Annales de Toxicologie Analytique, vol.

XIX, n 3, 2007

Dosage rapide par chromatographie phase gazeuse de la ktamine et de la norktamine chez le rat

Rapid gas chromatography determination of ketamine and norketamine in rats

Lauriane GINEFRF', Bernard GOURMEL3, Frdric J. BAUD(U), Pascal HOUZE(1A3)*

(1) Universit Paris Descartes, Facult de Pharmacie, Neuropsychopharmacologie des addictions, CNRS, UMR 7157 et Universit Paris 7 - F-75010 Paris - France (2) AP-HP, Hpital Lariboisire, Ranimation Mdicale et Toxicologique, 2, rue Ambroise Par - F-75010 Paris - France (3) AP-HP, Hpital Saint Louis, Laboratoire de Biochimie, 1 , avenue Claude Vellefaux - F-75010 Paris - France

* Auteur

qui adresser la correspondance : Pascal HOUZ, AP-HP, Hpital Saint Louis, Laboratoire de Biochimie, 1, avenue Claude Vellefaux - F-75010 Paris - France Tl. : +33 1 42 49 94 46 - Fax : +33 1 42 49 92 47 - E-mail : pascal.houze@sls.aphp.fr
(Reu le 2 avril 2007 ; accept aprs modification le 21 septembre 2007)

RESUME
La ktamine est un anesthsique dissociatif driv de la cyclohexanone, utilise en mdecine humaine et vtrinaire pour induire l'endormissement et le maintenir lors de brves interventions chirurgicales. Inhibiteur non comptitif du glu tamate au niveau des rcepteurs NMDA centraux, la ktami ne est rapidement mtabolise en norktamine, prsentant une action pharmacologique, puis en dhydronorktamine limine par voie urinaire aprs conjugaison. Les effets secondaires (dlires, hallucinations) sont recherchs au cours des raves parties. L'accroissement de son utilisation dans un but d' addict ion est l'origine d'un nombre lev d'intoxications dont certaines mortelles. De nombreuses mthodes chromatographiques en phase gazeuse ont t rap portes utilisant toutes une tape de drivation et un volume d'chantillon important. Dans ce travail, nous dcrivons une mthode de dosage simultan de la ktamine et de la nork tamine par chromatographie phase gazeuse sans drivation aprs extraction liquide-liquide. L'ifosfamide est utilis

SUMMARY
Ketamine is an anaesthesic agent extensively used for the induction and maintenance of anesthesia and analgesia in man and animals. Ketamine is a NMDA receptor agonist which is metabolised in the liver in norketamine then dhy dronorktamine excreted in urines as glucuroconjucated compounds. In rave party, adverse effects of ketamine are responsible of death occurring to respiratory arrest. Many gas chromatographic methods are described in literature using large sample and derivative procedure. In this paper, we report a rapid gas method without derivative step for the simultaneous determination of plasma norketamine and ketamine using ifosfamide as internal standard. The method is linear from 500 to 4.000 pg/L with a good sensitivity cor responding to 160 pg/l and 180 pg/L as limits detection for ketamine and norketamine, respectively. Precision (below 10 %) and accuracy (below 15 %) are satisfying with a small plasma sample. This method is available to realise pharma cologic study in rats as reported in this paper.
211

Article available at http://www.ata-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/ata:2007024

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIX, n 3, 2007

comme talon interne. La mthode est linaire entre 500 et 4000 pg/L La limite de dtection est de 160 et 180 pg/L pour la ktamine et la norktamine, respectivement. La prcision intra et inter sries est satisfaisante (< 10 %), de mme que l'exactitude (biais < 15 %). Utilisant un volume rduit de prlvement, cette mthode peut tre applique des tudes pharmacocintiques chez l 'animal. Pour illustrer cette appli cation, nous dcrivons les cintiques plasmatiques de la ktamine et de la norktamine chez le rat aprs perfusion de ktamine la dose de 70 mg/kg. Les valeurs des principaux paramtres pharmacocintiques sont galement prsentes.

MOTS-CLS
ktamine, chromatographie phase gazeuse, rat, pharmacocintique.

KEY-WORDS
ketamine, gas chromatography, rat, pharmacokinetics.

