Universidade Estadual do Cear UECE Faculdade de Educao, Cincias e Letras do Serto Central FECLESC Curso de Licenciatura em Cincias Biolgicas

Resumos

Quixad CE 2013 CRIOPRESEVAO DE MEDULA SSEA E CLULAS PLURIPOTENTES PERIFRICAS UTILIZANDO UM CONGELADOR PROGRAMVEL: EXPERINCIA EM 86 CONGELAMENTOS

A infuso de clulas hematopoticas totipotentes criopreservadas permite a recuperao da hematopoese aps quimioterapia mieloablativa. A criopreservao em congelador programvel permite o armazenamento de clulas hematopoticas e, potencialmente, pode causar menor dano celular. A utilizao das clulas pluripotentes (stemcell) criopreservadas, presentes na medula ssea ou no sangue perifrico aps sua infuso, permite a recuperao medular aps a administrao de altas doses de quimioterapia. A formao de cristais de gelo durante o processo de criopreservao um evento importante e a principal causa de destruio celular na recuperao medular aps infuso das clulas descongeladas. A adio de crioprotetores penetrantes, tais como o dimetilsulfxido (DMSO), diminui o volume de gua para formao de cristais de gelo e, consequentemente, o grau de desidratao da clula. O trabalho apresenta experincias realizadas no perodo de abril de 1993 a setembro de 1994, com 23 pacientes (entre homens e mulheres) com cinco tipos de diagnsticos e submetidos a tratamentos distintos, uma parcela destes pacientes recebeu quimioterapia como regime de condicionamento para o autotransplante e seis receberam quimioterapia associada radioterapia (radiao corporal total). A coleta de medula ssea realizado no mtodo do grupo de Seattle. Coletaram-se de 10-15mL/kg (de peso do paciente) de medula ssea por meio de mltiplas punes da regio esternal e das cristas ilacas superiores e posteriores. A medula ssea foi filtrada por dois filtros de dimetros diferentes (0.33mm e 0,22mm), respectivamente. A coleta das CTP foi realizada por meio de leucoafrese, realizando-se um procedimento por dia durante trs dias consecutivos, aps estimulo como G-CSF (5g/kg). As afreses foram realizadas em equipamento de fluxo contnuo Vivacell BT 798 (Dideco, Mirandola Itlia). Em cada coleta foram processados 10 12 litros de sangue do paciente, com fluxo de retirada de 50mL/min e fluxo de aspirao do buffycoat de 3-4mL/min. A velocidade de centrifugao foi de 180 x G e utilizou-se ACD frmula A como soluo anticoagulante numa proporo de 1 / 10 -1 /12. O volume dos produtos obtidos em cada coleta foi reposto aquivolumetricamente com soluo de albumina a 4%. O excesso de plasma contido no produto da coleta de CTP e da medula ssea foi removido por centrifugao em centrfuga Sorvall (3.000rpm/15min), colhendo-se, assim, a camada leucoplaquetria (buffy-coat). A contagem de clulas nucleadas foi feita antes e aps a obteno do buffy-coat, que foi congelado com igual volume de soluo criopreservante contendo 20% de dimetilsulfxido (DMSO), 40% de meio de cultura (TC 199) e 40% de plasma autgeno. As clulas do buffy-coat foram congeladas em uma cmara de congelamento programvel (CRYOMED, mod. 1010, Ohio). A taxa de congelamento foi razo de -1 C/ min da temperatura ambiente at 45C e, a seguir, a -10 C/min at -80C, antes de serem transferidos para um freezer mecnico a -110C (Forma Cientifica, mod 8380, Ohio). Antes da reinfuso, as clulas foram rapidamente descongeladas (3 a 5 minutos), em banho-maria a 37C, ao lado do leito do paciente. Foi adicionado anticoagulante (ACD) correspondente a 20% do volume total de cada bolsa, para evitar a formao de cogulos celulares. Todos os pacientes receberam fator de crescimento (G-CSF) a partir do dia + 1 do TMO at a

