C), metanognicas (anaerbicas que sintetizam metano) e haloflicas (que crescem em altas concentraes de sal) (Schiraldi et al., 2002). As propriedades incomuns das archaeas as tornam alvo para o desenvolvimento de processos biotecnolgicos e aplicaes industriais (Alqueres et al ., 2007). Nenhuma archaea foi descrita como patognica apesar de estarem presentes em humanos, animais e plantas (Cardoso et al., 2003). Muitos microrganismos do domnio Archaea tm sido isolados para fins industriais, como por exemplo, a utilizao de esterases e lipases, enzimas que possuem grande termoestabilidade e aplicao na biossntese orgnica (Alqueres et al., 2007). Em trabalhos mais recentes, archaeas foram encontradas em associao com esponjas. A archaea Cenarchaeum symbiosum foi descrita como um organismo simbionte da esponja Axinella mexicana, possuindo alta especificidade (Preston et al., 1996). Esta archaea apresenta um metabolismo quimiolitoautotrfico, que complementar ao da esponja, usando como nica fonte de carbono o CO2 e consumindo amnia para seu suprimento de energia (Hallam et al., 2006). Neste caso, a archaea atua detoxificando os produtos de excreo da esponja o que torna claras as relaes simbiticas. Archaeas metanognicas foram descritas em Rhopaloeides odorabile atravs de observao do gene 16S rRNA, parecendo formar um micronicho anaerbico dentro da esponja. Membros das archaeas Crenarchaeota e Euryarchaeota esto presentes no coanossoma e no mesohilo de Tentorium semisuberites (Thomas et al., 2006). Apesar de inmeros artigos demonstrarem
Figura 3. Reproduo esquemtica de uma esponja. (A) Mesohilo, camada intermediria e gelatinosa entre as paredes interna e externa da esponja, Poro, orifcio de entrada de gua e sculo principal canal de sada de gua. (B) Detalhe ampliado de um poro inalante. Coancito, clula flagelada que com o batimento do seu flagelo cria uma corrente de gua trazendo nutrientes e gases e espculas que formam o esqueleto da esponja
do de Haliclona sp., idntico ao aspicularen A, produzido por bactrias associadas (Crews e Bescansa, 1986). O composto 2-metiltio, 1,4-naphtoquinona foi isolado de bactrias associadas esponja Dysidea avara e demonstrou forte propriedade antiangiognica e antimicrobiana (Bringmann et al., 2003). Antibiticos incluindo lipopeptideos, originrios do gnero Bacillus, demonstraram forte atividade contra microrganismos com resistncia clnica, como por exemplo, Staphylococcus aureus e S. epidermidis (Muscholl et al., 2008). Um glicoglicerolipideo sintetizado pela bactria Microbacterium sp. encontrada em associao com a esponja Halichondria panicea exibiu propriedades antitumorais muito interessantes (Wicke et al., 2000). Metablitos com atividade citotxica e antimicrobianos produzidos por Pseudomonas sp. tambm foram isolados da esponja Homophymia sp. (Bultel-Ponce et al., 1999). Atividade antimicrobiana foi vista tambm em 27 isolados de bactrias associadas com as esponjas Aplysina aerophoba e Aplysina caverncola (Thoms et al., 2004). Christian e colaboradores (2005) mostraram que um composto natural halogenado sintetizado por uma cianobactria associada com quatro espcies de esponjas da ordem Dictyoceratida . A cianobactria Oscillatoria spongeliae, que compe grande parte do volume tecidual da esponja Dysidea herbacea, produtora do antimicrobiano ter bifenil polibrominato conferin66
do proteo contra outros microrganismos invasores (Unson et al., 1993). Bactrias Gram positivas como Actinomycetes so tambm conhecidas por produzirem metbolitos secundrios com atividade antibitica em esponjas (Chelossi et al., 2006). Aproximadamente a metade das bactrias encontradas em associao com as esponjas marinhas Hymeniacidon heliophila e Polymastia janeirensis pertence classe Proteobactria (Turque et al., 2008). Na esponja Theonella swinhoei as Proteobactrias so responsveis pela produo do composto theopalauamida (Webster et al., 2001). 2.2 Fungos A maioria dos compostos bioativos derivados de fungos marinhos descritos at hoje provm daqueles associados com esponjas. Os fungos do gnero Penicillium so os maiores produtores dos metablitos secundrios estudados. H um crescente interesse na determinao da verdadeira diversidade de fungos presentes nas esponjas marinhas e de possveis substncias biologicamente ativas. Ao contrrio da pesquisa de metablitos secundrios com fungos terrestres, esses estudos em ambientes marinhos so relativamente novos. As esponjas exibem inmeras associaes com fungos, mas o entendimento da produo de compostos com atividade biolgica em esponjas tem sido mais focado em bactrias, com menos nfase nos eucariotos (Taylor et al., 2004).