Introduction
La ktamine (K), [2-(o-chlorophenyl)-2-methylamino)] cyclohexanone (Figure 1), a t synthtise pour la premire fois en 1962, dans le but de trouver un anesthsique de remplacement la phencyclidine (1). Utilise sous forme de racmique, la ktamine est un agent anesthsique dissociatif courte dure d'action (2). L'anesthsie induite se caractrise, par une analg sie profonde, le maintien des rflexes pharyngo-laryngs, la conservation du tonus musculaire et mme une stimulation des fonctions cardiaque et respiratoire aux doses pharmacologiques (2). Chez l'homme, ces carac tristiques font de la ktamine (Ktalar, Ktamine Panpharma), un agent de choix pour induire l'anes thsie, pour les actes chirurgicaux de courte dure ou encore en analgsie dans les soins post-opratoires douloureux (3). En mdecine vtrinaire, la ktamine (Ktamine UVA, Clorketam, Imalgne) seule ou associe d'autres produits (xylazine) est frquem

(6- et 4- norktamine) qui par dshydratation vont aboutir la dhydronorktamine (DHNK), metabolite terminal. Les drivs hydroxyls et la DHNK sont li mins dans les urines (85 95 % de la dose adminis tre) aprs sulfo- ou glycuroconjugaison (7) (fig 1).
Sur le plan pharmacologique, la ktamine est un anta goniste non comptitif du glutamate au niveau des rcepteurs V-methyl-D-aspartate (NMDA) centraux (8). La ktamine S (+) est quatre fois plus puissante que la ktamine R (-) (9). Parmi les metabolites de la K, la norktamine a t dcrite comme pouvant interagir avec les rcepteurs NDMA mais elle serait cinq fois moins active que la molcule mre. Elle pourrait cependant contribuer l'activit pharmacologique de la ktamine, en particulier quand celle-ci est adminis tre par voie orale (10).

L'interaction de la K avec les rcepteurs est bien sr responsable de ces effets pharmacologiques mais aussi
de ces effets secondaires neuropsychiques comme les

ment utilise pour induire et entretenir l'anesthsie dans de nombreuses espces animales : rat, cheval, bovins (4).

hallucinations, le dlire et l'agitation (8,11).

Ces effets secondaires sont recherchs par les toxico

D'un point de vue mtabolique, la ktamine est bien

absorbe par toutes les voies parentrales (90-95 %) mais faiblement per os (10 -20 %) (3). La distribution tissulaire est rapide, avec une demi-vie comprise entre 7 et 1 minutes. Les concentrations les plus leves sont retrouves au niveau des tissus adipeux, du foie, des poumons et du cerveau, alors que les plus faibles sont observes dans les muscles et le sang circulant (3). La liaison de la ktamine aux protines plasmatiques est controverse. Pour certains auteurs, elle serait faible, de l'ordre de 10 % (5), pour d'autres elle pour rait atteindre 60 % (6). Mtabolise au niveau hpa tique par la voie des cytochromes P450 (principale ment le CYP2B6), la ktamine conduit rapidement (demi-vie d'limination 2 heures) la norktamine (NK) par dmthylation puis des drivs hydroxyls
1
1

manes avrs ou occasionnels en particuliers dans les soires rave o la ktamine circule sous diffrents

noms (Ket, Special K, Kit Kat, Super acide,..) seule ou associe d'autres drogues. Elle est essentiellement sniffe mais peut tre consomme par voie orale ou injecte en intraveineuse. En plus de ces proprits neuropsychiques, la ktamine a des effets dsinhibiteurs et anxiolytiques trs recherchs par les utilisa teurs. Les effets prsentent un maximum pendant 4 6 heures puis diminuent brusquement, entranant un recours d'autres drogues de remplacement, comme l'alcool ou les benzodiazepines. L'usage chronique et prolong de la ktamine gnre une tolrance et une dpendance impliquant son classement dans les pro duits stupfiants en France (arrt du 8 aot 1997), mais aussi dans d'autres pays (DEA Schedule III, USA, 1999 ; Classe C, UK, 2006) (12). Le surdosage

212

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIX, n 3, 2007

4-Hydroxyketamino

H.CN

-Hydroxy

ketamine

5-Hydroxyketamine

Chiral

centre

(R,S)-Norketamine
,ci 4-Hydroxy norketamine

6-Hydroxy
OH

norketamine

(R,S)-Dehydronorketamine

Figure

1 :

Structure et mtabolisme de la ktamine.

peut entraner des convulsions, une dfaillance cardio respiratoire avec risque d'arrt cardiaque ou une mort subite. Plusieurs cas d'intoxication fatale chez l'hom me par la ktamine ont t rapports dans la littrature (13,14)
Ces donnes toxicologiques expliquent le nouvel intrt

d'chantillons. Compte tenu de sa sensibilit, notre mthode parait parfaitement adapte la ralisation d'tudes pharmacocintiques chez le petit animal.