recuperao hematopotica. Uma paciente (RGC) recebeu GM-CSF e outro (RRS), GCSF e GM-CSF, alternadamente, como fatores estimulantes, por problemas de fornecimento. Nos resultados oitenta e seis congelamentos foram realizados naquele perodo. A mediana de coletas de CTP e de medula ssea por paciente foi de 3 e 1, respectivamente. Os pacientes receberam uma mediana de 5,31 x 10cels./kg (variao 1,68-26,74) de CTP associada a medula ssea autgena. Dois pacientes (RGC e AGC) receberam apenas medula ssea, pois no foi possvel coletar CTP devido ao peso dos pacientes. A mediana do tempo de recuperao medular foi de 12 dias (variao8-40) para os granulcitos e de 31 dias (variao 8-80) para as plaquetas. Dos 23 pacientes, um (RGF) teve recidiva precoce (dia +86) e morreu aps trs meses. Os demais pacientes morreram de outras causas. O tratamento com altas doses de quimioterapia, seguido da infuso de clulas precursoras hematopoticas, est sendo incorporado ao contexto teraputico com finalidades curativas de neoplasias. A importncia das clulas pluripotentes aps a quimioterapia mieloablativa faz-se notar pela reduo das intercorrncias como neutropenia, entre outros, os quais podem ser reduzidos ainda mais se empregados fatores de crescimento, associadamente. O transplante autlogo ou autoplstico de medula ssea (TAMO) passa a ter papel importante quando se visa administrar altas doses de quimioterapia. Recentemente, vrios procedimentos tm sido empregados para aumentar a coleta de clulas progenitoras. Richmanet al. Observaram aumento do nmero de CFU-GM (colonyformingunitgranulocyte macrophage), presentes no sangue perifrico de pacientes que receberam quimioterapia no-mieloablativa coincidente com a recuperao dos leuccitos. O mesmo fenmeno foi observado durante o tratamento de induo na leucemia mielide aguda e, aps quimioterapia, para linfoma no-Hodgkin. Os fatores de crescimento tambm tm sido empregados para melhorar o rendimento da coleta das clulas. Socinskiet al. Relataram aumento mdio de 15 vezes no nmero de CFU-GM no sangue perifrico, aps a infuso de GM-CSF (granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor), com doses escalonadas de 4-64 g/kg, em pacientes com tumores slidos que no receberam quimioterapia. Altas doses de quimioterapia, tais como com ciclofosfamida e VP 16, seguidas de G CSF, talvez tornem desnecessrias mltiplas coletas de clulas e resultem em um produto com menor quantidade de clulas tumorais. Desses trabalhos resultou que a melhor tcnica de coleta das clulas precursoras hematopoticas (CD34+) seria a combinao de quimioterapia seguida de fator de crescimento. Os pacientes tiveram a medula ssea ou CTP coletadas aps a quimioterapia de resgate ou sob estmulo com fator de crescimento. A maioria dos pacientes recebeu GCSF aps o TAMO com o intuito de acelerar a recuperao hematopotica. Uma mediana de 12 dias de recuperao dos granulcitos, aps o autotransplante, foi observada, estando de acordo com outros relatos. A recuperao hematopotica um bom ndice para avaliar a criopreservao das clulas pluripotentes hematopoticas. Korblinget al., estudando pacientes com linfoma de Burkitt em remisso completa que receberam CTP aps radioterapia corporal total e ciclofosfamida, observaram

recuperao precoce de neutrfilos e plaquetas (dias 9 e 10 ps transplante, respectivamente). O uso de CTP tem facilitado uma recuperao medular precoce, e isso se traduz por menor morbidade, menor custo, permitindo ampliar seu uso teraputico.

EXPOSIO DE DIFERENTES CRIOPROTETORES E CONCENTRAES SOBRE O DIMETRO E NMERODE CLULAS DA GRANULOSA DE FOLCULOS PR-ANTRAIS BOVINOS