Figura 4. Microscopia eletrnica de transmisso mostrando microrganismos associados a esponjas marinhas. Hymeniacidon heliophila (A,B,C e D), Polymastia janeirensis (E,F,G e H)
a ocorrncia de archaeas nas esponjas, seu potencial biotecnolgico no tem sido explorado. Nenhum estudo revelou at hoje compostos com aplicao biotecnolgica produzidos por archaeas associadas com esponjas marinhas. Isso sugere a necessidade de maiores esforos na pesquisa para futuras aplicaes industriais e farmacolgicas. 3. Cultivo A produo de drogas a partir de microrganismos associados s esponjas marinhas tem sido limitada pela dificuldade de cultivo desses organismos com meios definidos em laboratrio. Para o desenvolvimento de uma droga comercial necessria a produo desta em grande quantidade para estudos clnicos. Tcnicas dependentes de cultivo tm sido empregadas com pouco sucesso (Webster et al., 2001), uma vez que apenas uma quantidade proporcionalmente menor da comunidade total de bactrias associadas s esponjas cultivada com sucesso. Somente 0,15% da populao de bactrias da esponja do Caribe Ceratoporella nicholsoni foi cultivada (Santavy et al., 2001), enquanto propores maiores de cultivo, chegando a 11% da comunidade bacteriana, foram possveis em Aplyisina aerophoba, esponja do Mediterrneo (Friedrich et al., 2001). Muitas espcies de esponjas tm sido cultivadas com a utilizao de tcnicas de maricultura, que permite o cultivo desses organismos no mar, sendo de grande interesse para utilizao sustentvel das esponjas. Para a aplicao dessa tcnica, fatores como profundidade, corrente e luminosidade so importantes para o crescimento das espon-
jas e dos microrganismos associados (Sipkema et al., 2005). A maricultura tem sido empregada com muito sucesso em algumas espcies de esponjas marinhas, proporcionando aumento de biomassa desses organismos e a obteno de compostos qumicos em quantidades comerciais. 4. Metagenmica O interesse em microrganismos associados s esponjas como produtores de compostos biologicamente ativos vem crescendo, mas a vasta maioria dessa comunidade microbiana ainda no foi isolada em cultura pura. Metagenomas de micrbios associados s esponjas marinhas tm sido utilizados com sucesso na identificao de genes alvos envolvidos na sntese de produtos naturais (Hallam et al., 2006). Esse mtodo envolve construo de bibliotecas genmicas atravs de extrao e clonagem de DNA de alto peso molecular (Handelsman, 2004). O gene 16S rRNA um dos principais genes utilizados como marcador molecular para construo de bibliotecas, sendo de fcil amplificao pela tcnica de PCR (Reao em Cadeia da Polimerase) (Vieira et al., 2008). Essa nova abordagem revelou novos genes de microrganismos no cultivados associados s esponjas Theonella swinhoei e Discodermia dissoluta (Piel et al., 2004). A anlise de metagenoma tambm identificou enzimas, como as que so capazes de hidrolisar agar provenientes de algumas bactrias do gnero Cytophaga associadas a esponja Halichondria panicea (Imhoff e Sthr, 2003). Ge-
nes que codificam amilases e acetilcolinesterases foram identificados na bactria Artrobacter ilicis e no fungo Mucor sp., associados esponja Spirastrella sp. (Mohapatra et al., 1997). A construo de bibliotecas gnicas um mtodo promissor na elucidao do potencial gentico de microrganismos ainda no cultivados. Recentemente foi seqenciado o genoma de archaea Cenarchaeum symbiosum isolada da esponja Axinella mexicana disponibilizando mais de 2000 novos genes para a investigao cientifica das funes biolgicas e possveis aplicaes tecnolgicas (Hallam et al., 2006). A identificao de genes responsveis pela sntese de metablitos secundrios por meio dessa tcnica torna-se uma fonte alternativa para explorao da diversidade qumica presente na comunidade microbiana das esponjas disponibilizando inmeros genes para clonagem e expresso heterloga de protenas com interesse biotecnolgico. 5. Concluso Esponjas marinhas so hospedeiras de muitos microrganismos. A aplicao de bactrias, fungos e principalmente archaeas na biotecnologia permanece limitada. A produo em larga escala dos metablitos secundrios originados de microrganismos associados a esponjas, continua restrita devido dificuldade do cultivo em laboratrio da maioria destes micrbios. Estratgias alternativas tm sido propostas para a obteno desses compostos, como cultura de esponjas no ambiente marinho (maricultura) e tcnicas de metagenmica. Estudos recentes chamam a ateno para um sistema bioqumico de comunicao celular chamado Quorum Sensing. Este sistema sofisticado de comunicao permite que as bactrias enviem e recebam menBiotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 37 67
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Figura 5. rvore filogentica de grupos bacterianos associados com esponjas marinhas. rvore baseada no gene 16S rRNA mostrando grupos de bactrias das esponjas Hymeniacidon heliophila and Polymastia janeirensis construda pelo programa ARB usando algoritmo neighbor-joining e o modelo Kimura
sagens entre si e entre seus hospedeiros. So descritos dois sistemas principais, um a longa distncia mediado por substncias qumicas solveis e outro a curta distncia que depende do contato celular. Isso inclui vrios canais de sinalizao qumica entre os microrganismos e pode ser utilizado como ferramenta para o entendimento das relaes entre micrbios e esponjas. As perspectivas apontam para a necessidade de uma cooperao entre microbiologistas, bilogos, qumicos, taxonomistas, bioengenheiros e bioinformatas em um estudo coordenado de diversidade e da associao entre invertebrados marinhos, bactrias, archaeas e eucariotos, na busca por novos metablitos secundrios, de um potencial biotecnolgico ainda pouco explorado. 6. Agradecimentos Agradecemos a Fernando C. Moraes (Museu Nacional, UFRJ) pela colaborao nas atividades de coleta e a Monica Lins de Barros (IEAPM) pela reviso
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do manuscrito. Agradecemos tambm a Fundao Carlos Chagas Filho de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) pelo suporte financeiro.
7. Referncias Bibliogrficas
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Pesquisa
AVALIAO DE MORTE PROGRAMADA DE CLULAS

Fotos e ilustraes cedidas pelos autores Apoio: CNPq
Comparao do ndice Apopttico Progressivo em cultura de Condrcitos

INTRODUO Em todo mundo so gastos milhares de dlares todos os anos em tratamentos para reduzir sintomas de doenas sem cura efetiva. Os problemas ortopdicos que atingem em sua maioria idosos, so de grande importncia econmica para a sociedade, pois requerem muitas intervenes cirrgicas. Essas intervenes muitas vezes no obtm os resultados bons esperados em longo prazo. Uma das formas para reduzir os gastos e melhorar a qualidade de vida do paciente, quanto a possveis rejeies e incmodos com prteses, so os auto-transplantes, que se caracterizam pela retirada de material autlogo e, aps a realizao de cultura celular em laboratrio, o re-implante1. Estas consideraes se aplicam, entre outras, a transplantes de cartilagem em pacientes que apresentam doenas como a osteoartrite e a artrite reumatide. Estas so doenas degenerativas, sem cura efetiva, apenas com tratamento sintomtico e paliativo. Os tratamentos que vm sendo desenvolvidos, mais recentemente, envolvem a terapia celular. Esta terapia consiste em produzir a cartilagem articular in vitro para realizao de transplantes autlogos, com a finalidade de regenerar o tecido lesado. A produo de tecido in vitro se faz a partir de clulas do prprio paciente e, como no h incompatibilidade imunolgica, as chances de rejeio so extremamente reduzidas2. Uma das formas de se realizar um transplante autlogo utilizar condrcitos retirados da cartilagem do paciente. Os condrcitos devem ser cultivados em matriz tridimensional (scaffolds) para no perderem seu fentipo, durante trs a quatro semanas, e depois, transplantado para a rea lesada3. Estudos anteriores demonstraram que o fentipo dessa cartilagem teve alta variao, obtendo-se cartilagem do tipo hialina, fibrocartilagem e os dois tipos juntos4. Embora se verifique uma variao de fentipo, a maioria dos transplantes feita em outras demonstraes aponta sucesso em cerca de 80% 5. Esta taxa poderia ser melhorada se estudos induzissem no s a produo de matriz extracelular para formao do tecido, mas tambm a proliferao celular dos condrcitos, at porque, essas clulas esto sendo cultivadas em ambiente estranho, e podem apresentar morte celular precoce.