Matriel et mthodes
Solvants et ractifs
L' hydrochloride de ktamine a t obtenu auprs de Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France). L'hydrochloride de norktamine en solution mthanolique g/L, provient de la socit LGC Promochem (Molsheim, France). L'ifosfamide est un don des labo
1

apport au dosage de la ktamine et de son metabolite actif principal. D'un point de vue analytique, la revue de la littrature retrouve de nombreuses mthodes de dosa ge par chromatographie en phase gazeuse avec driva tion (15-17) ou en phase liquide (4, 18-19), ncessitant des volumes de prlvement important (de l'ordre de 500 /ri), difficilement applicable au petit animal lors de protocoles avec prlvements multiples.
Dans ce travail, nous rapportons une mthode par chro matographie en phase gazeuse sans drivation, pour le dosage simultan de la ktamine et de la norktamine. La technique dcrite est rapide, spcifique et suffisam ment sensible pour travailler sur de faibles volumes

ratoires Baxter (Paris, France).

Le methanol, la lessive de soude, le chloroforme et l'actate d'thyle, de qualit analytique, ont t fournis par la socit VWR International (Fontenay-sous-Bois, France). L'eau pour prparation injectable et le chloru re de sodium isotonique sont fournis par le Laboratoire Lavoisier (Paris, France).
213

Annales de Toxicologie Analytique, vol.

XIX,

n 3, 2007

La solution mre de ktamine est prpare par dissolu tion du produit pes dans du methanol, de faon obte nir une solution g/L de ktamine base (11,5 mg d'hydrochloride de ktamine dans 10 mL de methanol). La solution mre en NK est titre commercialement mg/mL en norktamine. Les deux solutions mres sont stables pendant 3 mois, conserves - 20C.
1

Le volume est complt 100 pL avec du chlorure de sodium isotonique, puis 400 pL de srum free sont ajouts chacun des points de gamme. Le srum free seul permet l'obtention du point zro.

Trois contrles de qualit sont raliss par surcharge du mme srum des concentrations basse (CQ[ : 500 pg/L) moyenne (CQ2 : 800 //g/L) et haute (CQ3 :
1

La solution mre d'ifosfamide 2 g/L (talon interne) dans le methanol est stable pendant 6 mois, conserve -20C. Une solution fille 4 mg/L est prpare extemporanment par dilution au 1/500 de la solution
mre dans de l'eau distille.

3600 pg/L).
Les points de gamme et les contrles sont rpartis sous un volume de 100 //L et congels -20C. Dans ces conditions les chantillons sont stables pendant un mois.

Un pool de srum free est utilis pour la prparation de la gamme d'talonnage et des contrles. Il est obte nu partir de srum humain de patients non traits, agit + 4 C avec du charbon actif (1 g pour 250 mL) pendant 24 heures puis filtr (filtre Nalgne 0,45// m,

Extraction des chantillons

A une prise d'essai de 100 pL (gamme, contrles et chantillons) est ajout 200 //L d'talon interne (El) 4 mg/L). Les chantillons sont alcaliniss par 50 pL de soude 0,1 N puis extraits par ,5 mL de chloroforme au multi vortex (3 fois 15 secondes). Aprs centrifugation 10 minutes 4000 tours, ,2 mL de phase organique est rcupr. L'extrait est vapor 37C sous courant d'azote. Les extraits secs sont repris par 100/.L d'ac tate d'thyle et pL est inject dans le systme chromatographique.
1

VWR International. Fontenay-sous-Bois, France). Aprs filtration, le srum free rparti en tubes de 5 mL, est conserv au conglateur -20C.

Systme et conditions chromatographiques

Les dosages de la ktamine et de son metabolite sont raliss sur un chromatographe en phase gazeuse Hewlett Packard 5890 quip d'un dtecteur spcifique azote-phosphore (NPSD) et coupl un systme d'in jection Hewlett Packard GC/SFC 7673. La colonne est une Hewlett Packard HP1 (longueur 30 m, diamtre interne 530 /.m, paisseur 2.65 /.m). L'hlium et utili s comme gaz vecteur (dbit = 7 mL/min). L'hydrogne et l'air utiliss comme gaz de combustion dans le dtecteur, ont respectivement pour dbit et 70 mL/min. Les tempratures de l'injecteuret du dtecteur sont de 250C et de 275C. L'analyse est ralise en isotherme 205C. Le potentiel du dtecteur est rgl de manire obtenir une valeur de ligne base comprise entre 20 et 30. Les donnes sont recueillies l'aide d'un intgrateur (Hewlett Packard 3396 Series II inte
1

Etude pharmacocintique chez l'animal

Pour la ralisation des cintiques, des rats mles Sprague-Dawley (Souche OFA, Charles River labora toires, BP0109 69592 L'arbresle Cedex) de 250 350 g (8 12 semaines) ont t utiliss. Les animaux taient livrs au minimum une semaine avant le jour de l'exprimentation. Ils sont gards l'animalerie dans des conditions de temprature et de luminosit adap tes, l'eau et la nourriture tant fournies ad libidum. Les animaux survivants l'exprimentation sont euthanasis au dioxyde de carbone.

grator).