O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do glicerol (GLI), dimetilsulfxido dimetro do folculo, do ovcito e do nmero de clulas da granulosa de folculos prantrais bovinos. Fragmentos ovarianos foram imediatamente fixados em Carnoy (controle) ou expostos aos crioprotetores nas concentraes de 20 e 40%, por 10 min. Aps o perodo de exposio, o tecido ovariano tambm foi fixado em Canoy e processado para incluso em parafina. Cinco seces de tecido ovariano foram coradas em hematoxilina e eosina e analisadas ao microscpio de luz com ocular em escala micromtrica. Os dados foram analisados por ANOVA e teste Tukey. Alm de avaliar o GLI tambm so avaliados DMSO e propilenoglicol (PROH) sobre o dimetro do folculo e do ovcito, assim como do nmero de clulas da granulosa de folculos prantrais inclusos em tecido ovariano bovino. Dois ovrios bovinos (Bosindicus) oriundos de diferentes animais obtidos em abatedouro e transportados ao laboratrio em bolsa lavados em lcool 70% e, logo em seguida, com soluo salina. Fragmentos de 5 x 3 mm (n=35) foram retirados da parte cortical do ovrio. Os folculos foram classificados, de acordo com o estgio de desenvolvimento, em primordiais e primrios. Aps a classificao folicular, os dimetros do folculo e do ovcito foram mensurados com uso de ocular com escala micromtrica (KACINSKIS) et al., foi contado o nmero de clulas da granulosa. A anlise estatstica foi realizada pelo software BIOESTAT 5.0. Com o estudo de poucos ovrios possvel a avaliao de centenas de folculos pr-antrais para analises morfolgicas, em diferentes espcies animais (LUCCI et al., 2004; LUCCI et al., 2007). Forma observados 633 folculos prantrais, dos quais 550 eram primordiais e 83 primrios, distribudos nos diferentes grupos. Em relao ao dimetro dos folculos, nenhuma diferena foi encontrada entre os grupos controle e aqueles expostos aos crioprotetores. Sobre o dimetro dos ovcitos primordiais, todos crioprotetores na concentrao de 40% levaram reduo do dimetro, quando comparados ao grupo controle (P 0,05). Na concentrao de 20% apenas o propilenoglicol induziu a reduo do dimetro dos ovcitos. J os ovcitos primrios, somente o glicerol a 40% diferiu do grupo controle (P 0,05). Em relao ao nmero de clulas da granulosa, o dimetilsulfxido a 40% e o propilenoglicol a 20% e a 40% apresentaram reduo significativa (P 0,05) quando comparados ao grupo controle. Altas concentraes de crioprotetores so usadas para a tcnica de vitrificao que, por sua vez, apresenta como vantagens rapidez na execuo, praticidade e baixo

custo quando comparada execuo da tcnica de congelao lenta parra a preservao de tecido ovariano bovino. Os folculos pr-antrais podem ser estudados no tecido ovariano em funo de sua fase de desenvolvimento. Relatos mostram que as classes foliculares podem influenciar na resistncia aos processos de criopreservao, e esse aspecto discutido na literatura. Alguns mostram que folculos primordiais de cabras so mais resistentes que os primrios, j outros indicam que folculos primordiais de bovinos so mais susceptveis ao processo de criopreservao e tem quem diga que no encontrou nenhuma diferena entre as classes foliculares criopreservadas de bovinos. Na anlise morfolgica do folculo, no foram observadas diferenas significativas, tanto nos primordiais como nos primrios, para os trs crioprotetores testados, em comparao ao grupo controle (P 0,05). Entretanto, observaram-se diferenas no dimetro do ovcito, quando utilizada a concentrao de 40% em todos crioprotetores e no caso do PROH mesmo a 20%. Quanto ao nmero de clulas da granulosa, somente os folculos primordiais expostos ao DMSO a 40% e ao PROH a 20 e 40% mostraram reduo na comparao com o grupo controle. A reduo do nmero de clulas da granulosa pelos crioprotetores estudados confirma os achados de Lucciet al. (2004), que, pela anlise de microscopia eletrnica do complexo clulas da granulosa-ovcito, em tecido ovariano bovino, constatou perdas de citoplasma das clulas da granulosa aps uso de altas concentraes de DMSO e PROH. O PROH foi o crioprotetor mais txico, pois afetou o dimetro ovocitrio e o nmero de clulas da granulosa nas duas concentraes usadas (20% e 40%). Concluso as estruturas primrias mostraram-se resistentes aos efeitos dos crioprotetores. O glicerol, o dimetilsulfxido e o propilenoglicol levaram a redues dos dimetros dos ovcitos e do nmero de clulas da granulosa das estruturas primordiais, mas no do dimetro folicular.