Ilustrao 01: Prola de alginato de sdio com clulas (aumento 20X)
Gabrielle Reinoldes Bizarria GUILHERME Mestranda do Programa de Ps Graduao em Biotecnologia Mdica gabrielle_rbg@yahoo.com.br Aparecida Vitria de Gonalves SOUZA Mestranda do Programa de Ps Graduao em Biotecnologia Mdica FMB-UNESP vitoriagsouza@yahoo.com.br Andrei MOROZ Mestrando do Programa de Ps Graduao em Biotecnologia Mdica - FMB-UNESP andreimoroz@terra.com.br Priscila MURADOR - Ms Pesquisadora do Hemocentro de Botucatu Faculdade de Medicina UNESP pmurador@fmb.unesp.br Renata Aparecida de Camargo BITTENCOURT - Ms Doutoranda do Programa de Ps Graduao em Ortopedia FMB UNESP Rentcourt2000@yahoo.com.br Marjorie de Assis GOLIM Dra Pesquisadora do Hemocentro de Botucatu Faculdade de Medicina UNESP citometria@fmb.unesp.br Rosana ROSSI-FERREIRA Profa. Dra. Docente do Departamento de Cincias Biolgicas FCUNESP Bauru rossi@fc.unesp.br Elenice DEFFUNE Profa. Dra. Docente do Departamento de Urologia FMB-UNESP Botucatu ed12@fmb.unesp.br
Ainda assim, este tipo de transplante contra-indicado em paciente com leses provocadas por osteonecrose, condrocalcinose, osteoartrite, artrite reumatide e meniscectomia total6. Nos ltimos trs anos, com o avano na tecnologia de clulas-tronco, um segundo tipo de cultivo celular vem sido testado. Ele consiste em cultivar clulastronco mesenquimais e diferenci-las em condrcitos. Essas clulas mesenquimais (ou clulas do estroma medular CTMs) esto presentes na medula ssea em
Ilustrao 02: Formao de grupos isgenos pelos condrcitos cultivados dentro da prola de alginato de sdio
baixssima quantidade (0,01% a 0,001% do total de mononucleares) e so capazes de serem diferenciadas (dependendo do ambiente local e estmulos trficos) em condrcitos, osteoblastos, adi-
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viabilidade celular (1) a tcnica mais amplamente utilizada para observao de viabilidade celular que consiste em usar o corante de viabilidade celular azul de Tripan junto com a Cmara de Neubauer; (2) e a tcnica por marcao com anexina V (conjugada com FITC - isoticianato) e iodeto de propdeo com posterior anlise por Citometria de Fluxo. MATERIAL E MTODOS A pesquisa foi aprovada pelo Comit de tica em Pesquisa e os animais utilizados estavam sob cuidados no Biotrio da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. Coleta da cartilagem e processamento: foram coletadas raspas de tecido cartilaginoso de coelhos machos. As amostras passaram por processamento em laboratrio para destruio da matriz extracelular e liberao dos condrcitos. A digesto do tecido foi feita com incubao a 37oC por 45 minutos com tripsina a 0,25%, aps a retirada da tripsina, foi feito nova incubao com hialuronidase na mesma condio anterior e por ltimo, aps a remoo da hialuronidase, o tecido foi incubado com colagenase tipo I em estufa a 37oC por 18 horas. Incluso dos condrcitos em prola de alginato: fez-se necessrio o uso de matriz tridimensional para o cultivo de condrcitos, para esses no perderem seu fentipo. Optou-se pelo hidrogel de alginato de sdio para realizao de matriz tridimensional pois um material reabsorvvel, podendo ser re-implantado diretamente nos organismos. Para isto foi preparado uma soluo de alginato de sdio 1,2% em cloreto de clcio a 155mM. O pellet celular de condrcitos foi ressuspenso na soluo de alginato de sdio e colocado em uma seringa de
Grfico 01: Mdia das viabilidades celulares de cultura de condrcitos em prola de alginato (tridimensional) durante 3 semanas de cultivo. Linha azul: viabilidade celular feita por citometria de fluxo e marcao com anexina V e iodeto de propdeo. Linha rosa: viabilidade celular feita por corante de viabilidade (azul de tripan) e Cmara de Neubauer
pcitos e micitos 7. A dificuldade existente nesta tcnica expandir as CTMs em laboratrio para obteno de cultura homognea e facilitar a sua diferenciao em outros tipo celulares. Infelizmente, na literatura, difcil de achar trabalhos bsicos sobre isolamento, expanso e caracterizao das CTMs, e a base do conhecimento sobre essas clulas que possuem pro-
balho, foi utilizada a matriz tridimensional de alginato de sdio. Essas clulas foram cultivadas em laboratrio sem estmulo de proliferao como descrito na literatura. Assim, observando a viabilidade celular em cultura tridimensional e a progresso de morte celular por apoptose podemos avaliar se essas clulas tem condies de serem re-implantadas em leses de tecido cartilaginoso
Tabela 01: Anlise das mdias de expresso de anexina V e iodeto de propdeo nas culturas durante 3 semanas de cultivo
priedades muito intrigantes, deixada de lado. A maioria trata sobre as possveis diferenciaes e transplantes. O estudo da apoptose (morte celular programada) importante pois, esse fenmeno pode ser desencadeado por estmulos diversos, presentes ou ausentes na cultura celular, como: hormnios ou fatores trficos, toxinas, competio negativa entre as clulas, etc. Assim, ao analisarmos a extenso da progresso da apoptose, podemos corrigir a cultura com o que estiver faltando ou sobrando para as clulas. Para o cultivo de condrcitos, neste tra-