La veille de l'exprimentation, les animaux sont anesthsis avec du thiobarbital (60 mg/kg par voie intrapritonale) pour la mise en place de cathters au niveau de l'artre et de la veine fmorales.
Le jour de l'exprimentation les animaux reoivent dans la veine fmorale, en perfusion de 30 min, une dose de 70 mg/kg de ktamine (exprime en ktamine base). Les chantillons de sang (200 //L) sont recueillis de faon fractionne entre 0 et 330 min au niveau du cathter de l'artre fmorale. Ils sont immdiatement centrifugs et le plasma est conserv -20C jusqu'au moment du dosage.

Prparation de la gamme d'talonnage et des contrles

Toutes les solutions et dilutions sont ralises en tube borosilicats de faon limiter l'adsorption non spci fique des molcules doser.

A partir des solutions mres de K et de NK, des solu tions filles sont prpares par dilution extemporane au 1/20 dans le chlorure de sodium isotonique, pour obte nir des solutions 50 p g/L en K et en NK.
La gamme d'talonnage en 6 points (500 4000 pg/L) est prpare par surcharge du srum free en K et NK. Des volumes croissants (5 40 /(L) de chaque solution fille sont dposs dans des tubes borosilicats.
214

Expression des rsultats et paramtres pharmacocintiques

Les rsultats sont exprims en moyenne +/- cart- type (m +/- S.D.)

La modlisation de la cintique et le calcul des para-

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIX, n 3, 2007

mtres pharmacocintiques obtenus aprs administra tion IV de la ktamine chez le rat, ont t dtermins en utilisant le logiciel WinNonlin (Pharsight, USA).

Validation analytique de la mthode

Dans ce but, nous avons vrifi les critres habituels de validation que sont la linarit, la limite de dtection, la prcision, l'exactitude et la spcificit.

Rsultats
Profils chromatographiques
La figure 2 reprsente les tracs chromatographiques obtenus pour le point zro (Figure 2a), un point de gamme 1500 pg/L (Figure 2b) et un prlvement obte nu chez le rat, correspondant un temps 10 minutes aprs la fin de la perfusion (Figure 2c). Les pics obtenus sont fins, symtriques et bien spars dans un temps d'analyse totale de 15 minutes. Les temps de rtention sont respectivement de 6,1, 6,8 et 9,4 min, pour NK, K et l'talon interne.

Linarit
La linarit a t vrifie en injectant trois gammes d'talonnage le mme jour dans les mmes conditions chromatographiques. Le calcul des rapports surfaces des molcules d'intrt (K et NK) sur El, montrent que les relations sont linaires pour la zone de concentra tions comprises entre 500 et 4000 /.g/L. En utilisant la rgression par la mthode des moindres carrs, les quations moyennes des droites d'talonnage sont : NK y = 0,00032x -0,012 et K y = 0,00020x-0,020 avec des coefficients de corrlation compris entre 0,95 et 0,99. Le tableau I rsume pour chaque point de gamme, les

3
h
C0

2
Ui Ci

a'_
3

3
E

'"L'i
r-

0
Kl

2
CI'

ci)

:.
co

"I

tfi
T,

s
ifl

8
4)
Cu

^ [ii Si
.CTi

ai

0
r-

i
1

ai

l
|
1

Cl

;,

a:

U
i
1

CD

a:
UJ

>

r-

c:
a:

r
(a)

h"

co

"J J

\ 1 \j^
!

I'

*"

h- 11-*

(ii

(b)

(c)

Figure 2 : Profil chromatographique du point zro (a), d'un point de gamme 1500 pg/L (b), et d'un prlvement obtenu chez le rat 10 minutes aprs la fin de la perfusion de ktamine (dose de 70 mg/kg) (c). Pics : I - norktamine ; 2 - ktamine ; 3 =
ifosfamide (talon interne).

215

Annales de Toxicologie Analytique, vol.

XIX, n 3, 2007
observ par rapport la valeur vraie. Les valeurs du biais sont toutes comprises dans les limites de plus ou moins 15 % et sont donc compatibles avec une exacti tude satisfaisante de notre mthode (tableau II).

valeurs de la moyenne, des cart-types, de la prcision (coefficient de variation) et de l'exactitude (biais).

Limites de dtection et de quantification

La limite de dtection (LD) a t dtermine en consi drant un rapport signal/bruit de 3/1. Dans ces condi tions elle est de 160 /<g/L pour la ktamine et de 180 pg/L pour la norktamine. Les limites de quantifi cation (LQ) peuvent tre considres comme tant gales un rapport signal/bruit de 10/1, soit des valeurs de LQ de 480 et 520 pg/L pour la K et la NK, respectivement. La limite de quantification pour les 2 molcules a donc t choisie 500 pg/L, correspondant au premier point de gamme.