CRIOPRESERVAO DE SMEN HUMANO COMPARAO ENTRE MTODOS DE CONGELAO E TIPOS DE ENVASE

O objetivo do trabalho em comparar duas diferentes tcnicas de congelamento e dois tipos de envase do smen humano durante o processo de criopreservao. Se as probabilidades de se engravidar para um casal sem qualquer problema pouco, o que se falar para os casais com algum fator que dificulte esse processo. Atualmente, 15 em cada 100 casais, em idade apresentam dificuldades em alcanar uma gravidez. Em metade desses casais, a causa da infertilidade decorre de um fator masculino isolado ou associado a outros fatores femininos. Para os casos mais graves (distrbios masculinos) e com o desenvolvimento de tcnicas de injeo intracitoplasmtica, foi criado um programa de doao de smen (dai surgiu os bancos de smen).

Estudos comprovam a eficcia e a segurana da utilizao de smen criopreservado por tcnicas de reproduo assistida obtendo taxas semelhantes s obtidas quando se utiliza smen no criopreservado. Alm de servir para os casos onde o homem tenha alguma disfuno, o banco de smen tambm recebe coletas de homens que precisam fazer vasectomia e no querem perder a chance de um dia constituir uma famlia, tambm serve para doadores annimos onde estes so utilizados para os casais com problemas de fertilidade e tambm para os casos de tratamentos agressivos que possam prejudicar a criao de espermatozoides (a fertilidade). O espermograma exame que avalia a qualidade do smen estuda diferentes parmetros que refletem a capacidade funcional dos espermatozoides. Concentraes elevadas de espermatozoides esto relacionadas com as maiores taxas de gravidez em ciclos espontneos e de inseminao artificial. Com o desenvolvimento das tcnicas de reproduo assistida, a criobiologia passou a despertar grande interesse, pois exerce papel essencial na manuteno da fertilidade. A criopreservao tem como principal objetivo manter a integridade estrutural e a viabilidade celular aps submeter essas clulas a baixas temperaturas por um determinado perodo. A velocidade de resfriamento das amostras de smen humano um fator determinante na preservao da qualidade espermtica. Em humanos, esse um fator ainda pouco estudado, merecendo, portanto, mais ateno. No intuito de reduz os dados causados na estrutura e na funcionalidade dos espermatozoides durante a criopreservao, tornam-se necessrios estudos sobre o processo ideal de congelao e estocagem das amostras de smen. O estudo foi desenvolvido no ano de 2004, no Centro de Reproduo Assistida do Cear. Foi um estudo experimental de validao de tcnica laboratorial. Foram avaliadas 18 amostras de smen de 18 voluntrios. De cada voluntrio, foi obtida uma amostra de smen. As amostras de smen foram colhidas em frascos coletar adequado e, em seguida, encaminhadas para anlises, realizadas pelo mesmo examinador. Os seguintes parmetros foram avaliados no smen in natura: concentrao espermtica, motilidade espermtica, segundo os critrios da Organizao Mundial de Sade (OMS) e morfologia espermtica, segundo os critrios de Kruger. O meio crioprotetor utilizado foi o Test-yolk buffer, com a seguinte constituio: 48% de soluo de test (325 mOsm de Tes com 325 mOsm de Tris), 30% de citrato de sdio, 20% de gema de ovo, 2% de frutose, glicerol com concentrao final de 6%, 1000.000 unidades de penicilina por mililitro e 100.000 g de sulfato de estreptomicina por mililitro (Irvine Scientific, Califrnia, EUA). Para congelao lenta, as palhetas de 0,25 mL e os criotubos de 2mL foram colocados em compartimento indicado do congelador automtico FrezerControlCryologic, modelo CL8000 (Austrlia) e ajustado para o programa de seis nmeros especfico para congelao de smen, conforme indicao do fabricante.