para regener-lo. E, tambm, contribuimos com dados bsicos, que faltam na literatura. Para o cultivo de CTMs em monocamada, avaliamos dados bsicos que, tambm, faltam na literatura como viabilidade celular ao longo da cultura, progresso do crescimento das CTMs durante a cultura de clulas mononucleadas do sangue de medula ssea, e a progresso da morte celular por apoptose. Alm de avaliar os ndices de apoptose nas culturas celulares, ainda foi possvel, ainda, comparar, duas tcnicas de
Ilustrao 03: Viabilidade celular por azul de tripan em Cmara de Neubauer. Clulas no viveis esto coradas em azul
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a temperatura ambiente. Aps a remoo da saponina por centrifugao, foi colocado o anticorpo monoclonal antivimentina e depois um anticorpo secundrio conjugado com FITC. A leitura foi feita por citometria de fluxo FACSCALIBUR BD e a anlise em software PAINT-A-GATE da BD. RESULTADOS Cultivo de condrcitos em prolas de alginato: Na cultura em prola de alginato de sdio (ilustrao 01), os condrcitos no perderam seu fentipo, continuando como clulas ovaladas que formam grupos isgenos (ilustrao 02). Viabilidade Celular e Progresso da Apoptose em Cultura Tridimensional de Condrcitos: A viabilidade celular foi analisada por dois mtodos (1) por marcao com anexina V e iodeto de propdeo analisadas por Citometria de Fluxo; e (2) usando-se o corante de viabilidade celular azul de Tripan com anlise pela Cmara de Neubauer. Em ambas as anlises, podemos perceber diminuio da taxa de viabilidade celular (grfico 01). Para confrontar as duas metodologias de avaliao da viabilidade celular utilizou-se o teste no paramtrico de MannWhitney. No houve diferena significativa dos testes para p<0,05. A progresso da apoptose foi analisada atravs da marcao com anexina V e iodeto de propdeo, com anlise por citometria de fluxo. Foi observado que os nveis de marcao com anexina V caram conforme o tempo de cultivo, enquanto os nveis de iodeto de propdeo aumentaram. A coexpresso de ambos tambm sofreu leve aumento (tabela 01) Isso indica diminuio da quantidade de clulas morrendo por apoptose e aumento de clulas em apoptose tardia ou necrose. A ilustrao 03 mostra o padro da anlise feita por corante de viabilidade celular Azul de Tripan. As clulas no viveis, isto com membrana plasmtica no ntegra, absorvem o corante tornando-se azuis. Nas viveis, ocorre o contrrio. No controle do padro da anlise por citometria de fluxo com marcao positiva para anexina V (FL1) e iodeto de propdeo (FL3) e a coexpresso de ambos esto presentes na ilustrao 04. Cultivo de clulas mononucleadas: Depois de processadas em laboratrio, as culturas de clulas mononucleadas da medula ssea foram mantidas em cultura por 4 semanas. Devido a baixa concentrao inicial (mximo de 20,2x103 cels/ml), na primeira e segunda semana
Ilustrao 04: Condrcitos marcados com anexina V (FL1) e iodeto de propdeo (FL3). Em azul e ciano temos expresso de anexina V; em verde e ciano temos expresso de iodeto de propdeo, e somente o ciano representa a coexpresso de anexina V e iodeto de propdeo. A maior parte da cultura em cinza so as clulas que no expressaram os marcadores, sendo consideradas clulas viveis. Ao lado, temos a legenda que mostra a porcentagem de cada cor (isto cada expresso)
1mL. Foi feito o gotejamento da soluo da seringa em cloreto de sdio a 55mM para a formao das prolas de alginato. Essas foram cultivadas em meio DMEM Dulbeccos Modified Eagle Media Meio - GIBCO suplementado com F-12 Nutrient Mixture (Ham) - GIBCO, com troca a cada dois dias. Dissoluo da prola de alginato para liberao de condrcitos: as prolas de alginato foram incubadas a temperatura ambiente com citrato de sdio a 165mM por uma hora. Aps contrifugao, o pellet celular formando foi ressuspenso em meio de cultura. Coleta de medula ssea e processamento: foi retirado 5 mL de medula s-
sea da crista ilaca de coelhos machos (com heparina para no coagular). O sangue foi processado em laboratrio tendo suas clulas mononucleadas separadas por Ficoll-hypaque densidade 1.077g/mL como descrito no protocolo de ZAGO e COVAS, 2006. As clulas mononucleadas foram cultivadas em fracos de 25cm2 com meio Knockout-DMEM - GIBCO. Tripsinizao das culturas: para soltar as CTMs que aderiram a placa, foi feito digesto enzimtica com tripsina a 0,25% durante 2 minutos. Viabilidade celular por azul de tripan: foram coletadas amostras de clulas e misturado (v:v) com azul de tripan 0,2%. A mistura foi colocada na Cmara de Neubauer para contagem celular. Viabilidade celular por marcao com anexina-V e iodeto de propdeo: foi utilizado o KIT ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I - BD Pharmingen e a marcao das clulas foi feita de acordo com as especificaes do fabricante. A leitura foi feita em citmetro de fluxo FACSCALIBUR BD e a anlise em software PAINT-A-GATE da BD.
Ilustrao 05: Aumento 20X. Trs semanas de cultivo (aps segunda passagem) das clulas mononucleadas da medula ssea. Na microscopia de luz contrastadada observa-se o aumento da formao de colnias celulares (nos crculos).