Rendement d'extraction
Pour calculer le rendement d'extraction, nous avons com par la hauteur des pics de solutions en K et NK prpa res dans du methanol des plasmas surchargs aux mmes concentrations. De faon vrifier le rendement d'extraction sur une plage tendue de concentrations, nous avons retenu comme concentrations tests les valeurs des 3 contrles de qualit, respectivement 500, 1800 et 3600 pg/L. Sur 4 dterminations, nous avons observ un rendement d'extraction de 92 +/- 4 % (500 pg/L) ; 95 +1-6 % (1800 //g/L) et 90 +/- 3% (3600 /(g/L).

Exactitude et prcision (inter- et intra-sries)

Ces paramtres de validation ont t dtermins en

mesurant les 3 contrles de qualit. La prcision de la mthode a t value en inter ou en intra-sries (n=10) et exprime en pourcentage de variation. Pour la kta mine et la norktamine, les valeurs des coefficients de variation sont comprises entre 3,6 et 10,5 % (tableau II). Sur les mmes dterminations, la valeur de l'exac titude a t calcule comme le pourcentage de biais
Tableau I

Spcificit
Les chromatogrammes obtenus ne montrent aucune interfrence biologique ou pharmacologique (Figure 2), en particulier avec les produits co-administrs lors de l'anesthsie des animaux. Le thiobarbital et la xylazine extraits dans les mmes conditions sont dtects mais lues respectivement 5,5 min et 8,3 min.

Prcision et exactitude de la gamme d'talonnage.

Concentrations thoriques Qig/L)
500
1000 1500

Composs

Concentrations calcules (m+/-S.D., n=3) (fig/L)

Prcision (C.V., %)
8.1

Exactitude (biais, %)
-4,9
1,6

Norktamine

480+/-39
1026+/- 105 1397+/- 158

10,3
11,3

-7,8 -3,2
1,8

2000 3000

1955+/- 176

9,0

3085+/-217

7.0
3,7

4000

3993+/- 147
49+/-33

-1.2
-1.7
1.7

Ktamine

500
1000

6,6
10,9
11,9

1027+/- 112
1455+/- 174

1500

-4.0
-1.4
-1,3

2000
3000

1991+/-188

9,4 5,4
2,7

2990+/- 162

4000
C.V. : coefficient de variation

4022+/-110

-0,4

Tableau

II

tude de la prcision et de l 'exactitude la mthode.

Concentrations
thoriques (/<g/L)

Composs

Prcision inter-sries (n=10)

Prcision intra-sries (n=10)

Concentrations mesures (m+/-S.D.) (//g/L)

Prcision (C.V., %)
7.7

Exactitude

(biais.';)
8.5

Concentrations mesures (m+/-S.D.,) (//g/L)

Prcision (C.V., %)
7.5 8.9
3.6

Exactitude (biais, %)
-9.1

Norktamine

800

(CQI)

732+/-56
1764+/- 122

735+A55
1724+/- 153

1800 (CQ2)

6.9 6,8
9.3
8,1

2.0

-5,2

3600 (CQ3)

3664+/-248

-1.8
4.1

3564+/- 129
786+A49
1834+/- 193

-2.0
-2,7
0,9

Ktamine

800 (CQI)
1800 (CQ2)

767+/-7

6,2
10,5

1798+/- 146

0,1

3600 (CQ3)

3634+/-323

8.9

-0,9

3566+/- 156

4.4

-1,9

C.V. : coefficient de variation

216

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIX, n 3, 2007

Application la pharmacocintique de la ktamine chez le rat

La figure 3 rapporte les cintiques moyennes de K et NK obtenues chez 6 rats aprs perfusion de ktamine durant 30 minutes. Pour la ktamine, les concentrations plasmatiques sont trs leves ds le dbut de la perfu sion, mais dcroissent ensuite trs rapidement selon une cintique d'apparence biphasique. La formation de la norktamine se produit ds le dbut de la perfusion. La modlisation pharmacocintique montre qu'un modle 2 compartiments ouverts avec une cintique d'limination d'ordre 1 est parfaitement corrl avec nos donnes exprimentales (Figure 4). Les principaux paramtres pharmacocintiques de la ktamine calculs en utilisant ce modle sont rapports dans le tableau III. Nous retrouvons des demi-vies moyennes de 9,6 et 107
10000-|

min, respectivement pour les phases de distribution et d'limination. Le volume de distribution moyen est lev de l'ordre de 19 L/kg. Le temps de sjour dans l'organisme (M.R.T.) est relativement court compatible avec une valeur trs leve de la clairance corporelle
totale. Les constantes pharmacocintiques sont caract rises par une grande variabilit d'un animal l'autre comme le montre la valeur des cart-types calculs pour chaque paramtre.