Para congelao lenta, as palhetas de 0,25 mL e os criotubos de 2mL foram colocados em compartimento indicado do congelador automtico Freezer ControlCryologic, modelo CL8000 (Australia), e ajustado para o programa de nmero seis, especifico para congelao de smen. Para congelao rpida foi utilizada uma caixa de isopor quadrada, com um revestimento interno de ao inox, medindo 32 cm de largura e de profundidade e 37 cm de altura. As palhetas de 0, 25mL e os criotubos de 2 mL foram colocados, horizontalmente, 10 cm acima do nvel do nitrognio liquido a -196 C. Os dados coletados foram digitados em programa de computador Microsoft Excel verso 2000 e realizadas as analises, aofinal dos experimentos, utilizado o programa de computador SPSS for Windows verso 11.0.0. O trabalho foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Cear (UFC), bem como pelo corpo clinico do Centro de Reproduo Assistida do Cear. Nos resultados os voluntrios apresentaram mdia de idade de 33,9 5,2 anos, variando de 26 a 44 anos. As analises das variveis iniciais, volume, concentrao, morfologia e motilidade espermtica, por meio do coeficiente de correlao de Spearman, revelaram uma ausncia de correlao, sugerindo uma independncia entre tais variveis. Aps a descongelao das amostras submetidas ao processo rpido e, envasadas em palheta (RP), foram encontrados os seguintes resultados: morfologia normal mdia de 12,8 5,4%, motilidade inicial mdia de 19,2 13,5%, com uma hora de 13,5 12,0%, com duas horas de 9,2 8,3% e com trs horas de 5,7 5,5%. J os envasados em criotubo (RT), foram encontrados os seguintes resultados: morfologia normal mdia de 12,6 5,7%, motilidade inicial mdia de 27,0 15,4%, com uma hora de 21,6 10,1%, com duas horas de 17,7 11,2% e com trs horas de 13,1 8,0%. As amostras submetidas ao processo lento e envasadas em palheta (LP), aps a descongelao foram encontrados os seguintes resultados: morfologia normal mdia de 12,6 5,8%, motilidade inicial mdia de 21,1 16,2%, com uma hora de 18,3 15,7%, com duas horas de 13,9 14,3% e com trs horas de 9,2 9,0%. E nos casos de envasamento criotubo (LT), foram encontrados os seguintes resultados: morfologia normal mdia de 12,4 4,7%, motilidade inicial mdia de 30,3 14,7%, com uma hora de 28,7 11,2%, com duas horas de 25,1 12,7% e com trs horas de 16,7 9,0%. A taxa de recuperao de espermatozoides moveis, aps o processo de criopreservao definida como o percentual de espermatozoides que se mantiveram mveis aps a descongelao. A avaliao, realizada 30 minutos aps a descongelao, revelou as seguintes taxas: 32,3% (RP), 46,7% (RT), 38,2% (LP) e 50,4% (LT). Quanto motilidade ao longo do tempo (curva de sobrevivncia), na amostra de smen in natura observou-se uma reduo gradual dos espermatozoides mveis, sendo de 11, 14 e 21% na primeira, segunda e terceira horas, respectivamente.

Durante as discurses a avaliao da morfologia dos espermatozoides demonstrou uma reduo significativa, depois da criopreservao, em trs mtodos, quando comparada com a morfologia inicial: mtodo RP, mtodo LP e mtodo LT. Quando analisados os diferentes mtodos, no se observou diferena quanto morfologia. A reduo da taxa de espermatozoides com morfologia normal inicial comparada com as morfologias aps a criopreservao foi calculada em torno de 10%. Analisando os mtodos de congelao, rpido e lento, observou-se que, apesar de ter piores taxas de espermatozoides mveis depois da descongelao, o mtodo rpido obteve melhores resultados quando o smen foi envasado em criotubos, em todos os momentos. Atualmente, alm da motilidade e morfologia espermtica, est sendo utilizado o grau de fragmentao do DNA espermtico como parmetro para avaliao da qualidade dos espermatozoides. Estudos demonstraram que o processo de criopreservao no vapor do nitrognio (mtodo rpido) provocou mais leso no DNA espermtico que o mtodo computadorizado (mtodo lento). Finalizando o mtodo de congelao lento foi superior ao rpido, mesmo quando utilizada a palheta como forma de envase, devendo tambm ser adotado como mtodo padro de congelao de smen.