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Marcao das CTM com anti-vimentina: A vimentina um componente intracelular de caracterizao das CTM, portanto sua marcao de extrema significncia. A permeabilizao celular foi feita com saponina a 1% por 15 minutos
Grfico 02: Mdia das viabilidades celulares de cultura de clulas mononucleadas da medula ssea durante 4 semanas de cultivo. Linha azul: viabilidade celular feita por citometria de fluxo e marcao com anexina V e iodeto de propdeo. Linha rosa: viabilidade celular feita por corante de viabilidade (azul de tripan) e Cmara de Neubauer
Tabela 02: Anlise das mdias de expresso de anexina V e iodeto de propdeo nas culturas durante 2 semanas de cultivo
Ilustrao 06 Clulas mononucleadas marcados com anexina V (FL1) e iodeto de propdeo (FL3). Em azul e ciano temos expresso de anexina V; em verde e ciano temos expresso de iodeto de propdeo, e somente o ciano representa a coexpresso de anexina V e iodeto de propdeo. A maior parte da cultura em cinza so as clulas que no expressaram os marcadores, sendo consideradas clulas viveis. Ao lado, temos a legenda que mostra a porcentagem de cada cor (isto cada expresso)
de cultivo, impossvel realizar qualquer tipo de teste a respeito de viabilidade celular, progresso de apoptose ou quantidade de CTM presente na amostra. Mesmo assim, conseguimos observar a progresso da cultura por microscopia de luz contrastada (ilustrao 05: trs semanas de cultura). A viabilidade celular das clulas mononucleadas tambm foi analisada pelos dois mtodos descritos. Em ambas as anlises, pode-se perceber diminuio da taxa de viabilidade celular (grfico 02). Para confrontar as duas metodologias de avaliao da viabilidade celular utilizou-se o teste no paramtrico de MannWhitney. No houve diferena significativa dos testes para p<0,05. A progresso da apoptose foi analisada atravs da marcao com anexina V e iodeto de propdeo, sendo que , os nveis de marcao com anexina V aumentaram conforme o tempo de cultivo, enquanto os nveis de iodeto de propdeo diminuram.A coexpresso de ambos tambm sofreu leve aumento (tabela 02) Isso indica diminuio da quantidade de clulas morrendo por apoptose e aumento de clulas em apoptose tardia ou necrose. O controle do padro da anlise por citometria de fluxo com marcao com anexina V (FL1), iodeto de propdeo (FL3) e a coexpresso de ambos esto presentes na ilustrao 06. A quantidade de CTM na cultura de clulas mononucleadas da medula ssea foi analisada por marcao da vimentina com o anticorpo anti-vimentina. Parte-se do princpio, utilizando a literatura, que existe na medula ssea 0.01% de CTM (tabela 03). Nesta anlise, observase um grande crescimento at a terceira semana e na semana seguinte uma reduo do nmero de CTM nas culturas. Podemos observar um aumento na viabilidade celular das CTM nas duas ltimas semanas de cultura (ilustrao 07). A progresso da apoptose foi analisada atravs da marcao com anexina V e iodeto de propdeo com anlise por citometria de fluxo (tabela 04). Observou-se que os nveis de marcao com anexina V, iodeto de propdeo e a coexpresso de ambos diminuiu (embora considerados no significantes para p<0,05). Isso indica diminuio da quantidade de clulas morrendo por apoptose e diminuio de clulas em apoptose tardia ou necrose. O controle do padro da anlise por citometria de fluxo com marcao por antivimentina est na ilustrao 08. A marcao positiva com anexina V (FL1), iodeto de propdeo (FL3) e a coexpresso de ambos esto presentes na ilustrao 09.
Tabela 03: Anlise das mdias de expresso positiva de anti-vimentina nas culturas durante 2 semanas de cultivo:
DISCUSSO A cultura em gel de alginato de sdio, embora no tenha proporcionado a proliferao celular, possibilitou a formao de matriz pericelular com colgeno tipo II (resultado no mostrado). Por no ser o ambiente prprio dos condrcitos, essas clulas apresentaram ao longo da cultura diminuio de suas viabilidades celulares, tanto pelo mtodo de marcao com anexina V e iodeto de propdeo quando analisados tanto por citometria de fluxo, quanto com o corante
o meio (hidrogel) ao qual essas clulas esto sendo expostas. Os mais provveis fatores de interferncia so: dificuldade do meio de cultura e nutrientes em chegar as clulas dentro do alginato de sdio, dificuldade das toxinas celulares liberadas sarem do gel, falta de estmulo de crescimento, como o TGF ou problemas de manipulao durante a coleta e processamento da cartilagem. Para essa cultura, o ndice apopttico comprova que as clulas, se re-implantadas com a finalidade de corrigir defeitos no tecido cartilaginoso, no atingiriam seus objetivos, uma vez que com a
Ilustrao 07: Mdia da viabilidade celulare de cultura de CTM duas ltimas semanas de cultivo. Linha azul: viabilidade celular feita por citometria de fluxo e marcao com anexina V e iodeto de propdeo
de viabilidade (azul de Tripan) na Cmara de Neubauer. A diminuio da viabilidade coincidiu com a alta incidncia de morte celular, tanto por apoptose quanto por necrose, pois no final da cultura observamos mais de 60% de apoptose precoce, 73% de necrose e 35% de apoptose tardia ou necrose secundria. Quanto a progresso da apoptose, embora tenha diminudo pouco durante o cultivo, ainda se apresentou alta ao final deste, nos fazendo considerar
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viabilidade baixa e grau de morte celular alto elas seriam incapazes de regenerar leses. A avaliao dos parmetros analisados neste trabalho deve ser refeita durante a realizao de novo cultivo celular em outros materiais hidrogeis, ou num alginato de sdio de menor concentrao, assim como colocar junto ao meio, fatores de crescimento extras. O mtodo pelo azul de tripan, embora neste estudo tenha se mostrado to efi-
caz quanto os marcadores de morte celular por citometria de fluxo, no permite identificar aquelas clulas que esto entrando em processo apopttico. Pelos resultados aqui apresentados, sugerimos que os testes de viabilidade celular devem ser feitos sempre durante o cultivo de condrcitos em matriz tridimensional. E sempre que a viabilidade celular diminuir, sugere-se fazer a curva de morte celular, principalmente por apoptose, para tentar corrigir os erros do cultivo. J a cultura em monocamada de clulas mononucleadas da medula ssea proporcionou a proliferao celular, e o aumento das CTMs no cultivo. A diminuio da viabilidade total das clulas em cultura, e o aumento da apoptose (confirmada pelo aumento da marcao com anexina V) se mostram compatveis. A partir do momento em que o meio de cultura usado serve para estimular o crescimento das CTM, compreensvel que vejamos diminuio da competio negativa proporcionada pelas clulas mononucleadas atravs da diminuio da viabilidade total das clulas. Ao mesmo tempo, a progresso do aumento da apoptose confirma tal resultado. A proliferao mxima das CTM ocorreu durante a terceira semana de cultivo, aps terceira passagem. Essa proliferao celular est de acordo com a diminuio da morte celular, tanto por apoptose quanto por necrose, observadas atrves da diminuio progressiva da marcao com anexina V e iodeto de propdeo. Na quarta semana observouse uma menor expresso de vimentina pelas clulas em cultura. Essa expresso diminuda pode estar relacionada com perda de fentipo pelas clulas (o que ocorre devido ao nmero de passagens) e no com a morte das clulas, pois no h indcio de aumento dos marcadores de morte celular na quarta semana. A partir da observao do grau de apoptose celular dessa cultura, sugere-se que a diferenciao celular ocorra na terceira semana, ponto em que as CTMs so em sua maioria homogneas e o ndice de apoptose/morte celular est diminuindo consideravelmente. Tal perda de fentipo das CTMs vem sido amplamente estudada e discutida na literatura como nos relatos de Javazon, E. (2004). Por um lado as passagens (repiques) com tripsina estimulam o crescimento, e por outro, ao estimular a taxa de proliferao, estimula tambm mutaes no DNA celular o que pode levar a perda do fentipo pela clula e diminuio da atividade das telomerases enzimas responsveis por manter os telmeros celulares com tamanho suficiente para a clula no entrar em senescncia. A pesquisa de CTMs elevou-se, somente, nos ltimos quatro anos, e ainda difcil achar trabalhos coerentes, principalmente, em relao a caracterizao e expanso dessas clulas. Por falta de informao base (o que est comeando a ser produzido e divulga-
Tabela 04: Anlise das mdias de expresso de anexina V e iodeto de propdeo nas culturas durante 2 semanas de cultivo.