Pour la norktamine, les concentrations vont crotre pour passer par une valeur maximale cinq minutes aprs la fin de la perfusion, puis resteront suprieures celles de la ktamine pendant toute la dure de l'tude. L'utilisation d'un modle non compartimentai montre une demi-vie d'limination de 95 +/minutes com parable celle rapporte dans la littrature (1 1,15).
1 1

constant rate XV

KIO

1
Kl 2

_l

'lK21
"

11
3.
01 01

^\l

oQ

V
>

E
tfl
(0

a.

1000N^N

12000 i

o
c
01

(1
10000'

A
i

o c

8000'

O
Perfusion Ktamine 70 mgftg

6000'

M\
\
O""

ommm

PmKM

4000-

2000

1000

50

100

\iO

200

250

300

350

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

330

360

min)

Temps (min)

Figure 3

: Cintiques en coordonnes semi-logarithmiques

plein) et de la norktamine (cercle clair) chez le rat mle Sprague Dawley aprs perfusion d'une dose de ktamine (70 mg/kg) en 30 minutes. Les rsultats sont reprsents sous la forme m+/- S.E.M. (n=6).
de la ktamine (cercle

Figure 4 : Modlisation de la cintique de la ktamine aprs perfusion chez le rat.

Tableau III : Paramtres pharmacocintiques moyens (n=6) de la ktamine obtenus chez le rat Sprague Dawley.
Cmax
Demie vie alpha min
9.6
3.3

/'g/L
moyenne

Demie vie bta min

107
13

A.U.C.
min*// g/L
358216
56026

CI
L/min/kg
0.2
0.03

Vd

M.R.T
min

L/kg
19

4334
562

95
11

S.E.M
Cmax

4.8

: concentration au pic plasmatique A.U.C. : aire sous la courbe

CI : clairance totale Vd : volume de distribution M.R.T. : Mean residence time

217

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIX, n 3, 2007

Discussion
Nous rapportons dans ce travail la mise au point d'une mthode de dosage de la ktamine (K) et de son meta bolite (NK) par chromatographie en phase gazeuse (CPG). La revue de la littrature montre que de nom breuses mthodes par CPG ont dj t dcrites per mettant le dosage simultan de la ktamine et de la nor ktamine (15) associ ou non d'autres metabolites, comme la dhydronorktamine (16). Ces mthodes uti lisent toutes une tape de drivation puis soit une dtec tion non spcifique par ionisation (dtecteur FID) ou plus gnralement une dtection azote-phosphore (dtecteur NPD) afin d'accrotre la sensibilit. Le labo ratoire tant dot des deux modes de dtection, nous avons compar la sensibilit des dtecteurs. Sans dri vation, le dtecteur FID tait 20 fois moins sensible que la dtection NPD sur des solutions de ktamine ou de norktamine la concentration de 1 000 pg/L. Ces rsultats sont similaires ceux rapports par Stiller et coll. (15) et Pedraz et coll. (16).
Les tapes de drivation sont en gnral considres comme consommatrices de temps, dlicates mettre en uvre mais ncessaires pour amliorer la sensibilit de la dtection. L'originalit de notre travail est de prsen ter une technique directe suffisamment sensible pour tre applique des prlvements sriques sans tape pralable de drivation. Cependant, l'exception d'une seule publication (17), aucune technique dcrite ne rap portait un dosage sans drivation de ces composs. Nous avons donc test une procdure de drivation fonde sur l'utilisation des anhydrides d'acide comme le TFAA (anhydride trifluoroactique) ou le HFBA (anhydride heptafluorobutyrique) (16). Dans notre exprience, les techniques de drivation n'ont pas montr d'amlioration significative de la sensibilit, contrairement Siller et coll. (15) qui rapportent une augmentation de sensibilit pour la ktamine mais pas d'effet sur la norktamine. L'absence d'amlioration de la sensibilit associe une faible reproductibilit de la mthode de drivation, nous a conduit dvelopper la mthode directe d'injection de l'extrait plasmatique.

d'essai la plus faible, nous avons compar les mthodes d'extraction. La revue de la littrature rapporte que l'extraction liquide-liquide est largement la plus utili se (15, 16, 21) avec des solvants varis (ther, hepta ne, cyclohexane) (4, 15, 21) ou des mlanges de sol vants comme le mlange dichloromthane-actate d'thyle (19). L'extraction solide-liquide base sur l'utilisation de cartouche SPE C18 a galement rappor te par d'autres auteurs (1 1, 20). Nous avons dvelop p au laboratoire une extraction liquide-liquide base sur l'utilisation d'un seul solvant, le chloroforme en milieu alcalin. Dans ces conditions, nous avons obtenu un rendement d'extraction trs satisfaisant (> 90 %) tant pour les molcules d'intrt que pour l'talon interne. Ces rendements sont comparables ceux rap ports dans la littrature (4). Dans notre exprience, l'extraction par l'actate d'thyle conduit des rende ments similaires, mais aboutit des profils chromato graphiques prsentant plus de pics non spcifiques tan dis que l'extraction solide-liquide a conduit des ren dements infrieurs voisins de 80 %. Ce pourcentage est comparable l'tude de Licata et coll. (13).