Shahdadfar, A. (2006). Pelos resultados aqui apresentados, sugerimos que os testes de viabilidade celular devem ser feitos sempre durante o cultivo de CTMs para verificar o auge da homogeneidade do cultivo e a baixa morte celular. BIBLIOGRAFIA 01. CARVALHO, A.C.C. Clulas-Tronco: a medicina do futuro. Cinc. Hoje. So Paulo, v.29, p. 27-31, 2001 02. GOLDSBY, R.A.; KINDT, T.J.; OSBORNE, B.A. Kuby Imunologia. Quarta ed. Rio de Janeiro: Livraria e Editora REVINTER Ltda., 2002. p 517-526. 03. BENTLEY, G.; MINAS, T. Reviso clnica:tratar a leso articular em jovens. Br. Med. J., London, v.10, 2001. Disponvel em http://www.bmj-pt.com 04. ROBERTS, S.; McCALL, I.W.; DARBY, A.J.; MENAGE, J.; EVANS, H.; HARRISON, P. E.; RICHARDSON, J.B. Autologous chondrocyte implantation for cartilage repair: monitoring its success by magnetic resonance imaging and histology. Arthritis Res. Ther. v. 5, p. 6072, 2003 05. WROBE, R. R. Articular cartilage injury and autologous chondrocyte implantation. Phys. Sportsmed., Minneapolis, v. 28, 2000. Disponvel em: http/ /www.physsportsmed.com.issues 06. KLINIKUM LEVERKUSEN TRAUMATOLOGY & ORTHOPEDIC SURGERY. Autologous chondrocyte implantation. Levekusen, 2000. Disponvel em: <http//www.Unfllchirurgie.com/english/autologous_condrocyte_ implant.htm>. Acesso em: 28 abr. 2003 07. MARTIN, I.; PADERA, R. F.; VUNJAK-NOVAKOVIC, G.; FREED, L.E. In vitro differentiation of chick embryo bone marrow stroma cells into cartilaginous and bone-like tissues. J. Bone Joint Surg., Boston, v. 16, p. 181-189, 1998 08. ZAGO,M.A; COVAS,D.T. ClulasTronco: A nova froteira da medicina. Primeira ed. So Paulo: Editora Atheneu, 2006. p.35-48 09. JAVAZON, E.; BEGGS, K.; FLAKE, A. Mesenchymal stem cells: Paradoxes of passaging Experimental Hematology v.32, p. 414425,2004 10. BONAB, M. et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biology, v.7:14 doi:10.1186/1471-2121-714, 2006 11. SHAHDADFAR, A. et al. In Vitro Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells:Choice of Serum Is a Determinant of Cell Proliferation, Differentiation, Gene Expression, and Transcriptome Stability Stem Cells v. 23, p.1357 1366,2005.
do por necessidade de entenderem as CTMs antes de diferenci-las) difcil correlacionar os resultados deste trabalho com a literatura. Os principais trabalhos com CTM na literatura indicam que fizeram a contagem celular (pelos mais variados mtodos) mas raramente expe
os resultados em seus artigos, e muitos deles no diferenciam as CTMs das outras clulas mononucleadas durante a contagem celular, levando em considerao somente a confluncia de clulas na placa de cultura vistas por microscopia de luz Bonab, M.M. et al. (2006),
Ilustrao 08: Cultura de clulas mononucleadas da medula ssea, e as CTMs esto marcadas com anti-vimentina (FL1). Ao lado, temos a legenda que mostra a porcentagem da expresso de anti-vimentina (29,50%)
Ilustrao 09 CTMs marcadas com anexina V (FL1) e iodeto de propdeo (FL3). Na esquerda temos somente as CTMs que foram marcadas com anti-vimentina, neste quadro distribudas por tamanha x granulosidade. Ao meio encontra-se a marcao das CTMs do gate R2 com anexina V e iodeto de propdeo. Do lado esquerdo temos a legenda do quadrante do meio (UL = up left, UR = up right, LL = low left, LR = low right) onde se l que 58,11% das clulas esto viveis, 6,94% expresso somente anexina V, 4,37% expresso somente iodeto de propdeo e 3,68% coexpressa anexina V e iodeto de propdeo
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Pesquisa
Caracterizao morfolgica e fisiolgica em acessos de Agaricus blazei e A. sylvaticus

Estudos baseados empelos critrios morfolgicos Fotos e ilustraes cedidas autores e fisiolgicos
Fotos e ilustraes cedidas pela autora
HISTRICO O cogumelo Agaricus blazei Murril foi encontrado pela primeira vez em 1965 na regio de Piedade So Paulo, pelo imigrante japons Takatoshi Furomoto. Em 1972,
Fig. 01 Agaricus sylvaticus cultivado em cu aberto em So Paulo
Arailde Fontes Urben, Ph.D Biloga, Fitopatologista, Micologista Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia arailde@cenargen.embrapa.br
ele enviou amostras deste fungo para a Universidade da Provncia de Mie no Japo para ser analisado. O material foi tambm enviado para a Blgica, Argentina e Estados Unidos, onde posteriormente o fungo foi classificado como Agaricus blazei Murril (Mizuno, 1997). Seus efeitos teraputicos foram inicialmente estudados pela Faculdade de Medicina da Universidade de Mie e pela Universidade de Shizuoka no Japo, onde descobriram suas propriedades anticancerigenas e seu potencial de ativar o sistema imunolgico. Os cientistas japoneses revelaram que o polissacardeo -glucan atuava no organismo, aumentando as funes imunolgicas, elevando os macrfagos, Natural Killer Cell (NKC), clulas T, clulas B e clulas complementares,evitando a regenerao e a metstase do cncer (Mizuno, 1990,1997). INTRODUO Os cogumelos tm sido considerados um grupo especial de fungos pelo seu tamanho
macroscpico, distinto corpo de frutificao e produo de bilhes de esporos. Suas frutificaes podem ser de cores vivas (amarelo, laranja, vermelho, violeta ou verde) escuras (marrom ou preto) ou sem colorao (branco ou hialino), de consistncia carnosa frgil a coricea, morfologia bastante varivel e formas curiosas. Apesar dos cogumelos serem considerados como um alimento especial, eles tambm podem ser txicos e alucingenos. Existem relatos de intoxicao e morte na Amrica e Inglaterra devido ao consumo de cogumelos silvestres. No Mxico, os fungos alucingenos eram usados pelos ndios em rituais religiosos e tambm como medicamentos. O gnero PSILOCYBE, comum naquele pas, era considerado um produto divino. Esses macrofungos so conhecidos pela humanidade, particularmente pelos povos asiticos, desde os primrdios da histria, seja pela sua toxidez ou pelas suas propriedades nutricionais e medicinais. O homem primitivo j se alimentava desses cogumelos no perodo entre 5.000 a 4.000 anos a.C. e logo aprendeu a valoriz-los como alimento. O Brasil foi o primeiro pas a cultivar o Aga-
Fig. 02 Agaricus blazei cultivado em estufas no Distrito Federal (A e B) acessos n 01 e (C) acesso n 2
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ricus blazei. Atualmente tambm cultivado em outros pases como o Japo, China e Coria. Inicialmente o cultivo era realizado usando as mesmas tcnicas para o Champignon de Paris (Agaricus bisporus). Hoje, sabe-se que a metodologia de cultivo vem se aprimorando cada vez mais direcionada para a produo de Agaricus blazei, cuja demanda vem crescendo consideravelmente nestes ltimos anos. O cultivo pode ser realizado no campo (em cu aberto) ou em estufas (cultivo protegido). Diversas so as vantagens de cultivar em estufas, entre elas: melhor controle da temperatura e umidade, proteo contra chuvas, ventos, granizo e controle de pragas (Abe, 2002). O seu mercado destina-se principalmente exportao para o Japo e Estados Unidos. Embora o mercado interno ainda no tenha a expresso econmica desejvel, o consumo a nvel nacional vem crescendo a cada ano, apesar dos altos preos que vem sendo praticados. Em geral, este produto vem sendo utilizado como nutricutico, por seus atributos de aumentar as defesas imunolgicas do organismo. Agaricus blazei Agaricus blazei, sinonmia A. sylvaticus um fungo saprfito, comestvel e medicinal, que se desenvolve em clima tropical e mido com temperatura variando entre 25 - 28C. rico em protenas, vitaminas e sais minerais. usado como nutricutico na preveno e tratamento de diversas enfermidades, como o cncer, Aids, artrites reumticas, lupus, hepatite B e C, entre outras doenas. No Japo, conhecido vulgarmente como Himematsutake. No Brasil, recebeu diversos nomes, como por exemplos: Cogumelo Piedade, Cogumelo da Vida, Cogumelo Medicinal, Cogumelo Princesa, Cogumelo de Deus, Cogumelo do Sol, etc. Classificao fngica de Agaricus blazei: REINO: Fungi FILO: Basidiomycota CLASSE: Basidiomycetes/Hymenomycetes ORDEM: Agaricales/Hymenomycetales FAMLIA: Agaricaceae GNERO: Agaricus ESPCIE: Agaricus blazei Murril A identificao e a classificao das espcies de Agaricus tm sido baseadas em caractersticas morfolgicas e fisiolgicas pela maioria dos especialistas em taxonomia, e mais recentemente, mtodos genticos, moleculares e bioqumicos. As espcies de Agaricus so diferenciadas principalmente pela colorao, forma e dimenso dos corpos frutferos e estruturas microscpicas (esporos, lamelas, cistdios, etc). Sob condies naturais e artificiais, este fun-
Fig. 03 - Aspectos culturais de 01 acesso de Agaricus sylvaticus (A) e 02 de Agaricus blazei (B e C), desenvolvidos a 28 C em meio de cultura BDA, com dez dias de incubao
go pode apresentar diversas linhagens. Estas linhagens ou grupo de isolados so observados a partir de caractersticas morfolgicas das colnias fngicas desenvolvidas em diferentes meios de cultivos artificiais de laboratrio, temperaturas e luminosidade. Em condies de campo ou estufas, a presena de uma nova linhagem, pode ser observada nos corpos de frutificao. Fatores abiticos ou mesmo biticos, podem favorecer ou contribuir com o surgimento de uma nova linhagem ou variedade. OBJETIVO: O objetivo deste trabalho foi caracterizar morfo- fisiologicamente diferentes acessos de Agaricus blazei e Agaricus sylvaticus para
verificar se havia similaridades ou diferenas entre eles. MATERIAL E MTODOS Acessos de Agaricus blazei e Agaricus sylvaticus procedentes do Distrito Federal e de So Paulo, foram submetidos a testes morfolgicos e fisiolgicos no Laboratrio de Quarentena Vegetal da Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, Setor de Micologia. Atravs do exame direto, avaliou-se o tamanho, cor, disposio das lamelas e textura do corpo frutfero. Em microscpio ptico de luz, observou-se a organizao das lamelas, a forma e tamanho dos esporos. Testou-se trs meios de cultura: batata-dextro-
Fig. 04 - Aspectos culturais de 01 acesso de Agaricus sylvaticus (A) e 02 de Agaricus blazei (B e C), desenvolvidos a 28 C em meio de cultura MB, com dez dias de incubao
Fig. 05 - Aspectos culturais de 01 acesso de Agaricus sylvaticus (A) e 01 de Agaricus blazei (B), desenvolvidos a 28 C em meio de cultura suco de tomate, com dez dias de incubao
Fig. 06 - Esquemas de corte transversal de lamelas mostrando a trama: A. trama de mediostrato: regular e filamentosa; hm himnio, hp - himenpede, sh - subhimmio, m - mediostrato; B. mediostrato regular en boyaux; C. mediostrato regular celuloso; D. mediostrato filamentosoemaranhado; E. mediostrato enteriforme; F. mediostrato bilateral; G. mediostrato inverso (bilateral-inverso); H. sub-himnio: H1 - filamentoso; H2 - celuloso; H3 ramoso
se-gar (BDA), suco de tomate e meio bsico (MB). As placas foram incubadas a 28 C sob luz fluorescente contnua RESULTADOS E DISCUSSO Os resultados mostraram pequenas diferenas entre o acesso de So Paulo com os de Braslia, evidenciados pela observao direta e caractersticas culturais. As amostras de A. sylvaticus analisadas apresentaram colorao mais clara nos bordos e mais escura no centro do pleo, dimenses maiores do corpo frutfero e dos esporos quando com-