La plupart des techniques dcrites (15, 20, 21) utilisent comme talon interne la bromoktamine, qui n'est pas disponible commercialement et ne peut plus tre obte nue auprs des laboratoires synthtisant la ktamine. Nous avons test les talons rapports pour des mthodes en phase liquide comme la dsipramine (4) ou la nortidiline (19). Dans nos conditions chromato graphiques, ces composs ne sont soit pas lues (norti diline) soit lues trop tardivement pour la dsipramine (tr = 15,3 min) par rapport aux substances d'intrt. L'talon interne que nous avons retenu est l'ifosfamide, un antimitotique qui peut tre extrait avec un rende ment satisfaisant et chromatographie sans drivation dans nos conditions. L'lution se fait avec un temps de rtention diffrent de ceux de la NK et de la K sans en tre trop loign. Bien que l'ifosfamide soit un mdi cament antimitotique, son utilisation comme El ne pose pas de problme pour les tudes chez l'animal, et pour les tudes chez l'homme, sa co-administration avec la ktamine reste fort peu probable.
Sur le plan de la sensibilit, nous avons dtermin une LQ voisine de 500 //g/L pour la K et son metabolite. Cette sensibilit est suffisante pour permettre en routi ne la dtection des 2 molcules dans les tudes phar macocintiques chez l'homme comme chez l'animal. Dans un cadre de mdecine lgale, compte tenu de sa sensibilit, notre mthode ne pourrait que valider une prise rcente de K, mais ne saurait tre suffisante pour les cas de soumission chimique, ou la spectromtrie de masse en tandem devrait lui tre prfre.

L'tude des volumes d'chantillons montre des volumes levs de plasma (suprieur 0,5 ml) quelque soit la mthode chromatographique utilise pour le dosage (15,16,19,20). Un tel volume n'est pas compa tible avec la ralisation de cintiques chez l'animal, comme le rat ou le volume maximal pouvant tre pr lev sur une cintique complte est de l'ordre de 2 ml de sang total. La mthode que nous avons dveloppe permet le dosage de la K et de la NK partir d'une prise d'essai de 100 /ri voire de 50 /ri pour les points les plus concentrs. Dans le but de travailler sur la prise
218

L'tude de la spcificit de notre mthode s'est limite

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIX, n 3, 2007

tester l'interfrence du pentobarbital et de la xylazine utiliss pour le pr-traitement des rats dans notre pro tocole opratoire. Ces deux substances sont extraites, peuvent tre chromatographies dans nos conditions, mais prsentent des temps de rtention diffrents des substances d'intrt. Pour appliquer notre mthode chez l'homme, une tude plus exhaustive de produits potentiellement interfrents, en particuliers les produits action centrale (benzodiazepines, barbituriques,..) devrait tre tests. Ces composs sont en effet suscep tibles d'tre consomms en mlange lors des rave

Rfrences
1.

Cheng J.Y.K., Mok V.K.K. Rapid determination of keta mine in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for a high throughput laboratory. Forensic. Sci.Int. 2004; 142 : 9-15.

2. Riou B., Langeron O. La ktamine. In : Gosgnach M.. Chauvin, M., Riou B., eds. Pharmacologie en anesthsieranimation. Paris : Arnette, 1999 ; 287-301. 3. White P.F., Way W.L., Trevor, A.J. Ketamine-its pharma cology and therapeutic use. Anaesthesiology 1982 ; 56 : 119-136.

party

Diffrents travaux ont rapports l'existence d'une mau vaise conservation des solutions de K et de NK mme trs basse temprature (22). Sur des priodes de conservation de dure moyenne (< 15 jours) + 4C, nous n'avons pas observ de variations de concentra tions aussi bien pour les solutions filles que pour des points de gamme condition de conserver les solutions en tubes borosilicat. Avec du verre non trait, nous avons observ une absorption non spcifique pouvant atteindre 20 30 % et apparaissant dans les 24 heures suivant la prparation des solutions.
Nous avons appliqu cette mthode une tude phar macocintique chez le rat aprs injection intraveineuse de ktamine. Les paramtres cintiques ainsi que l'li mination biphasique sont comparables ceux rapports chez l'homme (5, 17) ou dans d'autres espces ani males (4, 22).