parados com os acessos de A. blazei. Os esporos de A. sylvaticus apresentam colorao sub-hialina a marrom claro, sub-esfricos a ovides com uma nica membrana, dimenses: 7,2 - 14,4 x 7,2 - 9,6. Trama bilateral do tipo mediostrato, regular celuloso. Os esporos de A. blazei (acesso 01) apresentaram colorao hialina sub-hialina, sub-esfricos a ovides, com uma nica membrana, dimenses: 6,0 - 10,8 x 5,5 - 8,4. Trama bilateral do tipo mediostrato regular celuloso (Fig. 6). Os esporos de A. blazei (acesso 02) apresentaram as mesmas caractersticas do acesso 01 com diferenas nas dimenses dos esporos: 4,8 - 9,6 x 4,3 -7,2. Em meio de cultivo, o miclio de A. sylvaticus e de um dos acessos de A. blazei, apresentaram textura delicada, paredes estreitas, denso, filamentoso e cotonoso. J no segundo acesso, o miclio foi escasso, pouco denso e filamentoso (Figs. 3 a 5). A espessura do pleo e o vigor dos isolados so um dos principais determinantes do grau de qualidade do cogumelo. Estas pequenas diferenas entre os cogumelos estudados, so provavelmente devido a fatores climticos, utilizados no cultivo, como temperatura, luminosidade, umidade; o plantio em cu aberto, e a linhagem utilizada. Dentro de uma mesma espcie pode ocorrer variaes na forma, colorao e tamanho das estruturas macroscpicas e microscpicas, em decorrncia de fatores abiticos ou genticos. Como conseqncia dessas variaes pode, surgir novas linhagens ou variedades dentro de uma mesma espcie (Figs. 7 a 10). Definio - Forma especial (f.sp): grupo de indiv-
Fig. 08 - Pleurotus ostreatus var. chinesa cultivado pela tcnica Jun Cao adaptada pela Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
duos dentro de uma variedade ou espcie, distinto dos outros, por umas tantas reaes fisiolgicas. Designa uma qualidade diferenciada, distinta de outras espcies. - Linhagem: srie sucessiva de geraes de um fungo. - Variedade: subdiviso das espcies que se fundamenta em pequenas diferenas nos caracteres distintivos dos indivduos da mesma espcie. Outros exemplos: - Pleurotus columbinus e Pleurotus sapidus, so sinnimos de P. ostreatus. P. columbinus, o pleo tem colorao azulada e P. sapidus, cor cremosa a bege ou marrom claro. - Singer props, que P. columbinus uma variedade de P. ostreatus: P. ostreatus var. columbinus. - Literatura consultada: Growing Gourmet Medicinal Mushrooms Paul Stamets, 1993, pg. 314 CONCLUSO 1. Existe uma grande variabilidade gentica de cogumelos do gnero Agaricus nativos e cultivados em todo o mundo. 2. As linhagens produzidas por esses cogumelos so resultados do tipo de substrato ou do composto utilizado, das condies climticas, do local de cultivo e de mutao gentica que pode ocorrer naturalmente ou
Fig. 07 - Pleurotus ostreatus (Cogumelo Ostra) cultivado pela tcnica Jun Cao adaptada pela Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
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5. Agaricus sylvaticus sinnimo de Agaricus blazei. Os acessos analisados de So Paulo uma variedade de Agaricus blazei, podendo, portanto ser denominado, Agaricus blazei var. sylvaticus (Urben, 2005). 6. Normalmente pequenas diferenas morfolgicas no justificam o enquadramento de uma nova espcie, dessa forma, Agaricus sylvaticus e Agaricus brasiliensis, so sinnimos de Agaricus blazei. REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS URBEN, A.F.;AMAZONAS, A.;, URIARTT, A.; CORREIA, M.; VIEIRA, W. Curso cultivo de cogumelos comestveis e medicinais. Braslia: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 1999. p. 105-122.
Fig. 09 - Pleurotus ostreatus var. H1 cultivado pela tcnica Jun Cao adaptada pela Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
AURORA, D. Mushroom demystified. 2. ed. Berkeley: Ten Speed Press, 1986. 959 p. BADO, L. C. Produccion de hongos comestibles. In: VALOR nutritivo y toxicologia de los hongos. San Cristbal de las Casas, Mxico: [s.n.], 1994. 108 p. CHANG, S. T.; HILES, P. G. The nutritional attributes and medical value of edible mushroom. In: EDIBLE mushrooms and their cultivation. [Boca Raton]: CRC Press, 1989. p. 2740. HAYES, W. A.; WRIGTH, S. H. Edible mushrooms. In: Rose, A. H. (Ed.). Economic microbiology: microbial biomass. London: Academic Press, 1979. p. 31-176. HOBBS, C. Medicinal mushrooms: an exploration of tradition, healing, & culture. Santa Cruz, Ca.: Botanica Press, 1995. 252 p. MILES, P. G.; CHANG, S. T. Mushroom biology: concise basics and current developments. Singapore: World Scientific, 1997. 194 p. URBEN, A. F.; OLIVEIRA, C. Cogumelos comestveis: utilizao e fontes genticas. Reviso Anual de Patologia de Plantas, v. 6. p. 173196, 1998. ZHANXI, L.; ZHANZHUA, L. Fungi cultivation with Jun-Cao. Fuzhou: Asia-Pacific Cultivation Training Center, 1995. 110 p.
artificialmente. 3. Linhagens de alta qualidade, precisam satisfazer os seguintes critrios: miclio branco, denso, filamentoso, cotonoso, com fragrncia suave e livre de contaminantes. 4. Estudos qumicos tm revelado que a concentrao elevada de nutrientes e de princpios ativos nos cogumelos est diretamente relacionada com o tipo da linhagem utilizada, a qual exige condies especificas ou diversos fatores, como por exemplos: A)Fatores nutricionais (substncias essenci-
ais para o desenvolvimento: carbono, nitrognio, vitaminas e minerais). B)Fatores abiticos (umidade do composto e da cobertura, temperatura, luminosidade, oxignio, produtos qumicos no ar, concentrao de Co2). C)Fatores biticos (vrus, bactrias, actinomicetos, fungos, nematides, insetos, caros e genticos). D) Fatores genticos (natural ou artificial) E) Fatores inerentes ao processamento (colheita, secagem/ desidratao e estocagem).
Fig. 10 - Pleurotus sapidus cultivado pela tcnica Jun Cao adaptada pela Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
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