4. Niedorf F., Bohr H.H., Kietzmann M. Simultaneous determination of ketamine and xylazine in canine plasma by liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection. J. Chromatogr. B. 2003 ; 791 : 421-426.
5. Wieber J., Gugler R., Hengstmann J.H., Dengler H.J. Pharmacokinetics of ketamine in man. Anaesthetist 1975 ; 24 : 260-263. 6. Hijazi Y., Boulieu R. Protein binding

of ketamine

and its

active metabolites to human serum. Eur. J. Clin. Pharmacol. 2002 ; 58 : 37-40.

7. Adams J.D., Bai Hie T.A., Trevor A. J., Castagnoli N. Studies on the biotransformation of ketamine. 1. Identification of metabolites produced in vitro from rat liver microsomal preparations. Biomed. Mass Spectrom
1981

;8: 527-538.

8. Martin D., Lodge D. Ketamine acts as a non competitive N-methyl-D-aspartate antagonist on frog spinal cord in vitro. Neuropharmacology 1985 ; 10 : 999-1003. 9. Graf

Conclusion
Nous rapportons dans ce travail une mthode de dosa ge de la ktamine et de son metabolite principal, la nor ktamine, par chromatographie en phase gazeuse. Le principal intrt de notre mthode provient d'une sen sibilit satisfaisante obtenue en l'absence de drivation. Notre mthode est donc facile mettre robuste et fiable. Applicable aux tudes pharmacologiques ou toxicologiques chez l'homme, notre mthode trouve son principal intrt dans les protocoles pharmacocin tiques chez le petit animal en raison du faible volume de prlvement ncessaire sa mise en

M.B., Vicenzi M.N., Martine E.. Bosnjak Z.J., Stowe D.F. Ketamine has stereospecific effects in the iso lated perfused guinea pig heart. Anaesthesiology 1995 ; 82 : 1426-1437.

lO.Bjarke E., Mikkelsen S., Thorkildsen C, Borgbjerg F.M. Norketamine, the main metabolite of ketamine, is a non competitive NMDA receptor antagonist in the rat cortex and spinal cord. Eur. J. Pharmacol. 1997 ; 333 : 99-104.
1

1.

Hijazi Y.,Bolon M.. Boulieu R. Stability of ketamine and

its metabolites norketamine and dehydronorketamine in human biological samples. Clin. Chem. 2001 ; 47 (9) 1713-1715.
:

l2.Dalgarno P.J., Shewan D. Illicit use of ketamine in

Scotland.
J

Psychoactivre Drugs 1996 ; 28

191-199.

13.Licata M., Pierini G A fatal ketamine poisoning. J. Forensic. Sci 1994 ; 39 : 1314-1320.
14. Gill J.R.,

Remerciements
Les auteurs adressent tous leurs remerciements Mesdames M. Corvisier et I. Souletie pour leur pr cieuse aide technique dans la ralisation des dosages et au Dr. M. Debray pour l'analyse des paramtres phar macocintiques.

Stajic M. Ketamine in non-hospital and hospi tal deaths in New York City. J. Forensic. Sci 2000 ; 45 : 3 : 655-658.

15. Stiller

R.L.. Dayton P.G., Perel J.M. Gas chromatogra phic analysis of ketamine and norketamine in plasma and urine: nitrogen-sensitive detection. J. Chromatogr. 1982 : 232 : 305-314.

l.Pedraz J.L., Marino E.L.. Dominguez-Gil A. Quantitative determination of ketamine and its metabo lites in man by gas-liquid chromatography. II Farmaco:

38-5

209-218.

219

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XIX, n 3, 2007

17.Malinovsky J.M., Servin F., Cozian A., Lepage J.Y., Pinaud M. Ketamine and norketamine plasma concentra tions after i.v., nasal and rectal administration in children. Br. J. Anaesth. 1996 ; 77 : 203-207.
18.Kochhar M.M. The identification of ketamine and its metabolites in biologie fluids by gas-chromatographymass spectrometry. Clin. Toxicol. 1991 ; 67 : 310-316.
19.Bolze S., Boulieu R. HPLC determination of ketamine, norketamine, and dehydronorketamine in plasma with a high-purity reversed-phase sorbent. Clin. Chem. 1998 ; 44 : 3 : 560-564.
20. Rodriguez
Rosas M.E., Patel S., Wainer I.W. Determination of the enantiomers of ketamine and nor ketamine in human plasma by enantioselective liquid chromatography- mass spectrometry. J. Chromatogr. B.

21

2003;794:99-108. . Yanagihara Y, Ohtani M., Kariva S., Uchino K., Aoyama T., Yamamura Y, Iga I. Stereoselective high-performan ce liquid chromatographic determination of ketamine an
dits active metabolite, norketamine in human plasma. J. Chromatogr. B. 2000 ; 746 : 227-231.

22. Waterman A.E., Robertson S.A., Lane J.G. Pharmacokinetics of intravenously administered ketami ne in the horse. Res Vet Sci. 1987 ; 42 (2) : 162-166.

220